CN116789775A - 大豆转录因子GmGRAS487在植物耐盐性调控中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大豆转录因子GmGRAS487在植物耐盐性调控中的应用。本发明公开的大豆转录因子GmGRAS487，为氨基酸序列是序列2的蛋白质。本发明将转录因子GmGRAS487的编码基因转入受体大豆的毛状根中，得到转基因毛状根及转基因嵌合体，该转基因大豆毛状根与转空载体大豆毛状根相比，其耐盐性有显著提高。说明转录因子GmGRAS487及其编码基因可以调控植物耐盐性，对培育植物高耐盐性品种具有重要的理论和现实意义。

Description

大豆转录因子GmGRAS487在植物耐盐性调控中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，大豆转录因子GmGRAS487在植物耐盐性调控中的应用。

背景技术

环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、冷害、冻害、水涝等胁迫因素是造成农作物严重减产的原因之一。美国在1939年-1978年的40年间，保险业对作物减产的赔付统计数据表明，由于盐害及干旱引起减产的赔付比例约占40.8％，高于涝(16.4％)、低温(13.8％)、冰雹(11.3％)和风(7.0％)，更是远高于虫灾(4.5％)、病害(2.7％)和其他因素。因此，培育耐盐/旱性作物是种植业的主要目标之一。提高作物的耐盐/旱性，除了利用传统的育种方法，目前，分子遗传育种已经成为科技工作者所关注的领域之一。

GRAS结构域蛋白是植物特有的一类蛋白，一般包含400-700个氨基酸残基，至少可以分为13个亚家族。作为植物转录因子，该家族蛋白参与许多生物学过程，例如，赤霉素信号传导、根和茎的发育等等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的耐盐性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控植物耐盐性；

D2)制备调控植物耐盐性产品；

D3)培育耐盐性增强植物；

D4)制备培育耐盐性增强植物产品；

D5)植物育种；

所述蛋白质来源于大豆，其名称为GmGRAS487，为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的GmGRAS487蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的GmGRAS487蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的GmGRAS487蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1所示的DNA分子编码序列2所示的GmGRAS487蛋白质。

上述应用中，所述物质可为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码GmGRAS487的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低GmGRAS487表达量的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmGRAS487的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmGRAS487的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmGRAS487蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GmGRAS487蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmGRAS487蛋白质且具有GmGRAS487蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码GmGRAS487蛋白质的核酸分子的表达盒(GmGRAS487基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmGRAS487蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GmGRAS487基因转录的启动子，还可包括终止GmGRAS487基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述GmGRAS487基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pROKII载体或pZH01载体。

B3)所述重组载体具体可为pROKII-GmGRAS487。所述pROKII-GmGRAS487为将pROKII载体的BamHI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GmGRAS487基因得到的重组载体，能表达序列表中序列2所示的GmGRAS487与NPTⅡ所形成的融合蛋白质。

B9)所述重组载体具体可为pZH01-GmGRAS487-RNAi，pZH01-GmGRAS487-RNAi为将序列1的第1077位至1363位所示的DNA片段两次插入pZH01的多克隆位点间得到的重组载体，两次的插入片段方向相反。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如发根农杆菌K599。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

本发明还提供给了下述任一方法：

X1)培育耐盐性增强植物的方法，包括敲除受体植物中表达GmGRAS487的编码基因，或抑制受体植物中GmGRAS487编码基因的表达，或降低受体植物中GmGRAS487的含量，或降低受体植物中GmGRAS487的活性，得到耐盐性增强的目的植物；

X2)增强植物耐盐性的方法，包括敲除受体植物中表达GmGRAS487的编码基因，或抑制受体植物中GmGRAS487编码基因的表达，或降低受体植物中GmGRAS487的含量，或降低受体植物中GmGRAS487的活性，得到耐盐性增强的目的植物，实现植物耐盐性的增强。

上述方法中，X1)和X2)中抑制受体植物中GmGRAS487编码基因的表达可通过向所述受体植物导入抑制GmGRAS487编码基因的表达的核酸分子或表达所述核酸分子的重组载体实现。

上述方法中，所述编码基因可为B1)所述核酸分子。

上述方法中，其中所述GmGRAS487的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GmGRAS487的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述GmGRAS487的编码基因可利用含有所述GmGRAS487的编码基因的重组载体导入受体植物。所述重组载体具体可为所述pCAMBIA1301-GmGRAS487。

所述重组载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，显微注射，电穿孔，农杆菌介导等常规生物方法导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以干旱处理筛选转化植株。

所述目的植物理解为不仅包含GmGRAS487蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述受体植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

本发明还提供了增强植物耐盐性产品，所述产品含有GmGRAS487或所述调控所述蛋白质活性或含量的物质。

所述产品可以GmGRAS487或所述调控所述蛋白质活性或含量的物质为其活性成分，还可将GmGRAS487或所述调控所述蛋白质活性或含量的物质与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

GmGRAS487或所述调控所述蛋白质活性或含量的物质，也属于本发明的保护范围。

本发明中，所述耐盐性具体可为植物对NaCl模拟的高盐环境的耐性。所述NaCl模拟的高盐环境可为NaCl浓度为50mM-300mM(如100mM)的环境。

植物的耐盐性可通过植物的存活率、叶片萎蔫程度和/或叶片相对离子渗透率来体现。

本发明将转录因子GmGRAS487的编码基因转入受体大豆的毛状根中，得到转基因毛状根及转基因嵌合体，该转基因大豆毛状根与转空载体大豆毛状根相比，其耐盐性有显著提高。说明转录因子GmGRAS487及其编码基因可以调控植物耐盐性，对培育植物高耐盐性品种具有重要的理论和现实意义。

附图说明

图1为GmGRAS487在120mMNaCl处理下的转录模式。

图2为植物表达载体pROKII-GmGRAS487和pZH01-GmGRAS487-RNAi示意图。

图3为过表达GmGRAS487和GmGRAS487-RNAi大豆毛状根的分子鉴定。

图4为转GmGRAS487毛状根及嵌合体的耐盐表型。

图5为GmGRAS487转基因毛状根嵌合体盐胁迫下生理指标统计。*，p＜0.05；**，p＜0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的大豆科丰1号(Glycine max L.Merr.Kefeng 1)记载在W.K.Zhang,Y.J.Wang,G.Z.Luo,J.S.Zhang,C.Y.He,X.L.Wu,J.Y.Gai,S.Y.Chen,QTLmapping of ten agronomic traits on the soybean(Glycine max L.Merr.)geneticmap and their association with EST markers,Theor.Appl.Genet,2004,108:1131-1139中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，

大豆[Glycine max(L.)Merr]南农1138-2：南京农业大学国家大豆改良中心种质库，由南京农业大学国家大豆改良中心提供。

下述实施例中的表达载体pROKII载体(双元表达载体)记载在D.C.Baulcombe,G.R.Saunders,M.W.Bevan,M.A.Mayo and B.D.Harrison,Expression of biologicallyactive viral satellite RNA from the nuclear genome of transformedplants.Nature321(1986),pp.446–449中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；

pZH01载体，Stratagene公司，记载在Han Xiao,et al.Functional analysis ofthe rice AP3 homologue OsMADS16 by RNA interference,Plant Molecular Biology,2003,52,957-966中，公众也可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

发根农杆菌K599记载在Attila Kereszt,et al.,Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology,Nature Protocols,2007,2(4),549-552)中，公众可从Peter M Gressnon教授，The University ofQueensland,St Lucia,Queensland 4072,Australia,获得，或经Peter M Gressnon教授同意(书面同意书)后由中科院遗传与发育生物学研究所获得。

实施例1、大豆转录因子GmGRAS487编码基因的筛选及其cDNA克隆

发明人大豆科丰1号(盐敏)和南农1138-2(耐盐)在正常和高盐胁迫下的转录组分析中，筛选到位点名为Glyma08g15530(Locus name：Glyma.08G146900)的基因。Glyma08g15530在120mM NaCl处理时，其转录量急剧下降，考虑其可能在植物中负调控耐盐性。将大豆耐盐品种南农1138-2光照培养，生长2个星期后取幼苗分别提取RNA。将新鲜幼苗1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，之后，溶于水，得到总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA。引物为：

Gm15530-F1：ATGAAAACGATGGATTTTGA和

Gm15530-R1：CTATTTGACCTTGTCATCCAGATAA。

进行Real Time-PCR鉴定。Real-Time PCR反应使用TOYOBO公司的RealTime PCRMaster Mix试剂盒，并按照说明进行操作。大豆Tublin基因为内标，所用引物为Primer-TF：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT，和Primer-TR：5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA。

图1示出Glyma08g15530在120mM NaCl处理1小时时即大幅度下降，继续至3小时至最低点。测序表明，Glyma08g15530包含1464bp，编码487个氨基酸残基，将该蛋白命名为GmGRAS487。在南农1138-2中，GmGRAS487的氨基酸序列为序列表中序列2，DNA编码序列为序列1。

实施例2、大豆转录因子GmGRAS487的植物表达载体的构建

一、GmGRAS487超表达载体pROKII-GmGRAS487的构建

以南农1138-2的cDNA为模板，采用Gm15530-pROKII-F2和Gm15530-pROKII-R2进行PCR扩增，获得PCR产物。

Gm15530-pROKII-F2：AGAACACGGGGGACTCTAGAATGAAAACGATGGATTTTGA；

Gm15530-pROKII-R2：GATCGGGGAAATTCGAGCTCCTATTTGACCTTGTCATCCAGATAA。

用限制性内切酶BamHI和KpnI对pROKII载体进行双酶切，采用同源重组法将PCR回收片段连入pROKII载体,得到重组载体pROKII-GmGRAS487(部分载体示意图如图2)。pROKII-GmGRAS487为将pROKII载体的BamHI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GmGRAS487基因得到的重组载体，能表达序列表中序列2所示的GmGRAS487与NPTⅡ所形成的融合蛋白质。

二、GmGRAS487 RNAi表达载体pZH01-GmGRAS487-RNAi的构建

首先用Trizol法提取南农1138-2大豆总RNA，以反转录得到的cDNA为模板，用载体构建引物扩增GmGRAS487基因CDS区第1077位至1363位287bp的DNA片段用于构建RNAi载体。

所用RNAi载体为pZH01，引物如下：

GmGRAS487Ri-F1：(单下划线为Xba I的识别序列，双下划线为Sac I的识别序列)；

GmGRAS487Ri-R1：(单下划线为Sal I的识别序列，双下划线为Kpn I的识别序列)。

先用Sac I与Kpn I分别对PCR产物与pZH01载体进行双酶切，将得到的PCR产物酶切大片段与载体骨架连接，将得到的序列正确的重组载体与PCR产物利用Xba I与Sal I进行双酶切，将得到的PCR产物酶切大片段与载体骨架连接，将得到的序列正确的重组载体记为pZH01-GmGRAS487-RNAi(图2)。

上述所构建的载体均经过测序，验证序列无误后进行下一步实验。

实施例3、转GmGRAS487基因大豆毛状根的获得

发根农杆菌侵染法根据Attila Kereszt等方法(Attila Kereszt,et al.,Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of rootbiology,Nature Protocols,2007,2(4),549-552)略加改进，按照文献“Wang,Fang；Chen,Hao-Wei；Li,Qing-Tian；Wei,Wei；Li,Wei；Zhang,Wan-Ke；Ma,Biao；Bi,Ying-Dong；Lai,Yong-Cai；Liu,xin-Lei；Man,Wei-Qun；Zhang,Jin-Song；Chen,Shou-Yi,GmWRKY27interacts with GmMYB174to reduce expression of GmNAC29 for stress tolerancein soybean plants,2015,The Plant Journal,83,224–236”,或专利“陈受宜等，植物耐逆性相关转录因子GmWRKY78及其编码基因与应用，专利号：ZL2011 1 0053083.7,授权日2013.10.09”中的发根农杆菌介导转基因根系方法进行。

过量表达GmGRAS487及GmGRAS487-RNAi毛状根的制备：

1)重组农杆菌的获得

将实施例2得到的重组表达载体pROKⅡ-GmGRAS487和pZH01-GmGRAS487-RNAi分别通过电击法导入发根农杆菌K599，得到重组农杆菌。将含有上述质粒的重组农杆菌分别命名为K599/pROKⅡ-GmGRAS487和K599/pZH01-GmGRAS487-RNAi。

2)毛状根转化

用注射器分别将上述重组农杆菌K599/pROKⅡ-GmGRAS487和K599/pZH01-GmGRAS487-RNAi接种生长6天含两片真叶的大豆科丰1号幼苗，具体方法见上述引文，保湿生长：光照16小时，温度25℃，湿度50％。2周后，长出的毛状根即为转基因毛状根。分别获得121转K599/pROKⅡ-GmGRAS487的过表达嵌合体(GmGRAS487-OE)和120个K599/pZH01-GmGRAS487-RNAi嵌合体植株(GmGRAS487-RNAi)，可进一步作转基因鉴定和耐盐性检测。

以相同的方法将含空载体pROKⅡ的发根农杆菌K599/pROKⅡ转入大豆科丰1号，得到124个转空载体毛状根根系，以作为空载体对照。

3)转基因毛状根的分子鉴定

提取转基因毛状根和空载体对照的总RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，用Gm15530-F1：GGTGTGGGAGGAAGGGTTTT和Gm15530-R1：GCCATTGGTTCCCAGATTGAAG进行GmGRAS487基因表达量分析。大豆GmTubulin基因为内标，所用引物为Primer-TF：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT，和Primer-TR：5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA。实验重复三次，结果取平均值±标准差。

图3显示，GmGRAS487在空载体对照、GmGRAS487-OE和GmGRAS487-RNAi毛状根中的表达量分别约为0.024、2.35和0.013,GmGRAS487-OE中GmGRAS487的表达量极显著高于空载体对照，而GmGRAS487-RNAi毛状根中GmGRAS487的表达量则显著低于对照(图3)。

实施例4、转GmGRAS487和GmGRAS487-RNAi毛状根的耐盐性鉴定

实验样本为实施例3得到的转空载体对照和GmGRAS487-OE、GmGRAS487-RNAi毛状根及植株。

将上述3种实验样本分成2组，各取约12个，一组经100mM NaCl水溶液处理3天，即浸入100mM NaCl溶液中，25℃处理3天；第二组浸入水中作为对照。实验重复三次，结果取平均值±标准差。

100mM NaCl水溶液处理3天后，拍照观察。图4显示，转空载体毛状根和2个转基因毛状根的植株及叶表型可以看出，水处理(正常条件)转空载体(pROKⅡ)毛状根和转GmGRAS487基因及GmGRAS487-RNAi毛状根嵌合体生长无显著差异，100mM NaCl处理3天，转GmGRAS487-RNAi的毛状根嵌合体和叶(GmGRAS-RNAi)萎蔫程度显著低于对照嵌合体和叶，而过表达GmGRAS487毛状根嵌合体(GmGRAS-OE)和叶则萎蔫程度明显高于对照。

存活率检测：

图5右显示，在水培情况下，所有植株存活率均为100％，100mM NaCl处理3天后，对照、GmGRAS-RNAi和GmGRAS-OE嵌合体的存活率分别约为40％、63％和18％，过表达嵌合体和RNAi嵌合体与对照的差异呈显著和极显著。表明，GmGRAS487的过表达降低了植株的耐盐性，而其降低表达量则植株的耐盐性增加。

NaCl处理离子渗透率检测：

当植物组织受到逆境胁迫伤害时，细胞膜功能受损或结构破坏，透性增大，从而使细胞内各种水溶性物质包括电解质外渗。将植物组织浸入无离子水中，水的电导会因电解质的外渗而变大。伤害越重，细胞膜破坏越严重，外渗就越厉害，而水的电导率就越大。所以可以用电导仪测定外渗液电导率的变化情况，间接反映出植物组织受到的伤害程度。因此电导率的检测可计算相对离子渗透率，相对离子渗透率表示植物细胞膜受损伤的程度。

测定方法为，将大豆的叶片剪下，放置到干净的螺口玻璃瓶中，用去离子水漂洗3遍。之后加80mL去离子水将叶片完全浸泡，抽真空45min。室温静置30min后用电导仪(DDC-308A型，上海博取仪器有限公司)测定电导率E1。将叶片煮沸15min，待温度降到室温后，混匀用电导仪测定电导率E2。

相对离子渗透率EL(％)＝E1/E2 X 100，其中E1和E2为电导率。

图5左图显示，在水培情况下，所有植株离子渗透率均很低，约为6％，100mM NaCl处理3天后，对照、GmGRAS-RNAi和GmGRAS-OE嵌合体的存活率分别约为47％、62％和17％，表明，GmGRAS487过表达嵌合体在盐胁迫下叶细胞膜受损伤最厉害，对照次之，而降低GmGRAS487的表达，在盐胁迫下极显著保护细胞膜不受损伤。

上述结果表明，在植物中，GmGRAS487负调控耐盐性，降低GmGRAS487的表达，显著提高了植株的耐盐性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 大豆转录因子GmGRAS487在植物耐盐性调控中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1464

<212> DNA

<213> 大豆属大豆（Glycine max (L.) Merrill）

<400> 1

atgaaaacga tggattttga gcaattttat tactcatttg gccctcctta catgaatcaa 60

ctccatgagt gtatctcaga aaatgcattt ccatttcaaa cagaaaatct cttatctcca 120

aatactttcc tagatgaaat gtttgatcaa gagtactcca tggaaggatt gctgcagcaa 180

catgcaaaca accaggagga ctttggtttc ttgaagcatg atgatccact agagactgaa 240

ttttgtcatg gatttagccc tagtgctgag gaaaatatgc atgtttcaat ggaagaaggg 300

gattcttgtt tgaagggaat ccaagcagag ctaatggaag agactagttt agctgatctg 360

ttgctaacag gagctgaagc tgttgaagca caaaactggc cccttgcttc agatataatt 420

gagaaactta acaatgcctc atctttagaa aatggtgatg gtttattgaa caggttggct 480

cttttcttta ctcagagtct ctattataaa agcacaaatg cccctgaatt gctacagtgt 540

ggtgctgttt ctacgcacac aaatgctttc tgtgtgtttc aggttctcca agaactctct 600

ccctatgtaa aatttgctca tttcactgca aaccaagcaa tcttagaggc cacagaaggt 660

gctgaagatc ttcacatcat tgattttgat atcatggagg ggattcagtg gccacccttg 720

atggttgacc ttgcaatgaa gaaaagtgtt aattccctta gagtaacagc catcacagtg 780

aaccaaagag gtgcagattc tgttcaacaa acaggaagaa ggctcaaaga gtttgcagct 840

tctatcaact ttccattcat gtttgaccag ttaatgatgg aaagggaaga agattttcaa 900

ggaattgaac ttggtcaaac actcatagtc aactgcatga tacaccagtg gatgcctaat 960

aggagcttct cattggtcaa aacattcttg gatggtgtga ccaaattgtc cccaaggctt 1020

gttgttttag tggaagaaga actatttaat tttcctaggc tcaagtccat gtcctttgtg 1080

gagttcttct gtgaggcttt gcatcactac actgcacttt gtgattcact tgctagtaat 1140

ctatggggta gccacaagat ggagttgagc ctgatagaaa aagaggttat tgggctcaga 1200

atattggaca gtgtgaggca gtttccttgt gagagaaagg agagaatggt gtgggaggaa 1260

gggttttatt ccttgaaagg gtttaaacgt gtacctatga gtacatgtaa catttcacaa 1320

gccaaattct tggtaagcct ctttggtgga gggtattggg tccaatacga gaagggtagg 1380

ttggccttgt gttggaagtc aaggcctttg actgtggctt caatctggga accaatggct 1440

tatctggatg acaaggtcaa atag 1464

<210> 2

<211> 487

<212> PRT

<213> 大豆属大豆（Glycine max (L.) Merrill）

<400> 2

Met Lys Thr Met Asp Phe Glu Gln Phe Tyr Tyr Ser Phe Gly Pro Pro

1 5 10 15

Tyr Met Asn Gln Leu His Glu Cys Ile Ser Glu Asn Ala Phe Pro Phe

20 25 30

Gln Thr Glu Asn Leu Leu Ser Pro Asn Thr Phe Leu Asp Glu Met Phe

35 40 45

Asp Gln Glu Tyr Ser Met Glu Gly Leu Leu Gln Gln His Ala Asn Asn

50 55 60

Gln Glu Asp Phe Gly Phe Leu Lys His Asp Asp Pro Leu Glu Thr Glu

65 70 75 80

Phe Cys His Gly Phe Ser Pro Ser Ala Glu Glu Asn Met His Val Ser

85 90 95

Met Glu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Lys Gly Ile Gln Ala Glu Leu Met

100 105 110

Glu Glu Thr Ser Leu Ala Asp Leu Leu Leu Thr Gly Ala Glu Ala Val

115 120 125

Glu Ala Gln Asn Trp Pro Leu Ala Ser Asp Ile Ile Glu Lys Leu Asn

130 135 140

Asn Ala Ser Ser Leu Glu Asn Gly Asp Gly Leu Leu Asn Arg Leu Ala

145 150 155 160

Leu Phe Phe Thr Gln Ser Leu Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Ala Pro Glu

165 170 175

Leu Leu Gln Cys Gly Ala Val Ser Thr His Thr Asn Ala Phe Cys Val

180 185 190

Phe Gln Val Leu Gln Glu Leu Ser Pro Tyr Val Lys Phe Ala His Phe

195 200 205

Thr Ala Asn Gln Ala Ile Leu Glu Ala Thr Glu Gly Ala Glu Asp Leu

210 215 220

His Ile Ile Asp Phe Asp Ile Met Glu Gly Ile Gln Trp Pro Pro Leu

225 230 235 240

Met Val Asp Leu Ala Met Lys Lys Ser Val Asn Ser Leu Arg Val Thr

245 250 255

Ala Ile Thr Val Asn Gln Arg Gly Ala Asp Ser Val Gln Gln Thr Gly

260 265 270

Arg Arg Leu Lys Glu Phe Ala Ala Ser Ile Asn Phe Pro Phe Met Phe

275 280 285

Asp Gln Leu Met Met Glu Arg Glu Glu Asp Phe Gln Gly Ile Glu Leu

290 295 300

Gly Gln Thr Leu Ile Val Asn Cys Met Ile His Gln Trp Met Pro Asn

305 310 315 320

Arg Ser Phe Ser Leu Val Lys Thr Phe Leu Asp Gly Val Thr Lys Leu

325 330 335

Ser Pro Arg Leu Val Val Leu Val Glu Glu Glu Leu Phe Asn Phe Pro

340 345 350

Arg Leu Lys Ser Met Ser Phe Val Glu Phe Phe Cys Glu Ala Leu His

355 360 365

His Tyr Thr Ala Leu Cys Asp Ser Leu Ala Ser Asn Leu Trp Gly Ser

370 375 380

His Lys Met Glu Leu Ser Leu Ile Glu Lys Glu Val Ile Gly Leu Arg

385 390 395 400

Ile Leu Asp Ser Val Arg Gln Phe Pro Cys Glu Arg Lys Glu Arg Met

405 410 415

Val Trp Glu Glu Gly Phe Tyr Ser Leu Lys Gly Phe Lys Arg Val Pro

420 425 430

Met Ser Thr Cys Asn Ile Ser Gln Ala Lys Phe Leu Val Ser Leu Phe

435 440 445

Gly Gly Gly Tyr Trp Val Gln Tyr Glu Lys Gly Arg Leu Ala Leu Cys

450 455 460

Trp Lys Ser Arg Pro Leu Thr Val Ala Ser Ile Trp Glu Pro Met Ala

465 470 475 480

Tyr Leu Asp Asp Lys Val Lys

485

Claims (10)

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控植物耐盐性；

D2)制备调控植物耐盐性产品；

D3)培育耐盐性增强植物；

D4)制备培育耐盐性增强植物产品；

D5)植物育种；

所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

5.下述任一方法：

X1)培育耐盐性增强植物的方法，包括敲除受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质的编码基因，或抑制受体植物中权利要求1中所述蛋白质编码基因的表达，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到耐盐性增强的目的植物；

X2)增强植物耐盐性的方法，包括敲除受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质的编码基因，或抑制受体植物中权利要求1中所述蛋白质编码基因的表达，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到耐盐性增强的目的植物，实现植物耐盐性的增强。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：X1)和X2)中抑制受体植物中权利要求1中所述蛋白质编码基因的表达通过向所述受体植物导入抑制权利要求1中所述蛋白质编码基因的表达的核酸分子或表达所述核酸分子的重组载体实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述编码基因为权利要求2或3中B1)所述核酸分子。

8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述受体植物为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

9.增强植物耐盐性产品，含有权利要求1-3中任一所述蛋白质或所述调控所述蛋白质活性或含量的物质。

10.权利要求1-3中任一所述蛋白质或所述调控所述蛋白质活性或含量的物质。