CN116589591B - MBP标签、Spy标签或MBP-Spy串联标签在辅助重组蛋白表达中的应用 - Google Patents
MBP标签、Spy标签或MBP-Spy串联标签在辅助重组蛋白表达中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了MBP标签、Spy标签或MBP‑Spy串联标签在辅助重组蛋白表达中的应用。还公开了一种重组蛋白，为在蛋白的N端连接上述标签而成。以及相应的编码基因、表达载体和宿主菌。本发明使用Spy标签或MBP标签来促进重组蛋白的溶解性，协助蛋白进行正确折叠，且有助于提高蛋白的表达量。其中MBP‑Spy串联标签的效果明显优于单独的Spy标签或MBP标签。
Description
技术领域
本发明涉及MBP标签、Spy标签或MBP-Spy串联标签在辅助重组蛋白表达中的应用，属于蛋白表达技术领域。
背景技术
胶原蛋白(Collagen)是细胞外基质的主要成分，约占动物体内蛋白质总量的25-30％，它广泛存在于动物的结缔组织中，对机体和脏器起着支持、保护等作用。目前，重组胶原蛋白已成为该领域的热点，不仅能够在短时间内获得大量基因表达产物，而且所需成本也相对低廉。然而原核表达的重组胶原蛋白缺乏翻译后加工，导致不正确的蛋白折叠形成不溶性包涵体，需要经过后续复杂的工艺处理才能提高蛋白产量及纯度，不仅使成本增加，还使蛋白产量损耗增多。为了表达大量的可溶性外源蛋白，促溶标签常被用于促进外源重组蛋白的可溶性表达。
麦芽糖结合蛋白(MBP)标记的重组蛋白可以减轻毒性，提高表达量和溶解度，然而，MBP的分子量太大(42KDa)，当MBP标签被移除时，可能会导致目标蛋白的不溶或聚集；而促溶标签Spy是细菌周质伴侣，是一种具有摇篮形表面的二聚体，利用疏水和静电力与其底物相互作用，抑制蛋白质聚集并协助蛋白质折叠或重新折叠，此外还能促进不同重组蛋白的溶解度，提高靶蛋白的稳定性及产量。因此，利用MBP标签、Spy标签或MBP-Spy串联标签不仅可以增加重组蛋白的溶解性，还能协助蛋白的折叠以及提高蛋白的表达量。
发明内容
本发明的目的是利用促溶标签来提高重组蛋白的表达和溶解。
本发明采用的技术方案：
MBP标签或Spy标签在辅助重组蛋白表达中的应用。
本发明还公开了一种MBP-Spy串联标签，由MBP标签与Spy标签串联而成。
优选的，所述MBP标签与Spy标签之间通过Linker1连接。
优选的，所述Linker1的氨基酸序列为GSGGGS。
上述的串联标签在辅助重组蛋白表达中的应用。
本发明还公开了一种重组蛋白，为在蛋白的N端连接标签而成，所述标签为MBP标签或Spy标签，或者上述的MBP-Spy串联标签。
优选的，所述蛋白为胶原蛋白或纤连蛋白。
优选的，所述标签与蛋白之间通过Linker2连接，所述Linker2为(EAAAK)3。
优选的，所述Linker2与蛋白之间还设有TEV蛋白酶裂解序列ENLYFQG。
本发明还公开了上述的重组蛋白的编码基因。
本发明还公开了上述的重组蛋白的表达载体。
优选的，所述载体为pSEVA321。
本发明还公开了上述的重组蛋白的表达宿主菌。
优选的，所述宿主菌为大肠杆菌。
本发明的有益效果：
本发明使用Spy标签或MBP标签来促进重组蛋白的溶解性，协助蛋白进行正确折叠，且有助于提高蛋白的表达量。其中MBP-Spy串联标签的效果明显优于单独的Spy标签或MBP标签。
附图说明
图1为pSEVA321-His6-MBP-Spy-Col1的质粒图谱。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：单一标签融合蛋白的制备
1.质粒构建
(1)pSEVA321-Spy和pSEVA321-MBP表达载体构建
根据蛋白质序列委托生工生物公司合成Spy与MBP基因序列，其中促溶标签Spy的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；促溶标签MBP的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。通过Snapgene软件设计引物，以PCR技术扩增出Spy与MBP的基因片段后回收PCR产物，并利用同源臂引物，采用Gibson连接技术将Spy基因与MBP序列连接到载体上构建表达载体pSEVA321-Spy和pSEVA321-MBP。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，以氯霉抗性筛选阳性转化子，挑选转化子进行琼脂凝胶电泳验证，选择阳性转化子进行测序验证及质粒抽提。
PCR扩增：
| 体系成分 | 成分体积 |
| 引物F | 2.5μL |
| 引物R | 2.5μL |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | 2μL |
| 模板DNA | 25μL |
| ddH2O | To 50μL |
配制完PCR体系后，混匀并离心，PCR扩增条件为：第一阶段98℃预变性30s；第二阶段98℃变性10s，50-72℃退火30s，72℃延伸30s/kb，32个循环次数；第三阶段72℃终延伸2min。使用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)回收上述载体及基因片段，按照产品说明书的操作步骤进行。
Gibson连接：
| 体系成分 | 成分体积 |
| Gibson Assembly Master Mix(2X) | 5μL |
| 连接片段 | 0.2–1pmols*XμL |
| dd H2O | (5-X)μL |
| 总体系 | 10μL |
将以上成分在冰上混匀之后置于37℃热浴60min，获得的连接产物储存在冰上或者-20℃，以便后续的感受态转化。
转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：在冰上缓慢融解感受态细菌(对于新鲜制备的感受态可以直接使用)，加入3-5ul连接产物，轻轻用手指弹动离心管，以混匀细菌和质粒连接产物，冰浴放置30min，结束后42℃水浴热激2min,加入500ul LB，于37℃、220rpm恒温摇床培养1小时，培养后2000-3000g离心1min使菌体沉淀，留下约50-100ul上清重悬沉淀，然后全部涂布到含有氨苄素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
(2)pSEVA321-His6-Spy-Col1与pSEVA321-His6-MBP-Col1表达载体构建
根据核苷酸序列由生工生物公司合成Col1基因序列，Ⅰ型胶原蛋白Col1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，分别设计引物通过PCR扩增后回收PCR产物，通过Gibson将该基因连接到pSEVA321-Spy和pSEVA321-MBP载体上，同时分别在Spy和MBP的N端连接上His6标签以助于纯化，并且分别在Spy/MBP标签与Col1之间设计引物插入烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶裂解序列(ENLYFQG)，方便后续进行标签的切割去除。在标签和Col1之间以接头L2连接，构建pSEVA321-His6-Spy-Col1与pSEVA321-His6-MBP-Col1。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，以氯霉抗性筛选阳性转化子，挑选转化子进行琼脂凝胶电泳验证，阳性克隆进行送测，测序无误则确定各基因连接正确，同时，构建载体pSEVA321-His6-Col1作为对照。
2.融合蛋白的表达
pSEVA321-His6-Col1、pSEVA321-His6-Spy-Col1和pSEVA321-His6-MBP-Col1质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到三种重组大肠杆菌BL21(DE3)。将培养过夜的三种重组大肠杆菌BL21(DE3)挑取单菌落接种于5mL带氨苄的LB液体培养基中，37℃，220rpm恒温摇床培养10-12h作为种子液。将得到的种子液以1:100的体积比接种于20mL培养基中，置于37℃，220rpm恒温摇床培养至菌液OD600的值为0.6-0.8时，加入1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导胶原蛋白表达，继续培养5-6h。
3.融合蛋白溶解度及表达量检测
诱导完成后，4℃、12000 rpm下离心3min，收集细胞颗粒，将细胞颗粒重悬在100μL裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH 7.5)中，加入100X蛋白酶抑制剂cocktail，样品在4℃下孵育5min，然后使用300W超声仪超声30min(超声3s间隙3s)破碎细胞后，在4℃和12000 rpm下离心20min，收集上清和沉淀，用100μL 2％SDS重悬沉淀，上清及沉淀各取10μl样品与6X蛋白上样缓冲液混合，煮沸10分钟后进行SDS-PAGE，比较可溶部分和不可溶部分的表达。按照标准方案进行Western blot，将蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，然后用抗His抗体进行检测。
结果如表1所示，与对照组pSEVA321-His6-Col1相比，含有促溶标签MBP和Spy的大肠菌株中的外源蛋白产生相对量更高的可溶性蛋白。与对照组相比，含有MBP标签的菌株其可溶蛋白的量增加了32％，而含有Spy标签的重组菌株其外源蛋白的可溶性表达增加了30％，说明这两个标签均促进了大肠杆菌中外源蛋白的可溶性表达。
表1对照组及含有促溶标签MBP、Spy的可溶性蛋白表达情况
| 可溶性水平％ | 表达水平％ | |
| pSEVA321-His6-Col1 | 18％ | 31％ |
| pSEVA321-His6-Spy-Col1 | 30％ | 60％ |
| pSEVA321-His6-MBP-Col1 | 32％ | 58％ |
实施例2：串联标签MBP-Spy融合Ⅰ型胶原蛋白的制备
1.载体制备
(1)pSEVA321-MBP-Spy表达载体构建
利用同源臂引物，选择Gibson连接将Spy串联基因连接到载体上构建表达载体pSEVA321-MBP-Spy。MBP-Spy之间以L1接头连接，L1为GSGGGS，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，以氯霉抗性筛选阳性转化子，挑选转化子进行琼脂凝胶电泳验证，选择阳性转化子进行测序验证及质粒抽提。
(2)pSEVA321-His6-MBP-Spy-Col1表达载体构建
通过Gibson将Col1基因连接到pSEVA321-MBP-Spy载体上，Col1与标签之间以接头L2连接，L2为(EAAAK)3，同时设计引物在MBP的N端及Spy的C端分别连接上His6标签和TEV蛋白酶裂解序列，构建载体pSEVA321-His6-MBP-Spy-Col1，具体如图1所示。另外以实施例1构建的载体pSEVA321-His6-Col1作为对照。
2.融合蛋白诱导表达
将上述两个重组质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中培养过夜，挑取单菌落接种于5mL带氨苄的LB液体培养基中，37℃，220rpm恒温摇床培养10-12h作为种子液。将得到的种子液以1:100的体积比接种于20mL培养基中，于37℃，220rpm恒温摇床培养至菌液OD600的值为0.6-0.8时，加入1mMIPTG诱导胶原蛋白表达，继续培养5-6h。
3.融合蛋白溶解度及表达量检测
诱导完成后，收集细胞，加入裂解缓冲液后使用超声仪超声破碎细胞，然后离心收集上清和沉淀，用100μL 2％ SDS重悬沉淀，将蛋白质样品与6X蛋白上样缓冲液混合，煮沸10分钟后进行SDS-PAGE。按照标准方案进行Western blot进行检测。
4.TEV蛋白酶切割融合蛋白
将诱导后收集的细胞在裂解缓冲液(20mm HEPES-NaOH,pH 7.5,400mM NaCl,0.5mM EDTA,0.15μM抑肽酶，1.3mM苯甲脒盐酸盐，4.2μM亮抑酶酞，1μM胃酶抑素,1mM苯甲基磺酰氟)中重悬后使用细胞均质器对细胞进行破坏，并在4℃、9500×g下离心50min。上清液负载在3mL Ni-NTA琼脂糖柱上，并用裂解缓冲液洗涤。融合蛋白在裂解缓冲液(pH 7.5)中用300mM咪唑洗脱，在TEV蛋白酶消化前透析到rTEV缓冲液(25mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH8.0,0.1mM DTT)中过夜，最后在4℃下18000rpm离心20min。根据生产商指南(重组烟草蚀刻病毒蛋白酶，中国生工生物技术公司)，在上清液中加入TEV蛋白酶(1U/3μg重组蛋白)，反应在30℃下进行1h(或4℃过夜消化)。消化后，样品在4℃和18000rpm下离心20min，分离上清液和沉淀物。SDS-PAGE对两组分进行分析，观察标签去除后蛋白表达情况。
结果如表2所示，与上述含有pSEVA321-His6-Col1、pSEVA321-His6-Spy-Col1和pSEVA321-His6-MBP-Col1质粒的大肠杆菌菌株相比，拥有MBP-Spy串联标签的大肠菌株其可溶性蛋白表达量占62％，这表明串联标签的使用比起单一标签的效果要更好。
表2对照组及含有促溶标签MBP、Spy以及MBP-Spy串联标签的可溶性Ⅰ型胶原表达情况
| 可溶性水平％ | 表达水平％ | |
| pSEVA321-His6-Col1 | 18％ | 31％ |
| pSEVA321-His6-Spy-Col1 | 30％ | 60％ |
| pSEVA321-His6-MBP-Col1 | 32％ | 58％ |
| pSEVA321-His6-MBP-Spy-Col1 | 62％ | 72％ |
实施例3：串联标签MBP-Spy融合Ⅲ型胶原蛋白的制备
1.pSEVA321-His6-MBP-Spy-Col3表达载体构建
通过Gibson将Col3基因连接到上述实施例中构建完成的pSEVA321-MBP-Spy载体上，人Ⅲ型胶原蛋白Col3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，Col3与标签之间以接头L2连接，同时在MBP的N端及Spy的C端分别引入His6标签和TEV蛋白酶裂解序列，构建载体pSEVA321-His6-MBP-Spy-Col3，同时构建载体pSEVA321-His6-Col3作为对照。
2.融合蛋白诱导表达
将上述两个构建成功的质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中培养过夜，挑取单菌落接种于5mL带氨苄的LB液体培养基中，37℃，220rpm恒温摇床培养10-12h作为种子液。将得到的种子液以1:100的体积比接种于20mL培养基中，于37℃，220rpm恒温摇床培养至菌液OD600的值为0.6-0.8时，加入1mMIPTG诱导胶原蛋白表达，继续培养5-6h。
3.融合蛋白溶解度及表达量检测
诱导完成后，收集细胞，加入裂解缓冲液后使用超声仪超声破碎细胞，离心收集上清和沉淀，用100μL 2％ SDS重悬沉淀，将蛋白样品与6X蛋白上样缓冲液混合，煮沸10分钟后进行SDS-PAGE。按照标准方案进行Western blot。
4.TEV蛋白酶切割融合蛋白
按照实施例2所述方法对重组Ⅲ型胶原蛋白进行标签去除后，进行SDS-PAGE测定蛋白表达情况。结果如表3所示，与对照组pSEVA321-His6-Col3相比，拥有MBP-Spy串联标签pSEVA321-His6-MBP-Spy-Col3的大肠菌株其可溶性蛋白表达量增加了约40％，这表明串联标签的使用不局限于Ⅰ型胶原蛋白，同样适用于Ⅲ型胶原蛋白的可溶性溶解。
表3对照组及含有串联促溶标签MBP-Spy的可溶性Ⅲ型胶原蛋白表达情况
| 可溶性水平％ | 表达水平％ | |
| pSEVA321-His6-Col3 | 20％ | 30％ |
| pSEVA321-His6-MBP-Spy-Col3 | 63％ | 68％ |
实施例4：串联标签MBP-Spy融合纤连蛋白的制备
1.pSEVA321-His6-MBP-Spy-fibro表达载体构建
按实施例2中的方法构建载体pSEVA321-His6-MBP-Spy-fibro，同时构建载体pSEVA321-His6-fibro作为对照，纤连蛋白fibro的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
2.融合蛋白诱导表达
将上述两个构建成功的质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中培养过夜，挑取单菌落接种于5mL带氨苄的LB液体培养基中，37℃，220rpm恒温摇床培养10-12h作为种子液。取1％种子液接种于20mL培养基中，于37℃，220rpm恒温摇床培养至菌液OD600的值为0.6-0.8时，加入1mMIPTG诱导胶原蛋白表达，继续培养5-6h。
3.融合蛋白溶解度及表达量检测
诱导完成后，收集细胞，加入裂解缓冲液后使用超声仪超声破碎细胞，离心收集上清和沉淀，用100μL 2％ SDS重悬沉淀，将蛋白样品与6X蛋白上样缓冲液混合，煮沸10分钟后进行SDS-PAGE。按照标准方案进行Western blot。
4.TEV蛋白酶切割融合蛋白
按照实施例2所述方法对重组纤连蛋白进行标签去除后，SDS-PAGE测定蛋白表达情况。结果如表4所示，与对照组相比，拥有pSEVA321-His6-MBP-Spy-fibro的大肠菌株其可溶性蛋白表达量增加了45％，且其表达水平也增加了一倍，这表明MBP-Spy串联标签的促溶效果不仅对不同类型的胶原蛋白起作用，对纤连蛋白同样起效。
表4对照组及含有串联促溶标签MBP-Spy的可溶性纤连蛋白表达情况
上述的可溶性蛋白和表达水平百分比的计算方式：
Claims (13)
1.一种MBP-Spy串联标签，其特征在于由MBP标签与Spy标签串联而成，所述MBP标签的序列如SEQ ID No.5所示，所述Spy标签的序列如SEQID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的MBP-Spy串联标签，其特征在于所述MBP标签与Spy标签之间通过Linker1连接。
3.根据权利要求2所述的MBP-Spy串联标签，其特征在于所述Linker1的氨基酸序列为GSGGGS。
4.权利要求1-3中任一项所述的MBP-Spy串联标签在辅助重组蛋白表达中的应用。
5.一种重组蛋白，其特征在于：为在蛋白的N端连接标签而成，所述标签为权利要求1-3中任一项所述的MBP-Spy串联标签。
6.根据权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于：所述蛋白为胶原蛋白或纤连蛋白。
7.根据权利要求5或6所述的重组蛋白，其特征在于：所述标签与蛋白之间通过Linker2连接，所述Linker2为(EAAAK)3。
8.根据权利要求7所述的重组蛋白，其特征在于：所述Linker2与蛋白之间还设有TEV蛋白酶裂解序列ENLYFQG。
9.权利要求5-8中任一项所述的重组蛋白的编码基因。
10.权利要求5-8中任一项所述的重组蛋白的表达载体。
11.根据权利要求10所述的表达载体，其特征在于所述载体为pSEVA321。
12.权利要求5-8中任一项所述的重组蛋白的表达宿主菌。
13.根据权利要求12所述的表达宿主菌，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌。
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