CN117357692B

CN117357692B - 一种原位固化成型水凝胶及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN117357692B
Application number: CN202311665426.4A
Authority: CN
Inventors: 张晨; 钟国峰; 郭鹏; 瞿燕; 曾锐; 苟恺军; 王潇
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2023-12-06
Filing date: 2023-12-06
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2043-12-06
Also published as: CN117357692A

Abstract

本发明提供了一种原位固化成型水凝胶及其制备方法和用途，属于生物医用材料技术领域。本发明水凝胶前驱体液由分开存放的两个组分组成，组分A由如下质量百分比的原料组成：甲基丙烯酸化壳聚糖1.0‑2.0%，阿魏酸0.1‑1%，苯基磷酸盐0.1‑0.5%，余量为溶剂；组分B由如下质量百分比的原料组成：氧化白及多糖1‑10%，余量为溶剂。将两个组分混合后形成的水凝胶能完全契合在大面积宽阔且形状不规则的动态伤口之上，发挥抗菌、抗炎、促进伤口愈合的功效。此外，阿魏酸的加入可以改善水凝胶的韧性，能够伴随各种运动形态进行改变，完全适应动态伤口。本发明水凝胶的两个组分可分开存在，使用时依次喷洒于伤口上发挥效果，方便携带，成本低，在伤口护理中具有良好的应用前景。

Description

一种原位固化成型水凝胶及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种原位固化成型水凝胶及其制备方法和用途。

背景技术

人体表面与外界接触的最大器官是皮肤。它具有抵抗微生物、调节体温和抵抗外界环境刺激的功能。在外界因素影响情况下，皮肤受到损伤的风险也是整个人体组织器官当中最大的，同时在面临外界恶劣的环境情况下，皮肤创面可能会发生发炎、感染等情况，皮肤愈合也会因此变得缓慢，从而失去其功能。因此为了更好治疗伤口，则需要提供具有抗菌、抗炎和促进愈合特性的伤口敷料。

水凝胶伤口敷料是一种新型的伤口敷料，它以高含水量的亲水性高分子凝胶为主要成分。一方面，水凝胶能够为伤口创造潮湿的环境，从而促进伤口愈合。另一方面，通过将功能性聚合物结合到水凝胶的三维网络中，水凝胶具有各种功能，如粘附和自修复已经能满足生物医学的需求。在众多水凝胶中，由氧化葡聚糖或由葡萄糖/甘露糖组成的多糖（如魔芋多糖、白及多糖与壳聚糖）交联形成的水凝胶表明了其作为伤口敷料的某些优势。如公开号为CN112494713A的专利申请公开了使用氧化白及多糖和壳聚糖可以制备得到复合水凝胶，该水凝胶有一定抗菌活性和促进伤口愈合。但该水凝胶只能适用于普通小面积伤口，且无法固化黏附在伤口组织周围，其次无法适用于大面积宽阔且形状不规则的动态伤口，并且其力学性能较差，易碎不易携带。

如何提供一种抗菌活性、促进伤口愈合效果优异，适用于大面积宽阔且形状不规则的动态伤口，以及力学性能好、便于携带的水凝胶需要进一步研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种原位固化成型水凝胶及其制备方法和用途。

本发明提供了一种原位固化成型水凝胶产品盒，它是由分开存放的两个组分组成：

组分A由如下质量百分比的原料组成：甲基丙烯酸化壳聚糖1.0-2.0%，阿魏酸0.1-1%，苯基磷酸盐0.1-0.5%，余量为溶剂；

组分B由如下质量百分比的原料组成：氧化白及多糖1-10%，余量为溶剂。

进一步地，前述的原位固化成型水凝胶产品盒是由分开存放的两个组分组成：

组分A由如下质量百分比的原料组成：甲基丙烯酸化壳聚糖2 %，阿魏酸0.8%，苯基磷酸盐0.25%，余量为溶剂；

组分B由如下质量百分比的原料组成：氧化白及多糖2%，余量为溶剂。

进一步地，

组分A中，所述苯基磷酸盐为苯基磷酸锂盐；

和/或，组分A中，所述溶剂为水；

和/或，组分B中，所述溶剂为水。

进一步地，组分A中，所述甲基丙烯酸化壳聚糖的制备方法包括如下步骤：

将壳聚糖溶解在溶剂中，在壳聚糖溶液中加入甲基丙烯酸酐，反应后透析，冷冻干燥，即得；

所述壳聚糖溶解在溶剂中后，浓度为1~5%；

和/或，所述溶剂为1%乙酸溶液；

和/或，所述甲基丙烯酸酐和壳聚糖溶液的体积比为1:100；

和/或，所述反应的温度为20~30℃；所述反应的时间为24~48小时；

和/或，所述透析时，透析袋的截留分子量为4.0-8.0 kDa；

和/或，所述透析时，透析液为水；

和/或，所述透析的时间为1~3天。

进一步地，组分B中，所述氧化白及多糖的制备方法包括如下步骤：

1）将白及多糖和NaIO₄分别溶解在溶剂中，得到白及多糖溶液和NaIO₄溶液；

2）将白及多糖溶液和NaIO₄溶液混合反应后，加入乙二醇终止反应；

3）将反应液透析，冷冻干燥，即得。

进一步地，

步骤1）中，所述白及多糖由甘露糖和葡聚糖组成，甘露糖和葡聚糖的摩尔比为2.946:1；

和/或，步骤1）中，所述白及多糖和NaIO₄的摩尔比为0.4：1；

和/或，步骤1）中，所述溶剂为水；

和/或，步骤2）中，所述将白及多糖溶液和NaIO₄溶液混合后搅拌10~20h；

和/或，步骤2）中，所述反应的温度为20~30℃；所述反应的时间为8~12小时；

和/或，步骤3）中，所述透析时，透析袋的截留分子量为3.5 kDa；

和/或，步骤3）中，所述透析时，透析液为水；

和/或，步骤3）中，所述透析的时间为1~3天。

进一步地，所述白及多糖的制备方法包括如下步骤：

（1）白及药材打粉后使用脱脂；

（2）脱脂后的白及药材干燥后加入水提取，过滤，得提取物；

（3）提取物中加入Sevage试剂去除蛋白质，收集水相，采用醇溶液沉淀，沉淀物洗涤后干燥，即得；

步骤（1）中，所述脱脂分别用料液比为1g:5~10mL的95%乙醇和石油醚在70~90℃脱脂2~5小时；

和/或，步骤（2）中，所述白及药材和水的料液比为1g:40~60mL；

和/或，步骤（2）中，所述提取的温度为70~90℃，提取的时间为1~5h；

和/或，步骤（3）中，所述醇溶液为95%乙醇。

本发明还提供了一种水凝胶，它是取前述的原位固化成型水凝胶产品盒，将组分A和组分B混合，即得。

进一步地，组分A和组分B分别放于喷瓶中，先喷射其中一个组分，然后再喷射另一个组分后得到水凝胶；

或者，将组分A和组分B直接混合后得到水凝胶；

所述组分A和组分B的体积比为1:1。

本发明还提供了前述的原位固化成型水凝胶产品盒或前述的水凝胶在制备创面修复材料中的用途。

本发明提供了一种抗菌、抗炎、促进伤口愈合的低成本便携式水凝胶，用于各种创面的愈合。该水凝胶由两个组分组成，使用时先向伤口喷洒一种组分，然后喷洒另一种组分，即可形成水凝胶，再通过光照凝胶会固化于创面之上。

本发明组分A为改性后的甲基丙烯酸化壳聚糖-阿魏酸混合溶液(CSMA-FA)。壳聚糖是一种天然多糖，多数从甲壳类动物的外壳当中提取，其具有良好的生物相容性、可降解性、抗菌、抗炎、促进创面愈合，并且同时壳聚糖具有许多活泼官能团，其化学结构简单并易与其他功能相结合，然而水溶性较差，因此将壳聚糖对其进行光敏基团的结构修饰，使其具有良好的水溶性以及光固化性能。阿魏酸是一种天然小分子，存在于诸多的天然植物当中，具有低毒性，它具有许多良好的生理活性（促愈合、延缓皮肤衰老、抗辐射、抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌和抗糖尿病作用等功效已被报道），并且它价廉易得，已经广泛用于制药、食品和化妆品行业。本发明中阿魏酸除了具备药理活性，还能显著改善水凝胶的力学性能，提高水凝胶的黏附性，并且能够让水凝胶在不同的运动方式下保持原有形态。

本发明组分B为氧化白及多糖(OBSP)，是天然中草药植物白及当中提取的一种天然可溶性聚合物，由α-甘露糖、β-甘露糖和β-葡萄糖组成，具有止血、促进创面愈合、抗溃疡、抗炎等药理活性。并且白及多糖还是一种天然无毒、无刺激的高分子材料，具有良好的生物相容性和黏附性，其在粘合剂、伤口敷料和其他医学生物材料的制作当中具有重要的作用。

与现有技术相比，本发明水凝胶的优势为：

（1）水凝胶的制备成本较低，材料易获得，来源广泛，且均为天然动植物，均具有良好的生物活性以及良好的生物安全性。

（2）水凝胶方便易携带，易储存，使用方便，适用于各种环境当中，针对使用的人群广泛，适用于各种皮肤伤口以及运动中的伤口（创面形状不规则、术后创伤、深度创伤等）。

（3）能够减少绷带纱布等使用，减少伤口感染的可能性，并且水凝胶能直接长时间固化于伤口之上，具有抗炎、抗菌、促愈合迅速固化从而封闭伤口的作用。

（4）组分A和组分B可交替使用，使用组分A喷涂均匀覆盖在伤口上后随后立即喷涂组分B，两者使用不分先后，顺序相反亦可（注：二者均需相互配合使用，不可单用），均会在伤口上自组装形成水凝胶，最后再通过光照凝胶会固化于创面之上。

综上，本发明提供了一种原位固化成型水凝胶及其制备方法和用途，该水凝胶由两个组分混合后而得，组分A由甲基丙烯酸化壳聚糖和阿魏酸组成，组分B为氧化白及多糖，将组分A和组分B混合后可形成水凝胶，能完全契合在大面积宽阔且形状不规则的动态伤口之上，同时发挥抗菌、抗炎、促进伤口愈合的功效。此外，阿魏酸的加入可以改善水凝胶的韧性，能够伴随各种运动形态进行改变，能完全的适应动态伤口。本发明水凝胶的两个组分可分开存在，使用时依次喷洒于伤口上发挥效果。本发明水凝胶方便携带，低成本，在伤口护理中具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明水凝胶和制备水凝胶的原料的表征结果图：A为壳聚糖（CS）和甲基丙烯酸化壳聚糖（CSMA）的¹H-NMR核磁共振谱图；B为白及多糖（BSP）和氧化白及多糖（OBSP）的¹H-NMR核磁共振谱图；C为CS、BSP、CSMA、OBSP的红外光谱图：D为阿魏酸（FA）、CSOB水凝胶（CSOB）、CSOB-FA水凝胶（CSOB-FA）的红外光谱图；E为水凝胶小瓶倒置图；F为不同浓度CSMA溶液与OBSP溶液不同体积比制备的水凝胶的小瓶倒置图。

图2为水凝胶注射和喷射形状适应图：A为水凝胶注射图，图A中1为水凝胶在水中开始注射时的图，2为水凝胶注射5s时的图，3为水凝胶注射10s时的图，4为水凝胶注射20s时的图；B为水凝胶注射形成“CDUTCM2026”的图；C为水凝胶喷射后形成不同形状图。

图3为水凝胶流变性、自愈合及黏附性图：A为CSMA水凝胶流变数据图；B为CSOB^1st水凝胶流变数据图；C为CSOB水凝胶流变数据图；D为CSOB-FA^1st水凝胶流变数据图；E为CSOB-FA水凝胶流变数据图；F为CSOB-FA水凝胶自愈合数据图；G为CSOB^1st水凝胶和CSOB-FA^1st水凝胶黏附性测试图；H为CSMA、CSOB水凝胶和CSOB-FA水凝胶黏附性测试图；I为CSOB-FA水凝胶自愈合宏观图，图I中1为CSOB-FA水凝胶初始未剪切图，2为CSOB-FA水凝胶剪切后分离图，3为CSOB-FA水凝胶剪切愈合后的图，4为CSOB-FA水凝胶剪切愈合后单侧拉伸图，5为CSOB-FA水凝胶剪切愈合后两侧拉伸图。

图4为力学性能结果图：A为CSOB水凝胶和CSOB-FA水凝胶压缩强度结果图；B为CSOB-FA水凝胶的拉伸图，图B中1为CSOB-FA水凝胶初始拉伸距离图，2为CSOB-FA水凝胶拉伸1cm图，3为CSOB-FA水凝胶拉伸2cm图；C为CSOB-FA水凝胶指关节弯曲图；D为CSOB-FA水凝胶在猪皮上扭曲以及在水中扭曲的图；E为不同打光时间对CSOB-FA水凝胶压缩强度的影响图，其中CSOBFA-10S表示打光时间为10s得到的CSOB-FA水凝胶，CSOBFA-15S表示打光时间为15s得到的CSOB-FA水凝胶，CSOBFA-30S表示打光时间为30s得到的CSOB-FA水凝胶，压缩强度的单位为KPa。

图5为CSMA水凝胶、CSOB水凝胶和CSOB-FA水凝胶的溶胀比和保水性结果图：A为保水性结果图；B为溶胀比结果图。

图6为各水凝胶体外抗菌结果图：A为抗菌结果图；B为抗菌率结果图。

图7为各水凝胶生物相容性结果图：A为各水凝胶细胞毒性结果图；B为CSOB-FA水凝胶培养48小时的细胞形态图；C为各水凝胶血液相容性结果图。

图8为各水凝胶抗氧化结果图。

图9为各水凝胶止血性能结果图，图中数据是失血量，单位是mg。

图10为各水凝胶促进伤口愈合结果图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

本发明中，室温的温度为20~30℃。

实施例1、本发明原位固化成型水凝胶的制备

1、组分A：

（1）甲基丙烯酸化壳聚糖（CSMA）的制备

将1g壳聚糖（CS）粉末溶解在100 mL 1%乙酸溶液（99 mL纯水与1 mL冰乙酸混合的溶液）中，搅拌均匀直至溶解（壳聚糖的浓度是1g/100mL），随后加入1 mL甲基丙烯酸酐（含量98%），室温搅拌24h，反应后放入透析袋中（MWCO: 4.0-8.0 kDa），透析液为纯水，在室温下循环透析3天，冷冻干燥，最后得到固体CSMA。

（2）甲基丙烯酸化壳聚糖-阿魏酸（CSMA-FA）的制备

将200mg的CSMA、80mg的阿魏酸（FA）和25mg的苯基磷酸锂盐（简称：LAP，纯度为98%）溶于10mL的纯水当中，搅拌均匀直至溶解，即得到组分A：CSMA-FA溶液（使用时，称取的质量可变，浓度不可变，CSMA浓度为2%、FA浓度为0.8%、苯基磷酸锂盐浓度为0.25%）。

2、组分B：

（1）白及多糖（BSP）的制备

将干燥的白及药材打粉，所得粉末过50目筛，称取100g的白及粉末，按照料液比1:5（g/mL）分别用乙醇（95%）和石油醚在70 ℃下脱脂2次，每次2h。将脱脂后的药材粉末，经过自然干燥24小时，重新称定重量，按照料液比1:40（g/mL）将粉末加入去离子水中在70℃下搅拌2h，过滤，浓缩提取物。加入1/3的Sevage试剂去除蛋白质，收集水相，后加入95%乙醇，醇沉多糖，4℃冷藏处理12 h，过滤，将沉淀物洗涤，随后在40-50℃下真空干燥72h，得到BSP。采用反相高效液相色谱法和高效凝胶渗透色谱法测定BSP的单糖含量和纯度。

（2）氧化白及多糖（OBSP）的制备

以碘酸钠为氧化剂制备氧化白及多糖（OBSP）。精密称取3.00 g的BSP加入到50.0ml去离子水当中，搅拌均匀直至溶解，得BSP溶液。按照BSP与NaIO₄摩尔比为0.4：1的比例，精密称定1.44 g的NaIO₄加入到50.0 ml的纯水当中，得NaIO₄溶液。将BSP溶液和NaIO₄溶液混合搅拌12 h。加入2ml乙二醇终止反应，反应后的体系放入透析袋(MWCO: 3.5 kDa)，透析液为纯水，在室温下循环透析3天。最后通过冷冻干燥得到OBSP。

随后将200mg OBSP溶解于10mL的纯水中，得到组分B：浓度为2%的OBSP溶液（此处为质量百分比）。

3、原位喷射固化水凝胶的制备

（1）CSMA水凝胶的制备

以纯水为溶剂，将200mg CSMA固体溶解在10ml的纯水当中，随后通过打光（光的波长为320-405nm）15s后，形成CSMA凝胶。

（2）CSOB水凝胶的制备

以纯水为溶剂，将OBSP配制得到浓度为2%（质量百分比）的OBSP溶液（组分B）。以纯水为溶剂，将CSMA配制得到浓度为1%、2%、3%的CSMA溶液（组分A）。将组分A和组分B按照体积比1：1混合后，得到不同浓度的CSOB^1st水凝胶。随后通过光交联15s（光的波长为320-405nm），得到CSOB水凝胶，CSOB水凝胶密封放置在4℃冰箱当中保存。

（3）CSOB-FA水凝胶的制备

由于阿魏酸（FA）的安全使用浓度在0.1~1.0%（质量百分比）之间，因此本发明FA的浓度为0.8%。按照1（2）的方法制备得到组分A（CSMA-FA溶液），按照2（2）的方法制备得到组分B（OBSP溶液），将组分A和组分B分别装入喷瓶当中，按照体积比1:1分别喷射组分A和组分B，将组分A和组分B混合后形成CSOB-FA^1st水凝胶，再经过可见光（320-405 nm）的照射，对水凝胶进行15s光固化，形成CSOB-FA水凝胶。

上述各组分A和组分B可以直接混合，也可以分别装入喷瓶后喷射使用。

以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。

试验例1、材料表征

1、实验方法

¹H-NMR核磁共振：称取BSP、OBSP、CS和CSMA（实施例1制备），分别将其溶解在重水中，通过光谱仪(德国布鲁克公司，AVANCE NEO 600MHz)进行分析检测，以此确保OBSP和CSMA的成功合成。

FTIR红外光谱：使用Spectrum One傅里叶转换红外光谱仪(PerkinElmer，USA)进行FTIR光谱测量。采用KBr圆盘法测定OBSP、CS、FA、CSOB水凝胶冻干固体和CSOB-FA水凝胶冻干固体（实施例1制备）。所有样品的波长扫描范围在400 ~ 4000 cm^-1之间进行，平均每个样品进行32次扫描，分辨率为4 cm^-1。

通过试管倒置试验来确认实施例1中水凝胶的形成。

2、实验结果

BSP是由甘露糖和葡聚糖组成的一种杂多糖，甘露糖和葡聚糖的摩尔比为2.946:1。通过苯酚-硫酸法测定了BSP的总碳水化合物含量为63.46%。根据高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定，BSP的Mw和Mn分别为1.16×10⁵g/mol -3.99×10⁵g/mol和7.09×10⁴g/mol -1.12×10⁵g/mol；将BSP进行氧化反应得到OBSP，同时通过反应将甲基丙烯酸酯基团引入CS(MW：100000-200000)，合成了可光交联的CSMA，如图1A和1B所示，通过质子核磁共振（¹H-NMR）证实了OBSP的成功的氧化以及CSMA的成功的偶联，结果证明了OBSP在δ9.28ppm附近出现了一个醛基的低强度峰，证明了BSP当中部分羟基被成功氧化成了醛基(-CHO)，同时信号峰的强弱能反应出OBSP当中的氧化程度，这是由于通过氧化反应后获得的醛基，表明白及多糖的氧化反应成功进行，生成了醛基化的白及多糖。在CSMA当中甲基丙烯酸酯峰分别位于δ5.34 ppm和δ5.65 ppm（甲基丙烯酰胺基团的丙烯酸质子）。

随后通过傅里叶红外光谱（图1C和1D）对此实验结果进行验证，在BSP及OBSP波数4000~400 cm^-1处为典型的多糖主导信号，波数3399 cm^-1处长而宽的吸收峰是多糖的羟基O-H伸缩振动峰，波数2927 cm^-1的弱吸收峰是C-H的伸缩振动峰，波数1151 cm^-1、1062 cm^-1、和1031 cm^-1表现出吡喃糖的存在。OBSP于1735 cm^-1处出现加强的羰基(C=O)伸缩振动吸收峰，此峰表明BSP经氧化后其分子上的部分羟基变为醛基。CSMA的红外图谱上，838 cm^-1处为C=C上C-H的面外弯曲振动峰，另外与CS相比，在1598 cm^-1处的-NH2的伸缩振动吸收峰消失，而在1550 cm^-1、1234 cm^-1处分别出现了酰胺Ⅱ、Ⅲ带的特征吸收峰，C=C吸收峰的出现，氨基吸收峰的消失与酰胺键吸收峰的形成也表明MA和CS上的氨基发生了酰化反应。通过比较OBSP、CSMA、FA、CSOB、CSOB-FA水凝胶的红外光谱图可以看出：1735 cm^-1处属于OBSP的C=O的对称振动峰明显减弱，1643 cm^-1处出现属于C=N的吸收峰，表明氧化白及多糖的-CHO基团和壳聚糖的-NH2基团之间发生席夫碱反应，即生成Schiff键。对于FA，CSOB-FA中1695 cm^-1处的-COOH特征峰明显减弱，说明FA的-COOH-与CSMA的-NH2发生静电作用，导致CSOB质子化氨基振动峰蓝移，提示水凝胶交联反应成功。小瓶倒置实验如图1E所示，说明水凝胶的成功形成。

由图1F所示，当CSMA和OBSP混合交联时，固定OBSP浓度为2%(w/v)，CSMA浓度为1%(w/v)时，CSMA溶液虽然能够满足喷射条件，但是制备得到的水凝胶机械强度较差，透明度较差，且有部分溶液无法参与反应，CSMA浓度为3%(w/v)时，CSMA溶液粘性较大，难以进行喷射，不方便使用，CSMA浓度为2%(w/v)时，CSMA溶液能够满足喷射条件，且制备得到的水凝胶呈果冻状，机械强度好。因此，当2%(w/v)OBSP溶液与2%(w/v)CSMA溶液体积比为1:1时，为制备CSOB水凝胶的最佳配方。OBSP溶液和CSMA溶液作为水凝胶的前驱液，可放置在4℃冰箱中进行保存备用。由图1F可知本发明成功制备得到CSOB-FA水凝胶。

试验例2、本发明水凝胶的可注射性、喷射性及形状适应性

1、实验方法

根据实施例1的方法得到2%(w/v)CSMA-FA溶液和2%(w/v)OBSP溶液按照体积比1:1混合后光固化15s（320-405 nm），得到CSOB-FA水凝胶。在CSOB-FA水凝胶形成后加入亚甲蓝染色剂，搅拌均匀后，立即转移到注射器中，所用针头为16号针头，通过注射水凝胶“CDUTCM2026”一词来评估水凝胶的可注射性。此外，通过喷射2%(w/v)CSMA-FA溶液（组分A）和2%(w/v)OBSP溶液（组分B）两种水凝胶前驱溶液在不同形状的模具中，以评估其可喷射性以及形状适应性。

2、实验结果

如图2A和2B所示可以用单通道注射器注射水凝胶以此绘制“CDUTCM2026”，将组分A和组分B水凝胶前驱液体先混合，形成凝胶后立即将其转入到普通注射器当中，这表明水凝胶具有一定的可注射性质。将水凝胶CSOB-FA和OBSP溶液分别装入喷瓶当中，随后一同喷入不同形状的膜具当中（图2C），形成凝胶后将其打光后15s后取出，以此说明了水凝胶的可注射性，喷射性以及不同形状的适应性，能够让水凝胶喷剂适应不规则形状的伤口。

试验例3、本发明水凝胶的流变性能和自愈合性能

1、实验方法

（1）流变性能测试

用流变仪(MCR102E，Anton Paar)对水凝胶的流变性能进行表征。水凝胶制备成直径为1.2 cm，高度为3 mm的圆盘。在37℃、振荡频率为10^-1~ 10²rad/s的条件下，测定水凝胶的存储模量(G′)和损耗模量(G″)。水凝胶样品有CSMA水凝胶、CSOB^1st水凝胶、CSOB水凝胶、CSOB-FA^1st水凝胶以及CSOB-FA水凝胶，按照实施例1所述方法制备。

（2）自愈合性能测试

在室温下，将圆盘状CSOB-FA水凝胶（直径14mm，高度3mm）从中间切成两半并分开一定距离，然后将两半放置到位并等待一定的时间，直到两半再次团聚。之后，取出并提起水凝胶的两端进行拉伸，并将愈合的水凝胶保持悬浮状态。拍摄水凝胶的所有照片。

2、实验结果

通过流变实验评估了CSMA水凝胶、CSOB^1st水凝胶、CSOB水凝胶、CSOB-FA^1st水凝胶和CSOB-FA水凝胶的储能模量G′和损耗模量G″。图3A~3E显示所有样品的储能模量（G′）均高于损耗模量（G″），表明水凝胶形成，其中G′值在0.1至100 rad/s的频率下总体在G″以上。此外，CSOB、CSOB-FA水凝胶的储能模量高于CSMA单网络水凝胶，CSOB^1st水凝胶与光交联后水凝胶CSOB相比，光交联过后的CSOB水凝胶更加稳定，这可能是因为CSMA和OBSP之间形成的是动态变化的Schiff键，而CSOB通过光交联过后更加稳定，CSMA和CSOB^1st以及CSOB-FA^1st中G″值在高振荡频率下高于G′，CSOB-FA水凝胶则在光交联后均表现出更好的稳定性，且形成的凝胶特性G′达到了540.00以上，而CSOB仅仅在118.89左右。

之后进行连续替代的应变扫描，以此确定CSOB-FA水凝胶的自愈合行为，连续4次交替重复循环后，G′的值仍然能够大于G″，说明水凝胶具有自主愈合行为（图3F），同时通过流变仪测定了不同水凝胶的复数粘度，CSOB-FA^1st的粘度在852.24远远高于CSOB^1st水凝胶290.73，这可能是由于FA当中具有酚羟基所导致其黏附性增强，并且在打光之后，水凝胶的复数粘度更强，CSOB-FA粘度达到了4210.3，而CSOB光交联后黏附性变化不大，仅仅只有403.7，这可能是CSOB-FA水凝胶由于光交联过后交联的更加密集，导致形成更多的分子间氢键，从而提升了其黏性(图3G和3H)。并用宏观的自愈合实验表明水凝胶具有自愈合能力（图3I）。

试验例4、本发明水凝胶的力学性能

1、实验方法

通过水凝胶的压缩性评价CSOB-FA水凝胶（实施例1制备得到的CSOB-FA水凝胶）的力学性能。水凝胶被制备成直径为14 mm，高度为1.2 cm的圆柱形。然后使用使用质构仪(Rapid TA+，上海腾霸仪器技术有限公司)以1 mm/min的速度进行测试CSOB-FA水凝胶。其次将水凝胶黏附在猪皮上以及手指关节处进行拉伸扭曲实验，并且置于水中浸泡后进行拉伸扭曲。以CSOB水凝胶（实施例1制备）作为对照。

2、实验结果

本发明发现加入FA后水凝胶的韧性得到了极大的改善，与未加入FA的CSOB水凝胶相比，CSOB-FA水凝胶压缩强度显著降低（图4A），其变得更加柔软，可以防止水凝胶在不同的运动方式下，由于光固化后水凝胶强度过强，从而容易在伤口上破碎，不易长时间保留在动态伤口上。FA的加入降低了水凝胶的硬度，帮助水凝胶的柔韧性增强，图4B显示了CSOB-FA水凝胶能够进行拉伸，而CSMA水凝胶和CSOB水凝胶无法进行拉伸。因此本凝胶能够长时间的契合在创面之上，并且无变形与破碎，这样凝胶能更好适应关节部位等动态部位伤口，从而促进伤口的愈合（图4C和4D）。

此外，通过改变打光时间可以很容易的改变水凝胶的机械性能，以满足水凝胶针对于不同组织的需要。为了表征不同交联时间的CSOB-FA水凝胶的力学性能，分别在10、15和30s的不同交联条件下对样品进行了压缩试验。如图4E所示，水凝胶的压缩强度随着交联时间的增加而提高。随着打光时间的延迟，CSOB-FA水凝胶的极限应力显著增加（图4E）。较高的交联度有利于形成坚固的水凝胶。为了获得合适强度和弹性的水凝胶，本发明选择了15s的交联时间作为优化条件。生理软组织的承受能力在（10-200 kPa）的范围内，因此CSOB-FA水凝胶的压缩模量适合作为生理软组织当中的细胞增殖、迁移和分化的支架。

试验例5、本发明水凝胶的膨胀性能和保水性能

1、实验方法

按照实施例1所述方法分别制备CSMA水凝胶、CSOB水凝胶和CSOB-FA水凝胶，将形成的水凝胶称取初始重量后，分别按照不同的方法进行实验。

（1）膨胀性能

每种水凝胶样品的溶胀率由以下方法测定：简单地说，一旦形成，水凝胶被冻干并称重(Wd)。随后，将水凝胶样品置于室温下10 ml的PBS中。不时取出，过滤水凝胶表面的水，称其重量(Wt)。最后，水凝胶的重量不再变化，达到平衡溶胀状态。水凝胶在不同时间的溶胀率由下式计算。

溶胀比= (Wt -Wd)/Wd×100%

Wd和Wt分别表示干燥凝胶和膨胀凝胶在不同时间点的重量。

（2）保水性能

每个样品放置在37℃，并且用饱和的氯化钠保持环境当中的相对湿度在72.06 ±0.32 RH，在确定的实验点取出样品，然后称重，最后冻干。保水率定义如下：

保水率(%) =W0-Wt/W0×100%

W0和Wt分别表示不同时间点凝胶重量和冻干后除去凝胶干重的初始水的重量。

2、实验结果

溶胀比可以评价水凝胶是否能够为伤口提供湿润条件，并且保护使用部位受到外界的物理挤压。因此当水凝胶用作伤口的愈合时，低溶胀的水凝胶可能会对伤口愈合更加有益。它们可以避免由于高溶胀率而导致的柔韧性减弱，这可能会导致水凝胶在伤口愈合之前发生破裂和溶解，导致伤口发生二次创伤。本发明中CSMA水凝胶的膨胀率远高于CSOB和CSOB-FA，这可能是由于光交联后CSMA的孔隙大小高于CSOB与CSOB-FA在光交联后的孔隙大小，溶胀率因此变得更高（图5B）。

水凝胶的保水性能是将水长时间保留在水凝胶网络当中，能够保持伤口当中的相对湿度，在湿润的伤口中上皮层形成的更快，因为此时的上皮细胞在湿润的伤口中更容易繁殖。从而保护并促进伤口的愈合。因此，进行了水蒸发实验来评估水凝胶的保水能力。实验结果如图5A所示，其中所有测试的水凝胶中的水含量随着时间的增加而降低。在整个实验中，CSMA水凝胶的失水率最快、最大，其次是CSOB水凝胶，而CSOB-FA水凝胶的失水速率最慢、最小。在48 h后所有水凝胶均能保持85%以上的含水量，然而，水蒸发的速率和量在各组之间变化，这取决于水凝胶中网络的紧密性。这些结果表明CSOB-FA水凝胶具有最好的保水性且具有更紧密的水凝胶网络。

试验例6、本发明水凝胶的体外抗菌试验

按照实施例1所述方法分别制备CSMA水凝胶、CSOB水凝胶和CSOB-FA水凝胶，然后进行实验。

1、实验方法

使用平板菌落计数方法检测水凝胶对革兰氏阴性大肠杆菌（E.coli，CMCC（B）44102）和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（S.aureus，ATCC 25923）的抑制活性。将细菌接种在液体培养基（色氨酸大豆肉汤，TSB）中，并在37℃持续48小时以制备细菌溶液（10⁷CFU/ml）。在添加细菌之前，将水凝胶（50mg）在在48孔板中设置四组，每组中有3个平行孔。第一组在没有水凝胶的情况下放置作为对照组，其余三组依次放置50mg CSMA水凝胶、CSOB水凝胶和CSOB-FA水凝胶。将200 μl上述细菌溶液和800 μl液体培养基加入各自的孔中，并在37℃持续24小时。随后取出来自同一组的3个平行孔的细菌肉汤并混合，用无菌盐水进行一系列稀释，并铺展在平板计数琼脂（PCA）上。最后，将所有平板在37℃下孵育持续24小时，并使用相机拍照，使用Image J软件对菌落进行计数。抗菌率（%）=样品菌落数/空白对照菌落数×100%。

2、实验结果

壳聚糖的抗菌活性来源于其质子化氨基所携带的正电荷，而细菌的生物膜是携带负电荷，因此壳聚糖携带的正电荷与细菌的生物膜携带的负电荷进行了反应，从而导致细菌死亡。图6展示了CSMA、CSOB和CSOB-FA水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抗菌作用。CSOB组具有更多的菌落，表明其抗菌活性较差，这可能是由于CSMA与OBSP反应后，减少了氨基的存在，因此表现出较差的抗菌效果，而CSMA和CSOB-FA组都显示出显著更少的细菌，它们对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出优异的抗菌作用（图6A）。如图6B所示与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌共同培养24 h后CSMA水凝胶的抗菌率和CSOB-FA水凝胶的抗菌率均在99%以上。

试验例7、本发明水凝胶的生物相容性和血液相容性

1、实验方法

（1）生物相容性

为了研究水凝胶的细胞毒性，将200 mg无菌水凝胶浸入50 mL完全培养基中，37℃孵育后培养24 h，获得水凝胶提取物并用于细胞培养，水凝胶提取物浓度分别为（4 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml、0.5 mg/ml）。L929细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在CO₂培养箱中培养24 h。后用水凝胶提取物与细胞共培养24 h和48 h，在每个孔中加入10 μl CCK-8试剂，并将平板再孵育30分钟。通过微板读取器读取吸光度（OD）。通过等式计算相对细胞活力：

相对细胞活力（%）=（（OD_s−OD_b）/（OD_c–OD_b））×100%，

OD_s是样品（水凝胶）组的平均吸光度；OD_c为对照组的平均吸光度；OD_b是空白组的平均吸光度。

（2）血液相容性

采用体外溶血试验评估水凝胶的血液相容性。称取水凝胶样品1.0g，添加到10ml生理盐水中，在37℃的生化培养箱中浸泡48h。取新西兰大白兔耳缘静脉血以2000 rpm离心10分钟，分离红细胞，然后用生理盐水洗涤三次。用生理盐水稀释纯化的红细胞，以获得红细胞悬浮液（5%，v\/v）。本发明选择生理盐水阴性对照组和0.1%Triton X-100阳性对照组。制备200 µl RBC悬浮液，与100µl水凝胶混悬液和700µL0.9%NaCl溶液混合，作为实验组。37℃培养1h，以1500 rpm离心试管5分钟，以吸收上清液，并在540 nm处测量吸光度。

2、实验结果

安全性是应用于医学上的第一标准，因此水凝胶是否具有良好的细胞相容性对水凝胶在生物医学上能否应用至关重要，CCK-8和直接接触实验均用于评估CSMA、CSOB、CSOB-FA水凝胶的细胞毒性，实验结果如图7A所示，将不同浓度的水凝胶在24 h均显示出良好的细胞相容性(均超过80%)，并且均产生了细胞繁衍增殖的情况，表明该系列水凝胶无细胞毒性，并且产生令人满意的细胞相容性，随后为了验证此实验结果，将CSOB-FA水凝胶培养液与细胞共同培养48h，结果如图7B所示，在共聚焦荧光显微镜下可以观察到大量的纺锤形态的活细胞，并且48 h后的细胞形态均正常，几乎没有死亡细胞，此外从0天开始，都持续表现出细胞增殖的状态，虽然表明CSMA、CSOB、CSOB-FA水凝胶均有良好的细胞相容性，但是总体而言，CSOB-FA水凝胶相对于其他两组具有更加优异的细胞相容性。此外因为伤口敷料不可避免地会与血液接触，溶血性被认为是评估生物材料相容性的重要指标，因此通过溶血试验评估水凝胶的血液相容性。所有水凝胶孵育之后没有导致任何明显的溶血，表明这些水凝胶具有良好的血液相容性（图7C）。总之，这些结果表明，CSOB-FA水凝胶具有良好的生物相容性、非溶血性，并支持细胞粘附、生长和增殖。

试验例8、本发明水凝胶的抗氧化活性

1、实验方法

通过DPPH自由基清除试验评估了水凝胶的抗氧化活性。简单地说，将40.0 mg水凝胶溶液分散在10.0 ml纯水中。将上述分散液分别稀释到4mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml、0.5mg/ml加入到DPPH溶液(0.08 mg/ml)中，加入纯水，最终体积为1 ml。在37℃反应2小时后，用紫外-可见光谱法测定517 nm处的吸光度。DPPH的降解计算公式为:

DPPH清除率(%)=(A₀-A_n)/A0×100%

A₀为0 μl样品分散最终溶液的吸光度，A_n为不同体积样品分散最终溶液的吸光度。

2、实验结果

在糖尿病伤口环境中会产生大量的ROS，随着ROS的大量积累，伤口则会表现为慢性氧化应激状态。含有抗氧化剂的伤口敷料能有效清除ROS，有助于慢性伤口愈合。据报道FA是一种很好的抗氧化剂，其通常被封装在各种载体中，以防止其被氧化，并在用于伤口修复时实现缓释作用。因此，为了评价CSOB-FA水凝胶对糖尿病伤口具有良好的抗氧化作用。通过DPPH自由基清除实验研究了CSOB-FA水凝胶的体外抗氧化性能，随着水凝胶浓度的增加，DPPH的清除效率得到了不断提高，当水凝胶浓度增加到4mg/ml时，此时DPPH自由基清除率得到了极大的增强(图8)，而CSMA水凝胶和CSOB水凝胶对DPPH自由基清除效率显著差于CSOB-FA水凝胶。

试验例9、本发明水凝胶的止血实验

1、实验方法

CSOB-FA喷雾水凝胶具有良好的机械强度和稳定性、自愈能力、生物相容性、抗菌效率高、粘附性好等优点，因此被选作后续的体内研究。通过出血性肝小鼠模型评价所制备的水凝胶的止血性能。记录应用水凝胶后或未治疗时止血过程中的失血量，进行急性肝出血小鼠（昆明小鼠，30-35 g，雄性）用于评估体内CSOB-FA水凝胶的止血潜力。分为4组，每组5只，每组用酒精消毒腹部皮肤后，用手术剪刀小心地暴露肝脏。预先称重的滤纸放在肝脏下面。用针头诱导肝脏急性出血伤口，然后迅速用水凝胶覆盖，未经治疗的急性伤口为对照组。在10、20和30秒时拍摄数字图像，最后称量滤纸对各组失血量进行定量。

2、实验结果

血管疾病是糖尿病患者的并发症，因此抗凝血治疗是常规的治疗方法之一，以此预防其余并发症，因此，清创手术过后的持续出血是不可忽视的，有效止血是伤口能否有效愈合先决条件之一。通过小鼠肝出血模型用于评估CSOB-FA水凝胶的止血能力，与空白组相对比，CSOB和CSOB-FA的失血量明显减少，CSMA也显示出了一定的止血能力（图9）。

试验例10、本发明水凝胶伤口愈合实验

1、实验方法

选取体重在180-250g的雄性SD大鼠9只作为实验研究对象，在第0天时，将大鼠随机分为对照组和实验组，麻醉后去除背部毛发，用活组织检查打孔器在大鼠背部制作直径为8 mm的圆形创面。在创面当中加入50 μL细菌悬浮液（金黄色葡萄球菌，10⁸CFU/mL），用无菌封闭PU膜覆盖创面24h，制成细菌感染创面模型。在第1天时，将CSMA、CSOB和CSOB-FA三种水凝胶在创面处进行喷雾交联，随后进行紫外固化15s。动物随机分为4组，分别应用对照组、CSMA水凝胶、CSOB水凝胶和CSOB-FA水凝胶。分别于术后4、8、11、14天采集创面数字图像，并用ImageJ软件进行测量。

2、实验结果

为了评价CSOB-FA水凝胶在体内创面的愈合效果，建立了SD大鼠细菌感染性皮肤缺损模型，采用金黄色葡萄球菌感染大鼠全层皮肤缺损模型，评价该水凝胶对感染创面的愈合能力，实验结果如图10所示，很明显的是CSOB-FA组水凝胶几乎已完全愈合，而对于空白和CSMA组伤口均仍然清晰可见。而与CSOB组相比，创面的疤痕仍然明显，因此这些结果表面CSOB-FA水凝胶具有更好的伤口愈合能力，这可能是因为水凝胶成分OBSP具有良好的促进组织修复的能力的同时FA协助提供抗菌的能力从而促进伤口加速愈合。

Claims

1.一种原位固化成型水凝胶产品盒，其特征在于：它是由分开存放的两个组分组成：

2.根据权利要求1所述的原位固化成型水凝胶产品盒，其特征在于：它是由分开存放的两个组分组成：

3.根据权利要求1或2所述的原位固化成型水凝胶产品盒，其特征在于：

组分A中，所述苯基磷酸盐为苯基磷酸锂盐；

和/或，组分A中，所述溶剂为水；

和/或，组分B中，所述溶剂为水。

4.根据权利要求1或2所述的原位固化成型水凝胶产品盒，其特征在于：组分A中，所述甲基丙烯酸化壳聚糖的制备方法包括如下步骤：

所述壳聚糖溶解在溶剂中后，浓度为1~5%；

和/或，所述溶剂为1%乙酸溶液；

和/或，所述甲基丙烯酸酐和壳聚糖溶液的体积比为1:100；

和/或，所述透析时，透析袋的截留分子量为4.0-8.0 kDa；

和/或，所述透析时，透析液为水；

和/或，所述透析的时间为1~3天。

5.根据权利要求1或2所述的原位固化成型水凝胶产品盒，其特征在于：组分B中，所述氧化白及多糖的制备方法包括如下步骤：

3）将反应液透析，冷冻干燥，即得。

6.根据权利要求5所述的原位固化成型水凝胶产品盒，其特征在于：

和/或，步骤1）中，所述白及多糖和NaIO₄的摩尔比为0.4：1；

和/或，步骤1）中，所述溶剂为水；

和/或，步骤3）中，所述透析时，透析液为水；

和/或，步骤3）中，所述透析的时间为1~3天。

7.根据权利要求6所述的原位固化成型水凝胶产品盒，其特征在于：所述白及多糖的制备方法包括如下步骤：

（1）白及药材打粉后使用脱脂；

和/或，步骤（3）中，所述醇溶液为95%乙醇。

8.一种水凝胶，其特征在于：它是取权利要求1~7任一项所述的原位固化成型水凝胶产品盒，将组分A和组分B混合，即得。

9.根据权利要求8所述的水凝胶，其特征在于：组分A和组分B分别放于喷瓶中，先喷射其中一个组分，然后再喷射另一个组分后得到水凝胶；

或者，将组分A和组分B直接混合后得到水凝胶；

所述组分A和组分B的体积比为1:1。

10.权利要求1~7任一项所述的原位固化成型水凝胶产品盒或权利要求8~9任一项所述的水凝胶在制备创面修复材料中的用途。