CN116803402B

CN116803402B - 治疗糖尿病的中药组合物及制备方法

Info

Publication number: CN116803402B
Application number: CN202310716938.2A
Authority: CN
Inventors: 邓小宽; 周维
Original assignee: Chengdu Zhibiao Pure Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Zhibiao Pure Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-06-16
Filing date: 2023-06-16
Publication date: 2025-01-28
Anticipated expiration: 2043-06-16
Also published as: CN116803402A

Abstract

本发明公开了治疗糖尿病的中药组合物，属于中药领域，按照重量份，包括：杜仲叶精提物：501～1746份；桑叶精提物：885～2700；肉苁蓉总苷：528～2600；葛根总黄酮：398～1880；女贞子精提物：620～2200；所述的杜仲叶精提物为酚酸和苷类成份含量大于50％的精提物；所述的桑叶精提物为黄酮和生物碱成分含量大50％的精提物；所述的肉苁蓉总苷指的是从肉苁蓉药材中提取的含有重量百分含量为50％以上苷类成分的精提物；所述的葛根总黄酮指的是从葛根药材中提取的含有重量百分含量为50％以上总黄酮类成分的精提物。女贞子精提物为从女贞子提取，苷类成分和三萜酸成分含量大于50％重量百分比的精提物。

Description

治疗糖尿病的中药组合物及制备方法

技术领域

本发明涉及中药组合物领域。

背景技术

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征。

近年来发现一些重要在治疗糖尿病有较好的效果，但是单个中药对治疗糖尿病效仍不理想，制备合适配方的中药组合物至关重要

杜仲叶精提物富含酚酸类成分和木脂素苷类成分，二者均具有抑制脂肪酶和葡萄糖苷酶的活性，而且可以提高人体免疫力，增强体质作用。桑叶精提物中总生物碱具有很好的抑制葡萄糖吸收的作用，总黄酮可以改善血管微循环，抗氧化等作用。肉苁蓉总苷具有很好的抗氧化、保肝、改善肾功能的作用。葛根总黄酮可以保护血管，改善微循环，提高机体免疫力。女贞子精提物中，三萜酸可以减少胰岛素抵抗，改善胰岛素敏感性，总苷改善血循环，提高免疫力。五种中药活性精提物组合使用，可以有效控制血糖浓度，减少胰岛素抵抗，同时保护肝肾功能，改善人体体质，具有标本兼治的功效。上述各精提物的提取工艺对其性能有着至关重要的影响，寻找合适的提取工艺以及中药组合物成为制备糖尿病中药的难点。

发明内容

本申请的目的在于，针对现有技术当中存在的问题，公开了一种治疗糖尿病的中药组合物，它是由如下重量份的原料制成：

杜仲叶精提物：501—1746

桑叶精提物：885—2700

肉苁蓉总苷：528—2600

葛根总黄酮：398-1880

女贞子精提物：620-2200

杜仲叶精提物由杜仲叶经水提或者含水乙醇提取精制，酚酸和苷类成分含量大于50%重量百分比。

桑叶精提物由桑叶经水提精制而成，其活性成分由总生物碱和总黄酮组成，总活性成分含量大于50%重量百分比。

肉苁蓉总苷由肉苁蓉由水或者含水乙醇提取精制，其总苷成分含量大于50%重量百分比。

葛根总黄酮由水或者含水乙醇提取精制，其黄酮成分含量大于50%重量百分比。

女贞子精提物由水或者含水乙醇提取精制，其苷类成分和三萜酸成分含量大于50%重量百分比。

在一个具体的实施方案当中，所述杜仲叶精提物按照以下方法制备：

1）取杜仲叶药材粉末，按照重量加入10-15倍浓度为0%-70%的乙醇溶液，加热回流提取1-3次，每次0.5-2小时，合并提取液。

2）将提取液降压浓缩至无醇味，通过大孔树脂，先用去离子水洗脱至流出液透明，然后用浓度为20%-70%乙醇溶液洗脱4-6倍柱体积，收集20%-70%的乙醇洗脱液。

3）将20%-70%乙醇洗脱液浓缩至无醇味，通过MCI GEL反相树脂柱，0%-10%乙醇洗脱3-4倍柱体积，弃去，30%-60%乙醇洗脱5-6倍柱体积，HPLC检测，收集富含多酚和苷类的洗脱液，浓缩干燥，得到酚酸和总苷含量50%-90%的精提物。

4）杜仲叶精提物的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂是AB-8型或者D101型大孔吸附树脂。所述MCI GEL反相填料为50-75u或者30-50u。

在一个具体的实施方案当中，所述桑叶精提物按照以下方法制备：

1）取桑叶药材，按照重量加入10-15倍去离子水，加热回流提取1-3次，每次0.5-2小时，合并提取液。

2）将提取液过滤，通过大孔树脂，先用去离子水洗脱至流出液透明，然后用浓度为20%-70%乙醇溶液洗脱4-6倍柱体积，收集流出液和20%-70%的乙醇洗脱液。

3）将流出液通过阳离子交换树脂，先用去去离子水洗脱至流出液透明，然后用PH9-11氨水溶液洗脱4-6倍柱体积，收集氨水洗脱液。

4）氨水洗脱液和20%-70%乙醇洗脱液合并，浓缩干燥得到黄酮和生物碱含量50%-80%的桑叶精提物。

在一个具体的实施方案当中，所述肉苁蓉总苷按照以下方法制备：

1）取肉苁蓉药材粉末，按照重量加入10-15倍浓度为30%-90%的乙醇溶液，加热回流提取1-3次，每次0.5-2小时，合并提取液。

2）将提取液降压浓缩至无醇味，通过大孔树脂，先用水或浓度不超过10%的乙醇溶液洗脱至流出液透明，然后用浓度为20%-60%乙醇溶液洗脱4-6倍柱体积，收集20%-60%的乙醇洗脱液。

3）将20%-60%乙醇洗脱液浓缩至无醇味，通过MCI GEL反相树脂柱，5%-20%乙醇洗脱3-4倍柱体积，弃去，40%-70%乙醇洗脱5-6倍柱体积，HPLC检测，收集富含松果菊苷、肉苁蓉苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的洗脱液，浓缩干燥，得到含量50%-90%的肉苁蓉总苷。

4）肉苁蓉的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂是AB-8型或者D101型大孔吸附树脂。所述MCI GEL反相填料为50-75u或者30-50u。

在一个具体的实施方案当中，所述葛根总黄酮按照以下方法制备：

1）取葛根药材，按照重量加入10-15倍浓度为30%-90%的乙醇溶液，加热回流提取1-3次，每次0.5-2小时，合并提取液。

2）将提取液降压浓缩至无醇味，通过大孔树脂，先用水或浓度不超过10%的乙醇溶液洗脱至流出液透明，然后用浓度为30%-70%乙醇溶液洗脱4-6倍柱体积，HPLC检测，收集富含葛根素、3-羟基葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷等黄酮的洗脱液，浓缩干燥，得到含量50%-90%的葛根总黄酮。

4）葛根总黄酮的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂是AB-8型或者D101型大孔吸附树脂。

在一个具体的实施方案当中，所述女贞子精提物按照以下方法制备：

1）取女贞子药材，按照重量加入10-15倍浓度为60%-90%的乙醇溶液，加热回流提取1-3次，每次0.5-2小时，合并提取液；

2）将提取液通过大孔树脂，用相同浓度乙醇溶液洗脱至流出液无色，然后浓缩至乙醇浓度小于40%-50%，放置过夜，过滤，收集淡黄色滤饼；

3）滤液继续浓缩至无醇味，通过大孔树脂，先用水或浓度不超过10%的乙醇溶液洗脱至流出液透明，再用浓度为30%-70%乙醇溶液洗脱4-6倍柱体积，HPLC检测，收集富含特女贞苷、红景天苷等苷类成分的洗脱液，浓缩干燥，与上述淡黄色滤饼均匀混合，得到含量50%-90%的苷类和三萜酸精提物。

4）女贞子的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂是AB-8型或者D101型大孔吸附树脂。

本申请提供了一种五味药材有效成分的组合物，该组合物具有较强的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTPlB抑制活性，可用于制备预防和治疗糖尿病等由胰岛素抵抗引起的疾病的药物。

经体外PTPlB酶抑制活性的测试，组合物最佳比例组合物的总抑制活性IC₅₀为1.8ug／mL。此外，动物试验发现，本发明对四氧嘧啶诱发的糖尿病小鼠模型具有明显的降血糖和减少饮水量、排尿样的作用，并且三个月给药后维持小剂量给药，一个月内，90%以上的小鼠的血糖水平可以基本保持稳定。可见本发明提供的中药组合物有强PTPlB抑制活性，对于开发制备预防和治疗糖尿病等由胰岛素抵抗引起的疾病的药物和保健产品是可行的。

药效和毒理研究结果表明，本发明的组合物具有明显的降糖作用，其药效活性明显优于组合物中各单味药材精提物使用者，且安全无明显毒副反应。

该组合物可以在对血糖水平进行有效的控制的同时，改善肝肾功能，增加胰岛素敏感性，减低胰岛素抵抗，提高机体免疫力。根据该组合物的作用机理及其活性强度，可以作为II型糖尿病的防治药。

本发明制备工艺简单、易于大规模生产，所得精提物的有效成分含量高达50%以上，技术先进，质量可控。本发明采用最新的材料结合优化的工艺条件，使产品的质量得到大大的提高，而且操作简单，易于放大。

具体实施方式

下面对本发明作详细的说明。

一、精提物提取

1、杜仲叶精提物提取

1）取杜仲叶药材粉末，按照重量加入10倍浓度为50%的乙醇溶液，加热回流提取3次，每次1小时，合并提取液。

2）将提取液降压浓缩至无醇味，通过D101大孔树脂，先用去离子水洗脱至流出液透明，然后用浓度为60%乙醇溶液洗脱6倍柱体积，收集60%的乙醇洗脱液。

3）将将60%乙醇洗脱液浓缩至无醇味，通过50-70微米的MCI GEL反相树脂柱，10%乙醇洗脱4倍柱体积，弃去，50%乙醇洗脱5-6倍柱体积，HPLC检测，收集富含多酚和苷类的洗脱液，浓缩干燥，得到酚酸和总苷含量68%的精提物。

2、桑叶精提物提取

1）取桑叶药材，按照重量加入12倍去离子水，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液。

2）将提取液过滤，通过AB-8大孔树脂，先用去离子水洗脱至流出液透明，然后用浓度为55%乙醇溶液洗脱6倍柱体积，收集流出液和55%的乙醇洗脱液。

3）将流出液通过阳离子交换树脂，先用去去离子水洗脱至流出液透明，然后用PH10氨水溶液洗脱5倍柱体积，收集氨水洗脱液。

4）氨水洗脱液和55%乙醇洗脱液合并，浓缩干燥得到黄酮和生物碱含量65%的桑叶精提物。

2、肉苁蓉总苷提取

所述肉苁蓉总苷按照以下方法制备：

1）取肉苁蓉药材粉末，按照重量加入10倍浓度为50%的乙醇溶液，加热回流提取3次，每次1小时，合并提取液。

2）将提取液降压浓缩至无醇味，通过D101大孔树脂，先用水洗脱至流出液透明，然后用浓度为50%乙醇溶液洗脱5倍柱体积，收集50%的乙醇洗脱液。

3）将将50%乙醇洗脱液浓缩至无醇味，通过MCI GEL反相树脂柱，10%乙醇洗脱3-4倍柱体积，弃去，40%乙醇洗脱6倍柱体积，HPLC检测，收集富含松果菊苷、肉苁蓉苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的洗脱液，浓缩干燥，得到含量71%的肉苁蓉总苷。

4、葛根总黄酮提取

所述葛根总黄酮按照以下方法制备：

1）取葛根药材，按照重量加入10倍浓度为50%的乙醇溶液，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液。

2）将提取液降压浓缩至无醇味，通过AB-8大孔树脂，先用水洗脱至流出液透明，然后用浓度为50%乙醇溶液洗脱6倍柱体积。

3）将50%乙醇洗脱液浓缩至无醇味，通过MCI GEL反相树脂柱，10%乙醇洗脱3-4倍柱体积，弃去，40%乙醇洗脱6倍柱体积，HPLC检测，收集富含葛根素、3-羟基葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷等黄酮的洗脱液，浓缩干燥，得到含量68%的葛根总黄酮。

5、女贞子精提物提取

所述女贞子精提物按照以下方法制备：

1）取女贞子药材，按照重量加入12倍浓度为90%的乙醇溶液，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液。

2）将提取液通过D101大孔树脂，用相同浓度乙醇溶液洗脱至流出液无色，然后浓缩至乙醇浓度小于50%，放置过夜，过滤，收集淡黄色滤饼。

3）滤液继续浓缩至无醇味，通过大孔树脂，先用10%的乙醇溶液洗脱至流出液透明，再用浓度为50%乙醇溶液洗脱6倍柱体积，HPLC检测，收集富含特女贞苷、红景天苷等苷类成分的洗脱液，浓缩干燥，与上述淡黄色滤饼均匀混合，得到总含量62%的苷类和三萜酸精提物。

将制备的各种提取物以及提取物制备的进行如下测试。

二、PTPlB抑制活性测试

（一）测试原理：利用分子生物学手段在大肠杆菌系统表达人源蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B(hPTPlB)催化结构域，经纯化后的hPTPlB重组蛋白能水解底物对硝基苯基磷酸酯(PNPP)的磷酯键，得到的产物在410nnl处有很强的光吸收，因此可以通过直接检测410nm处光吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况。标准的测活体系如下：10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，PH7.6，10mM 对硝基苯基磷酸酯，2％二甲亚砜(DMSO)，100nM hPTPlB。

（二）观察指标：动态测定波长为410 nlm处的光吸收，时间为3分钟，其动力学曲线一级反应的斜率作为酶的活性指标。

（三）样品测试：将所有被测样品杜仲叶精提物、桑叶精提物、肉苁蓉总苷、葛根总黄酮和女贞子精提物及特定比例组合物用DMSO配成lmg/ml溶液，从中取2uL的样品放入一微孔，然后加入2uL的底物PNPP，93uL的缓冲液，5uL的PTPlB酶，摇匀后放入酶标仪读取数据，经数据处理得到抑制率。对抑制活性高于50％时，再配制系列浓度如l0ug/mL，5ug/mL，1ug/mL，0.5ug/mL，0.1ug/mL等，测试抑制率，经数据处理得出IC50值。阳性对照品为正钒酸钠(4ug/mL的DMSO溶液)。

测试结果：杜仲叶精提物的抑制活性IC50为6.1ug／mL，桑叶精提物的抑制活性IC50为2.9ug／mL，肉苁蓉总苷的抑制活性IC50为4.6ug／mL，葛根总黄酮的抑制活性IC50为3.8ug／mL，女贞子精提物的抑制活性IC50为2.6ug／mL。

五者混合组合物的总抑制活性IC50为1.8ug／mL，其中组合物中杜仲叶精提物、桑叶精提物、肉苁蓉总苷、葛根总黄酮、女贞子精提物比例为0.5:1:0.5:1:1。

三、药理活性实验

1、精提物和组合物对四氧嘧啶诱发的糖尿病模型小鼠糖耐量的影响：

雄性四氧嘧啶诱发的糖尿病模型小鼠80只，体重23-26g，以生理盐水为空白对照；60mg/kg正钒酸钠水溶液为阳性对照；受试样品为杜仲叶精提物、桑叶精提物、肉苁蓉总苷、葛根总黄酮、女贞子精提物和五者同质量比例的组合物，根据本实施例的方法制备，模型小鼠随机分为8组，每组10只，分别灌服生理盐水、正钒酸钠水溶液(60mg/kg)和受试样品的1％羧甲基纤维素钠悬液，(200mg/kg)，每日一次，连续4周，末次给药后禁食12小时，灌服葡萄糖溶液(2g/kg)，30min后取血测定血糖。

试验结果见下表

从上表可以看出，对于四氧嘧啶诱发的糖尿病小鼠模型，五种中药精提物均有一定的降血糖作用，桑叶精提物组合女贞子精提物组比较显著，分别降低血糖32%和31%，且五者的组合物具有更加明显的增效作用，降低血糖达到了43%。单组分组与正钒酸钠对照组比较，有的药效较低，有的药效相当，而组合物组的药效则大大优于正钒酸钠对照组。

2五种中药精提物比例组合物对四氧嘧啶诱发的糖尿病模型小鼠糖耐量的影响：

雄性四氧嘧啶诱发的糖尿病模型小鼠130只，体重23-26g，以生理盐水为空白对照；60mg/kg正钒酸钠水溶液为阳性对照；五种精提物分别设置高低两个剂量，分别以两种精提物进行变化，其他三种精提物不变，首先以1:1:1:1:1为基准，受试样品组合分别杜仲叶精提物、桑叶精提物、肉苁蓉总苷、葛根总黄酮、女贞子精提物比例为0.5:0.5:1:1:1,0.5:1:0.5:1:1， 0.5:1:1:0.5:1, 0.5:1:1:1:0.5， 1:0.5:0.5:1:1， 1:0.5:1:0.5:1， 1:0.5:1:1:0.5， 1:1:0.5:0.5:1， 1:1:0.5:1:0.5， 1:1:1:0.5:0.5，共10组，进行筛选优化较佳比例。根据实施例1的方法制备，模型小鼠随机分为13组，每组10只，分别灌服生理盐水、正钒酸钠水溶液(60mg/kg)和受试样品的1％羧甲基纤维素钠悬液(200mg/kg)，每日一次，连续4周，末次给药后禁食12小时，灌服葡萄糖溶液(2g/kg)，30min后取血测定血糖。

试验结果见下表所示：

从上表可以看出，对于四氧嘧啶诱发的糖尿病小鼠模型，不同比例的组合物的均有较明显的降血糖作用，各不同比例组与正钒酸钠对照组比较均优于正钒酸钠对照组，而0.5:1:0.5:1:1组合物组的药效则大大优于正钒酸钠对照组，为最佳比例组合物，降低血糖达到了46%。

Claims

1.治疗糖尿病的中药组合物，其特征在于，按照重量份，由以下组分组成：

杜仲叶精提物：501～1746；

桑叶精提物：885～2700；

肉苁蓉总苷：528～2600；

葛根总黄酮：398～1880；

女贞子精提物：620～2200；

所述杜仲叶精提物的提取方法为：1）取杜仲叶药材粉末，按照重量加入10倍浓度为50%的乙醇溶液，加热回流提取3次，每次1小时，合并提取液；2）将提取液降压浓缩至无醇味，通过D101大孔树脂，先用去离子水洗脱至流出液透明，然后用浓度为60%乙醇溶液洗脱6倍柱体积，收集60%的乙醇洗脱液；3）将60%乙醇洗脱液浓缩至无醇味，通过50-70微米的MCI GEL反相树脂柱，10%乙醇洗脱4倍柱体积，弃去，50%乙醇洗脱5-6倍柱体积，HPLC检测，收集富含多酚和苷类的洗脱液，浓缩干燥，得到杜仲叶精提物；

所述桑叶精提物的提取方法为：1）取桑叶药材，按照重量加入12倍去离子水，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液；2）将提取液过滤，通过AB-8大孔树脂，先用去离子水洗脱至流出液透明，然后用浓度为55%乙醇溶液洗脱6倍柱体积，收集流出液和55%的乙醇洗脱液；3）将流出液通过阳离子交换树脂，先用去离子水洗脱至流出液透明，然后用PH10氨水溶液洗脱5倍柱体积，收集氨水洗脱液；4）氨水洗脱液和55%乙醇洗脱液合并，浓缩干燥得到桑叶精提物；

所述肉苁蓉总苷的提取方法为：1）取肉苁蓉药材粉末，按照重量加入10倍浓度为50%的乙醇溶液，加热回流提取3次，每次1小时，合并提取液；2）将提取液降压浓缩至无醇味，通过D101大孔树脂，先用水洗脱至流出液透明，然后用浓度为50%乙醇溶液洗脱5倍柱体积，收集50%的乙醇洗脱液；3）将50%乙醇洗脱液浓缩至无醇味，通过MCI GEL反相树脂柱，10%乙醇洗脱3-4倍柱体积，弃去，40%乙醇洗脱6倍柱体积，HPLC检测，收集富含松果菊苷、肉苁蓉苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的洗脱液，浓缩干燥，得到肉苁蓉总苷；

所述葛根总黄酮的提取方法为：1）取葛根药材，按照重量加入10倍浓度为50%的乙醇溶液，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液；2）将提取液降压浓缩至无醇味，通过AB-8大孔树脂，先用水洗脱至流出液透明，然后用浓度为50%乙醇溶液洗脱6倍柱体积；3）将50%乙醇洗脱液浓缩至无醇味，通过MCI GEL反相树脂柱，10%乙醇洗脱3-4倍柱体积，弃去，40%乙醇洗脱6倍柱体积，HPLC检测，收集富含葛根素、3-羟基葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷的洗脱液，浓缩干燥，得到葛根总黄酮；

所述女贞子精提物的提取方法为：1）取女贞子药材，按照重量加入12倍浓度为90%的乙醇溶液，加热回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液；2）将提取液通过D101大孔树脂，用相同浓度乙醇溶液洗脱至流出液无色，然后浓缩至乙醇浓度小于50%，放置过夜，过滤，收集淡黄色滤饼；3）滤液继续浓缩至无醇味，通过大孔树脂，先用10%的乙醇溶液洗脱至流出液透明，再用浓度为50%乙醇溶液洗脱6倍柱体积，HPLC检测，收集富含特女贞苷、红景天苷的洗脱液，浓缩干燥，与上述淡黄色滤饼均匀混合，得到女贞子精提物。