CN116410867B - 一种黄曲霉菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体公开一种黄曲霉菌及其发酵方法与应用。通过显微观察和ITSrDNA序列分析，本发明将分离得到的黄曲霉菌命名为YJNfs21.11，其保藏编号为CGMCCNo.40260。经生物测定获知，所述黄曲霉菌的菌株及发酵产物对甜瓜、西瓜等果蔬上的蚜虫具有较好的防治效果，可制备用于防治农作物蚜虫危害或其他防治蚜虫相关领域的药剂。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及微生物发酵及其应用，具体涉及一种黄曲霉菌株的分离鉴定、发酵方法及其在蚜虫等作物病害防治方面的应用。
背景技术
蚜虫是瓜类植物栽培中经常发生且为害严重的主要害虫。蚜虫成虫、若虫主要在瓜叶背面、嫩梢、嫩茎上为害，以吸食其汁液为主。瓜类嫩叶、生长点被害后，叶片呈现卷缩状，植株生长逐渐停滞，甚至全株萎蔫，直至死亡；老叶受蚜虫为害时，叶片不卷缩，但会逐渐干枯。当前大棚甜瓜、西瓜生产中，前期有棚膜保温，中、后期有棚膜避雨防雨，不仅保护了蚜虫免遭雨水的机械冲击，而且瓜棚内温暖无风、低湿干燥的环境，极利于蚜虫的繁殖生长。由于瓜蚜虫口密度增长快，生产上主要依靠化学药剂进行防治，存在施药量大、用药频繁、用药种类较为单一等问题，瓜蚜抗药性持续提高，导致更大量、更频繁的施药，从而形成恶性循环，进而也形成环境及食品安全隐患。
目前，防治瓜蚜的药剂较多，虽有一些结构新颖、高效低毒、对作物安全的新型化学农药不断涌现，如氟啶虫酰胺、氟啶虫胺腈等，但依然未能延长新农药使用寿命、减缓蚜虫抗性增长，且容易使蚜虫产生抗药性。根据已有微生物菌剂研究，寄生曲霉对蚜虫防治有良好效用，但是关于黄曲霉菌株灭杀蚜虫的研究未见报道。因此作为一种新兴菌剂，微生物菌剂成为高效绿色的化学农药替代品是刻不容缓的任务，也是如今农药及其制剂开发技术领域的研究热点。
发明内容
基于目前蚜虫防治的现状，本发明旨在提供一种新型、高效、广谱、低毒、环保的杀蚜虫微生物菌剂。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案。
本专利申请发明人从宁夏回族自治区石嘴山市盐碱土中分离出一种杀蚜虫活性的黄曲霉菌。该菌(生物材料)的保藏信息为：
菌株名称：YJNfs21.11；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏编号：CGMCC No.40260；
分类命名：黄曲霉Aspergillusflavus；
保藏时间：2022年8月1日。
首先，本发明提供了所述黄曲霉菌YJNfs21.11菌株的分离方法，具体包括：
1)将盐碱土除杂质、过100目筛、用无菌水冲洗、静置、过滤后，用无菌水稀释10倍后放入超净工作台；
2)用无菌水分别进行梯度稀释102、103、104、105、106、107、108倍；
3)每一个梯度采用涂布法接种100μL于PDA培养基上，每一个梯度接种三个培养皿；
4)置于28℃的恒温培养箱中培养3-5d；
5)反复划线纯化直至得到单菌落；
6)置于4℃保藏备用。
本发明通过ITS rDNA序列方法对菌株进行了分类鉴定。提取此菌的DNA，扩增ITSrDNA的序列。ITS rDNA基因PCR扩增中所使用的引物委托北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成，其引物序列为：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，扩增片段大小约500bp～1000bp。扩增产物进行sanger双向测序，测序结果在NCBI上比对分析，以同源性在97％以上且同源性最高的物种判断为该菌株的种属。测序结果表明：所述黄曲霉菌株基因序列与菌株Aspergillusflavusstrain(GenBank：KY234275.1)最为接近。所述黄曲霉菌YJNfs21.11菌株的基因序列如SEQ IDNO.1所示，GenBank上的登录号为：OP071264。
同时，本发明还结合形态学特征对所述黄曲霉菌株进行了分类鉴定。菌株接种在培养基上，呈现的形态学特征为：菌株生长迅速，菌落直径达2cm～3cm，结构疏松，菌落平展，初期为白色短绒状菌丝，向四周平铺生长，菌落边缘不规则，后期菌落中央颜色变绿，长出大量绿色孢子；营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生近球形顶囊，表面产生许多小梗，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。
结合菌株形态观察、培养特性及ITS rDNA的鉴定结果，本发明所述黄曲霉菌，本专利申请发明人将其命名为YJNfs21.11。
另一方面，本发明给出了所述黄曲霉菌的发酵方法，其包括：
(1)所述黄曲霉菌株活化，所述菌株活化选用的培养基为PDA培养基，活化的条件为：33℃、培养3～4天；
(2)配制所述黄曲霉菌孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度控制在106个/mL数量级；
(3)接种发酵，孢子悬浮液以5％体积比例的接种量接入发酵培养基中，发酵条件为：28℃、150r/min振荡培养60h；
(4)所述发酵培养基的组成为：可溶性淀粉35g，蔗糖15g，酵母浸粉12.5g，黄豆饼粉7.5g，KH2PO41.0g，无水MgSO41.1g，NaCl 1.0g，蒸馏水1L。
此外，本发明还给出了YJNfs21.11发酵液及稀释液的田间和室内对蚜虫的防治效果的试验，试验结果证明，YJNfs21.11菌株的发酵液及代谢产物具有杀蚜虫的作用，YJNfs21.11发酵液可用于防治甜瓜、西瓜上的蚜虫。
鉴于所述黄曲霉菌的发酵液具有杀蚜虫的活性或功用，本领域普通技术人员易于得出，所述黄曲霉菌的发酵液可用于制备防治蚜虫的药剂。需要指出的是，所述药剂可以是单一地含有所述黄曲霉菌的菌丝体、孢子、子实体、发酵液等与助剂、载体等的混合物或组合物；或是所述黄曲霉菌的发酵产物与另外其他活性成分的组合物。
结合YJNfs21.11菌株及其发酵产物(液)表现出的生物活性，本发明提出了YJNfs21.11在防治蚜虫等作物病害方面的应用。
与现有技术相比，本发明所述黄曲霉菌及其发酵方法与应用，至少具有下述有益效果或优点：
本发明从宁夏回族自治区石嘴山市盐碱土中，分离筛选得到一株具有生物活性的霉菌YJNfs21.11，经鉴定，该菌归属黄曲霉(Aspergillusflavus)。该黄曲霉菌可以作为开发新型、高效、广谱、低毒、环保的生物菌剂的原料微生物。该微生物菌剂不会对环境造成污染和破坏土壤结构，具有保护生态、成本低廉等优点，同时，本发明所述黄曲霉菌及其发酵物性价比高、绿色无公害、耐高温、防治病虫害且提高农作物产量，因此，本发明所述黄曲霉菌在微生物农药、微生物制剂及其他防治农业病虫害相关领域，具有较好的开发应用前景。
附图说明
图1为所述黄曲霉菌株在PDA培养基上培养3d后的菌落生长形态图。
图2为所述黄曲霉菌株在发酵培养基培养4d后的菌球形态图。
图3为所述黄曲霉菌株在光学显微镜下放大1000倍的孢子形态图。
图4为所述黄曲霉菌株在光学显微镜下放大1000倍的孢子梗形态图。
图5为所述黄曲霉菌株在扫描电镜下放大800倍的孢子梗形态图。
图6为所述黄曲霉菌株在扫描电镜下放大150倍的菌体侵染蚜虫形态图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细阐述。
实施例1：YJNfs21.11菌株的分离
本实施例提供了一种从宁夏回族自治区石嘴山市盐碱土中分离出YJNfs21.11菌株的方法，具体包括：
1)将盐碱土除杂质、过100目筛、用无菌水冲洗、静置、过滤后，用无菌水稀释10倍后放入超净工作台；
2)用无菌水分别进行梯度稀释102、103、104、105、106、107、108倍；
3)每一个梯度采用涂布法接种100μL于PDA培养基上，每一个梯度接种三个培养皿；
4)置于28℃的恒温培养箱中培养3-5d；
5)反复划线纯化直至得到单菌落；
6)置于4℃保藏备用。
所述黄曲霉菌株在PDA培养基上培养3d后的菌落生长形态如图1所示。
实施例2：YJNfs21.11菌株的鉴定
本实施例通过ITS rDNA序列方法对菌株进行了分类鉴定。提取实施例1)中分离得到的菌株的DNA，扩增ITS rDNA的序列。ITS rDNA基因PCR扩增中所使用的引物委托北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成，其序列为：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，扩增片段大小约500bp～1000bp。
扩增产物进行sanger双向测序，测序结果在NCBI上比对分析，以同源性在97％以上且同源性最高的物种判断为该菌株的种属。测序结果表明：所述黄曲霉菌株基因序列与菌株Aspergillusflavusstrain(GenBank：KY234275.1)的最为相似。
本实施例还结合形态学特征对所述黄曲霉菌株进行了分类鉴定。菌株接种在培养基上，在PDA培养基上培养3d后的菌落生长形态如图1所示。在光学显微镜下放大1000倍的孢子、孢子梗的形态如图3、图4所示，所述黄曲霉菌株在扫描电镜下放大800倍的孢子梗形态如图5所示，呈现的形态学特征为：菌株生长迅速，菌落直径达2cm～3cm，结构疏松，菌落平展，初期为白色短绒状菌丝，向四周平铺生长，菌落边缘不规则，后期菌落中央颜色变绿，长出大量绿色孢子；营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生近球形顶囊，表面产生许多小梗，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。
结合菌株形态观察、培养特性及ITS rDNA的鉴定结果，本发明所述黄曲霉菌，本专利申请发明人将其命名为YJNfs21.11。
实施例3：YJNfs21.11菌株的发酵方法
本实施例提供了所述YJNfs21.11菌的发酵方法，其包括：
(1)取实施例1)分离得到的菌株，活化选用的培养基为PDA培养基，活化的条件为：33℃、培养3～4天；
(2)配制YJNfs21.11菌孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度控制在106个/mL数量级；
(3)接种发酵，孢子悬浮液以5％体积比例的接种量接入发酵培养基中，发酵条件为：28℃、150r/min振荡培养60h；
(4)所述发酵培养基的组成为：可溶性淀粉35g，蔗糖15g，酵母浸粉12.5g，黄豆饼粉7.5g，KH2PO41.0g，无水MgSO41.1g，NaCl 1.0g，蒸馏水1L。
YJNfs21.11菌株在发酵培养基培养4d后的菌球形态如图2所示。
实施例4：甜瓜蚜虫防治的田间试验
本实施例给出YJNfs21.11发酵液防治甜瓜蚜虫的田间试验，具体试验操作描述如下：
田间试验施药时间为2022年5月9日，试验地位于陕西杨凌农家甜瓜大棚，供试植物为甜瓜叶，蚜虫害严重，化学农药喷施效果不显。试验设1％吐温20 作为阴性对照，YJNfs21.11发酵液原液、YJNfs21.11发酵液稀释十倍菌剂为试验组，喷施4批，每批3个处理，每个处理做3个平行试验，每个平行试验选取一片叶子进行试验。采用手动喷雾器喷药一次，使叶片正反面均匀铺满药液，同时使该叶片附近的叶片均匀喷满药液。于喷药前调查药前活虫数，喷药后1d、3d、5d分别调查各叶片活蚜虫数，计算虫口减退率和防治效果。YJNfs21.11发酵液甜瓜叶田间杀虫药效试验结果见表1。
虫口减退率和防治效果的计算公式如下：
表1YJNfs21.11发酵液甜瓜叶杀虫药效试验结果
注：菌种名指该菌种的发酵液，菌种后“×10”意为该菌种的发酵液稀释10倍
本实施例试验结果(表1)：YJNfs21.11发酵液原液药后1d防效为75.24％，药后3d防效为80.59％，药后5d防效为96.88％。YJNfs21.11发酵液稀释10倍后1d防效为53.12％，药后3d防效为81.76％，药后5d防效为85.95％。由此可以看出，YJNfs21.11菌株的发酵液具有杀蚜虫的作用，并且发酵液原液试验组的防效逐步提升，药效持效期超过5天，药后5d的防效达到96.88％。
为了进一步验证YJNfs21.11对蚜虫有活性，采用扫描电镜进行验证，结果如图6所示，YJNfs21.11菌成功侵染了蚜虫。
实施例5：西瓜藤蔓叶蚜虫防治的室内试验
田间试验施药时间为2022年7月4日，试验原料采集于陕西杨凌农家西瓜大棚，供试植物为西瓜藤蔓叶，蚜虫害严重，严重影响西瓜生长。试验设1％吐温20为阴性对照、YJNfs21.11发酵液原液、YJNfs21.11发酵液稀释2倍、50倍菌剂及发酵滤液为试验组，喷施4批，每批3个处理，每个处理做3个平行试验，每个平行试验选取一片叶子进行试验。采用手动喷雾器喷药一次，使叶片正反面均匀铺满药液，同时在培养皿内放置润湿的滤纸，将叶片放置于滤纸上，叶片根茎用棉花系捆并滴加清水，在培养皿上盖一层保鲜膜，并扎一定数量的小孔，保证通氧量。于喷药前调查药前活虫数，喷药后16h、24h、40h分别调查各叶片活蚜虫数，计算虫口减退率和防治效果，虫口减退率和防治效果的计算公式见实施例1。YJNfs21.11发酵液西瓜藤蔓叶田间杀虫药效试验结果见表2。
表2YJNfs21.11发酵液西瓜藤蔓叶叶杀虫药效试验结果
注：菌种名指该菌种的发酵液，菌种后“×2”意为该菌种的发酵液稀释2倍
本实施例试验结果(表2)：YJNfs21.11发酵液稀释2倍后16h防效为44.92％，药后24h防效为61.50％，药后40h防效为93.47％。YJNfs21.11发酵液稀释50倍后16h防效为12.87％，药后24h防效为54.45％，药后40h防效为73.51％。发酵滤液16h防效为59.67％，药后24h防效为82.98％，药后40h防效为91.39％由此可以看出，YJNfs21.11菌株的发酵液及代谢产物具有杀蚜虫的作用，为之后深入探索研究提供重大意义。
上面结合实施例对本专利做了进一步的叙述，但本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (6)
1.一种黄曲霉(Aspergillus flavus)菌株YJNfs21.11，保藏编号为CGMCC No.40260。
2.权利要求1所述黄曲霉菌株YJNfs21.11的发酵方法，其特征在于，包括：
选用PDA培养基活化所述黄曲霉菌株，活化条件为：33℃、培养3～4天；向发酵培养基中接种所述黄曲霉菌株孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度控制在106个/mL数量级，发酵条件为：28℃、150r/min振荡培养60h。
3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，以体积比计，所述孢子悬浮液的接种量为发酵培养基的5％。
4.根据权利要求2或3所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：可溶性淀粉35g，蔗糖15g，酵母浸粉12.5g，黄豆饼粉7.5g，KH2PO4 1.0g，无水MgSO4 1.1g，NaCl1.0g，蒸馏水1L。
5.权利要求1所述黄曲霉菌株YJNfs21.11及其发酵液或其发酵滤液在农业上的用途，其特征在于，所述黄曲霉菌株YJNfs21.11及其发酵液或其发酵滤液用于防治蚜虫。
6.一种农用组合物，其特征在于，所述农用组合物的有效成分含有黄曲霉菌株YJNfs21.11及其发酵液或其发酵滤液；
所述黄曲霉菌株YJNfs21.11的保藏编号为CGMCC No.40260。
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