CN116837000B - 一种调控菊花花期的基因、表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种调控菊花花期的基因、表达载体和应用。本发明所述基因CmbHLH110，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明利用所述基因CmbHLH110构建植物表达载体，将所述植物表达载体转化入菊花材料中，得到转基因菊花材料。通过表型观察及分析获得具有开花时间差异的转基因菊花株系。结果发现，与未转基因植株相比，转入CmbHLH110基因的植株在短日照下提前开花，抑制CmbHLH110基因表达的植株在短日照下推迟开花，即CmbHLH110基因可以显著改变菊花开花时间。

Description

一种调控菊花花期的基因、表达载体和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控菊花花期的基因、表达载体和应用。

背景技术

菊花(Chrysanthemummorifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一，消费量仅次于月季。目前，大多数切花菊品种均为短日照品种，花期多集中在秋季，限制了菊花的周年生产。目前，生产上多采用人工遮光、补光和加温等栽培措施调控花期，以满足周年生产的需求，但易导致品质下降而且成本及能耗高。

bHLH(basichelix-loop-helixprotein)是真核生物中存在最广泛的一类转录因子，其通过特定的氨基酸残基与靶基因相互作用，进而调节相关基因的表达。近年来，随着分子生物学的迅速发展，通过农杆菌介导的遗传转化技术在植物体内过量表达或定点敲除特定的内源基因以改变作物的农艺性状，已逐渐成为现代育种的一类重要手段。相较于以杂交为主要方式的传统育种方式，这种育种方法极大地提高了育种的效率，缩短了育种时间，为改良菊花品种提供了新的手段和途径。

菊花花期遗传改良研究发现，将反花素基因CsAFT超表达菊花，转基因菊花开花时间延迟(Higuchietal.,2013)。菊花BBX24沉默后，转基因菊花提前开花(Yangetal.,2014)。目前并没有与bHLH转录因子与菊花花期的相关联研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控菊花花期的基因、表达载体和应用，可定向改良菊花观赏性状，为利用基因工程技术开展观赏性菊花分子育种提供方法和实例。

本发明提供了一种调控菊花花期的基因CmbHLH110，所述基因CmbHLH110的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一组克隆上述基因CmbHLH110的引物对，包括核苷酸序列如SEQID No.2所示的上游引物CmbHLH110-F和SEQ ID No.3所示的下游引物CmbHLH110-R。

本发明还提供了一种调控菊花花期的方法，包括调控上述基因CmbHLH110在菊花中的表达量。

优选的，所述调控包括超表达和敲低表达。

本发明还提供了一种促进菊花提前开花的方法，在目标菊花的基因组中表达或超表达上述基因CmbHLH110。

本发明还提供了上述基因CmbHLH110的表达载体的构建方法，包括以下步骤：将所述基因CmbHLH110连接到T载体的多克隆位点处，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；

分别利用与所述连接的多克隆位点相同的酶对所述阳性质粒和植物过表达载体进行线性化，得两种线性化质粒；

将两种线性化质粒进行连接和转化，提取阳性质粒，构建得到植物表达载体。

优选的，所述线性化所用的酶包括BamHI和EcoRI。

本发明还提供了利用上述构建方法得到的植物表达载体。

本发明还提供了上述基因CmbHLH110或上述植物表达载体在调控菊花花期中的应用。

本发明还提供了上述基因CmbHLH110或上述植物表达载体在培育不同花期菊花种质中的应用。

有益效果：本发明提供从切花菊‘神马’中克隆得到的调控菊花花期的基因CmbHLH110，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明还利用所述基因CmbHLH110构建植物表达载体，将所述植物表达载体转化入菊花材料中，得到转基因菊花材料。本发明采用转基因技术，将基因CmbHLH110整合到菊花基因组中，通过表型观察及分析获得具有开花时间差异的转基因菊花株系。结果发现，与未转基因植株相比，转入CmbHLH110基因的植株在短日照下提前开花，即向菊花基因组中转入CmbHLH110基因可以显著改变菊花开花时间。

附图说明

图1为CmbHLH110基因克隆琼脂糖凝胶电泳图，M：Marker2000；

图2为pORE-R4-CmbHLH110植物表达载体质粒电泳图，M：Marker2000；

图3为转CmbHLH110基因菊花特异引物检测电泳图；M：MarkerDL2000，阳：阳性质粒；阴：野生型植株；1-3：转CmbHLH110的超表达菊花株系；

图4为转基因及未转基因的菊花植株中CmbHLH110基因的相对表达量水平图；WT：野生型植株；OX1-3：转CmbHLH110的株系；

图5为转基因及未转基因的菊花植株中CmbHLH110基因的相对表达量水平图；WT：野生型植株；amiR1-3：转CmbHLH110的干扰株系；

图6为转基因菊花开花的表型观察图；WT：野生型植株；OX1-3：转CmbHLH110的超表达株系；amiR1-3：转CmbHLH110的干扰株系；

图7为转基因菊花和野生型菊花开花时间进程图；

图8为CmbHLH110转基因菊花和WT开花时间统计图；FBD：花芽发育阶段；VC：显色期；EO：早期开放期；OF：开放期；SF：衰老期；

图9为pORE-R4-amiR-CmbHLH110载体构建电泳图；

图10为pORE-R4-amiR-CmbHLH110转基因菊花鉴定电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种调控菊花花期的基因CmbHLH110，所述基因CmbHLH110的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：ATGGAGTCTGCAAATTTTTATCACCATCAACAACAAGATAATCAACTTGTGGATACTTCTTTTCATTGGTCCCAAAATCCCATCTTGAATGGAGCGAATAACAACATAAATTCAAGAAATCTTGACACTAGTAGTATCAATTCCATGGTTGAAGACATGGGATTTCCCTACAATGGTATCGGTTATCCGATAGACAACCTCGTGACTCAAGAATTGCAACGTTTGGCACGAATCAAGGAAGAGTTCTCCGTTGCCGAATCATATCCAAAGTTTTTAGAACTTTTGAATGGCAGCCCAACAACCTCGAGTATTGAAGATTTACGCTCACAACCTTACTCTACTACTTACATGAAGACTGACCATCATGATCAGCAAATTAGCTACTCAAATTATAATCAAGATTTCTTGCTAACAAATTTGCTTAATGGATGTCAAATCAAAGGTGGCCAGCTTGTAAATGATCAAAATAGTTCTAATGGAACACTTAGCCAGATTTTTCCAACTATAAGTATTTCAAGTTTGAAGCAATCCACCACCTCATCATCATCGTCATCATCCTCAGCAATTTCTTCAAGCTCTTTTGATATGAACTGCTTACCAGCTTTAGATCACTTTGGCTCTCCAAGGTTCGATGCCAGCTTTAATCGTCCTTCCTCGCTTAACGGCAATAATCTTGGTGGCTTTCCGTATGGTCTTGACCGTATGAATCAACCAAATCACAAGCCAGCAGTTTGCCCTAGCAAGATATCATCGGTCTCCAACACTGGAAGCTGTACATATCAATCAGCAAAGAGGCCAGCTAGTAAGTATATCGACGAAAAGGTGACTCAACCCATAGGACAAAAGAAATCAAAATCGGAGCCACGCGCTCCTTGTGCACCCTTTCAGGTCAGGAAGGAAAAATTAGGGGACAGAATTGCAGCTATTCAGCAGATGGTGGCACCTTTTGGCAAGACTGATACAGCTTCGGTATTAATGGAGGCTATTGGATATATCAAATTTCTTCACACCCAAGTCGAGACGCTAAGCGTTCCATACATGAAGTCAACAAACAAGATTTTCGGAACATCTTCACAAGGGGGACGAGTGGAGGATGGAGTTACACAGGCAAAAAGAGATCTTCAAAGTCGAGGATTGTGCTTGGTGCCATTGTCATGCTTGTCATACGTTACAGATGGATGCGAAGGCATTTGGCCACCACAT。

本发明所述基因CmbHLH110从切花菊‘神马’中克隆得到，且经实施例证实，当所述基因在菊花中超表达时，开花提前。

本发明还提供了一组克隆上述基因CmbHLH110的引物对，包括核苷酸序列如SEQID No.2所示的上游引物CmbHLH110-F和SEQ ID No.3所示的下游引物CmbHLH110-R。

本发明利用所述引物对克隆所述基因时，优选以切花菊‘神马’根系为材料，提取RNA并反转录成cDNA，利用上游引物CmbHLH110-F(SEQ ID No.2)：5′-ATGGAGTCTGCAAATTTTTATCACC-3′，下游引物CmbHLH110-R(SEQ IDNo.3)：5′-ATGTGGTGGCCAAATGCCTTCGCAT-3′进行PCR扩增，所述PCR扩增的程序，优选包括：95℃预变性5min；94℃解链45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，反应30个循环；72℃延伸10min。本发明优选将PCR反应产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，获得目的基因的序列为SEQ IDNo.1。

本发明还提供了一种调控菊花花期的方法，包括调控上述基因CmbHLH110在菊花中的表达量。

本发明所述调控优选包括超表达和敲低表达，实施例中证实对转基因植株进行花期表型观察，发现与未转基因植株相比，超表达CmbHLH110转基因植株提前开花，干扰CmbHLH110植株推迟开花。

本发明还提供了一种促进菊花提前开花的方法，在目标菊花的基因组中表达或超表达上述基因CmbHLH110。

本发明优选通过遗传转化的方法使目标菊花的基因组中表达或超表达所述基因，所述超表达优选包括采用植物超表达载体的方式。

本发明还提供了上述基因CmbHLH110的表达载体的构建方法，包括以下步骤：将所述基因CmbHLH110连接到T载体的多克隆位点处，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；

分别利用与所述连接的多克隆位点相同的酶对所述阳性质粒和植物过表达载体进行线性化，得两种线性化质粒；

将两种线性化质粒进行连接和转化，提取阳性质粒，构建得到植物表达载体pORE-R4-CmbHLH110。

本发明优选以切花菊‘神马’的cDNA为模板，设计如SEQ ID No.4所示的上游引物CmbHLH110-BamHI-F(5′-CGGGATCCA ATGGAGTCTGCAAATTTTTA-3′)和SEQ ID No.5所示的下游引物CmbHLH110-EcoRI-R(5′-CGGAATTCTATGTGGTGGCCAAATGCCTT-3′)，进行PCR反应，在CmbHLH110基因的上游和下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，将PCR产物连接到T载体，更优选连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；

将提取的阳性质粒由BamHI和EcoRI双酶切得到的CmbHLH110片段与BamHI和EcoRI双酶切的植物过表达载体，更优选为pORE-R4载体连接，转化，提取阳性质粒，得到CmbHLH110基因植物表达载体pORE-R4-CmbHLH110。

本发明还提供了利用上述构建方法得到的植物表达载体。

本发明还提供了上述基因CmbHLH110或上述植物表达载体在调控菊花花期中的应用。

本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明还提供了上述基因CmbHLH110或上述植物表达载体在培育不同花期菊花种质中的应用。

利用本发明所述基因或植物表达载体，可培育得到不同花期的菊花。本发明对所述培育的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规转基因方法即可。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种调控菊花花期的基因、表达载体和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

CmbHLH110基因的克隆

以切花菊‘神马’为材料，取叶片0.15g，参照TrizolRNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书的操作方法提取根系的总RNA，根据M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)进行反转录获得cDNA，利用特异引物(SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)扩增CmbHLH110；

以根系的cDNA为模板，进行PCR反应，50μL反应体系：10×PCRBuffer5.0μL，CmbHLH110-F、CmbHLH110-R引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，dNTPmix4.0μL(2.5mmol·L^-1)，TaqDNAPolymerase0.2μL，cDNA模板1μL，ddH₂O37.8μL；

反应程序：95℃预变性5min；94℃解链45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，反应30个循环；72℃延伸10min；

产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T载体(TaKaRa)，转化DH5α感受态细胞，序列测定为SEQ IDNo.1。

实施例2

植物表达载体pORE-R4-CmbHLH110的构建

根据CmbHLH110全长基因序列设计引物进行PCR反应，在目的基因CmbHLH110的上游和下游分别引入酶切位点BamHI和EcoRI，PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒用BamHI和EcoRI双酶切得到的CmbHLH110片段与BamHI和EcoRI双酶切的CmbHLH110连接，转化，提取阳性质粒。

上游引物CmbHLH110-BamHI-F(SEQ ID No.4)：5′-CGGGATCCAATGGAGTCTGCAAATTTTTA-3′，

下游引物CmbHLH110-EcoRI-R(SEQ ID No.5)：5′-CGGAATTCTATGTGGTGGCCAAATGCCTT-3′；

以切花菊‘神马’根系cDNA作为模板，用高保真酶(PrimeSTAR^TMHSDNA Polymerase，TaKaRa)进行PCR反应，50μL反应体系：10×HSPCRBuffer5.0μL，CmbHLH110-BamHI-F、CmbHLH110-EcoRI-R引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，dNTPmix4.0μL(2.5mmol·L^-1)，PrimeSTARTMHSDNAPolymerase0.4μL，cDNA模板1μL，ddH₂O37.6μL；

反应程序：95℃预变性5min；94℃解链45sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，反应30个循环；72℃延伸10min；

PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收，连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-CmbHLH110；

取载体pORE-R4(Invitrogen,USA)和pMD19-CmbHLH110用BamHI和EcoRI双酶切，双酶切体系(50μL)：10×HSBuffer5μL，BSA5μL，质粒pORE-R4或pMD19-CmbHLH11015μL，BamHI2μL，EcoRI2μL，ddH₂O21μL；37℃反应1h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pORE-R4片段和CmbHLH110片段。

用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应体系(10μL)：10×T4ligaseBuffer1μL，pORE-R4片段2μL，pMD19-CmbHLH110片段6μL，T4DNA连接酶1μL；16℃过夜连接反应，取5μL连接产物转化DH5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质pORE-R4-CmbHLH110，电泳和测序验证。植物表达载体pORE-R4-CmbHLH110构建成功(图1和图2)。

实施例3

农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花

从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的100mMCaCl₂(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。

取10μLpORE-R4-CmbHLH110载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μLYEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌至OD＝0.5，离心后，弃上清，用MS(pH5.8)培养液将沉淀等体积悬浮，用于转化菊花。

采用的农杆菌指包含CmbHLH110基因的植物表达载体的EHA105，用YEB液体培养基培养农杆菌EHA105；将转基因植株后代命名为OX，以切花菊‘神马’叶片为外植体，采用根癌农杆菌介导法将‘神马’中克隆得到的CmbHLH110基因导入菊花。取组培瓶中菊花苗顶端叶盘(0.5cmⅹ0.5cm)作为转化受体，在预培养培养基(MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L)中预培养3d，然后浸入备好的农杆菌菌液中感染10min，用滤纸吸干菌液后再接种到共培养培养基(MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L)上黑暗中共培养3d，然后转入筛选培养基(MS+卡那霉素(Kan)10mg/L+羧卞青霉素(Carb)500mg/L+6-苄氨基嘌(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.1mg/L)上继代培养4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基(MS+卡那霉素(Kan)8mg/L)上培养，初步获得卡那霉素抗性植株。

菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，100Kpa、121℃灭菌20分钟。

实施例4

将转CmbHLH110基因抗性植株进行分子检测(PCR、荧光定量RT-PCR)呈阳性，获得转基因菊花株系。

1)PCR检测

取生根筛选得到的卡那霉素抗性植株嫩叶及未转化株嫩叶，提取基因组DNA，将Kan基因作为检测目标，根据Kan基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长1406bp，引物序列为：

上游引物35S-F(SEQ ID No.6)：5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3′，

下游引物CmbHLH110-R(SEQ ID No.7)：5′-TGATCATTTACAAGCTGGCCA-3′；

分别以卡那霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以35S-F和CmbHLH110-R为引物，进行PCR检测。扩增体系为：1μLDNA模板，2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，1.5μL2.5mmol·L^-1MgCl₂，5U·μL^-1Taq酶0.2μL，35S-F和CmbHLH110-R各1μL，去离子水补足体积至25μL。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析结果如图3所示，转CmbHLH110的植株均可扩增出与阳性对照相同的特异扩增带，野生型植株没有扩增出条带。

2)荧光定量RT-PCR检测

提取抗卡那霉素植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光定量RT-PCR对CmbHLH110基因的表达量进行检测。按照荧光定量试剂盒(GreenRealtimePCRMasterMix-Plus-(QPK-212))说明书建立扩增体系，扩增条件：95℃1min；95℃15s，60℃15s，72℃45s，40个循环。根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况。特异引物扩增出的片段长为210bp，引物序列为：

上游引物qRT-CmbHLH110-F(SEQ ID No.8)：5′-AGATTTACGCTCACAACCTTACTC-3′，

下游引物qRT-CmbHLH110-R(SEQ ID No.9)：5′-ATGATGAGGTGGTGGATTGC-3′；

以EF1α扩增的基因片段为内标，片段长度为210bp，引物序列：

上游引物EF1α-F(SEQ ID No.10)：5′-TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG-3′，下游引物EF1α-R(SEQ ID No.11)：5′-CCATTCAAGCGACAGACTCA-3′；

荧光定量RT-PCR检测结果如图4所示，与野生型相比，转CmbHLH110的植株株系基因表达量有所提高，与野生型菊花相比表达量具有显著性差异。证实内源源基因已经转入切花菊基因组DNA中并表达。

实施例5

植物表达载体pORE-R4-amiR-CmbHLH110的构建

将CmbHLH110基因的特异序列在网站(wmd3.weigelworld.org/)上进行分析，设计特异引物(表1)。

表1特异性引物序列

以pBS300载体(有拟南芥miR319的前体序列)为模板进行一轮高保真PCR扩增，获得a、b、c片段后并电泳检测，大小正确后切胶回收，继续以纯化后的三个片段为模板，以A、B为通用引物进行第二轮高保真PCR以获取d片段，即为人工miRNA前体(Schwab等，2006)。

d片段加A尾后连接pMD19-T载体用于测序。测序正确后，通过酶切连接的方法构建到pORER4载体，选择miR319a的前体骨架pBS300载体含有的酶切位点(EcoRI/SpeI)进行37℃反应3h后，切胶回收16℃过夜连接，第二天电击转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经过Kan抗生素板筛选阳性克隆PCR检测后，送公司测序，将测序正确且连接成功即为可以遗传转化的植物表达终载体：pORE-R4-amiR-CmbHLH110(图9)。

将测序正确的pORE-R4-amiR-CmbHLH110质粒电击转化农杆菌菌株EHA105，菌液检测正确的阳性克隆，利用与实施例3相同的方法转化菊花‘神马’叶盘；进行实施例4所述的鉴定，pORE-R4-amiR-CmbHLH110转基因菊花鉴定电泳图如图10所示，将抑制表达的植株命名为amiR植株。

实施例6

转基因植株后代的表型观察

选取野生型菊花(WT)、过表达转基因菊花(OX)和抑制表达转基因菊花(amiR)的扦插苗作为表型观察的材料，定植于温室大棚。长日照条件下，OX较野生型切花菊‘神马’提早开花，且amiR较野生型切花菊‘神马’推迟开花(图5，图6，图7和图8)。

转基因植株表型观察实验表明CmbHLH110超表达转基因的菊花株系较野生型菊花提早开花，CmbHLH110基因对菊花花期具有明显的调控作用。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种调控菊花花期的基因CmbHLH110，其特征在于，所述基因CmbHLH110的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一组克隆权利要求1所述基因CmbHLH110的引物对，其特征在于，为核苷酸序列如SEQID No.2所示的上游引物CmbHLH110-F和SEQ ID No.3所示的下游引物CmbHLH110-R。

3.一种调控菊花花期的方法，其特征在于，包括调控权利要求1所述基因CmbHLH110在菊花中的表达量。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述调控包括超表达和敲低表达。

5.一种促进菊花提前开花的方法，其特征在于，在目标菊花的基因组中超表达权利要求1所述基因CmbHLH110。

6.含有权利要求1所述基因CmbHLH110的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述基因CmbHLH110连接到T载体的多克隆位点处上，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；

分别利用与所述连接的多克隆位点相同的酶对所述阳性质粒和植物表达载体进行线性化，得两种线性化质粒；

将两种线性化质粒进行连接和转化，提取阳性质粒，构建得到含有所述基因CmbHLH110的植物表达载体。

7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述线性化所用的酶包括BamH I和EcoRI。

8.利用权利要求6或7所述构建方法得到的植物表达载体。

9.权利要求1所述基因CmbHLH110或权利要求8所述植物表达载体在调控菊花花期中的应用。

10.权利要求1所述基因CmbHLH110或权利要求8所述植物表达载体在培育不同花期菊花种质中的应用。