CN113416725A

CN113416725A - 一种重组硫酸软骨素酶abc-i蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113416725A
Application number: CN202110591614.1A
Authority: CN
Inventors: 范小蔓; 黄佳滢; 张业旺
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2021-09-21

Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组硫酸软骨素酶ABC‑I蛋白及其制备方法与应用。本发明使用分子克隆技术通过提取硫酸软骨素酶ABC‑I基因设计引物，经PCR扩增后与表达载体连接，构建重组表达载体；将重组表达载体转化至大肠杆菌，构建重组表达转化体，实现重组硫酸软骨素酶ABC‑I蛋白的可溶性表达。构建过程操作简单，成本低。所构建的重组硫酸软骨素酶ABC‑I蛋白表达量高、具有较高的酶活性，粗酶活性可达到7144U/L，经Ni‑NTA纯化后，酶活力为492.1 U/mg；且稳定性好，37℃下的半衰期为120 min，在4℃下的半衰期为112天。在生产低分子量硫酸软骨素中具有较高的应用价值，在医药、环保等领域上前景广阔。

Description

一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

硫酸软骨素（chondroitin sulfate）是一类糖胺聚糖(GAGs)的阴离子生物大分子，通常以共价连接到蛋白质。在包括神经元发育、凝血、炎症、细胞运输、细胞增殖和肿瘤发生等过程中起着重要作用。硫酸软骨素作为结缔组织中天然存在的成分，能够与水分子结合从而起到润滑和支撑关节的作用，使关节能够活动自如，减轻关节疼痛。此外，它还被证明可作为具有乳化特性的食品防腐剂使用，并可用于营养配方，以预防和减少骨关节炎。硫酸软骨素需要在细胞内起作用，但它的大分子体积会影响其顺利穿过细胞表面的一层薄膜，而无法在机体内发挥出其多种良好的药理功能。低分子量的硫酸软骨素因具有溶解性好及生物利用度高等优点具有更好的生物化学特性。

硫酸软骨素ABC裂解酶(Chon-ABC，EC 4.2.2.4)是一类具有广泛特异性的糖胺酶，通过β-消除反应降解硫酸软骨素糖胺聚糖(GAGs)。根据裂解机理，Chon-ABCs分为内源性消除酶(Chon-ABC-I，能将硫酸软骨素解聚为不饱和的四糖和二糖)和外源性消除酶(Chon-ABC-II，能将硫酸软骨素六四糖降解为二糖)。Chon-ABC-I因在硫酸软骨素低聚糖降解方面的应用具有很好的医用前景。主要通过发酵和纯化工艺制备硫酸软骨素酶ABC-I，但存在酶活性低、生产繁琐、成本高等问题。为了增加可溶性表达和活性，引入分子伴侣蛋白用于异源表达。但其生产仍然繁琐，且存在表达过程中包涵体形成、蛋白回收率低等问题。目前尚缺乏一种低成本、高稳定性的硫酸软骨素酶ABC-I制备工艺。

发明内容

有鉴于此，本发明通过分子克隆的方法提供一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白及其制备方法与应用。本发明的重组硫酸软骨素酶ABC-I具有较高的酶活力及稳定性能，制备方法简单、成本低，可用于工业化生产低分子量的硫酸软骨素酶ABC-I。

本发明的方案通过如下技术手段得以实现：

本发明提供了一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码1006个氨基酸，分子量108 kDa。

另一方面，本发明还提供了编码上述硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的一种氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的构建方法，具体包括如下步骤：

（1）以多形拟杆菌硫酸软骨素酶ABC-I基因组为模板，采用分别带有NdeI和XbaI酶切位点及5’端保护碱基为引物，按照常规方法进行PCR扩增编码获得目的基因片段；

（2）将目的基因片段与表达载体pCznl连接构建硫酸软骨素酶ABC-I基因的pCznl-Chon-ABC-I重组表达载体；

（3）将步骤（2）中构建的pCznl-Chon-ABC-I重组表达载体转化进入大肠杆菌宿主菌中，构建硫酸软骨素酶ABC-I基因大肠杆菌工程菌；

（4）硫酸软骨素酶ABC-I基因大肠杆菌工程菌中重组硫酸软骨素酶的诱导表达；

（5）分离纯化步骤（4）所得的表达产物，获得重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白。

进一步地，步骤（1）中所述引物的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；下游引物序列如SEQ ID NO：2所示。

步骤（1）中所述PCR扩增的反应参数为：95℃起始变性4 min，95℃变性30 s，60℃退火55 s，72℃延伸1 min，循环20次，72 ℃延伸10 min。

步骤（2）中所述的目的基因片段与表达载体pCznl均分别使用NdeI和 XbaI进行双酶切处理。

步骤（2）中所述连接的条件为25℃，12小时；连接体系为：载体2 μL，目的基因6 μL，10×Ligation buffer 1 μL，T4DNA连接酶1 μL。

步骤（4）中所述的诱导表达为：硫酸软骨素酶ABC-I基因大肠杆菌工程菌接种到5mL含有终浓度50 ug/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜制得种子液，将种子液接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6~0.8后，添加终浓度为0.75 mM的IPTG在25℃下振荡6 h。

步骤（5）中所述的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的分子量为108 kDa。

本发明还提供了上述的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白在制备低分子量硫酸软骨素中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明使用分子克隆技术通过提取硫酸软骨素酶ABC-I基因设计引物，经PCR扩增后与表达载体连接，构建重组表达载体；将重组表达载体转化至大肠杆菌，构建重组表达转化体，实现重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的可溶性表达。构建过程操作简单，成本低。所构建的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白表达量高、具有较高的酶活性，粗酶活性可达到7144U/L，经Ni-NTA纯化后，酶活力为492.1 U/mg；且稳定性好，37℃下的半衰期为120 min，在4℃下的半衰期为112天。在生产低分子量硫酸软骨素中具有较高的应用价值，在医药、环保等领域上前景广阔。

附图说明

图1是重组质粒的双酶切琼脂糖电泳分析图；图中，A是ABC-I的 PCR扩增产物，B是ABC-I重组质粒；

图2是重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图3是重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白在37℃下的热稳定性分析图；

图4是重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白在4℃下的储存稳定性分析图。

具体实施方式

本发明公开了一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白及其制备方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

试剂：多形拟杆菌Bacteroides thetaiotaomicron购买于广东微生物菌种保存中心；pCznl、质粒抽提试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖（PYG）、硫酸软骨素A等购于Sigma有限公司。

实施例1：一种硫酸软骨素酶ABC-I基因的克隆

（1）多形拟杆菌基因组DNA的提取

1）将活化的多形拟杆菌Bacteroides thetaiotaomicron (PBD ID: 2Q1F)的菌株接种到含有100 mL蛋白胨-酵母-葡萄糖（PYG）培养基的250 mL锥形瓶中，在10 %的CO₂下，37 ℃培养18小时，1788×g离心得到菌体。

2）将离心收集的菌体用5倍体积的蒸馏水洗涤，振荡沉淀混匀，随后4℃，1788×g离心8分钟，弃上清；重复该步骤一次。

3）研钵中加入无水酒精，充分燃烧，消除研钵中可能存在的RNase。

4）将步骤2）中离心得到的菌体加入液氮预冷的研钵中，充分研磨。

5）利用质粒抽提试剂盒对离心后的菌体进行质粒抽提，得到Bacteroides thetaiotaomicron的基因组DNA，-80℃保存质粒。

（2）PCR反应扩增硫酸软骨素酶ABC-I的基因

从NCBI中查到Bacteroides thetaiotaomicron的硫酸软骨素酶ABC-I的基因，设计引物并合成含酶切位点的一对引物序列，用于扩增硫酸软骨素酶ABC-I基因的开放读码框，引物中分别含有NdeI和XbaI两种酶的酶切位点：上游引物序列如SEQ ID NO：1所示：即5’-catatgcaggtcatagggtttgaag-3’，下游引物序列如seq id no：2所示：即5’-agatcttttattttcaagaatcatttc-3’。

以步骤（1）中抽提到的多形拟杆菌Bacteroides thetaiotaomicron基因组DNA作为模板，利用设计的引物进行PCR扩增，反应程序：1）95℃下4分钟；2）95℃下30秒；3）60 ℃下55秒；4）72℃下1分钟；5）重复步骤2）到4）20个循环；5）72℃下10分钟。将PCR产物纯化后与表达载体pCznl分别使用NdeI和XbaI进行双酶切，双酶切产物纯化回收再进行连接得到重组表达载体pCznl-Chon-ABC-I。连接条件为25 ℃，12小时；连接体系（10 μL）为：载体 2μL，目的基因6 μL，10×Ligation buffer 1 μL，T4DNA连接酶1 μL。

将连接后的重组表达载体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单菌落培养，抽提质粒，对质粒进行双酶切验证。图1是重组载体的双酶切琼脂糖电泳分析图；图中，A是硫酸软骨素酶ABC-I的PCR扩增图，编号1表示DNA Marker，编号2表示ChSase-ABC-I PCR扩增产物；B是硫酸软骨素酶ABC-I重组质粒； M是DNA Marker，编号1代表ChSase-ABC-I重组质粒，编号2代表重组ChSase-ABC-I酶切鉴定；如图1所示，酶切结果显示出了两条目的条带分别对应了pCznl（5369 bp）和硫酸软骨素酶ABC-I（3018 bp），显示重组表达质粒连接成功。

将含有重组表达载体pCznl-Chon-ABC-I的菌落扩大培养后，提取质粒保存甘油菌，并将所提质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。经测序验证本实施例中硫酸软骨素酶ABC-I的基因全长3018 bp，编码1006个氨基酸，分子量108 kDa。其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。需要说明的是，本发明中的硫酸软骨素酶ABC-I不仅限于SEQ ID NO:4序列表中所示的氨基酸序列，还可以是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有相同的蛋白活性的有SEQ ID NO:4所示序列衍生的蛋白质的氨基酸序列。

实施例2：硫酸软骨素酶ABC-I的表达纯化

（1）将实施例1中获得的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，对该菌株进行培养。然后挑取单菌落接种于含5 mL卡那霉素（50 μg/mL）的LB液体培养中，37℃下过夜培养。

（2）取5 mL的过夜培养的菌液到装有250 mL LB液体培养基（含有50 μg/mL卡那霉素）的500 mL锥形瓶中，200转/分钟振荡培养至OD₆₀₀为0.6~0.8；添加终浓度为0.75 mM的异丙基-β-D-硫代半苷（IPTG），在25℃下振荡6 h进行目的基因的诱导表达；

（3）取全部培养液，4℃下1788×g离心5分钟；将离心后的菌体加入8 mL PBS缓冲液（20 mM，pH 7.5，200 mM NaCl，10mM CaCl₂），置于冰水中进行超声破碎，4℃下1788×g离心20分钟收集上清得到重组硫酸软骨素酶ABC-I粗酶液。

（4）采用Ni柱亲和纯化获取目的蛋白。吸取1 mL Ni-NTA填料于层析柱中，用无菌水冲洗并用结合液平衡Ni柱；吸取全部平衡后的填料与步骤（3）中得到的上清在4℃下结合2小时。用含20 mM咪唑的20 mM PBS缓冲液清洗杂蛋白，至流出液的OD₂₈₀值达到基线。用含有250 mM咪唑的20 mM PBS的缓冲液洗脱，收集流出液，经SDS-PAGE证实纯化的目的蛋白重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白。

图2 是重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的SDS-PAGE电泳图；图中，M代表分子量标记；编号1代表Marker，2代表硫酸软骨素酶Chon-ABC-I；如图2所示，重组硫酸软骨素酶ABC-I通过SDS-PAGE在108 kDa得到一个明显的目的条带，与硫酸软骨素酶ABC-I理论值108 kDa一致。

实施例3：重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的酶活力分析

在本实施例中以硫酸软骨素A 为底物，测定不饱和二糖在232 nm处吸光度增加量来计算硫酸软骨素酶ABC-I的活力。酶的活力单位为：37℃条件下，每分钟降解硫酸软骨素A形成1 μmoL不饱和二糖的酶量。产物不饱和二糖在232 nm下的摩尔消光系数为3.8，根据蛋白质标准曲线计算出硫酸软骨素酶ABC-I的酶活力。每个实验需独立测定3次，计算标准差。经计算重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的粗酶活性可达到7144U/L，经Ni-NTA纯化后，酶活力为492.1 U/mg。

实施例4：重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的热稳定性分析

（1）热稳定性分析

对实施例2所得重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白在37℃的条件下进行热稳定性分析，分析过程没有加入任何酶保护剂。

分别取5 μL纯化的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白于895μL pH 8.0的PBS缓冲液（20mM）中，分别于37℃水浴锅中放置0、2、10、20、30、40、60、120 min，于设定好的时间拿出在4℃冷却1 min后，立即加入100 μL 浓度为10 mg·mL^-1的硫酸软骨素钠底物溶液，开始反应并测定重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的酶活力。图3是重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白在37℃下的热稳定性分析图；如图3所示，重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白在37℃保温60 min后，任能保留80%以上的酶活力，在37℃下重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的半衰期有120分钟，具有良好的热稳定性能。

（2）储存稳定性分析

分别吸取10 μL实施例2中纯化的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白于1.5 mL EP管中，离心确保没有气泡后储存于4℃冰箱中，于第0、7、10、14、21、35天取出，加入890 μL pH 为7.5的PBS缓冲液（20 mM），测定重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的酶活力。图4是重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白在4℃下的储存稳定性分析图。如图4所示，在4℃的环境下保存重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白活力损失较小，可以相对较长时间保存，在保存的第35天其依然具有80%以上的酶活力，在4℃的环境下其半衰期为112天，表明制备得到的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白具有良好的存储稳定性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白及其制备方法与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catatgcagg tcatagggtt tgaag 25

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agatctttta ttttcaagaa tcatttc 27

<210> 3

<211> 3078

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgataaagc aatcttttac tctgtcagtg acaatgctga tattgtcttt tctctgtccg 60

gcattcctca atgcgcagat agttacggac gagcggatgt tctcttttga agaaccgcag 120

ttacctgcct gtataaccgg tgttcagtct cagttgggca tatccggtgc acattataaa 180

gacgggaaac attcgttgga atggaccttc gaaccgaacg ggaaactgga actccggaaa 240

gacctgaagt ttgaaaagaa ggacccgaca gggaaagacc tgtatctttc cgctttcatc 300

gtatggatat acaatgagca gcctcaggac gctgctatcg agtttgaatt tctgaaagac 360

ggccgtaagt gcgcttcttt ccctttcggc atcaatttca aaggctggcg tgcggcatgg 420

gtctgctatg aacgcgatat gcaaggcacg ccggaagagg gaatgaacga gctccgcatc 480

gtggctccca atgcaaaagg acgccttttc atcgatcatc tgatcactgc gacgaaggta 540

gacgcccgtc agcagacagc cgatctgcaa gtcccctttg tcaatgccgg cactaccaat 600

cactggctgg tactctacaa acactccctc ctgaaaccgg acatcgaact gactcccgta 660

agcgacaggc agcggcagga aatgaaactg ctggaaaagc gttttcgtga catgatctat 720

accaaaggga aggtgacgga gaaagaagcc gaaaccatcc gtaagaaata cgacctctat 780

cagataacct ataaggacgg gcaagtgtcc ggagtgccca ttttcatggt gcgcgcttcc 840

gaagcctacg aacggatgat tccggactgg gacaaggata tgctgaccaa gatggggata 900

gagatgcgtg cctattttga cttgatgaaa cggattgccg tagcttacaa taacagtgag 960

gcaggatcac cggtccgcga ggaaatgaaa cggaaattcc ttgcgatgta cgaccatatc 1020

accgatcagg gagtggctta tggtagttgc tggggcaata ttcatcatta cggatatagc 1080

gtgcgcggac tttatccggc ttatttcctg atgaaagatg tattgcggga agaaggaaaa 1140

ctgcttgaag cggagcgtac gttgcgttgg tatgctatca ccaacgaggt atatcccaaa 1200

ccggaaggca acggcatcga tatggattct ttcaatacac aaaccaccgg gcgtatcgca 1260

agcattctga tgatggaaga cacgccggag aagctgcaat acttgaaatc cttctcccga 1320

tggattgact acggctgccg tcctgcaccg ggactggccg gttctttcaa agtggacgga 1380

ggagctttcc atcaccgtaa taactaccct gcctatgccg ttggaggact ggacggggca 1440

acgaatatga tttatctttt cagtcggaca agccttgccg tttccgaatt ggcacaccgg 1500

acggtcaaag atgtcctgct tgccatgcgt ttctactgca ataaactgaa ctttcccttg 1560

tctatgtccg ggcgccatcc cgatggacag gggaaattag ttcccatgca ctatgcgatg 1620

atggcaattg ccggaactcc cgatggaaag ggcgattttg ataaagagat ggcatccgcc 1680

tacctgcgtc tcgtatcttc cgattcctct tctgcggaac aggcaccgga atatatgccg 1740

aaagtttcga acgctcagga gcgtaagatt gccaaacgac tggtggaaaa cggttttcgt 1800

gccgaatccg atccgcaggg taatctctca ctaggctatg gctgtgtatc tgtgcaacgg 1860

cgtgaaaact ggtcggctgt ggcacgcgga cattcacgct acctttgggc agccgaacat 1920

tatctgggac acaacctcta tggacgttat ctggcacatg gaagtctcca gatactgaca 1980

gcacctccgg gacagacagt gactcccgcc accagcggat ggcagcagga aggtttcgac 2040

tggaaccgca ttccgggagt gacttccatc catctcccgc tggacctgct caaagccaac 2100

gtgctgaatg tagatacatt ctccggaatg gaagagatgc tttattcgga tgaagccttt 2160

gccggcggcc tgtcacaagg aaagatgaat ggcaacttcg gaatgaaact gcacgaacac 2220

gataagtata acggaacgca tcgtgcgcga aaatcctacc atttcatcga tggaatgatc 2280

gtttgtctag gctcggatat cgagaataca aacacggatt atccaacgga gacgaccatc 2340

ttccaactgg cggtgacaga taaagcggca catgactatt ggaagaataa tgcgggtgaa 2400

ggaaaagtat ggatggatca tctgggcacc ggatattatg tgccggttcc tgcaagattc 2460

gagaaaaact ttccgcaata ctcccgtatg caggatacag gcaaagaaac gaaaggagac 2520

tgggtatcat tgattatcga ccatgggaaa gcaccgaaag cgggaagcta cgaatatgcc 2580

attctgccgg gaaccgaccg gaagacgatg actgcctttg caaagaaacc tgcctacagc 2640

gtattacagc aagaccggaa tgcacatatc cttgaatcgc cttcggacag gataacttct 2700

tatgtgcttt ttgaaactcc ccagtcactg cttcccggtg gattgttgca gcgtacggat 2760

acgtcctgct tagtgatggt ccgtaaggaa tctgctgata aagtattatt gactgtagct 2820

caaccggatc tggcattgta tcgtggtccg agtgatgaag ctttcgataa agacggaaaa 2880

cgtatggaac gcagcatcta ttcccgcccg tggattgaca atgaaagcgg tgagattcct 2940

gtgacggtga ctctgaaagg caggtggaag gtagcggaga ctcctttctg caaagtggta 3000

tccgaggata aaaaacaaac ggtactccgc ttcctctgta aggatggagc cagctatgag 3060

gtagaactgg agaaataa 3078

<210> 5

<211> 1025

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ile Lys Gln Ser Phe Thr Leu Ser Val Thr Met Leu Ile Leu Ser

1 5 10 15

Phe Leu Cys Pro Ala Phe Leu Asn Ala Gln Ile Val Thr Asp Glu Arg

20 25 30

Met Phe Ser Phe Glu Glu Pro Gln Leu Pro Ala Cys Ile Thr Gly Val

35 40 45

Gln Ser Gln Leu Gly Ile Ser Gly Ala His Tyr Lys Asp Gly Lys His

50 55 60

Ser Leu Glu Trp Thr Phe Glu Pro Asn Gly Lys Leu Glu Leu Arg Lys

65 70 75 80

Asp Leu Lys Phe Glu Lys Lys Asp Pro Thr Gly Lys Asp Leu Tyr Leu

85 90 95

Ser Ala Phe Ile Val Trp Ile Tyr Asn Glu Gln Pro Gln Asp Ala Ala

100 105 110

Ile Glu Phe Glu Phe Leu Lys Asp Gly Arg Lys Cys Ala Ser Phe Pro

115 120 125

Phe Gly Ile Asn Phe Lys Gly Trp Arg Ala Ala Trp Val Cys Tyr Glu

130 135 140

Arg Asp Met Gln Gly Thr Pro Glu Glu Gly Met Asn Glu Leu Arg Ile

145 150 155 160

Val Ala Pro Asn Ala Lys Gly Arg Leu Phe Ile Asp His Leu Ile Thr

165 170 175

Ala Thr Lys Val Asp Ala Arg Gln Gln Thr Ala Asp Leu Gln Val Pro

180 185 190

Phe Val Asn Ala Gly Thr Thr Asn His Trp Leu Val Leu Tyr Lys His

195 200 205

Ser Leu Leu Lys Pro Asp Ile Glu Leu Thr Pro Val Ser Asp Arg Gln

210 215 220

Arg Gln Glu Met Lys Leu Leu Glu Lys Arg Phe Arg Asp Met Ile Tyr

225 230 235 240

Thr Lys Gly Lys Val Thr Glu Lys Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Lys

245 250 255

Tyr Asp Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr Lys Asp Gly Gln Val Ser Gly Val

260 265 270

Pro Ile Phe Met Val Arg Ala Ser Glu Ala Tyr Glu Arg Met Ile Pro

275 280 285

Asp Trp Asp Lys Asp Met Leu Thr Lys Met Gly Ile Glu Met Arg Ala

290 295 300

Tyr Phe Asp Leu Met Lys Arg Ile Ala Val Ala Tyr Asn Asn Ser Glu

305 310 315 320

Ala Gly Ser Pro Val Arg Glu Glu Met Lys Arg Lys Phe Leu Ala Met

325 330 335

Tyr Asp His Ile Thr Asp Gln Gly Val Ala Tyr Gly Ser Cys Trp Gly

340 345 350

Asn Ile His His Tyr Gly Tyr Ser Val Arg Gly Leu Tyr Pro Ala Tyr

355 360 365

Phe Leu Met Lys Asp Val Leu Arg Glu Glu Gly Lys Leu Leu Glu Ala

370 375 380

Glu Arg Thr Leu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Asn Glu Val Tyr Pro Lys

385 390 395 400

Pro Glu Gly Asn Gly Ile Asp Met Asp Ser Phe Asn Thr Gln Thr Thr

405 410 415

Gly Arg Ile Ala Ser Ile Leu Met Met Glu Asp Thr Pro Glu Lys Leu

420 425 430

Gln Tyr Leu Lys Ser Phe Ser Arg Trp Ile Asp Tyr Gly Cys Arg Pro

435 440 445

Ala Pro Gly Leu Ala Gly Ser Phe Lys Val Asp Gly Gly Ala Phe His

450 455 460

His Arg Asn Asn Tyr Pro Ala Tyr Ala Val Gly Gly Leu Asp Gly Ala

465 470 475 480

Thr Asn Met Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Thr Ser Leu Ala Val Ser Glu

485 490 495

Leu Ala His Arg Thr Val Lys Asp Val Leu Leu Ala Met Arg Phe Tyr

500 505 510

Cys Asn Lys Leu Asn Phe Pro Leu Ser Met Ser Gly Arg His Pro Asp

515 520 525

Gly Gln Gly Lys Leu Val Pro Met His Tyr Ala Met Met Ala Ile Ala

530 535 540

Gly Thr Pro Asp Gly Lys Gly Asp Phe Asp Lys Glu Met Ala Ser Ala

545 550 555 560

Tyr Leu Arg Leu Val Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ala Glu Gln Ala Pro

565 570 575

Glu Tyr Met Pro Lys Val Ser Asn Ala Gln Glu Arg Lys Ile Ala Lys

580 585 590

Arg Leu Val Glu Asn Gly Phe Arg Ala Glu Ser Asp Pro Gln Gly Asn

595 600 605

Leu Ser Leu Gly Tyr Gly Cys Val Ser Val Gln Arg Arg Glu Asn Trp

610 615 620

Ser Ala Val Ala Arg Gly His Ser Arg Tyr Leu Trp Ala Ala Glu His

625 630 635 640

Tyr Leu Gly His Asn Leu Tyr Gly Arg Tyr Leu Ala His Gly Ser Leu

645 650 655

Gln Ile Leu Thr Ala Pro Pro Gly Gln Thr Val Thr Pro Ala Thr Ser

660 665 670

Gly Trp Gln Gln Glu Gly Phe Asp Trp Asn Arg Ile Pro Gly Val Thr

675 680 685

Ser Ile His Leu Pro Leu Asp Leu Leu Lys Ala Asn Val Leu Asn Val

690 695 700

Asp Thr Phe Ser Gly Met Glu Glu Met Leu Tyr Ser Asp Glu Ala Phe

705 710 715 720

Ala Gly Gly Leu Ser Gln Gly Lys Met Asn Gly Asn Phe Gly Met Lys

725 730 735

Leu His Glu His Asp Lys Tyr Asn Gly Thr His Arg Ala Arg Lys Ser

740 745 750

Tyr His Phe Ile Asp Gly Met Ile Val Cys Leu Gly Ser Asp Ile Glu

755 760 765

Asn Thr Asn Thr Asp Tyr Pro Thr Glu Thr Thr Ile Phe Gln Leu Ala

770 775 780

Val Thr Asp Lys Ala Ala His Asp Tyr Trp Lys Asn Asn Ala Gly Glu

785 790 795 800

Gly Lys Val Trp Met Asp His Leu Gly Thr Gly Tyr Tyr Val Pro Val

805 810 815

Pro Ala Arg Phe Glu Lys Asn Phe Pro Gln Tyr Ser Arg Met Gln Asp

820 825 830

Thr Gly Lys Glu Thr Lys Gly Asp Trp Val Ser Leu Ile Ile Asp His

835 840 845

Gly Lys Ala Pro Lys Ala Gly Ser Tyr Glu Tyr Ala Ile Leu Pro Gly

850 855 860

Thr Asp Arg Lys Thr Met Thr Ala Phe Ala Lys Lys Pro Ala Tyr Ser

865 870 875 880

Val Leu Gln Gln Asp Arg Asn Ala His Ile Leu Glu Ser Pro Ser Asp

885 890 895

Arg Ile Thr Ser Tyr Val Leu Phe Glu Thr Pro Gln Ser Leu Leu Pro

900 905 910

Gly Gly Leu Leu Gln Arg Thr Asp Thr Ser Cys Leu Val Met Val Arg

915 920 925

Lys Glu Ser Ala Asp Lys Val Leu Leu Thr Val Ala Gln Pro Asp Leu

930 935 940

Ala Leu Tyr Arg Gly Pro Ser Asp Glu Ala Phe Asp Lys Asp Gly Lys

945 950 955 960

Arg Met Glu Arg Ser Ile Tyr Ser Arg Pro Trp Ile Asp Asn Glu Ser

965 970 975

Gly Glu Ile Pro Val Thr Val Thr Leu Lys Gly Arg Trp Lys Val Ala

980 985 990

Glu Thr Pro Phe Cys Lys Val Val Ser Glu Asp Lys Lys Gln Thr Val

995 1000 1005

Leu Arg Phe Leu Cys Lys Asp Gly Ala Ser Tyr Glu Val Glu Leu Glu

1010 1015 1020

Lys

1025

Claims

1.一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白，其特征在于，所述重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码1006个氨基酸，分子量108 kDa。

2.根据权利要求1所述的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述引物的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；下游引物序列如SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述PCR扩增的反应参数为：95℃起始变性4 min，95℃变性30 s，60℃退火55 s，72℃延伸1 min，循环20次，72 ℃延伸10 min。

6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中所述的目的基因片段与表达载体pCznl均分别使用NdeI和 XbaI进行双酶切处理。

7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中所述连接的条件为25℃，12小时；连接体系为：载体2 μL，目的基因6 μL，10×Ligation buffer 1 μL，T4DNA连接酶1 μL。

8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中所述的诱导表达为：硫酸软骨素酶ABC-I基因大肠杆菌工程菌接种到5 mL含有终浓度50 ug/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜制得种子液，将种子液接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6~0.8后，添加终浓度为0.75 mM的IPTG在25℃下振荡6 h。

9.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（5）中所述的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白的分子量为108 kDa。

10.一种如权利要求1所述的重组硫酸软骨素酶ABC-I蛋白在制备低分子量硫酸软骨素中的应用。