CN116019973A - 基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶及其制备方法和应用。本发明制备的纳米杂化双网络水凝胶结合纳米酶催化功能与水凝胶模拟ECM力学性能，具有供氧、酶催化、抗菌、自愈合、可注射、组织黏附、重塑氧化还原微环境等功能特性。本发明的纳米杂化双网络水凝胶通过降低伤口处血糖水平、调节伤口pH微环境、清除细菌感染、重塑伤口氧化还原微环境、组织适形贴合形成物理屏障加速了糖尿病伤口愈合，实现综合多种适用糖尿病伤口特征功能、覆盖伤口愈合全阶段的多功能长效水凝胶敷料，为全阶段愈合提供长效多样化治疗作用，显著提高糖尿病伤口的治疗效果。

Description

基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于高分子水凝胶技术领域，具体涉及基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶及其制备方法和在糖尿病伤口治疗中的应用。

背景技术

目前，许多高分子水凝胶敷料已被研究，其中一些水凝胶敷料已被批准用于临床伤口护理与治疗。糖尿病足(DFU)是糖尿病高血糖患者最常见的并发症，其发病率、死亡率、复发率高，是世界范围内非创伤性截肢的主要原因。伤口愈合是一个复杂的过程，通常分为止血、炎症、增殖和重塑四个阶段，然而糖尿病伤口中四个阶段无法顺利进行，其特征是存在长期的低度炎症，这将会减缓或阻碍伤口愈合。在细胞水平上，高葡萄糖浓度抑制成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞的增殖，阻碍血管生成和再上皮化。缺氧是伤口修复最重要的预后决定因素之一。炎症、增殖和基质重塑三个过程都显着取决于血管和参与愈合过程的细胞的营养和氧气供应。角质形成细胞增殖和迁移以及内皮肾小管形成都需要血管生成，新血管可以缓解营养和氧气不足，这决定了糖尿病伤口的愈合效果。此外，伤口自发愈合的失败将大大增加细菌感染的风险，DFU中最危险的病原体包括金黄色葡萄球菌。上述需氧致病菌使糖尿病患者的健康状况迅速恶化，难以治愈且危及生活质量。因此如何降低伤口表面的血糖浓度，改善伤口乏氧环境，清除细菌感染是改善糖尿病愈合状况的关键。临床糖尿病伤口治疗手段包括控制血糖、手术清创、移植和伤口敷料。然而，仍然没有持续有效和广泛适用的疗法来治疗慢性且难以愈合的DFU，因此进一步发展长效治疗，功能多样的糖尿病伤口治疗新方法至关重要。

在近几十年中，已经研究了许多针对伤口愈合各个步骤的方法，用于治疗糖尿病足等慢性伤口。包括不同类型的敷料，细胞因子和生长因子的输送，细胞治疗以及应用电或机械刺激等多种方法。在所有这些技术中，使用人工结构，作为临时物质来支持伤口愈合过程，被认为是最有效的策略。鉴于此，最近开发了不同类别的生物材料伤口敷料，用于模拟皮肤微环境。在这些生物材料中，具有仿生结构和物理性质的水凝胶已被广泛用于伤口愈合应用。其高生物相容性和出色的药物控释能力，使水凝胶成为较为理想的生物材料。然而传统的水凝胶作用单一，仅针对伤口愈合单一阶段发挥功能，功能单一，作用效果有限，无法满足伤口愈合不同阶段的多样化需求，治疗作用不理想。因此十分需要能匹配伤口不同愈合阶段需求的水凝胶，在不同阶段发挥不同作用，提供覆盖全阶段的治疗作用。

具有优异的类酶催化活性的纳米材料已被定义为纳米酶。人工纳米酶因其相对于天然酶的广泛优势而引起了广泛的兴趣，例如环境友好性、低成本、易于生产、可调节的催化活性和可回收性。Pt纳米颗粒已被证实具有在弱酸性pH条件下催化H₂O₂转化为剧毒的·OH的能力，即类过氧化物酶(POD)活性，Pt纳米颗粒在中性pH条件下能将H₂O₂分解成无毒的水和氧气，表现出类过氧化氢酶(CAT)活性。Pt纳米颗粒可以模拟葡萄糖氧化酶(GOX)催化葡萄糖转化为葡萄糖酸和H₂O₂。Pt纳米颗粒还具有类超氧化物歧化酶(SOD)活性，可以迅速将有害的O₂·-转化为H₂O₂和O₂，作为O₂·-清除剂。同时具有多种酶活性的纳米颗粒与催化条件有关，纳米酶在不同的pH条件下发挥不同的酶活性。针对糖尿病足伤口愈合的不同阶段，Pt纳米颗粒可以发挥不同的作用。类GOX酶活性可以降低伤口表面葡萄糖含量，调整伤口的高糖环境。同时类POD酶活性可以产生活性氧抗菌，类超氧化物歧化酶以及类过氧化氢酶活性可以清除后期过量活性氧，重塑伤口氧化还原微环境。纳米酶具有的pH依赖的多类酶活性能满足伤口不同阶段的愈合需求，可根据伤口微环境变化发挥不同功能，创造性地满足了伤口全阶段地愈合需求。然而纳米材料的在伤口处的滞留问题限制了其发挥作用。纳米酶因其纳米尺寸易被代谢，难以长期在伤口处留存，作用时间短。将纳米酶杂化至水凝胶使其与水凝胶网络动态结合可以有效解决留存问题，使纳米酶长期作用于伤口表面，同时满足伤口所需的湿性愈合环境。

发明内容

发明目的：针对现有糖尿病伤口敷料功能单一，作用时效短等问题，本发明的目的之一是提供了一种催化与携氧性能、生物相容性良好的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶。

本发明的目的之二是提供了基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶的制备方法。

本发明的目的之三是提供了基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶在糖尿病伤口愈合中的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶，所述纳米杂化双网络水凝胶为双网络水凝胶与纳米酶复合体通过动态非共价键杂化得到，所述纳米酶复合体以载氧微球为内核且表面修饰纳米酶。

其中，所述载氧微球为负载载氧剂的高分子共聚物纳米微球，所述的负载载氧剂的高分子共聚物纳米微球的粒径为120～200nm。

其中，所述纳米酶为超小纳米酶，所述超小纳米酶直径为2～5nm，所述纳米酶复合体的水动力尺寸在150～300nm。

由于本发明的纳米酶复合体是将纳米酶修饰在高分子聚合物纳米微球表面，所以需要考虑高分子聚合物纳米微球的稳定性、粒径大小、表面基团，才能实现良好的包覆效果。而高分子聚合物纳米微球的稳定性、粒径大小、表面基团取决于所采用的原料比例、制备方法。

本发明内容还包括所述的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)以聚乙二醇为包覆剂，加入还原剂、氯铂酸，搅拌获得超小纳米酶；

(2)以高分子共聚物为载体，聚乙烯醇为乳化剂，采用溶剂挥发法制备负载载氧剂的纳米微球；

(3)将超小纳米酶与与负载载氧剂的纳米微球的水溶液混合，加入二环己基碳二亚胺，置于恒温摇床反应，超小纳米酶通过酰胺键偶联至纳米微球表面，获得纳米酶复合体；

(4)将高分子聚合物、引发剂、交联剂、纳米酶复合体混合得到反应液，将反应液注入模具，经光引发自由基聚合反应制得纳米杂化双网络水凝胶。

其中，步骤(1)中聚乙二醇的分子量为2000～5000，作为优选地，步骤(1)中所用聚乙二醇的分子量为2000、3500或者5000。

其中，所述聚乙二醇终浓度为5～30mg/mL，还原剂终浓度为1～3mg/mL，氯铂酸终浓度为1～2mg/mL；

其中，步骤(1)中所述的还原剂包括但不仅限于硼氢化钠、柠檬酸钠或L-抗坏血酸中的一种或几种；在本发明的一个具体实施案例中，还原剂优选硼氢化钠。

其中，步骤(1)的搅拌时间为30min～60min；所述的超小纳米酶直径为2～5nm。

其中，步骤(2)的具体步骤为：将载氧剂、高分子共聚物溶于三氯甲烷，并加到聚乙烯醇水溶液中，冰浴并超声破碎，恒温机械搅拌挥发三氯甲烷即得。

其中，步骤(2)中的高分子共聚物包括但不仅限于末端带有羧基的聚乳酸-羟基乙酸或聚乳酸；生物相容性的高分子共聚物具有良好的亲水性，可以实现疏水性药物的包载，同时表面具有丰富的功能基团，易于修饰，以达到特定的改造目的。

在本发明的一个具体实施案例中，高分子共聚物优选为聚乳酸-羟基乙酸。

其中，步骤(2)中的所述高分子共聚物终浓度为3～6mg/mL；

适用于本发明的载氧剂包括但不限于全氟溴辛烷、全氟溴庚烷、全氟溴己烷中的一种或几种组合。

步骤(2)中所述载氧剂在三氯甲烷中的终体积百分数为5％～20％；所述的超声破碎时间为2～5s，超声间隔时间为2～5s，功率为100～250W，超声次数为60～100；所述机械搅拌时间为2～5h，搅拌温度为20～25℃，搅拌速度为300～450rpm。

在本发明的一个具体实施案例中，所述载氧剂优选全氟溴辛烷。

其中，步骤(3)中的超小纳米酶与负载载氧剂的纳米微球水溶液的体积比为1∶1～1.5∶1；所述的恒温摇床温度为30～40℃，转速为100～250r/min，偶联时间为30～60min。

其中，作为优选，步骤(3)具体包括：将超小铂纳米酶与负载载氧剂的纳米微球水溶液按体积比1∶1或1.5∶1混合，加入二环己基碳二亚胺(DCC)，置于恒温摇床上反应30～60min，最后离心去除游离聚乙二醇、铂纳米酶和聚乙烯醇，得到铂纳米酶复合体(PFOB@PLGA@Pt)。

其中，步骤(4)中所述高分子聚合物包括高分子A和高分子B；

其中，所述高分子A包括但不仅限于甲基丙烯酸酐化明胶、聚(乙二醇)二丙烯酸酯或甲基丙烯酸酐化壳聚糖中的一种或几种，在本发明的一个具体实施案例中，高分子A优选甲基丙烯酸酐化明胶。

其中，所述高分子B包括但不仅限于氧化葡聚糖、氧化透明质酸、氧化海藻酸钠中的一种或几种；在本发明的一个具体实施案例中，高分子B优选氧化葡聚糖。

其中，所述高分子A质量百分比为5％～25％，所述高分子B质量百分比为5％～25％；所述交联剂为N，N-亚甲基双丙烯酰胺，光引发剂为苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐；所述自由基聚合反应为蓝光引发自由基聚合反应，蓝光波长为405nm，功率为40～50w，光引发距离1～3cm，光照时间10～20s。

本发明内容还包括所述的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶在糖尿病伤口愈合辅料的制备中的应用。

本发明的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶以负载载氧剂的高分子聚合物纳米微球为内核，表面修饰超小纳米酶。利用纳米复合体表面胺基杂化至双网络凝胶。该凝胶保持了纳米酶复合体的催化与携氧性能，具有良好生物相容性。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明制备的纳米杂化双网络水凝胶结合纳米酶催化功能与水凝胶模拟ECM力学性能，具有供氧、酶催化、抗菌、自愈合、可注射、组织黏附、重塑氧化还原微环境等功能特性。本发明的纳米杂化双网络水凝胶通过降低伤口处血糖水平、调节伤口pH微环境、清除细菌感染、重塑伤口氧化还原微环境、组织适形贴合形成物理屏障加速了糖尿病伤口愈合，实现综合多种适用糖尿病伤口特征功能、覆盖伤口愈合全阶段的多功能长效水凝胶敷料，为全阶段愈合提供长效多样化治疗作用，显著提高糖尿病伤口的治疗效果。

附图说明

图1为Pt NPs、PFOB@PLGA、PFOB@PLGA@Pt纳米微球的透射电镜图。

图2为PFOB@PLGA、PFOB@PLGA@Pt纳米微球的粒径分布图。

图3为PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex扫描电镜图。

图4为PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex组织黏附、可注射、自愈合、酶催化图。

图5为PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex体外抗金黄葡萄球菌结果。

图6为PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex生物安全性研究(标尺：50μm)。

图7为PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex对糖尿病伤口治疗效果。

图8为本发明的纳米杂化双网络水凝胶的形成过程以及修复伤口的示意图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面用实施例进一步阐明本发明，但本发明的内容不仅仅局限于下面实例

实施例1制备Pt NPs超小纳米酶

将1ml氯铂酸(10mg/mL)与10mg聚乙二醇(SH-PEG-NH₂，Mn(数均分子量)为2000)溶解在10mL纯水中，冰浴加入1mL硼氢化钠水溶液(10mg/mL)，机械搅拌500rpm，30min，得到超小铂纳米酶(Pt NPs)，其中，超小铂纳米酶(Pt NPs)中铂的浓度为270mg/L。

实施例2制备PFOB@PLGA负载载氧剂的纳米微球

50mg聚乳酸-羟基乙酸(PLGA，山东省药学科学院提供，其中，乳酸：羟基乙酸为50∶50，粘度0.1dL/g(CHCl3/25℃))和150μL全氟溴辛烷(PFOB)超声溶解于3mL的三氯甲烷，并加入到10mL2％聚乙烯醇(PVA，88％hydrolyzed，average M.W.20000-30000)水溶液中，冰浴并超声破碎(时间为2s，超声间隔时间为3s，功率为120W，超声次数为60)。恒温25℃，机械搅拌450rpm，2h以挥发有机试剂，得到聚乳酸-羟基乙酸纳米微球(PFOB@PLGA)水溶液。

实施例3制备PFOB@PLGA@Pt纳米酶复合体

将5mL超小铂纳米酶(Pt NPs)与5mL聚乳酸-羟基乙酸纳米微球水溶液混合(PFOB@PLGA)混合，加入2mL二环己基碳二亚胺(10mg/mL)，置于恒温摇床上37℃反应60min，最后离心(离心3次，离心转速4500rpm，离心时间10min)去除游离聚乙二醇、铂纳米酶和聚乙烯醇，离心后加超纯水复溶至5mL，得到铂纳米酶复合体(PFOB@PLGA@Pt)(其中，铂浓度为270mg/L)。

实施例4PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex纳米杂化双网络水凝胶的制备

将0.1g甲基丙烯酸酐化明胶(司特易生物技术有限公司，货号：R201C2)溶于1mL纯水中，加入0.01g引发剂苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，0.005g交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺，恒温水浴混合，再加入0.1g氧化葡聚糖(西安瑞禧生物科技有限公司，M.W.100,000)，150μL铂纳米酶复合体(PFOB@PLGA@Pt，其中铂浓度为270mg/L)，混合均匀得到反应液。将反应液注入模具，405nm蓝光，功率为40w，光引发距离1cm，光照时间10s，引发自由基聚合反应，制得三种基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶(PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex)(铂浓度为35μg/mL)。

实施例5Pt NPs、PFOB@PLGA、PFOB@PLGA@Pt纳米酶复合体的表征

取少量上述步骤制得的Pt NPs、PFOB@PLGA和PFOB@PLGA@Pt纳米酶复合体，涂在铜网上，利用透射电镜观察纳米颗粒形貌和粒径。如图1所示，可以观察到Pt NPs TEM结果表明Pt NPs具有良好的分散性与稳定性，平均粒径在2～5nm。PFOB@PLGA纳米微球呈球状，粒径分布均匀(100～300nm)，无团聚现象，稳定性好；从PFOB@PLGA@Pt纳米酶复合体图中可以明显的看到黑色的Pt纳米颗粒簇，EDS能谱结果表明其主要含有C、N、O、F、Pt元素；

如图2所示，采用马尔文粒度仪分别测定PFOB@PLGA、PFOB@PLGA@Pt纳米微球的水动力尺寸。PFOB@PLGA纳米微球的平均粒径约为100nm，PFOB@PLGA@Pt纳米微球的平均尺寸约为250nm，证明修饰铂纳米酶之后会增大微球的粒径。

实施例6PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex组织黏附、可注射、自愈合、酶催化、载氧功能

组织黏附性能：取两块猪皮组织(3cm*3cm，去毛洗净)(购买于南京市进香河农贸市场)，将0.02g甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA，司特易生物技术有限公司，货号：R201C2)，0.02g氧化葡聚糖(ODex，西安瑞禧生物科技有限公司，M.W.100,000)，加入0.002g引发剂苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，0.001g交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺，溶解于0.2mL纯水中，再加入30μL实施例3制备的PFOB@PLGA@Pt纳米酶复合体，混合后注射至皮间的空隙，用405nm光源照射20s后，观察凝胶对组织粘附情况自愈合性能：分别用考马斯亮蓝和邻菲罗啉对凝胶进行染色，将染色后的凝胶在湿盒中放置3h后观察自愈合情况。携氧能力测试：在孔板中原位合成PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex水凝胶，向孔板中加入2mL无氧水，针式溶解氧探头测量凝胶内部氧含量变化类过氧化物酶活性：向400μLPFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex水凝胶中加入1mL HAc-NaAc(pH 4.4，1M)缓冲液，加入100μL H₂O₂(10M)，50μLTMB(10mg/mL)，记录水凝胶颜色变化。类过氧化氢酶活性：向400μLPFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex水凝胶中加入200μL H₂O₂(10M)，记录水凝胶变化。

如图3、4所示，纳米杂化双网络水凝胶具有良好网状结构，且具有组织黏附、自愈合、可注射性能。由于PFOB携氧剂的存在，PFOB@PLGA@Pt/GelMA/Odex水凝胶中氧气下降速率更为缓慢。在过氧化物酶活性测试中水凝胶明显的蓝色表明，过氧化氢酶活性测试中快速产生大量气泡，类葡萄糖氧化酶测试中pH值的下降表明该水凝胶优秀的酶催化性能。

实施例7PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex水凝胶体外抗金黄葡萄球菌

按照实施例4的方法通过加入不同体积(0、10、30μL)的铂纳米酶复合体(PFOB@PLGA@Pt，其中铂浓度为270mg/L)，在12孔板中合成不同铂浓度(0、13、35μg/mL)的PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex水凝胶，加入PBS(浓度为1M，pH 6.0，含20mM葡萄糖)作为碳源，加入10μl金黄色葡萄球菌细菌悬浮液(10⁶CFU mL^-1)，37℃孵育4h，24h后，重悬菌液，取100μL涂抹在LB固体平板培养基上，37℃培养24h。

如图5所示，PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex水凝胶对金黄葡萄球菌具有优秀的抗菌性能。

实施例8PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex生物安全性研究

在12孔板中预先合成PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex水凝胶(铂浓度：35μg/mL)，紫外过夜灭菌，辅以10％的胎牛血清(Gibco)、dulbecco′s modified eaglemedium(DMEM)(Gibco)、1.0×10⁵U L^-1青霉素(Hyclone)和100mg/L链霉素(Hyclone)作为完全生长培养基。将HUVEC，L929，RAW264.7细胞以5x10⁴个/mL的密度接种在凝胶上，共培养72h后活/死细胞染色试剂盒(CalceinAM·PI)(Cell Viability/Cytotoxicity Detec)试剂盒进行细胞相容性评估。

如图6所示，PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex水凝胶具有良好的生物安全性，以及细胞黏附性。

实施例9PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex对糖尿病伤口治疗效果

糖尿病大鼠伤口造模成功后，伤口分别用对照(PBS缓冲液(1M，pH7.4))、GelMA/ODex水凝胶(将0.02g甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA，司特易生物技术有限公司，货号：R201C2)，0.02g氧化葡聚糖(ODex，西安瑞禧生物科技有限公司，M.W.100,000)，加入0.002g引发剂苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，0.001g交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺，溶解于0.2mL纯水中，用405nm光源照射20s后制得GelMA/ODex水凝胶)、实施例4合成的PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex水凝胶处理。第3、6、9天拍摄伤口照片，在第3、6、9天切除小鼠的伤口，然后将其置于无菌盐水(1mL)中。然后在37℃下孵育24小时后从伤口收集细菌样本。

如图7所示，PFOB@PLGA@Pt/GelMA/ODex组表现出了更快的伤口愈合速度，且在六天与九天时伤口细菌数量明显低于对照组。

Claims (10)

1.基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶，其特征在于，所述纳米杂化双网络水凝胶为双网络水凝胶与纳米酶复合体通过动态非共价键杂化得到，所述纳米酶复合体以载氧微球为内核且表面修饰纳米酶。

2.根据权利要求1所述的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶，其特征在于，所述载氧微球为负载载氧剂的高分子共聚物纳米微球，所述的负载载氧剂的高分子共聚物纳米微球的粒径为120~200 nm。

3.权利要求1所述的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶，其特征在于，所述纳米酶为超小纳米酶，所述超小纳米酶直径为2~5 nm，所述纳米酶复合体的水动力尺寸为150~300nm。

4.权利要求1~3任一项所述的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以聚乙二醇为包覆剂，加入还原剂、氯铂酸，搅拌获得超小纳米酶；

（2）以高分子共聚物为载体，聚乙烯醇为乳化剂，采用溶剂挥发法制备负载载氧剂的纳米微球；

（3）将超小纳米酶与负载载氧剂的纳米微球的水溶液混合，加入二环己基碳二亚胺，置于恒温摇床反应，超小纳米酶通过酰胺键偶联至纳米微球表面，获得纳米酶复合体；

（4）将高分子聚合物、引发剂、交联剂、纳米酶复合体混合得到反应液，将反应液注入模具，经光引发自由基聚合反应制得纳米杂化双网络水凝胶。

5.根据权利要求4所述的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述聚乙二醇的分子量为2000~5000，所述聚乙二醇终浓度为5~30mg/mL，所述还原剂终浓度为1~3 mg/mL，氯铂酸终浓度为1~2 mg/mL；所述还原剂为硼氢化钠、柠檬酸钠或L-抗坏血酸；搅拌时间为30 min~60 min；所述的超小纳米酶直径为2~5 nm。

6.根据权利要求4所述的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：将载氧剂、高分子共聚物溶于三氯甲烷，并加到聚乙烯醇水溶液中，冰浴并超声破碎，恒温机械搅拌挥发三氯甲烷即得。

7.根据权利要求6所述的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的所述高分子共聚物包括末端带有羧基的聚乳酸-羟基乙酸或聚乳酸；所述高分子共聚物终浓度为3~6 mg/mL，所述载氧剂为全氟溴辛烷、全氟溴庚烷或全氟溴己烷；所述载氧剂在三氯甲烷中的终体积百分数为5%~20%；所述的超声破碎时间为2~5s，超声间隔时间为2~5 s，功率为100~250 W，超声次数为60~100；所述机械搅拌的时间为2~5 h，搅拌温度为20~25℃，搅拌速度为300~450 rpm。

8.根据权利要求6所述的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的超小纳米酶与负载载氧剂的纳米微球水溶液的体积比为1：1~1.5：1；所述恒温摇床的温度为30~40 ℃，转速为100~250 r/min，偶联时间为30~60 min。

9.根据权利要求6所述的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述高分子聚合物包括高分子A和高分子B，所述高分子A包括甲基丙烯酸酐化明胶、聚(乙二醇)二丙烯酸酯或甲基丙烯酸酐化壳聚糖中的一种或几种，所述高分子B包括氧化葡聚糖、氧化透明质酸、氧化海藻酸钠中的一种或几种；所述高分子A质量百分比为5%~25%，所高分子B质量百分比为5%~25%；所述交联剂为N，N-亚甲基双丙烯酰胺，光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐；所述自由基聚合反应为蓝光引发自由基聚合反应，蓝光波长为405nm，功率为40~50w，光引发距离1~3cm，光照时间10~20s。

10.权利要求1~3任一项所述的基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶在糖尿病伤口愈合辅料的制备中的应用。

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