CN115011532B

CN115011532B - 一种副干酪乳杆菌jy062制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115011532B
Application number: CN202210944148.5A
Authority: CN
Inventors: 满朝新; 姜毓君; 张宇; 苏悦; 崔政盈
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-08-08
Filing date: 2022-08-08
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2042-08-08
Also published as: CN115011532A

Abstract

本发明公开了副干酪乳杆菌JY062制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤一，将副干酪乳杆菌JY062（Lactobacillus paracasei JY062）以5%接种量接种至MRS培养基，32‑37℃培养16‑18 h后，三区划线于MRS固体培养基上，培养后挑取单菌落于MRS培养基中，传代培养两代后6000‑8000 r/min离心至少10分钟，收集发酵上清液，菌泥用PBS洗涤至少两次后，再用PBS重悬，使菌悬液活菌数至少达10⁹CFU/mL。同时本发明公开一种上述制备方法获得的制剂及其应用。本发明获得的制剂活菌数更高，具有良好的应用效果。

Description

一种副干酪乳杆菌JY062制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种副干酪乳杆菌JY062制剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种用于改善糖脂代谢紊乱引起的肝损伤的副干酪乳杆菌JY062制剂及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。

背景技术

糖脂代谢紊乱性疾病（Glucolipid metabolic disorders，GLMD）是受遗传、心理以及环境等因素影响而引起糖、脂代谢紊乱的一系列疾病。GLMD的主要病理表现为神经内分泌功能障碍、胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR）、代谢性炎症和肠道菌群紊乱。其主要临床表现为二型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）、高脂血症、肥胖症、非酒精性脂肪肝疾病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）和动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）等疾病单一或合并出现。糖脂代谢紊乱性疾病成因复杂，其症状随病程的变化而不断变化，特别是并发症的出现为疾病的治疗带来更多阻碍，现临床诊治多以单病种、分科诊疗为主，主要聚焦于某个具体疾病，忽略多个疾病并发存在时需要综合整体治疗，导致疾病的防控效果并不理想。临床上一般采用降糖降脂药联合使用，如磺脲类、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂等，但这些药物的一些副作用限制了其在临床上的长期应用，而且这些降糖降脂药无法改善肝损伤。因此，一种天然的、安全的新型降糖药物或辅助治疗药物的开发变得尤为重要。

目前大量的研究表明，益生菌可以调控机体肠道内环境稳态，并通过降低炎症反应、减轻氧化应激反应、提高肠道屏障和增强免疫调节等途径在不同程度上缓解动物模型或临床患者的糖脂代谢紊乱。近年来，随着宿主与肠道菌群相互作用的深入研究，益生菌通过介导患者的肠道菌群来缓解GLMD已被认为是切实可行的，具有重要的研究价值。本发明开发出可改善糖脂代谢紊乱的一株副干酪乳杆菌。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种副干酪乳杆菌JY062制剂的制备方法，该法获得的制剂活菌数更高，具有良好的应用效果。

同时，本发明提供采用一种副干酪乳杆菌JY062制剂的制备方法获得的制剂。

同时，本发明提供一种副干酪乳杆菌JY062制剂在制备改善糖脂代谢紊乱引起的肝损伤的药物中的应用。

同时，本发明提供一种副干酪乳杆菌JY062制剂在制备改善糖脂代谢紊乱的药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

本发明公开一种副干酪乳杆菌JY062制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，将副干酪乳杆菌JY062（Lactobacillus paracasei JY062）以5%接种量接种至MRS培养基，32-37℃培养16-18 h后，三区划线于MRS固体培养基上，培养后挑取单菌落于MRS培养基中，传代培养两代后6000-8000 r/min离心至少10 min，收集发酵上清液，菌泥用PBS洗涤至少两次后，再用PBS重悬，使菌悬液活菌数至少达10⁹CFU/mL；

步骤二，离心菌悬液，收集菌泥，将制剂溶液的组分一加入到菌泥中，菌泥与组分一的体积比为1:4，充分混匀制成菌悬液二；

步骤三，再在菌悬液二中加入制剂溶液的组分二，混匀，获得菌悬液三；

步骤四，将菌悬液三置于恒温水浴锅中，35-37℃静置至少20 min后，真空冷冻干燥，获得菌粉；

所述制剂溶液的组分一包括以下质量百分数的组分：脱脂乳10~20%，海藻糖8~12％，麦芽糖糊精4~6％，L-谷氨酸钠2~4％和余量的水；

所述制剂溶液的组分二包括：2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL），所述2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）的加入体积相当于组分一的1~3%，组分二为5-10wt%的2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）水溶液；

所述菌粉的活菌数至少为1.23×10¹¹CFU/mL。

所述MRS培养基的配方如下：蛋白胨5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，柠檬酸氢二铵2.6 g，磷酸氢二钾2.0 g，乙酸钠5.0 g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25 g，Tween-80 1 mL；MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000 mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15 min，4℃保存备用。

所述MRS固体培养基的配方如下：蛋白胨10.0 g，牛肉膏8.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，乙酸钠5.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.04g，琼脂14.0 g，Tween-80 1 mL；MRS固体培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000 mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15 min，

放入60℃恒温水浴锅中备用。

所述真空冷冻干燥的工艺为：将处理好的菌悬液三放入超低温冰箱中进行预冻，预冻温度为-80℃，时间是2 h；预先开启真空冷冻干燥机，将预冻好的菌悬液三放到真空冷冻干燥机的隔板上，抽真空进行冷冻干燥，冻干机冷阱温度为-53.2℃，真空度为0.162mbar，时间为24 h。

所述PBS为0.1 mol/L，pH值6.8。

同时，本发明公开一种根据上述的制备方法获得的制剂。

同时，本发明公开一种上述的制剂在制备改善糖脂代谢紊乱引起的肝损伤的药物中的应用。

同时，本发明公开一种上述的制剂在制备改善糖脂代谢紊乱的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种副干酪乳杆菌JY062，属于食品微生物技术领域。本发明所用副干酪乳杆菌JY062制剂，制剂配方的组分一按总质量分数100%计：包括脱脂乳10~20%，海藻糖8~12％，麦芽糖糊精为4~6％，L-谷氨酸钠2~4％，其余为水；制剂配方的组分二为2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL），2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）的加入体积相当于组分一的1~3%；所述的2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）具有良好益生功能以及协同益生菌功效，可以提高制剂中副干酪乳杆菌JY062菌活力。本发明所用乳酸菌是从西藏乳制品分离出副干酪乳杆菌JY062，将其用于改善高糖高脂饮食诱导的糖脂代谢紊乱小鼠肝损伤；获得肝脏和血清样本，并检测脂肪因子和胰岛素水平和脂肪-胰岛素轴通路相关的基因表达，以评估副干酪乳杆菌JY062对糖脂代谢紊乱的影响；结果说明，副干酪乳杆菌JY062激活APN-AMPK信号通路的表达，下调脂代谢中SREBP-1c、ACC和FAS的表达，并上调糖代谢中GLUT-4和PGC-1α的表达，从而改善糖脂指标进而缓解肝脏损伤。

附图说明

图1为制剂的活菌数测量结果图；

图2 为小鼠体重和血糖变化图，其中，a）为小鼠体重，b）为小鼠血糖；

图3为小鼠糖耐量变化图，其中，a）为小鼠血糖值，b）为小鼠葡萄糖耐受性；

图4为小鼠脂肪因子和胰岛素变化图，其中，a）为瘦素值（LEP），b）为脂联素值（ADPN），c）为胰岛素值（INS），d）为胰高血糖素样肽-1值（GLP-1），e）为游离脂肪酸值（FFA）；

图5为小鼠肝脏中脂联素相关基因（AdipoQ和Adipor-2）、AMPK、脂代谢相关基因（SREBP-1c、FAS、ACC），糖代谢相关基因（GLUT-4、PGC-1α）的基因表达变化图，其中，a）为AdipoQ基因，b）为Adipor-2基因，c）为AMPK基因，d）为SREBP-1c基因，e）为FAS基因，f）为ACC基因，g）为GLUT-4基因，h）为PGC-1α基因；

图6为小鼠肝脏HE染色图，a）为N组小鼠肝脏；b）为HFD组小鼠肝脏；c）为LPL组小鼠肝脏；d）为LPM组小鼠肝脏；e）为LPH组小鼠肝脏；细箭头代表肝细胞水肿；粗箭头代表脂肪变性；

图7为小鼠胰腺HE染色图，a）为N组小鼠胰腺；b）为HFD组小鼠胰腺；c）为LPL组小鼠胰腺；d）为LPM组小鼠胰腺；e）为LPH组小鼠胰腺。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

本发明中，副干酪乳杆菌JY062的拉丁名为Lactobacillus paracasei JY062，保藏于东北农业大学乳品重点实验室，本发明中的副干酪乳杆菌JY062的现有技术来源为：一株高产胞外多糖降血糖副干酪乳杆菌JY062（TD062）的黏附性与耐受性评价[J].中国乳品工业，2022，50（4）。

实施例1

1.1实验试剂

（1）MRS培养基

用于培养副干酪乳杆菌JY062，培养基的配方如下：蛋白胨5.0 g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，柠檬酸氢二铵2.6 g，磷酸氢二钾2.0 g，乙酸钠5.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，Tween-80 1 mL；MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000 mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15 min，4℃保存备用。

（2）高脂高糖饲料

高脂高糖饲料由65%基础饲料、20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇、1%胆酸钠、1.5%鸡蛋麻油花生等混合调和剂组成。

（3）脂肪因子、胰岛素Elisa试剂盒（上海鑫乐）；PrimeScript TM RT reagentKit、SYBR Premix Ex TaqTM II（大连宝生物工程有限公司）。

（4）基因引物：

表1基因引物序列

1.2副干酪乳杆菌JY062培养

副干酪乳杆菌JY062以5%接种量接种至MRS培养基，37℃培养18 h后，三区划线于MRS固体培养基上，培养后挑取单菌落于MRS培养基中，传代培养两代后6000 r/min离心10min，收集发酵上清液，菌泥用PBS（0.1mol/L，pH值6.8）洗涤两次后，再用PBS重悬，使菌悬液活菌数达约10⁹CFU/mL。

1.3副干酪乳杆菌JY062制剂的制备

（1）制剂菌悬液的制备

优化组1：副干酪乳杆菌JY062按上述条件培养，使菌悬液活菌数达约10⁹CFU/mL，离心浓缩收集后，将制备好的制剂溶液（2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）已混入），加入到菌泥中充分混匀制成菌悬液。将菌悬液置于恒温水浴锅中，37℃静置20 min后无菌转入玻璃平皿中。

优化组2：副干酪乳杆菌JY062按上述条件培养，使菌悬液活菌数达约10⁹CFU/mL，离心浓缩收集后，将制备好的制剂溶液（2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）未混入），加入到菌泥中充分混匀制成菌悬液，再加入5wt%的溶解的2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）进一步混匀。将菌悬液置于恒温水浴锅中，37℃静置20 min后无菌转入玻璃平皿中。

具体地，制剂溶液的组分一包括以下质量百分数的组分：脱脂乳15%，海藻糖10％，麦芽糖糊精5％，L-谷氨酸钠3％和余量的水；

制剂溶液的组分二包括：2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL），所述2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）的加入体积相当于组分一的2%。

对照组：为不添加2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）的普通冻干保护剂，其他条件同优化组。

（2）真空冷冻干燥的方法

将制备好的菌悬液放入超低温冰箱中进行预冻，预冻温度为-80℃，时间是2 h。预先开启真空冷冻干燥机，将预冻好的样品迅速放到隔板上，抽真空进行冷冻干燥。冻干机冷阱温度为-53.2℃，真空度为0.162 mbar，时间为24 h。冻干结束后收集菌粉，测定菌粉中菌活。

（3）将冻干菌粉用无菌PBS溶液进行10倍系列梯度稀释，达到适宜梯度后取1 mL稀释液加入培养皿中，采用平板计数法测定活菌数，培养基为MRS琼脂。培养皿放置于37℃培养箱中培养48 h后进行数据统计。

（4）副干酪乳杆菌JY062制剂活菌数：根据图1可以看出，通过优化组2制剂方式所得到的活菌数更高，为1.23×10¹¹CFU/mL，具有良好的应用效果。

1.4小鼠实验方案

实验选用60只雄性C57BL/6J小鼠，鼠龄为三周左右，随机分为5组： N：（正常组）、HFD：模型组、LPH：高剂量副干酪乳杆菌JY062制剂组、LPM：中剂量副干酪乳杆菌JY062制剂组和LPL：低剂量副干酪乳杆菌JY062制剂组。鼠房温度为22±2℃，湿度为55±5%，12 h昼夜交替，基础饲料适应性喂养一周。从第二周开始，HFD、LPL、LPM和LPH组喂养高脂高糖饲料。造模三周后，测定小鼠随机血糖，血糖值高于11.1 mmol/L的为模型成功小鼠。然后每天上午9:00，LPH、LPM和LPL组以10 mL/kg的剂量分别灌胃10⁹、10⁸和10⁷CFU/mL的副干酪乳杆菌JY062菌悬液，N和HFD组灌胃相同剂量的生理盐水。

本实施例中，菌粉中的活菌数为1.23×10¹¹ CFU/mL，在菌粉中加入生理盐水梯度稀释至10⁹、10⁸和10⁷CFU/mL；配制后的菌悬液灌胃。

1.5小鼠体重测定

从第一周开始至实验结束，每周测定小鼠体重并记录。

结果：饲养期间各组小鼠的体重变化情况从图2 a）中可以看出，N组小鼠在饲养期间一直是正常饮食，该组小鼠的体重呈现先增加后趋于平缓的趋势。在试验第二周至第四周，与N组相比，其他几组小鼠体重增加，且高于正常饮食的小鼠体重，在试验第四周时，HFD组小鼠体重达到25.5 g，较N组体重增加了45.50%，在试验第五周至十一周，HFD组小鼠体重持续上升，而灌胃副干酪乳杆菌JY062的LPL组、LPM组、LPH组的小鼠体重增速变缓，小鼠体重增加量显著低于HFD组，在试验第十一周末，与试验第四周的体重相比，LPL组、LPM组、LPH组的体重增量分别是4.025 g、3.57 g、3.07 g，低于HFD组的4.4 g（P<0.05）。综上所述，副干酪乳杆菌JY062具有缓解糖脂代谢紊乱小鼠体重增加的作用，且高剂量的副干酪乳杆菌JY062的作用效果更显著。

1.6小鼠血糖和口服糖耐量测定

1.6.1小鼠血糖实验：从第一周开始至实验结束，每周固定时间测定小鼠的体重和餐前空腹血糖（Fasting plasma glucose，FBG），测定前小鼠隔夜禁食不禁水，取尾部血液，测定其FBG值。结果如图2 b）所示，试验期间各组小鼠的空腹血糖变化情况。从图中可以观察到，N组小鼠在整个试验期血糖水平稳定。在试验第二周至第四周，与N组相比，其他几组的小鼠血糖无差异；在试验第五周，HFD组小鼠血糖显著升高，达到8.83 mmol/L，这表明饲喂高脂高糖饲料后，小鼠的糖代谢发生改变。在试验的五-十一周，HFD组小鼠一直处于高血糖水平状态。在试验的五-七周，LPL组、LPM组以及LPH组的血糖水平与HFD组相比，虽低于HFD组的血糖水平但差异不大，而在试验的第八周-第十一周，与HFD组相比，LPL组、LPM组以及LPH组的血糖水平下降。在试验第十一周结束时，LPL组、LPM组以及LPH组的血糖水平分别为7.44 mmol/L、7.00 mmol/L和6.29 mmol/L，而HFD组血糖水平为9.17 mmol/L。

1.6.2小鼠口服糖耐量实验：在第十一周实验结束，小鼠隔夜禁食不禁水12 h，选取3只小鼠给予40%的葡萄糖溶液，按照5 mL/kg体积灌胃，灌胃标准为葡萄糖2 g/kg。分别于空腹及糖负荷30 min、60 min、120 min测定小鼠血糖值，并计算葡萄糖曲线下面积（areaunder the curve，AUC）。

从图3 a）中可以看出，N组小鼠在灌胃葡萄糖后血糖代谢正常，血糖水平先逐渐升高，在30 min时达到峰值，最高血糖值为12.06 mmol/L，随后其值快速下降并在2 h时接近正常血糖值（6.83 mmol/L）。表明N组小鼠胰岛细胞功能正常，且机体对血糖的调节能力良好。然而在高糖高脂饮食干预的HFD、LPL、LPM和LPH组小鼠中，在灌胃葡萄糖后，血糖水平急速升高，在30 min时达到峰值，分别为18.6 mmol/L，17.0 mmol/L，16.7 mmol/L，14.7mmol/L，和N 组相比均具有显著性差异（P<0.05）。在30 min后小鼠的血糖值呈缓慢下降趋势，2 h时各组小鼠的血糖值并未恢复至初始水平，HFD组小鼠血糖浓度仍处于高水平，为12.6 mmol/L，而LPL、LPM和LPH组的小鼠血糖值显著低于HFD组小鼠血糖值（P<0.05），2 h时LPL组小鼠的血糖值达到11.07 mmol/L，LPM组小鼠的血糖值达到9.53 mmol/L，LPH组小鼠的血糖值达到7.77 mmol/L。该结果说明了副干酪乳杆菌JY062显著抑制糖脂代谢紊乱小鼠灌胃葡萄糖后血糖的异常升高，可使胰岛细胞功能正常化，且这种作用呈现剂量依赖性，高剂量的副干酪乳杆菌JY062的作用效果最好。

根据口服糖耐量曲线，做峰曲线下面积（AUC），AUC可以用来表示糖耐量受损程度，AUC数值越大则糖耐量受损程度越严重，结果如图3 b）所示。从图中可以看出，HFD组的AUC值显著高于N组。与N组相比，HFD组AUC值增长了62.41%（P<0.05），这表明HFD组小鼠血糖代谢异常，糖耐量能力受损。而LPL、LPM和LPH组的AUC值与HFD组相比，显著降低（P<0.05），且LPH组AUC值最低，与HFD组相比，降低了27.08%。该结果表明副干酪乳杆菌JY062在一定程度上增强糖脂代谢紊乱小鼠机体对葡萄糖的耐受性，且这种作用呈现剂量依赖性，高剂量的副干酪乳杆菌JY062的作用效果最好。

1.7小鼠脂肪因子、胰岛素测定

实验结束时，五组小鼠均隔夜禁食12 h后，称重，眼球取血，血液样品在4℃条件下3000×g离心10 min，收集血清，并依据试剂盒说明书测定其含量。

结果：如图4所示，经过高糖高脂饮食喂养后，与N组小鼠相比，HFD组小鼠的瘦素（LEP）、胰岛素（INS）、以及游离脂肪酸（FFA）含量显著升高（P<0.05），分别升高了143%、117%和68.8%，而脂联素（ADPN）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）含量显著下降（P<0.05），下降了64.25%和71.02%，而在LPL、LPM和LPH组中，与HFD组相比，瘦素（LEP）、胰岛素（INS）和游离脂肪酸（FFA）含量显著下降，脂联素（ADPN）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）含量显著上升（P<0.05）；其中，LPH组效果最好，与HFD组相比，瘦素（LEP）、胰岛素（INS）和游离脂肪酸（FFA）含量下降了54.34%、39.95%和40.68%，脂联素（ADPN）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）含量分别升高了153%和135%(P<0.05)。

1.8小鼠肝脏组织的定量PCR分析

根据试剂盒说明书提取小鼠肝脏组织中mRNA，并反转录成cDNA，然后将得到的cDNA根据下表2反应体系和反应条件反应。

表2 Real-time RT-PCR反应体系

表3 Real-time RT-PCR反应条件

结果：如图5所示，与N组小鼠相比，经过高糖高脂饮食喂养后，HFD组小鼠肝脏中脂联素相关基因（AdipoQ和AdipoR-2）、AMPK、糖代谢相关基因（GLUT-4和PGC-1α）的基因相对表达量显著下调（P＜0.05），而脂代谢相关基因（SREBP-1c、ACC 和FAS）的基因相对表达量显著上调（P＜0.05）。在LPL、LPM和LPH组中，与HFD组相比，脂联素相关基因（AdipoQ和AdipoR-2）、AMPK、糖代谢相关基因（GLUT-4和PGC-1α）的基因相对表达量显著上调（P＜0.05），脂代谢相关基因（SREBP-1c、ACC和FAS）的基因相对表达量显著下调（P＜0.05），其中LPH组效果最好，脂联素相关基因（AdipoQ和AdipoR-2）、AMPK、糖代谢相关基因（GLUT-4和PGC-1α）的基因相对表达量分别上调了182%、202%、384%、138%和185%（P＜0.05），脂代谢相关基因（SREBP-1c、ACC 和FAS）的基因相对表达量分别下调了47.2%、44.6%和50.9%（P＜0.05）

1.9小鼠肝脏和胰腺HE染色

将小鼠肝脏和胰腺组织固定4%多聚甲醛溶液中24 h，然后脱水、清除、石蜡包埋、切片和染色（H&E）。然后在光学显微镜下对样品进行成像，并对组织学进行了检查。

结果：N组小鼠肝组织结构轻度异常，部分肝细胞轻度水肿，胞核清晰，胞质呈空泡化，如图6细箭头所示；肝实质内未见炎症细胞浸润和脂肪变性；HFD组小鼠肝组织结构重度异常，大面积肝细胞脂肪变性，可见大量大小不一的脂滴，如图6细箭头所示；部分细胞重度水肿，细胞肿胀，胞质呈空泡化，如图6粗箭头所示。与HFD组相比，不同剂量的副干酪乳杆菌JY062制剂干预后，肝细胞的水肿和脂肪变性程度减轻，肝细胞排列均匀化，肝脏细胞间隙减小，且LPH组效果最好，与N组小鼠的肝细胞状态近似。

如图7所示，N组小鼠胰腺组织结构清晰，未见空泡化和炎症细胞浸润；胰岛成球形细胞团样结构，分布在腺泡之间，与周围腺体界限清晰，胰岛内细胞排列规则，细胞密度较高，胞质丰富；HFD组小鼠胰岛分布在腺泡之间，与周围腺体界限不清晰，胰岛数量也明显减少，可见大量炎症细胞浸润，图7 b）、7 c）中箭头所示。与HFD组相比，不同剂量的副干酪乳杆菌JY062制剂干预后，胰岛细胞排列逐渐规则，胰岛数量也逐渐增多，胰岛与周围腺体界限逐渐清晰，M组出现部分毛细血管扩张现象，如图7 d）箭头所示。说明副干酪乳杆菌JY062对糖脂代谢紊乱小鼠的胰腺具有修复作用，且呈剂量依赖，LPH组的作用效果最为明显。

本发明选用的副干酪乳杆菌JY062制剂具有调控脂肪-胰岛素轴上脂肪因子和胰岛素水平能力，并通过APN-AMPK通路，下调脂代谢中SREBP-1c、ACC和FAS的表达，并上调糖代谢中GLUT-4和PGC-1α的表达来改善糖脂紊乱，进而对肝脏损伤起到缓解作用。副干酪乳杆菌JY062制剂可应用于糖脂代谢紊乱引起的多器官损伤的缓解和预防中，为开发安全有效且生产储存容易的具有缓解糖脂代谢紊乱引起的肝脏损伤益生菌相关产品提供了理论参考。

实施例2

本实施例的目的是为了提供一种副干酪乳杆菌JY062制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，将副干酪乳杆菌JY062（Lactobacillus paracasei JY062）以5%接种量接种至MRS培养基，32℃培养16 h后，三区划线于MRS固体培养基上，培养后挑取单菌落于MRS培养基中，传代培养两代后8000r/min离心20 min，收集发酵上清液，菌泥用PBS洗涤，PBS为0.1mol/L，pH值6.8，洗涤三次后，再用PBS重悬，使菌悬液活菌数达10⁹CFU/mL；

步骤四，将菌悬液三置于恒温水浴锅中，35℃静置30 min后，真空冷冻干燥，获得菌粉；

所述制剂溶液的组分一包括以下质量百分数的组分：脱脂乳10%，海藻糖8％，麦芽糖糊精4％，L-谷氨酸钠2％和余量的水；

所述制剂溶液的组分二包括：2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL），所述2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）的加入体积相当于组分一的1%，组分二为10wt%的2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）水溶液；

所述菌粉的活菌数为10¹¹CFU/mL。

MRS培养基的配方如下：蛋白胨5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0 g，柠檬酸氢二铵2.6 g，磷酸氢二钾2.0 g，乙酸钠5.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，Tween-80 1 mL；MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000 mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15 min，4℃保存备用。

MRS固体培养基的配方如下：蛋白胨10.0 g，牛肉膏8.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，乙酸钠5.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.04g，琼脂14.0 g，Tween-80 1 mL；MRS固体培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000 mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15 min，

放入60℃恒温水浴锅中备用。

真空冷冻干燥的工艺为：将处理好的菌悬液三放入超低温冰箱中进行预冻，预冻温度为-80℃，时间是2 h；预先开启真空冷冻干燥机，将预冻好的菌悬液三放到真空冷冻干燥机的隔板上，抽真空进行冷冻干燥，冻干机冷阱温度为-53.2℃，真空度为0.162 mbar，时间为24 h。

根据本实施例所述的制备方法获得的制剂。

根据本实施例所述的制剂在制备改善糖脂代谢紊乱引起的肝损伤的药物中的应用。

根据本实施例所述的制剂在制备改善糖脂代谢紊乱的药物中的应用。

实施例3

本实施例与实施例2的区别仅在于：组分一包括以下质量百分数的组分：脱脂乳20%，海藻糖12％，麦芽糖糊精6％，L-谷氨酸钠4％和余量的水；

所述制剂溶液的组分二包括：2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL），所述2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）的加入体积相当于组分一的3%，组分二为8wt%的2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）水溶液。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种副干酪乳杆菌JY062制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述制剂溶液的组分二包括：2'-岩藻糖基乳糖，所述2'-岩藻糖基乳糖的加入体积相当于组分一的1~3%，组分二为5-10wt%的2'-岩藻糖基乳糖水溶液；

所述菌粉的活菌数至少为1.23×10¹¹CFU/mL。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述MRS培养基的配方如下：蛋白胨5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，柠檬酸氢二铵2.6 g，磷酸氢二钾2.0 g，乙酸钠5.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，Tween-80 1 mL；MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取各组分定容于1000 mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15 min，4℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述MRS固体培养基的配方如下：蛋白胨10.0 g，牛肉膏8.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.04 g，琼脂14.0 g，Tween-80 1 mL；MRS固体培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取各组分定容于1000 mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15 min，

放入60℃恒温水浴锅中备用。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥的工艺为：将处理好的菌悬液三放入超低温冰箱中进行预冻，预冻温度为-80℃，时间是2 h；预先开启真空冷冻干燥机，将预冻好的菌悬液三放到真空冷冻干燥机的隔板上，抽真空进行冷冻干燥，冻干机冷阱温度为-53.2℃，真空度为0.162 mbar，时间为24 h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PBS为0.1 mol/L，pH值6.8。

6.根据权利要求1~5任意一项所述的制备方法获得的制剂。

7.根据权利要求6所述的制剂在制备改善糖脂代谢紊乱的药物中的应用。

8.根据权利要求6所述的制剂在制备改善糖脂代谢紊乱引起的肝损伤的药物中的应用。