KR101752728B1 - 식물체의 개화시기를 조절하는 CmFT 유전자 및 이를 이용한 단일 조건에서 식물체의 개화시기 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체의 개화시기를 조절하는 CmFT 유전자 및 이를 이용한 단일 조건에서 식물체의 개화시기 조절 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 스탠다드 국화(Chrysanthemum morifolium)의 신마품종(Jinba) 유래의 식물의 개화시기를 조절하는 유전자 CmFT와, 상기 CmFT를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환 세포, 상기 재조합 벡터를 이용하여 단일 조건에서 식물체의 개화시기를 조절하는 방법, 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환 식물체의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 형질전환 식물체가 개시된다.

Description

식물체의 개화시기를 조절하는 CmFT 유전자 및 이를 이용한 단일 조건에서 식물체의 개화시기 조절 방법{Chrysanthemum flowering locus T gene CmFT, and method of manipulation for short-day flowering using the same}

본 발명은 식물체의 개화시기를 조절하는 CmFT 유전자 및 이를 이용한 단일 조건에서 식물체의 개화시기 조절 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 스탠다드 국화(Chrysanthemum morifolium)의 신마품종(Jinba) 유래의 식물의 개화시기를 조절하는 유전자 CmFT와, 상기 CmFT 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환시킴으로써 단일 조건에서 식물체의 개화시기를 조절하는 방법에 관한 것이다.

최근, 생명자원에 대한 자료와 유전공학 기술을 토대로 식물 및 식물이 생산하는 물질의 생산량을 향상시키고자 생육 조건의 최적화뿐 만 아니라 형질을 결정하는 유전자를 탐색하고 이를 개량하는 많은 연구들이 진행되고 있다. 또한 식물의 생산량 및 생산 효율성을 높이기 위해 식물 개체의 크기 증대나 다양한 스트레스에 대한 저항성 향상 등과 함께 생육 기간을 단축시키는 방법들도 과거부터 현재까지 활발히 연구되고 있다. 이 중에서 생육 기간을 단축시키는 방법은 한정된 공간과 시간으로부터 최대의 생산력 향상을 가져 올 수 있다.

식물의 생장은 뿌리와 잎, 줄기 등의 영양기관이 생장하여 식물 개체의 길이 및 부피 생장을 이끄는 영양생장(vegetative growth)과, 자손을 생산하여 번식하기 위해 꽃을 발달시키고 수분과 수정 과정을 거쳐 종자를 생산하는 생식생장(reproductive growth) 과정으로 이루어져 있다.

영양생장에서 생식생장으로의 전이과정은 개화(flowering) 과정을 통해 이루어지며 개화 과정은 식물이 꽃을 피울 준비 단계부터 꽃의 소기관 형성을 완료하는 단계까지를 이른다. 식물에서 생식생장으로 전이, 개화는 식물의 내·외적 신호에 의해 조절된다. 식물은 외적으로 빛이나 온도의 변화를 감지하고 내적으로 식물의 발달 상황을 인식함으로써 프로그래밍화되어 있는 개화조절 메카니즘에 의해 개화시기를 결정한다. 수년간의 연구 결과, 식물은 별개의 환경 요인들, 일장(photoperiod)과 저온(vernalization)에 대해 반응하는 개별적인 메카니즘을 가지고 있는 것이 밝혀졌다. 이러한 환경 요인에 반응하는 유전적 경로와 조절 단백질의 동정과 기능 규명은 모델식물인 애기장대에 대해 집중되어 있다.

관련하여 식물은 당면한 환경에 반응하여 일장 혹은 온도에 반응하여 발현이 조절되는 전사조절인자에 의해 개화시기를 유연성있게 조절한다. 환경적 요인들에 반응하여 발현이 조절되어 개화에 영향을 미치는 전사조절인자들을 florigen이라고 하며 이 중에서 각기 다른 환경적 요인에 반응하는 florigen의 신호를 받아들여 영양생장에서 생식생장으로의 전이와 개화 초기단계를 유도하는 유전자를 floral integrator 유전자라고 한다. 개화 시기의 조절을 통해 영양기관의 성장, 종자 및 열매의 발달과 생산을 조절할 수 있기 때문에 최소의 비용으로 생산량을 최대화해야 하는 작물산업에서 개화 시기의 조절은 중요한 과제이다.

최근에 벼, 보리, 옥수수, 토마토 와 같은 농작물로부터 유래한 애기장대 florigen 유사 유전자들에 대한 연구가 진행되고 있다. 이들 유전자들은 애기장대 유래의 유전자들과 유사성을 가지고 있지만 개별적인 특징 또한 가지고 있으며 애기장대에는 존재하지 않은 개화조절 유전자 역시 발견되고 있다. 이는 일장조건에 따라 개화 시기가 다른 장일 및 단일 식물의 개화 조절 메카니즘이 다를 수 있음을 시사한다. 더 나아가서는 일생동안 한 번 꽃을 피우고 시드는 일년생 식물과 여러 해 꽃을 피우고 지기를 반복하는 다년생 식물의 개화 조절 메카니즘 역시 다를 것임을 암시한다.

또한 식물의 개화를 조절하는 floral intergator 인자들 중에서 Flowering locus T(FT)는 하루 동안의 광(光)주기에 의해 달리 발현되는 Constants(CO)에 의해 잎에서 발현이 조절되는 유전자이다. 잎에서 발현된 FT단백질은 정단분열조직으로 이동하여 정단분열조직에서 화서분열조직으로의 전환을 유도하여 생식기관의 발달을 초기화하게 된다. 장일식물인 애기장대에서 FT는 장일조건에서 발현된 반면, 단일 식물인 벼에서는 단일조건에서 촉진되고 장일조건에서 억제되었다.

그러므로 모델 식물인 애기장대를 이용하여 밝혀진 개화 조절 메카니즘을 토대로 각기 다른 생리적 특징과 일생 주기를 가지는 식물들에 대한 개화조절 경로와 관련 인자의 규명이 요구되며 이를 상업적 작물에 적용함으로써 경제적 효율성을 높일 수 있다. 즉, 벼, 보리, 옥수수 등의 작물과, 엽채류 및 과채류, 원예 및 화훼작물 등의 상업적 작물에 대한 개화조절 기작에 대한 연구는 학문적으로나 산업적으로 중요한 의미를 갖는다. 특히 산업적으로 식물의 개화를 앞당기는 것은 꽃이나 열매를 이용하는 화훼, 원예 및 식용작물의 생육기간을 줄일 수 있다. 또한 잎을 이용하는 채소 등의 작물은 개화에 의한 노화 촉진으로 인한 상품가치 하락을, 개화를 늦춤으로써 방지할 수 있다. 결국 상업 작물의 개화조절을 통해 상품의 가치 향상과 생산량의 증대를 기대할 수 있다. 특히, 단일 식물 특이적 개화 시기 조절 메카니즘을 활용함으로써 종자 및 열매의 생산시기를 앞당길 수 있을 뿐만 아니라 생육기간 동안 단일 조건을 유지함으로써 생산 비용을 절감할 수 있어 생산 효율과 생산량 개선에 유용하다.

특히, 국화(Chrysanthemum morifolium)는 장미, 카네이션과 더불어 세계 3대 화훼작물 중의 하나로써 다양한 화색과 화형을 가지고 있어 정원과 실내 장식물, 의식 상징물 등의 비롯한 약용과 요리 재료, 살충제, 실내공기정화 등을 목적으로 활용되고 있다. 이러한 국화의 개화는 일장조절만으로 연중 개화시킬 수 있는 특징을 가진 대표적인 단일 식물로 국화의 개화시기 조절은 화훼농원의 경제효율성 향상과 소득 증가에 매우 중요하다고 할 수 있다. 따라서 국화산업에 있어서 꽃의 수확시기, 유통기간 동안 습도, 온도, 빛, 일조량에 의한 개화와 꽃의 품질 변화가 매우 중요한 요인인 바, 국화 산업에서 최적의 외부 환경적 요인을 찾기 위한 연구들이 행해지고 있다. 관련하여 특히 국화의 개화 조절 인자를 찾는 것은 최소한의 생산 비용으로 효율적으로 그리고 최대치로 국화 개화 및 꽃의 품질을 관리할 수 있어서 매우 유용하다.

국내 국화 산업의 경우, 2010년에 재배면적이 583ha로 원예 및 화훼 작물 중 가장 넓은 면적을 차지하고 있으며 생산액 역시 2010년에 773.9억 원으로 2위를 차지하는 중요한 절화작목이다. 특히 스탠다드 국화(Chrysanthemum morifolium)가 차지하는 비중이 81.5%로 매우 높다. 스탠다드 국화 중에서도 신마품종(Jinba)은 추동국으로써, 가을부터 이듬해 5월까지 수확하여 국내 유통 및 수출하고 있는 주력 품종이다.

한편, 상기 국화의 개화조절인자와 관련하여, 한국공개특허 제2001-0042756호에는 '개화 유전자좌 T(FT) 및 개화가 조절되는 유전자 변형식물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2004-0097423에는 '애기장대 유래의 개화시기를 조절하는 신규한 단백질과 이를 암호화한 디엔에이, 재조합 벡터, 형질 전환체 및 이를 이용한 식물의 개화시기 조절 방법'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이, 스탠다드 국화 유래의 개화시기 조절 유전자 CmFT에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 기술사항에 착안하여 안출된 것으로, 스탠다드 국화의 신마품종 유래의 식물의 개화시기를 조절하는 유전자 CmFT를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환 세포, 상기 재조합 벡터를 이용하여 단일 조건에서 식물체의 개화시기를 조절하는 방법, 상기 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환 식물체의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 형질전환 식물체를 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 국화 유래의 식물의 개화시기를 조절하는 CmFT 유전자와, 상기 CmFT 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터가 제공된다.

바람직하게는 상기 프로모터는 옥토파인 합성효소 전사 활성화 요소, 마노파인 합성효소 전사 활성화 요소와 프로모터로 구성된 슈퍼 프로모터인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환 세포가 제공된다.

바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 세포는 아그로박테리움 속 미생물인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또다른 측면에 따르면, 상기 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 단일 조건에서 식물체의 개화시기를 조절하는 방법이 제공된다.

바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 CmFT 유전자를 과발현시킴으로써 조기 개화를 유도하는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또다른 측면에 따르면, 상기 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터에 의하여 식물을 형질전환시켜 CmFT 유전자를 상기 식물체에서 과발현시키는 단계를 포함하는 단일조건에서 식물의 개화시기가 조절된 형질전환 식물체의 제조방법이 제공된다.

바람직하게는 본 발명에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:

상기 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터를 제조하는 제1 단계;

애기장대에 상기 제1 단계에서 제조된 재조합 벡터를 도입하는 제2 단계; 및

상기 재조합 벡터가 도입됨에 따라 CmFT 유전자가 과발현된 애기장대 형질전환체를 선별하는 제3 단계.

또한 상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또다른 측면에 따르면, 상기 방법으로 제조되는 단일조건에서 식물의 개화시기가 조절되는 형질전환 식물체가 제공된다.

바람직하게는 본 발명에 있어서 상기 식물체는 단일조건에서 조기개화가 유도되는 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 분리한 스탠다드 국화 신마품종(Chrysanthemum morifolium Jinba) 유래의 CmFT 유전자를 이용하는 경우 식물의 개화시기를 조절할 수 있게 된다. 따라서 본 발명에 따르면, 상기 CmFT 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 원예 및 화훼작물과, 식용작물 모두에 적용할 수 있고, 상기 CmFT 유전자를 포함한 식물체 과발현 재조합 벡터를 통해 개화시기를 조절함으로써 조기개화를 통해 꽃과 종자 수확을 위한 생육시간과 생산비용의 감축이나 생산량의 증대를, 만기개화를 통해 영양생장 기간을 확장함으로써 잎이나 줄기를 이용하는 식물의 생산량 증대 효과를 기대할 수 있다. 특히 상기 CmFT 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체 내에 도입함으로써 단일조건에서 조기개화를 유도하여 단일식물 뿐만 아니라 장일 식물의 단일 조건에서의 조기 개화를 통한 식물의 생육 기간 감축과 생산 비용의 절감을 통해 생산량 증대 효과를 가져올 수 있게 된다.

뿐만 아니라 본 발명에서 분리한 CmFT 유전자는 국화를 포함한 단일식물의 개화 조절기작 규명에 매우 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 분리된 신규의 CmFT 단백질의 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 제작된, 칼리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터와, CmFT 유전자를 삽입한 식물체 과발현을 위한 재조합 벡터의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 제작된, 옥토파인 합성효소 전사 활성화 요소와 만노파인 합성효소 전사 활성화 요소와 프로모터로 구성된 슈퍼 프로모터와, CmFT 유전자를 삽입한 식물체 과발현을 위한 재조합 벡터의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 이용된, 옥토파인 합성효소 전사 활성화 요소와 만노파인 합성효소 전사 활성화 요소와 프로모터로 구성된 슈퍼 프로모터의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 슈퍼 프로모터를 이용한 CmFT 과발현 재조합 벡터를 도입한 애기장대 형질전환체에서 CmFT의 과발현량을 RT-PCR 방법으로 야생형과 비교 조사한 결과를 나타낸 것이다(대조군: TUB4).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 야생형과 슈퍼 프로모터를 이용한 CmFT 과발현 재조합 벡터를 도입한 형질전환 애기장대에서 장일 및 단일 조건에서의 꽃대 형성 시기를 로제트잎의 수와 파종 후 개화날짜를 측정하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 야생형과 슈퍼 프로모터를 이용한 CmFT 과발현 재조합 벡터를 도입한 형질전환 애기장대에서, 장일 및 단일 조건에서 파종 후 26일차, 33일차, 47일차 조기개화 표현형을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은, 서열번호 1로 표시되는 염기서열 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 국화 유래의 식물의 개화시기를 조절하는 CmFT 유전자와, 상기 CmFT 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는, CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 CmFT 유전자는 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열 또는 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열 또는 상기 서열번호 2로 표시된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한 본 발명에 따른 국화의 개화 조절 인자 CmFT 유전자는 보존된 PEBP (Phosphatidyl Ethanolamine-Binding Protein) 도메인을 가지고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 국화에서 개화시기 조절에 관여하는 유전자를 탐색하기 위하여, 스탠다드 국화 신마품종(Chrysanthemum morlifolium Jinba)의 cDNA library로부터 CmFT 코딩영역을 클로닝하고, 클로닝 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다. 상기 CmFT 유전자의 염기서열은 서열번호 1로, 상기 CmFT 유전자의 아미노산 서열은 서열번호 2에 기재되어 있다. 상기 분석된 염기서열로 기존에 보고된 국화의 CmFT와 다른 식물체의 FT 유전자들과의 계통분류학적 분석을 시도한 결과, 상기 분리된 CmFT는 애기장대의 FT와 아미노산 서열이 72% 유사했으며, 상추속 (Lactuca sativa)의 식물의 FT 유전자들과 계통분류학적으로 가장 가까운 것으로 확인되었다(97%).

본 발명의 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, DNA를 복제하고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 재조합 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서 재조합 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입 시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 재조합 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.

상기 통상의 벡터는 본 발명의 유전자를 도입할 수 있는 것이면 어떠한 것이든 무방하나, 바람직하게는 pCAMBIA 계열 또는 pGA계열의 벡터, 예컨대, pGA3383, pCAMBIA1381, pCAMBIA1391, pCAMBIA3300, pGWB3, pGA3426, pGA3428, pGA3438, pGA2715, pGA2717 와 같이 Ti-plasmid에서 파생된 벡터로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 보다 바람직하게는 pCAMBIA3300 이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 용어 "유전자 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 용어 "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터로, 특히 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 프로모터의 예로는, 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워크 모자이크 바이러스 (FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는, 상기 CmFT 유전자와, 상기 CmFT 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터를 pCAMBIA3300에 삽입하여 과발현 조절용 재조합 벡터를 제조하였다. 이 때, 상기 프로모터로는 옥토파인 합성효소 전사 활성화 요소, 마노파인 합성효소 전사 활성화 요소와 프로모터로 구성된 슈퍼 프로모터를 사용하였고, 상기 슈퍼 프로모터를 삽입하여 제조된 재조합 벡터에 의하여 단일조건에서 조기개화가 두드러지게 나타나는 것을 확인하였다. 이러한 슈퍼 프로모터는 서열번호 3으로 표시된다.

또한, 본 발명은 상기 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환 세포를 제공한다.

상기한 재조합 벡터는 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 전기천공 및 형질전환과 같은 주지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 숙주 세포는 아그로박테리움 속 미생물인 형질전환 세포가 제공될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 단일 조건에서 식물체의 개화시기를 조절하는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법에 따르면 상기 CmFT 유전자가 과발현됨으로써 단일조건에서 식물체의 조기 개화를 유도한다.

본 발명에 있어서, 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미하는 것으로, 상기 형질전환 방법은 반드시 재생 또는 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 임의의 식물 세포가 이용가능하다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양세포의 어떤 형태도 가능하다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 줄기, 잎, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터에 의하여 식물을 형질전환시켜 CmFT 유전자를 상기 식물체에서 과발현시키는 단계를 포함하는, 단일조건에서 식물의 개화시기가 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 본 발명의 방법에 따르면, 상기 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터를 제조하는 제1 단계; 애기장대에 상기 제1 단계에서 제조된 재조합 벡터를 도입하는 제2 단계; 및 상기 재조합 벡터가 도입됨에 따라 CmFT 유전자가 과발현된 애기장대 형질전환체를 선별하는 제3 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CmFT 재조합 벡터를 제조한 뒤, 아그로박테리움을 이용한 floral dipping 방법을 통해 애기장대에 도입하여 형질전환된 식물체를 선별하였다. 선별된 형질전환 식물체의 total RNA로부터 CmFT의 발현량을 조사하여 CmFT의 과발현을 확인하였고, CmFT를 과발현시킨 형질전환 애기장대는 단일 조건에서 조기 개화를 관찰할 수 있었다.

이 때, 상기 CmFT의 발현량 분석은 RT-PCR을 통해 조사되며, 상기 RT-PCR용 특이적 프라이머 세트는 다음과 같다.

Forward primer 5'-ATGCCGAGGGAAAGGGAT-3' (서열번호 4)

Reverse primer 5'-TTATCTCCGTCGTCCACCAA-3' (서열번호 5)

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조되는 단일조건에서 식물의 개화시기가 조절된 형질전환 식물체를 제공한다. 상기 식물체는 단일조건에서 조기개화가 유도된다. 이러한 식물체의 예로는, 코스모스, 포인세티아, 칼랑코에, 만생종 샐비어, 부발디아, 카네이션, 장미, 페튜니아, 국화, 애기장대, 해바라기, 담배, 포플러, 목화, 벼, 녹두, 밀, 보리, 옥수수, 기장, 깨, 호박, 대두, 강낭콩, 완두, 감자, 카사바, 고구마, 유채, 토마토, 가지, 당근, 고추, 배추, 무, 수박, 오이, 멜론, 쑥갓, 시금치, 양배추, 딸기 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하기로 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

CmFT 유전자의 분리 및 서열 분석

본 실시예에서는 국화에서 개화시기 조절에 관여하는 유전자를 탐색하기 위하여, 스탠다드국화 (Chrysanthemum morifolium) 신마품종(Jinba)의 잎과 꽃기관의 total RNA로부터 합성한 cDNA library로부터 를 원형으로 기존에 보고된 타 식물체의 FT 유사유전자로부터 제작한 전사개시부분 및 전사종결부분의 증폭 프라이머로 국화 신마품종(Jinba)의 신규 FT 유사유전자를 PCR로 증폭, 분리하였다. 분리한 신규 FT 유사유전자를 클로닝 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하고, 이 신규 유전자를 CmFT라고 명명하였다.

도 1은 상기 CmFT 유전자의 염기서열과, 상기 분석한 염기서열을 바탕으로 유추된 아미노산의 염기서열을 나타내었다.

또한 분석된 염기서열로 기존에 보고된 국화의 CmFT와 다른 식물체의 FT 유전자들과의 계통분류학적으로 분석하였다. 구체적으로, 상기 유추한 아미노산 서열을 데이터베이스에서 탐색하여 유사 유전자들을 검색한 결과, 기존에 보고된 국화의 CmFT를 포함한 타 식물체들의 FT 유사 유전자들이 검색되었고, 상기 CmFT와 검색된 FT 유전자들의 아미노산 서열로부터 Clustal W를 이용하여 계통분류학적 분석을 시도하였다.

그 결과, 스탠다드 국화 신마품종의 CmFT는 애기장대의 FT의 아미노산 서열과 약 72% 유사성을 나타내었으며, 상추속 (Lactuca sativa)의 식물의 FT 유전자들과 계통분류학적으로 가장 가까운 것으로 확인되었다(97%).

또한 상기 아미노산을 코딩하고 하는 염기서열을 분석한 결과, 스탠다드 국화 신마품종 특이적으로 보이는 111번째 뉴클레오타이드 C는 T로, 270번째 뉴클레오타이드 T는 C로, 465번째 뉴클레오타이드 A는 G로 치환된 서열을 발견하였다. 이로써 상기 CmFT는 스탠다드 국화의 개화 조절에 최적화된 CmFT일 것으로 추정·확인되었다.

<실시예 2>

CmFT 개화조절인자의 식물체 내 발현을 위한 재조합 벡터의 구축

상기 실시예 1에서 분리된 CmFT 유전자를 식물형질전환용 벡터인 pCAMBIA3300을 바탕으로, 식물 내 과발현 프로모터로서 CaMV 35S 프로모터와 Super 프로모터를 각각 삽입하여 국화 내 CmFT 과발현을 위한 재조합 벡터를 제조하였다.

도 2 및 도 3에 CaMV 35S 프로모터를 삽입한 재조합 벡터의 모식도와 Super 프로모터를 삽입한 재조합 벡터의 모식도를 나타내었다.

도 4는 상기 Super 프로모터의 염기서열을 나타내었다.

<실시예 3>

CmFT 과발현 형질전환 애기장대의 선별과 형질전환 애기장대의 CmFT 발현량 분석

상기 실시예 2에서 제조된, Super 프로모터가 삽입된 재조합 벡터(도 3)를, 아그로박테리움을 이용한 floral dipping 방법으로 애기장대에 도입하고 형질전환체를 항생제를 이용하여 선별하였다. 선별된 형질전환체들을 대상으로 CmFT 발현량을 조사하였다. CmFT 발현량은 개화한 시점의 전체 식물체로부터 total RNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 조사하였다. 대조군으로 TUB4 유전자를 사용하였다.

상기 RT-PCR에 사용된 프라이머 세트는 다음과 같다.

Forward primer 5'-ATGCCGAGGGAAAGGGAT-3' (서열번호 4)

Reverse primer 5'-TTATCTCCGTCGTCCACCAA-3' (서열번호 5)

도 3의 재조합 벡터를 포함한 아그로박테리움을 이용하여 재조합 벡터가 애기장대 게놈의 각기 다른 위치에 삽입된 독립적인 30 라인 이상의 개체를 획득하였고, 이들 중에서 도 5에 나타난 바와 같이 CmFT 발현량이 높은 두 라인, SUPERpro-7과 SUPERpro-17을 선별하였다.

도 5는 상기 CmFT 발현량의 분석 결과를 나타낸 것으로, 도 5에 나타난 바와 같이 CmFT 유전자는 야생형에서 전혀 발현되지 않았으며, 선별된 형질전환 식물체에서 CmFT 유전자가 과발현되고 있음을 확인할 수 있다.

<실시예 4>

CmFT 과발현 형질전환 애기장대의 개화시기 조사와 CmFT 의 개화조절 기능 분석

본 실시예에서는 CmFT 과발현 형질전환 애기장대의 개화 표현형을 조사하기 위해 CmFT 과발현을 확인한 형질전환체를 단일조건에서 생육하여 개화시기 변화를 분석하였다.

즉, 애기장대는 장일조건에 개화를 촉진하는 장일식물이므로 장일조건뿐만 아니라 보다 정확한 CmFT의 효과를 알아보기 위해 단일조건에서도 야생형과 CmFT 과발현 형질전환체를 생육하고 꽃대 형성 시점, 개화시점의 본엽의 수와 파종 후 날짜를 분석하였다.

분석결과 및 사진은 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7을 참고하면, 야생형과 Super 프로모터 하에서 CmFT를 과발현시킨 형질전환 애기장대는 장일 조건에서 개화시기의 큰 차이를 보이지 않았지만, 단일 조건에서 야생형에 비해 더욱 두드러진 조기개화를 확인할 수 있다.

구체적으로 도 6을 참고하면, 단일 조건에서 Super 프로모터가 삽입된 도 3의 재조합 벡터를 이용한 형질전환체는 야생형에 비해 꽃대 발생 시점이 파종 후 27일 이른 것으로 확인되었다(야생형 파종 후 54일, CmFT 형질전환체 파종 후 26~27일). 또한 꽃대 발생 시점의 본엽 수도, CmFT 형질전환체는 야생형에 비해 20 장 적은 것으로 확인되었다(야생형 30 장, CmFT 형질전환체 10~11 장).

이러한 결과로부터 본 발명에 따른 CmFT 과발현 형질전환체는 절대적인 조기개화 일수의 감축 및 영양생장에서 생식생장에의 기간이 단축되는 것을 확인할 수 있는바, 본 발명에서 분리한 개화시기 조절인자 CmFT 에 의하여 효과적으로 조기개화 형질이 조절되었음을 의미한다. 특히, Super 프로모터를 도입한 형질전환체에서 다른 프로모터의 조절 하에서 보다 더 효과적인 조기개화 형질을 나타내었으며 이들의 구별된 사용을 통한 적절한 조기개화 조절에 이용할 수 있다.

또한, 장일 식물의 단일 조건에서의 조기 개화 효과가 두드러지는 것을 확인할 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Dong-A University <120> Chrysanthemum flowering locus T gene CmFT, and method of manipulation for short-day flowering using the same <130> HP-0984 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 525 <212> DNA <213> CmFT <400> 1 atgccgaggg aaagggatcc attggttgtt ggacgtgtaa ttggcgatgt tcttgatagt 60 ttcaccaagt caatcaacct ctctgtgtcc tataatgata gggaagttgc taacgggtgt 120 gagctaaaac cctctaaggt tgtgaaccaa ccgagagttg atatcggagg tgatgatatg 180 cgcgcatttc acacattagt gatggtagat cctgatgctc caagtcctag tgaccctaac 240 ttaagggaat acttacactg gttggttacc gatattccag cgacaacagg agcacagttt 300 ggtcaagaaa ttgtgtgcta tgagagccca aggccatcaa tgggaattca tcgcatggtt 360 tttgtgctat tccggcaatt gggtcgacaa actgtgtacg ccccaggatg gcgccagaac 420 ttcaacacca aagactttgc ggagctctac aacctcggat ctccggtagc cgcggtttat 480 tttaactgtc aacgggaaag tggatttggt ggacgacgga gataa 525 <210> 2 <211> 174 <212> PRT <213> CmFT <400> 2 Met Pro Arg Glu Arg Asp Pro Leu Val Val Gly Arg Val Ile Gly Asp 1 5 10 15 Val Leu Asp Ser Phe Thr Lys Ser Ile Asn Leu Ser Val Ser Tyr Asn 20 25 30 Asp Arg Glu Val Ala Asn Gly Cys Glu Leu Lys Pro Ser Lys Val Val 35 40 45 Asn Gln Pro Arg Val Asp Ile Gly Gly Asp Asp Met Arg Ala Phe His 50 55 60 Thr Leu Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser Asp Pro Asn 65 70 75 80 Leu Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val Thr Asp Ile Pro Ala Thr Thr 85 90 95 Gly Ala Gln Phe Gly Gln Glu Ile Val Cys Tyr Glu Ser Pro Arg Pro 100 105 110 Ser Met Gly Ile His Arg Met Val Phe Val Leu Phe Arg Gln Leu Gly 115 120 125 Arg Gln Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe Asn Thr Lys 130 135 140 Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Ser Pro Val Ala Ala Val Tyr 145 150 155 160 Phe Asn Cys Gln Arg Glu Ser Gly Phe Gly Gly Arg Arg Arg 165 170 <210> 3 <211> 1162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Super promoter <400> 3 aagcttgata tgaattccgg tatcgcgata agctcgcgga tccctgaaag cgacgttgga 60 tgttaacatc tacaaattgc cttttcttat cgaccatgta cgtaagcgct tacgtttttg 120 gtggaccctt gaggaaactg gtagctgttg tgggcctgtg gtctcaagat ggatcattaa 180 tttccacctt cacctacgat ggggggcatc gcaccggtga gtaatattgt acggctaaga 240 gcgaatttgg cctgtaggat ccctgaaagc gacgttggat gttaacatct acaaattgcc 300 ttttcttatc gaccatgtac gtaagcgctt acgtttttgg tggacccttg aggaaactgg 360 tagctgttgt gggcctgtgg tctcaagatg gatcattaat ttccaccttc acctacgatg 420 gggggcatcg caccggtgag taatattgta cggctaagag cgaatttggc ctgtaggatc 480 cctgaaagcg acgttggatg ttaacatcta caaattgcct tttcttatcg accatgtacg 540 taagcgctta cgtttttggt ggacccttga ggaaactggt agctgttgtg ggcctgtggt 600 ctcaagatgg atcattaatt tccaccttca cctacgatgg ggggcatcgc accggtgagt 660 aatattgtac ggctaagagc gaatttggcc tgtaggatcc gcgagctggt caatcccatt 720 gcttttgaag cagctcaaca ttgatctctt tctcgatcga gggagatttt tcaaatcagt 780 gcgcaagacg tgacgtaagt atccgagtca gtttttattt ttctactaat ttggtcgttt 840 atttcggcgt gtaggacatg gcaaccgggc ctgaatttcg cgggtattct gtttctattc 900 caactttttc ttgatccgca gccattaacg acttttgaat agatacgctg acacgccaag 960 cctcgctagt caaaagtgta ccaaacaacg ctttacagca agaacggaat gcgcgtgacg 1020 ctcgcggtga cgccatttcg ccttttcaga aatggataaa tagccttgct tcctattata 1080 tcttcccaaa ttaccaatac attacactag catctgaatt tcataaccaa tctcgataca 1140 ccaaatcgac tctaggggta cc 1162 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 4 atgccgaggg aaagggat 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 5 ttatctccgt cgtccaccaa 20

Claims (10)

1. 식물형질전환용 벡터 pCAMBIA3300;
   서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고 국화 유래의 식물의 개화시기를 조절하는 CmFT 유전자; 및
   상기 CmFT 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터;를 포함하는 재조합 벡터이고,
   상기 CmFT 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 55 내지 492번째 염기서열에 해당되는 보존된 PEBP 도메인을 포함하며,
   상기 프로모터는 옥토파인 합성효소 전사 활성화 요소, 마노파인 합성효소 전사 활성화 요소와 프로모터로 구성된 슈퍼 프로모터인 것을 특징으로 하고,
   상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환체는 파종 후, 26~27일 후에 꽃대가 발생하는 것을 특징으로 하는, CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터.
2. 삭제
3. 제1항에 따른 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환 세포.
4. 제3항에 있어서,
   상기 세포는 아그로박테리움 속 미생물인 형질전환 세포.
5. 제1항에 따른 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 단일 조건에서 식물체의 개화시기를 조절하는 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 CmFT 유전자를 과발현시킴으로써 조기 개화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 식물체의 개화시기를 조절하는 방법.
7. 제1항에 따른 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터에 의하여 식물을 형질전환시켜 CmFT 유전자를 상기 식물에서 과발현시키는 단계를 포함하는, 단일조건에서 식물의 개화시기가 조절된 형질전환 식물체의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법:
   제1항에 따른 CmFT 유전자를 포함한 재조합 벡터를 제조하는 제1 단계;
   애기장대에 상기 제1 단계에서 제조된 재조합 벡터를 도입하는 제2 단계; 및
   상기 재조합 벡터가 도입됨에 따라 CmFT 유전자가 과발현된 애기장대 형질전환체를 선별하는 제3 단계.
9. 제7항의 방법으로 제조되는 단일조건에서 식물의 개화시기가 조절된 형질전환 식물체.
10. 삭제

Images