CN111876337B - 一种尖孢镰刀菌及其发酵方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体公开一种尖孢镰刀菌及其发酵方法与应用。结合菌株形态观察、培养特性及16S rDNA序列分析，将分离得到的尖孢镰刀菌鉴定为镰刀菌属真菌，其保藏编号为CGMCC No.19031。所述尖孢镰刀菌菌株的发酵液对甜瓜白粉病以及葡萄的霜霉病、灰霉病都具有较好的防治效果，可制备用于防治甜瓜白粉病、葡萄霜霉病及灰霉病危害的药剂。

Description

一种尖孢镰刀菌及其发酵方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物及其应用，具体涉及一种隶属于镰刀菌属的尖孢镰刀菌菌株，以及其在农业病害防治方面的应用。

背景技术

随着农业经济的发展，农药日益成为农业生产中不可缺少的生产资料，在粮食等作物的稳产、高产和产品质量等方面起着极其重要的作用。另一方面，农药的使用关系到农产品的安全问题，特别是农药残留的问题，不仅涉及国民身体健康，同时也已经成为一个国家农产品出口的重要障碍。随着人们环保意识的提高，以及人类可持续发展的不断深化，积极开发、推广应用生物农药成为全球的共识。

近年来，农药企业巨头如先正达、杜邦、拜耳等公司均涉足生物农药领域，从而再次掀起了生物农药的开发热潮。我国农药产品的结构，目前仍以化学农药为主，据统计，其市场份额占全部农药的90％以上，而生物农药的市场份额不足10％。我国在生物农药的开发和利用方面，先后有很多生物农药投入生产和应用，如灭瘟素、春雷霉素、井冈霉素、赤霉素、多抗霉素、阿维菌素、农抗120、中生菌素、宁南霉素等，这些生物农药为我国的粮食生产与粮食安全做出了重大贡献。从宏观上来看，我国是一个生物农药应用的大国，但生物农药的品种和数量都很有限，其市场占有率也不高，与我国绿色防控、绿色食品生产的要求还存在着很大的差距。迄今我国还没有真正独创的生物农药品种，这与我国的大国地位很不相称。因此，积极筛选和开发高效低毒生物农药新品种对我国农业生产及提高我国的国际地位都有十分重要的意义。

当前，农林业病虫害防治的主要方式是化学防治，但是长期使用性质相对稳定的化学药剂，不仅会增强害虫、病原菌的抗药性，降低其防治效果，并且还可能会污染农产品、土壤和水资源，进而危害人、牲畜的健康和安全，同时也大大破坏了人类赖以生存的生态环境。因此，开发及应用高效、安全、不易产生抗药性的药剂来防治植物病虫害，已成为农药及其制剂开发技术领域的研究热点。

发明内容

天然产物具有丰富的结构和化学多样性，是农药研发的理想资源。微生物源生物农药因不危害人畜、无土壤残留、不污染环境、不杀伤天敌，有利于生态平衡和稳定，备受人们青睐。生物菌剂是指利用目标微生物的发酵液及其代谢产物进行加工而制成的具有防治植物病害的制剂。生物菌剂具有安全、无污染的特点，不仅能防治植物的病害，而且对生态环境十分友好。

为了研究开发新型、高效、广谱、低毒、环保的生物菌剂，本发明提供一种尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，经鉴定，该菌归属镰刀菌属。所述尖孢镰刀菌是本专利申请发明人于2018年4月在陕西省咸阳市杨凌示范区新天地农业示范科技园葡萄种质资源基地内采集获得。所述尖孢镰刀菌的具有显著的抑菌活性，其保藏信息如下。

菌株名称：S_fr118.2；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏编号：CGMCC No.19031；

保藏时间：2019年12月06日。

所述尖孢镰刀菌的分离方法简述为：用水冲洗采摘的葡萄根，放置于超净台，剪成5cm×5cm小块备用；先将葡萄根放入75％乙醇中浸泡30s，取出后用无菌水冲洗4次，再用0.01％HgCl₂浸泡3min，取出后再用无菌水冲洗4次；上述灭菌操作完成后，将葡萄根切成0.5cm左右的长度，接种至培养皿中，每个培养皿接2片，做2-3个重复，置于28℃培养箱培养3-5d；待组织块周围有菌落长出后，用接种环挑取菌体，在PDA培养基上划线，封口并做好标记后于28℃恒温培养箱培养；待有菌落长出后重复此步骤，反复划线，得到单菌落后，用PDA斜面培养基于4℃保藏备用。

本发明通过16S rDNA序列方法对所述尖孢镰刀菌菌株进行分类鉴定。本领域普通技术人员易借鉴现有技术提取所述尖孢镰刀菌的DNA，扩增16S rDNA的序列。16S rDNA基因PCR扩增中所使用的引物序列为：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，扩增片段大小约500bp-700bp。扩增产物进行sanger双向测序，测序结果在NCBI上比对分析，以同源性在97％以上且同源性最高的物种判断为该菌株的种属。测序结果表明：所述尖孢镰刀菌菌株16S rDNA基因序列与最近有效菌株Fusariumoxysporum isolate B5Fo(MH368295.1)的相似率为99％。

本发明将所述尖孢镰刀菌菌株的基因序列提交NCBI的GenBank数据库，所述尖孢镰刀菌菌株在GenBank上的登录号为：MN744320。

同时，本发明还结合形态学特征对所述尖孢镰刀菌菌株进行了分类鉴定。图1为所述尖孢镰刀菌菌株在PDA培养基上培养2d后的菌落形态图。图2为所述尖孢镰刀菌菌株在发酵培养5d后的菌体形态图。图3为所述尖孢镰刀菌菌株经乳酸石炭酸棉蓝染色后放大100倍的菌丝体形态图。将所述尖孢镰刀菌菌株接种在PDA培养基上，呈现的形态学特征为：菌株生长迅速，菌落直径达1.9cm，质地致密，菌落平展，初期为白色短绒状菌丝，向四周均匀生长，菌落边缘呈绒毛状，后期菌落中央颜色逐渐加深，长出大量浅棕色孢子；菌株气生菌丝有隔。

结合菌株形态观察、培养特性及16S rDNA的鉴定结果，本发明所述尖孢镰刀菌鉴定归属于镰刀菌属，本专利申请发明人将其命名为S_fr118.2。

再者，本发明进一步探索了所述尖孢镰刀菌的活化、发酵方法。作为本发明技术方案的优选实施方式之一，活化所述尖孢镰刀菌的培养基为PDA培养基，活化条件为：32℃、培养3-4d。发酵所述尖孢镰刀菌的培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1L。

具体地，本发明给出一种优选的所述尖孢镰刀菌的发酵方法，其包括，选用PDA培养基活化所述尖孢镰刀菌菌株，活化条件为：32℃、培养3-4d；配制所述尖孢镰刀菌孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度控制在10⁶个/mL数量级；接种发酵，孢子悬浮液以5％体积比例的接种量接入发酵培养基中，发酵条件为：30℃、120r/min振荡培养72h。

还有，结合所述尖孢镰刀菌及其发酵产物(液)表现出的生物活性，本发明提出了所述尖孢镰刀菌在农业方面的应用。

作为所述尖孢镰刀菌在农业方面的应用方向之一，所述尖孢镰刀菌用于防治白粉病、霜霉病、灰霉病。基于本发明的技术思路，本领域普通技术人员，还可以将所述尖孢镰刀菌用于其它植物病害微生物的防治。

白粉病广泛发生于许多农作物、蔬菜、花卉等植物上，具有种类多、分布范围广、潜育期短、传染性强、传播速度快的特点，是一种严重影响植物正常生长的世界性病害。能引发植物白粉病的因素很多，一旦被引发白粉病，周围植株可能迅速大量被传染。初期，染病叶片上会生出白色斑点，然后病斑将会沿着叶脉扩展，最后布满全叶，使全叶片覆盖上一层粉末，会严重影响光合作用，造成叶片枯黄，进而引起大量叶片脱落，严重影响植物正常生长。

葡萄灰霉病由灰葡萄孢侵染引起，是葡萄生产及储运过程中的严重病害，每年造成葡萄20％的损失。该病害主要危害花序果实，有时也危害叶片和新梢。果穗染病初呈淡褐色水浸状，很快变成暗褐色，整个果穗软腐，此期若遇阴雨，2-3d后果穗长出一层淡灰色霉层。成熟期染病，初期果面出现灰褐色斑点，继而出现褐色凹陷斑，很快腐烂，其上长出鼠灰色霉层。贮藏期如受病菌侵染，病斑部会溢出黄褐色粘液，浆果变色、腐烂。

葡萄霜霉病是一种高温高湿型病害，主要危害葡萄叶片，发病初期在叶面形成浅黄色近圆形至多角形病斑，容易并发角斑病，空气潮湿时叶背产生霜状霉层，有时可蔓延到叶面。后期病斑枯死连片，呈黄褐色，严重时全部外叶枯黄死亡。田间种植过密、定植后浇水过早、土壤湿度大、等条件下都容易发病。

本发明还进一步提出了所述尖孢镰刀菌的发酵液在农业方面的应用。有关所述尖孢镰刀菌发酵液的制备，可采用本发明所述尖孢镰刀菌的发酵方法制备，基于本发明的技术思路，本领域普通技术人员，还可以进一步优化或改进制备所述尖孢镰刀菌发酵液的工艺参数或条件。

作为所述尖孢镰刀菌的发酵液在农业方面的应用方向之一，所述尖孢镰刀菌的发酵液用于防治甜瓜白粉病、葡萄霜霉病和灰霉病。

基于上述尖孢镰刀菌及其发酵液在农业领域的应用，本发明提供一种农用组合物，其组分包括所述尖孢镰刀菌，或者包括所述尖孢镰刀菌的发酵产物。

在本发明技术方案的启示下，本领域普通技术人员利用所述尖孢镰刀菌制备用于防治甜瓜白粉病、葡萄灰霉病及霜霉病等农业病害的活性物质，并可基于现有技术，对该活性物质作进一步拓展应用，比如将该活性物质作为制备用于防治病害的药剂的组分，或者通过适宜的途径或手段直接用该活性物质防治病害。

鉴于所述尖孢镰刀菌的发酵液具有防治甜瓜白粉病、葡萄灰霉病及霜霉病的活性或功用，本领域普通技术人员易于得出，所述尖孢镰刀菌的发酵液可用于制备防治以上病害的药剂。需要指出的是，所述药剂可以是单一地含有所述镰刀菌的菌丝体、孢子、子实体或发酵液等，或者是所述尖孢镰刀菌发酵液与助剂、载体等的混合物或组合物；或是所述尖孢镰刀菌的发酵产物与另外其它活性成分的组合物。

与现有技术相比，本发明所述尖孢镰刀菌及其发酵方法与应用，至少具有下述有益效果或优点。

(1)本发明从陕西省咸阳市杨凌示范区新天地农业示范科技园葡萄种质资源基地内的葡萄植株中，分离筛选得到一株具有生物活性的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，经鉴定，该菌归属镰刀菌属。该尖孢镰刀菌可以作为开发新型、高效、广谱、低毒、环保的生物菌剂的原料微生物。

(2)本发明明确了所述尖孢镰刀菌的活化培养基、发酵培养基，以及其发酵培养方法。

(3)根据本发明的试验结果，所述尖孢镰刀菌的发酵液能直接用于白粉病、灰霉病及霜霉病等植物病害的防治，尤其是，所述尖孢镰刀菌的发酵液对甜瓜白粉病、葡萄灰霉病及霜霉病具有较好的防治效果。

(4)基于本发明的技术方案，可以预测所述尖孢镰刀菌在微生物农药、微生物制剂及其他防治农业病虫害相关领域，具有较好的开发应用前景。

附图说明

图1为所述尖孢镰刀菌菌株在PDA培养基上培养2d后的菌落形态图。

图2为所述尖孢镰刀菌菌株在发酵培养5d后的菌体形态图。

图3为所述尖孢镰刀菌菌株经乳酸石炭酸棉蓝染色后放大100倍的菌丝体形态图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细阐述。

实施例1

本实施例给出所述尖孢镰刀菌的发酵液防治甜瓜白粉病的田间试验，具体试验操作描述如下。

田间试验施药时间为2018年5月，试验地位于陕西杨凌筒张村甜瓜大棚，供试植株共18株，均为成熟苗，高1.7米，占地约10平方米，土壤肥力良好。试验设喷施所述尖孢镰刀菌的发酵液原液的处理组为试验组，设喷清水处理组为对照组，共2个处理，每个处理3-4株，每株调查10片叶。采用手动喷雾器喷药一次，使叶片正反面均匀铺满药液，同时使该叶片附近的叶片均喷满药液。于喷药前调查病级指数并做好标记，喷药后3d、7d、15d分别调查病情指数并计算防效，结果见表1。

分级标准：按叶片病斑面积占全叶面积百分率分为8级。

0级：健康叶，无病斑；

1级：病斑面积占全叶面积0.1％-5.0％；

2级：病斑面积占全叶面积5.1％-15％；

3级：病斑面积占全叶面积15.1％-30％；

4级：病斑面积占全叶面积30.1％-45％；

5级：病斑面积占全叶面积45.1％-65％；

6级：病斑面积占全叶面积65.1％-85％；

7级：病斑面积占全叶面积85.1％以上。

甜瓜白粉病病情指数及防治效果的计算公式如下：

表1尖孢镰刀菌的发酵液甜瓜棚内白粉病防治试验结果

从表1看出，所述尖孢镰刀菌的发酵液具有防治甜瓜白粉病的作用，3d、7d、15d的防效分别为69.72％、67.00％、67.42％，对白粉病的平均防效达到68.05％。

实施例2

实施例给出所述尖孢镰刀菌的发酵液防治葡萄霜霉病的田间试验，具体试验操作描述如下。

田间试验施药时间为2019年7月，试验地位于陕西省咸阳市杨凌示范区新天地农业示范科技园葡萄种质资源基地内进行，供试植物为红地球葡萄。试验共分为三组：本发明所述尖孢镰刀菌发酵液原液处理组(S_fr118.2)、本发明所述尖孢镰刀菌发酵液加助剂处理组(S_fr118.2+助剂)和清水对照组，每组设3个重复，每个重复选取20片叶子进行试验。试验时随机选取叶片，调查病情指数并做好标记，采用手动喷雾器喷药一次，使叶片正反面均匀铺满药液，同时使该叶片附近的叶片均喷满药液。于喷药前调查病级指数并做好标记，喷药后3d、5d、7d分别调查病情指数并计算防效，结果见表2。

葡萄霜霉病叶片病害分级标准：

0级：健康叶，无病斑；

1级：病斑面积占整个叶片面积的5％以下；

3级：病斑面积占整个叶片面积的6％-25％；

5级：病斑面积占整个叶片面积的26％-50％；

7级：病斑面积占整个叶片面积的51％-75％；

9级：病斑面积占整个叶片面积的76％以上。

霜霉病病情指数及防治效果计算公式：

表2尖孢镰刀菌的发酵液葡萄霜霉病田间防治试验结果

由表2可知，所述尖孢镰刀菌的发酵液对葡萄霜霉病有较好的田间防效，平均防效65.2％，最高可达70.04％；尖孢镰刀菌发酵液与常规农用助剂组合使用，可以提高所述尖孢镰刀菌的发酵液对葡萄霜霉病的田间防效，施药3d后的防效达到最高，为78.8％。

实施例3

本实施例给出所述尖孢镰刀菌的发酵液防治葡萄灰霉病病原菌的室内试验，具体试验操作描述如下。

2019年10月于陕西省咸阳市杨凌示范区新天地农业示范科技园葡萄种质资源基地内采集患灰霉病的葡萄果实，在PDA平板上培养，长出菌落后，多次划线纯化得到灰霉病病原菌。取三份50mL所述尖孢镰刀菌的发酵液(S_fr118.2)做以下处理：第一份发酵液，14000r/min离心10min，取上清即为样品A；第二份发酵液，14000r/min离心10min，取沉淀加80％丙酮水溶液充分搅拌提取，抽滤后浓缩，待丙酮充分挥发后与离心上清合并，即为样品B；获取样品B处理过程中，向留下的沉淀加50mL蒸馏水混合均匀，超声破碎，离心过滤后取滤液即为样品C；第三份发酵液直接作为样品D。

配制300mL PDA固体培养基，用量筒量取59mL分装于5个250ml三角瓶中，注意分装时要将培养基搅拌均匀，121℃灭菌20min。冷却至50℃左右后，无菌条件下取四瓶培养基分别加入A、B、C、D样品各1mL，混合均匀后倒入培养皿。再取一瓶培养基直接倒入三组培养皿作为空白对照。

在无菌条件下，使用灭菌后的10mm打孔器，切取灰霉病原菌菌落外沿制成菌饼，用灭菌后的镊子夹取菌饼，将菌饼有菌丝一面向下置于各组培养基中央，标记好样品序号及日期，置于32℃培养箱中培养。培养三天后用实际交叉法统计菌落直径，选取平均值计算相对抑制率，结果见表3。

相对抑制率计算公式：

表3尖孢镰刀菌的发酵液葡萄灰霉病病实验室试验结果

由表3可知，所述尖孢镰刀菌的发酵液，以及尖孢镰刀菌的菌丝体、孢子、子实体均可以对葡萄灰霉病病原菌表现出不同程度的抑制作用。

上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种尖孢镰刀菌及其发酵方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 552

<212> DNA

<213> 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)

<400> 1

ggatcgggtt ctactgattc gaggtcacat tcagaagttg ggtgttttac ggcgtggccg 60

cgccgctctc cagttgcgag gtgttagcta ctacgcaatg gaagctgcgg cgggaccgcc 120

actgtatttg ggggacggcg ttgtgcccgc agggggcttc cgccgatccc caacgccagg 180

cccgggggcc tgagggttgt aatgacgctc gaacaggcat gcccgccaga atactggcgg 240

gcgcaatgtg cgttcaaaga ttcgatgatt cactgaattc tgcaattcac attacttatc 300

gcatttcgct gcgttcttca tcgatgccag agccaagaga tccgttgttg aaagttttaa 360

tttatttgct tgtttactca gaagaaacat tatagaaaca gagttagggg gtcctctggc 420

gggggcggcc cgtgttacgg ggccgtctgt tcccgccgag gcaacgttat aggtatgttc 480

acagggttga tgagttgtat aactcggtaa tgatccctcc gcaggtcacc ctacggaggt 540

ctttcgccgt tt 552

Claims (8)

1. 一种尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），所述尖孢镰刀菌归属镰刀菌属，于2019年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19031。

2.根据权利要求1所述尖孢镰刀菌，其特征在于，所述尖孢镰刀菌的ITS基因PCR扩增引物为ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

3.根据权利要求1所述尖孢镰刀菌，其特征在于，活化所述尖孢镰刀菌的培养基为PDA培养基，活化条件为：32℃、培养3-4d。

4.根据权利要求1所述尖孢镰刀菌，其特征在于，发酵所述尖孢镰刀菌的培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1L。

5.权利要求1至4任一项所述尖孢镰刀菌的发酵方法，其特征在于，包括，选用PDA培养基活化所述尖孢镰刀菌菌株，活化条件为：32℃、培养3-4d；配制所述尖孢镰刀菌孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度控制在10⁶个/mL数量级；接种发酵，孢子悬浮液以5%体积比例的接种量接入发酵培养基中，发酵条件为：30℃、120r/min振荡培养72h。

6.权利要求1至4任一项所述尖孢镰刀菌在防治甜瓜白粉病，或葡萄霜霉病，或葡萄灰霉病中的应用。

7.权利要求1至4任一项所述尖孢镰刀菌的发酵液在防治甜瓜白粉病，或葡萄霜霉病，或葡萄灰霉病中的应用。

8.一种农用组合物，其组分包括权利要求1所述尖孢镰刀菌，或包括权利要求1所述尖孢镰刀菌的发酵产物。

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