CN113637698A - 一种串联双促溶标签及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种串联双促溶标签，包括促溶标签IF2DI和SUMO以及内含肽Mxe，本发明同时采用IF2DI和SUMO两个促溶标签组成双促溶表达标签，相对于单一的标签，可以更好促进目的蛋白的正确折叠并提高表达量，克服了单一标签蛋白折叠不好，促溶效果不理想的情况；且内含肽Mxe剪接后末端没有多余的氨基酸序列，提高了目的蛋白的纯度。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白表达纯化领域，尤其涉及一种串联双促溶标签及其应用。
背景技术
重组蛋白的原核表达目前已被广泛应用，其优点是能够在短时间内获得大量基因表达产物，所需成本相对低廉。为了能够进行后续的结构功能研究，所获得的重组蛋白必须可溶，稳定，正确折叠以及具有生物活性。原核表达的缺点是表达出来的蛋白缺乏翻译后加工，导致不正确的蛋白折叠形成不溶性包涵体，需要经过复杂的变性复性处理，很难表达大量的可溶外源蛋白。重组蛋白表达的可溶性成为首要解决的问题，促溶标签常被用于促进重组蛋白的可溶性表达。
促溶标签IF2DI来源于大肠杆菌，分子量18kDa，对蛋白的结构影响小，具有很高的亲水性，可在不同的宿主中表达，适用范围广，促溶效率高。小泛素样修饰蛋白SUMO来源于啤酒酵母，分子量11.5kDa，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，还能抗蛋白酶水解和促进目的蛋白正确折叠，提高重组蛋白的稳定性和可溶性。促溶标签IF2DI与SUMO串联融合表达可以显著促进目的蛋白的可溶性表达。但是促溶标签IF2DI与SUMO在表达CD138时，蛋白酶或凝血酶酶切促溶标签IF2DI与SUMO时，目的蛋白的末端常残留有多余的氨基酸序列，从而影响目的蛋白的纯度。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种可以避免包涵体，同时也无需引入蛋白酶酶切，能够得到序列天然的目标产物的IF2DI和SUMO串联双促溶表达标签序列。
本发明的技术方案是这样实现的：一方面，本发明提供了一种串联双促溶标签，包括促溶标签IF2DI和SUMO以及内含肽Mxe。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述促溶标签IF2DI的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述促溶标签SUMO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述内含肽Mxe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
另一方面，提供了一种串联双促溶标签在蛋白表达纯化中的应用，包括如下步骤：
S1，构建表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe；
S2，将目的基因X插入表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe的HindIII和XhoI酶切位点之间；
S3，将插入目的基因的表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe-X转入表达菌株中，诱导表达；
S4，诱导后破碎菌株细胞，进行可溶蛋白的镍柱亲和纯化，得到纯合的目的蛋白。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S3所述诱导表达采用IPTG作为诱导剂。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S1的表达载体采用PCR及酶切连接方法，将IF2DI、SUMO和Mxe序列连接，并插入pET28a载体，获得pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe载体。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述IF2DI促溶标签插入pET28a载体的方法为：人工合成IF2DI基因序列，并将该基因插入pET28a载体的NcoI和NdeI酶切位点之间，构建表达载体pET28a-IF2DI，并将载体转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述SUMO促溶标签插入pET28a载体的方法为：通过PCR技术扩增出SUMO的基因片段，并将其插入pET28a-IF2DI质粒的NdeI和BamHI酶切位点之间，位于IF2DI基因的下游，构建表达载体pET28a-IF2DI-SUMO，并将载体转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述内含肽Mxe插入pET28a载体的方法为：通过PCR技术扩增出内含肽Mxe蛋白的基因片段，并将其插入pET28a-IF2DI-SUMO质粒的BamHI和HindIII酶切位点之间，位于SUMO基因的下游，构建表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe，并将载体转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中。
本发明的一种串联双促溶标签及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明同时采用IF2DI和SUMO两个促溶标签组成双促溶表达标签，相对于单一的标签，可以更好促进目的蛋白的正确折叠并提供表达量，克服了单一标签蛋白折叠不好，促溶效果不理想的情况。
(2)该表达载体可通过镍柱亲和纯化，纯化方法简单。纯化完成后无需用SUMO蛋白酶去除标签部分，内含肽可以自行切除标签并与目的基因连接，大大节约了研究的时间和成本。
(3)内含肽可以自行切除标签并与目的蛋白连接，可以减少目的蛋白末端残留的多余氨基酸序列，提高目的蛋白纯度，从而保证目的蛋白的天然结构和功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的pET28a图诱导前后不同处理样品的SDS-PAGE电泳图；
图2为本发明的pET28a-IF2DI诱导前后不同处理样品的SDS-PAGE电泳图；
图3为本发明的pET28a-SUMO诱导前后不同处理样品的SDS-PAGE电泳图；
图4为本发明的pET28a-IF2DI-SUMO诱导后不同处理样品的SDS-PAGE电泳图；
图5为本发明的pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe诱导后不同处理样品的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
一、载体制备
大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21(DE3)、CD138购自北京全式金公司，于LB培养基中培养，所用抗生素浓度为：45μg/ml Kan。pET28A质粒购自Novagen公司。质粒抽提、载体克隆和蛋白表达纯化步骤均为常规实验方法，参照《分子克隆实验指南》。
IF2DI的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；促溶标签SUMO的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；内含肽Mxe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
1.pET28a-IF2DI表达载体构建
委托生工生物公司合成IF2DI基因序列，在基因5’端引物NcoI酶切位点，3’端引入Thrombin酶识别位点(5’-CTGGTTCCGCGTGGATCC-3’)和NdeI酶切位点。将蛋白载体pET28a和IF2DI基因均用限制性内切酶NcoI和NdeI双酶切，然后用T4 DNA连接酶将酶切后的pET28a和IF2DI片段16℃酶连过夜，构建表达载体pET28a-IF2DI。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，以卡那霉素抗性筛选阳性转化子进行测序验证。
表达载体pET28a-IF2DI验证：将挑选的阳性转化子扩大培养，抽提质粒DNA，经限制性内切酶NcoI和NdeI双酶切后，进行琼脂凝胶电泳验证。并将双酶切验证正确的重组质粒测序，验证得到正确的重组表达载体pET28a-IF2DI。
2.pET28a-IF2DI-SUMO表达载体构建
通过PCR技术扩增出SUMO的基因片段，并将其插入pET28a-IF2DI质粒的NdeI和BamHI酶切位点之间，位于IF2DI基因的下游，构建表达载体pET28a-IF2DI-SUMO，并将载体转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中。
PCR反应体系：10×Pfu buffer，5μL；dNTP(2.5mmol/L)，5μL；引物F(10μmol/L)，2μL；引物R(10μmol/L)，2μL；模板DNA1μL；DNA聚合酶，0.5μL；加ddH2O至反应体系为50μL。
PCR扩增体系：
第一阶段94℃，3min；
第二阶段：94℃，30s，58℃，20s，72℃，30s，共25个循环；
第三阶段72℃，5min；
第四阶段：4℃，永久。
将获得的PCR产物回收后，用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切，再把经过限制性核酸内切酶NdeI和BamHI双酶切后回收的载体pET28a-IF2DI和片段SUMO以T4 DNA连接酶酶连；含酶连产物的质粒pET28a-IF2DI-SUMO转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，挑选转化子进行测序验证。
表达载体pET28a-IF2DI-SUMO验证：将挑选的阳性转化子扩大培养，抽提质粒DNA，经限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切后，进行琼脂凝胶电泳验证。并将双酶切验证正确的重组质粒测序，验证得到正确的重组表达载体pET28a-IF2DI-SUMO。
3.pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe表达载体构建
通过PCR技术扩增出内含肽Mxe蛋白的基因片段，然后用BamHI和HindIII双酶切然后连入pET28a-IF2DI-SUMO载体，构建表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe，并将载体转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中。
PCR反应体系：10×Pfu buffer，5μL；dNTP(2.5mmol/L)，5μL；引物F(10μmol/L)，2μL；引物R(10μmol/L)，2μL；模板DNA 1μL；DNA聚合酶，0.5μL；加ddH2O至反应体系为50μL。
PCR扩增体系：
第一阶段94℃，3min；
第二阶段：94℃，30s，58℃，20s，72℃，30s，共25个循环；
第三阶段72℃，5min；
第四阶段：4℃，永久。
将获得的PCR产物回收后，用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，再把经过限制性核酸内切酶BamHI和HindIII双酶切后回收的载体pET28a-IF2DI-SUMO和片段Mxe以T4DNA连接酶酶连；含酶连产物的质粒pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，挑选转化子进行测序验证。
表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe验证：将挑选的阳性转化子扩大培养，抽提质粒DNA，经限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，进行琼脂凝胶电泳验证。并将双酶切验证正确的重组质粒测序，验证得到正确的重组表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe。
二、插入外源基因CD138表达载体的构建
根据蛋白质序列由生工生物公司合成CD138全基因序列，然后用HindIII和XhoI双酶切然后连入pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe载体，测序验证，确定CD138基因连接到pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe载体上，最终得到表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe-CD138。同时，构建表达载体pET28a、pET28a-SUMO、pET28a-IF2DI、pET28a-IF2DI-SUMO作为对照，CD138基因插入相同酶切位点。
三、CD138蛋白的纯化及诱导内含肽自剪切后的二次纯化
(1)pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe融合蛋白的纯化
S1，CD138在25℃，180rpm的情况下诱导表达24h。
S2，收集菌体，纯化Binding Buffer重悬，进行镍柱亲和层析纯化，收集纯化前后的样品，SDS-PAGE检测，并将上样样品进行WesternBlot检测。
S3，将纯化得到的重组蛋白透析到Binding Buffer，添加终浓度为20mM DTT室温过夜诱导内含肽自剪切。
S4，将自剪切后的蛋白透析至Binding Buffer，进行二次镍柱亲和层析，TricineSDS-PAGE检测纯化样品。
(2)pET28a、pET28a-SUMO、pET28a-IF2DI、pET28a-IF2DI-SUMO融合CD138蛋白的表达
将质粒pET28a、pET28a-SUMO、pET28a-IF2DI和pET28a-IF2DI-SUMO分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到四种重组大肠杆菌BL21(DE3)。将培养过夜的四种重组大肠杆菌BL21(DE3)按照1:100的体积比分别接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至对数中期后，加终浓度为0.1mM的IPTG于16℃条件下诱导表达16h。
收集融合表达菌液，超声波破碎细胞至菌液清亮，超高速离心并收集上清，上样于Ni离子亲和层析柱纯化融合蛋白IF2DI-SUMO-CD138，依次用25mmol/L咪唑和150mmol/L咪唑漂洗柱子，以去除杂蛋白，最后使用500mmol/L咪唑洗脱融合蛋白。分别取离心后的沉淀重悬液和上清液以及不同浓度咪唑洗脱后蛋白液，用12％的SDS-PAGE分别分析含有pET28a、pET28a-SUMO、pET28a-IF2DI和pET28a-IF2DI-SUMO重组质粒的重组菌中BDNF蛋白可溶性表达量的差异。
实验结果如图1-5所示，pET28A载体的图片显示表达蛋白为30kd包涵体，没有可溶表达；pET28A-SUMO载体、pET28A-IF2DI载体，pET28a-IF2DI-SUMO载体、pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe载体表达蛋白都有可溶上清，但是pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe载体表达量最高，在洗脱1和洗脱2中都有高纯度蛋白。
向最后收集的蛋白液中加入凝血酶，室温孵育20min，切割纯化的重组蛋白，再利用分子筛层析分离目的蛋白CD138、6×His标签和促溶标签IF2DI、SUMO，最终得到纯的目的蛋白。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉菲恩生物科技有限公司
<120> 一种串联促溶标签及其应用
<130> 2021
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgacagatg taacgattaa aacgctggcc gcagagcgac agacctccgt ggaacgcctg 60
gtacagcaat ttgctgatgc aggtatccgg aagtctgctg acgactctgt gtctgcacaa 120
gagaaacaga ctttgattga ccacctgaat cagaaaaatt caggcccgga cgggttgacg 180
ctgcaacgta aaacacgcag cacccttaac attcctggta ccggtggaaa aagcaaatcg 240
gtacaaatcg aagtccgcaa gaaacgcacc tttgtgaaac gcgatccgca agaggctgaa 300
cgccttgcag cggaagagca agcgcagcgt gaagcggaag agcaagcccg tcgtgaggca 360
gaagaatcgg ctaaacgcga ggcgcaacaa aaagctgaac gtgaggccgc agaacaagct 420
aagcgtgaag ctgctgaaca agcgaaacgt gaagctgcgg aaaaagacaa agtg 474
<210> 2
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcggactcag aagtcaatca agaagctaag ccagaggtca agccagaagt caagcctgag 60
actcacatca atttaaaggt gtccgatgga tcttcagaga tcttcttcaa gatcaaaaag 120
accactcctt taagaaggct gatggaagcg ttcgctaaaa gacagggtaa ggaaatggac 180
tccttaagat tcttgtacga cggtattcgc attcaagctg atcaggcccc tgaagatttg 240
gacatggagg ataacgatat tattgaggct caccgcgaac agattggagg tctcgag 297
<210> 3
<211> 594
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcatcacgg gagatgcact agttgcccta cccgagggcg agtcggtacg catcgccgac 60
atcgtgccgg gtgcgcggcc cggcagtgac aacgccatcg acctgaaagt cattgaccgg 120
catggcaatc ccgtgctcgc cgaccggctg ttccactccg gcgagcatcc ggtgtacacg 180
gtgcgtacgg tcgaaggtct gcgtgtgacg ggcaccgcga accgcccgtt gttgtgtttg 240
gtcgacgtcg ccggggtgcc gaccctgctg tggaagctga tcgacgaaat caagccgggc 300
gattacgcgg tgattcaacg cagcgcattc agcgtcgact gtgcaggttt tgcccgcgga 360
aaacccgaat ttgcgcccac aacctgcaca gtcggcgtcc ctggactggt gcgtttcttg 420
gaagcacacc accgagaccc ggacgcccaa gctatcgccg acgagctgac cgacgggcgg 480
ttctactacg cgaaagtcgc cagtgtcacc gacgccggcg tgcagccggt gtatagcctt 540
cgtgtcgaca cggcagacca cgcgtttatc acgaacgggt tcgtcagcca cgct 594
Claims (7)
1.一种串联双促溶标签，其特征在于：包括促溶标签IF2DI和SUMO以及内含肽Mxe。
2.如权利要求1所述的一种串联双促溶标签，其特征在于：所述促溶标签IF2DI的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述促溶标签SUMO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述内含肽Mxe的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种串联双促溶标签在蛋白表达纯化中的应用，其特征在于：包括如下步骤：
S1，构建表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe；
S2，将目的基因X插入表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe的HindIII和XhoI酶切位点之间；
S3，将插入目的基因的表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe-X转入表达菌株中，诱导表达；
S4，诱导后破碎菌株细胞，进行可溶蛋白的镍柱亲和纯化，得到纯合的目的蛋白。
4.如权利要求3所述的一种串联双促溶标签在蛋白表达纯化中的应用，其特征在于，步骤S1的表达载体采用PCR及酶切连接方法，将IF2DI、SUMO和Mxe序列连接，并插入pET28a载体，获得pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe载体。
5.如权利要求4所述的一种串联双促溶标签在蛋白表达纯化中的应用，其特征在于，所述IF2DI促溶标签插入pET28a载体的方法为：人工合成IF2DI基因序列，并将该基因插入pET28a载体的NcoI和NdeI酶切位点之间，构建表达载体pET28a-IF2DI，并将载体转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中。
6.如权利要求5所述的一种串联双促溶标签在蛋白表达纯化中的应用，其特征在于，所述SUMO促溶标签插入pET28a载体的方法为：通过PCR技术扩增出SUMO的基因片段，并将其插入pET28a-IF2DI质粒的NdeI和BamHI酶切位点之间，位于IF2DI基因的下游，构建表达载体pET28a-IF2DI-SUMO，并将载体转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中。
7.如权利要求6所述的一种串联双促溶标签在蛋白表达纯化中的应用，其特征在于，所述内含肽Mxe插入pET28a载体的方法为：通过PCR技术扩增出内含肽Mxe蛋白的基因片段，并将其插入pET28a-IF2DI-SUMO质粒的BamHI和HindIII酶切位点之间，位于SUMO基因的下游，构建表达载体pET28a-IF2DI-SUMO-Mxe，并将载体转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中。
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