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CN105907680A - 一种枯草芽孢杆菌j-5及其生物菌剂和应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌j-5及其生物菌剂和应用 Download PDF

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CN105907680A CN201610359661.2A CN201610359661A CN105907680A CN 105907680 A CN105907680 A CN 105907680A CN 201610359661 A CN201610359661 A CN 201610359661A CN 105907680 A CN105907680 A CN 105907680A
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宋水山
马宏
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Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
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Abstract

本发明提供了一种保藏号为CGMCCNo.11750的枯草芽孢杆菌(Busillus subtilis)，以及含有此枯草芽孢杆菌的微生物菌剂，还提供了所述枯草芽孢杆菌或微生物菌剂在防治番茄、黄瓜、草莓等果蔬灰霉病中的应用，本发明提供的保藏号为CGMCCNo.11750的枯草芽孢杆菌及含有该菌的微生物菌剂对灰霉病菌有很强的拮抗作用，且见效快，防效持续时间长。利用本发明筛选出的枯草芽孢杆菌菌株可以制成相应的微生物制剂，将制得的微生物菌剂施用到田间后，通过该枯草芽孢杆菌的作用能够防治番茄、黄瓜、草莓等蔬菜灰霉病的发生，从而降低果蔬生产过程中化学农药的施用。

Description

一种枯草芽孢杆菌J-5及其生物菌剂和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌J-5及其生物菌剂和应用。
背景技术
灰霉菌（Botrytis cinerea），又称灰葡萄孢菌，是一类世界性分布的真菌，它是一种广寄主性的、能够引起200多种已知植物（如水果、蔬菜及花卉）灰霉病的坏死营养型病原真菌。以菌核、分生孢子及菌丝体随病残组织在土壤中越冬，通过伤口、自然孔口及幼嫩组织侵入寄主，发病后又可产生大量分生孢子，借风雨传播蔓延进行多次再侵染，引起灰霉病，花、果、叶、茎均可发病，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重要病害之一。
在黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓等上，灰霉病病苗色浅，叶片、叶柄发病呈灰白色，水渍状，组织软化至腐烂，高湿时表面生有灰霉。幼茎多在叶柄基部初生不规则水浸斑，很快变软腐烂，缢缩或折倒，最后病苗腐烂枯萎病死。果实染病，青果受害重，残留的柱头或花瓣多先被侵染，后向果实扩展，致使果皮呈灰白色，并生有厚厚的灰色霉层，呈水腐状，叶片发病从叶尖开始，沿叶脉间成“V”形向内扩展，灰褐色，边有深浅相间的纹状线，病键交界分明。染病地块轻则减产20%，严重的减产50%以上。
目前灰霉病已成为黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓生产上的一种主要病害，对黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓产量和品质构成了极为严重的威胁，该病目前主要通过杀菌剂类化学农药进行防治，但是效果不佳且对环境污染较为严重，急需寻找低污染、高防效的灰霉病防治方式。
利用拮抗微生物防治农作物病害由于具有低污染、低残留、不引起病害抗性等优点，近年来得到广泛的重视。该防治方式的关键是筛选出对病原微生物有拮抗作用且抑菌谱广的拮抗微生物，并利用菌剂或者其代谢产物粗提取物形成生物制剂，在黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓的灰霉病防治上进行应用。目前已有一些用于灰霉病生物防治的生防制剂，但大多抑菌效果不够理想，抑菌谱窄，且作用持续时间短。因此，迫切需要筛选出一种能够高效、持久拮抗灰霉病病源菌的微生物菌株及相关的微生物菌剂，从而通过生物防治降低灰霉病给黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓生产带来的危害。
发明内容
基于以上技术现状，本发明的目的在于提供一种能够有效、持久抑制灰霉菌生长，尤其是能够高效拮抗黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌菌株，并且本发明还提供了一种含有上述枯草芽孢杆菌菌株的用于防治灰霉菌感染所致的黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病的生物菌剂。
为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明所述的枯草芽孢杆菌J-5于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 11750。
本发明还提供了含有所述枯草芽孢杆菌J-5的生物菌剂，其中枯草芽孢杆菌J-5的含量为4×109cfu/g~7×109cfu/g菌剂。
所述生物菌剂为枯草芽孢杆菌J-5的芽孢菌剂的混合菌剂。
本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌J-5及其菌剂在防治黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓等果蔬灰霉病中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明的枯草芽孢杆菌J-5可以有效抑制灰霉菌感染所致的黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病，具有高效的防治作用，有效率可以达到60%以上，且见效快，作用持续时间长。作为生物介入手段，可以避免化学品如农药引起的残留和污染，是一种更经济、环保、绿色的植物病害防治手段。
本发明的枯草芽孢杆菌J-5可以制成多种生物菌剂，或作为有效成分添加到现有生物菌剂中，当制成芽孢菌剂时，可适应多种保存环境，并具有较长的保质期，在常温常压下，可保存1-3年，利于仓储和运输。
生物样品保藏信息
枯草芽孢杆菌J-5，分类命名为Bacillus subtilis，已于2015年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC No. 11750。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌J-5在固体LB培养基上培养48小时的菌落形态。
图2为枯草芽孢杆菌J-5复红染色后的光学显微镜下的形态。
具体实施方式
实施例1 对黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病具有拮抗作用的细菌的分离、筛选
采集灰霉病害发病严重黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓地块中的健康植株根际土壤作为试验材料，在实验室内从该样品中进行细菌分离，在LB培养基上进行多次分离纯化，得到纯培养菌落后，以番茄灰霉病菌为指示菌，采用对峙试验方法进行拮抗性能高的菌株的筛选。
具体步骤：上述土壤样品来自河北省、宁夏、山东、山西等地的染有灰霉病害的黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓种植田地中，将该土壤经梯度稀释后涂布于PB培养基中，于28℃恒温培养箱培养。上述培养基根据“微生物培养基手册”的记载制备得到，培养基配方为：牛肉膏5g ，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，自来水1000ml，pH7.2~7.4，121℃灭菌20min后使用。待平板长出菌落后，挑取不同形态的单菌落采用划线分离法反复进行分离纯化，直到得到单菌落的纯培养物，纯化后的菌株保存于PB培养基斜面。
以番茄灰霉菌为指示菌，采用十字交叉法测定不同菌株对灰霉菌生长的抑制率。将筛选出的细菌菌株点接在距平板中央3cm 处的4个角上，平板中央同时接种直径5mm 的活化的番茄灰霉病菌块，每个菌株重复三次，28℃恒温培养5d，测量、记录抑菌圈直径的大小并计算平均抑制率。筛选出了对番茄灰霉菌拮抗作用最强的菌株J-5。
并对该菌株进行了保藏，保藏号为CGMCC No.11750。
实施例2 拮抗菌株遗传稳定性的确定
将菌株J-5在PB培养基上采用划线法进行传代培养，培养20代后，采用平板对峙法测定传代后的J-5菌株对番茄灰霉菌的拮抗效果，以原始J-5菌株为对照，该拮抗菌株经过20代培养后与原始菌株具有相同的拮抗作用，说明该拮抗菌株具有良好的遗传稳定性，将抑菌效果稳定的拮抗菌进行PB培养基液体培养，吸取菌液进行-80℃甘油保存。
实施例3 拮抗菌株的鉴定
根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容和实验方法，对筛得的保藏号为CGMCC No.11750的菌株J-5进行鉴定，菌落形态观测是在PB培养基上进行的，将菌株划线接种后，于28℃恒温培养24 小时观察菌落形态。保藏号为CGMCC No.11750的菌株的菌落近圆形，边缘啮蚀状，脐突状突起，表面皱褶，颜色为乳白色，无光泽不透明，与培养基结合不紧密。挑取培养24 小时菌苔革兰氏染色后在光学显微镜的100倍油镜下观察。在显微镜下可以看到，保藏号为CGMCC No.11750的菌株为芽孢杆菌，革兰氏阳性菌，芽孢位置中生或近中生，芽孢膨大，无伴孢晶体，单个出现。初步确定为芽孢杆菌。
16SrDNA鉴定：将保藏号为CGMCC No.11750的菌株接种到PB培养液，28℃摇床培养24 h，采用天根生化科技（北京）有限公司基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组DNA，然后以提取的总DNA 作为模板，以上游引物：F27（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′）和下游引物R1492 (5′- TACGGCTA CCTTGTTA CGAC TT -3 ′)引物对进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μl，反应体系为:基因组DNA 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，F27引物0.5μL，R1492引物0.5μL，dNTPs 2μL，Taq 酶(5U/μL) 0.25μL，ddH2O 18.25μL。反应条件为：95℃ 预变性5 min；95℃变性30s，50℃退火1min，72℃ 延伸2min，循环30次；72℃ 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR条带大小约为1500bp的PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA序列（见序列1），输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比较分析。利用MEGA4.1进行系统发育树的构建。经过序列分析显示，保藏号为CGMCCNo.11750的菌株属于枯草芽孢杆菌。
实施例4-7 枯草芽孢杆菌J-5的番茄种植田间应用
将保藏号为CGMCC No.11750枯草芽孢杆菌菌株接种到装有15L PB液体培养基的30L发酵罐中，于28℃、180r/min的恒温条件下培养36小时，离心获得枯草芽孢杆菌的芽孢，然后喷雾干燥，用可溶性淀粉混匀该菌的芽孢干粉，形成终浓度为4×109cfu/g~7×109cfu/g的芽孢制剂。
在河北省青县和泊头市两地区的番茄连作田对番茄灰霉病进行芽孢杆菌剂的田间试验。将芽孢制剂和水1：300的重量比悬溶后分别喷施在番茄定植10天后、开花期和初果期，每次使用剂量为每亩300g芽孢制剂；常规对照使用常规剂量的化学农药高巧作为防治药物，空白对照不施用防治药物但施加与实施例组相同重量的水；每个处理3次重复，调查番茄灰霉病的发病情况。
调查方法：
在成熟期采用对角线五点取样法，每个点定株20株，共取样100株调查株发病率与病情指数，记录总调查株数、总发病株数。
番茄灰霉病病情指数分级标准：
0级：全株无害病斑；1级：少数叶片发病至全株下部1/4以下的叶片有病斑；2级：全株中下部1/2以下的叶片有病斑或者茎秆分枝上有病斑；3级：全株3/4以下部位的叶片有病斑或者单个分支茎秆枯死和单株有1~2个果实发病腐烂；4级：全株3/4以上的叶片发病枯黄或者茎秆枯死，单株有2个以上的果实发病腐烂。
防效计算方法：
番茄株发病率=总发病株数/总调查株数×100
病情指数=∑(发病株数×该发病株级值）/（总调查株数×最高级值）×100
防治效果（%）=（对照区病情指数—处理区病情指数）/对照区病情指数 ×100
防治效果如表1所示，J-5芽孢菌剂对番茄灰霉病具有良好的防效，在施用J-5芽孢菌剂的情况下番茄灰霉病发病率和病情指数均降低，不同实施例的防病效果均在80%以上。
表1 不同菌剂施用对番茄灰霉病的防治效果
。
实施例8-11 枯草芽孢杆菌J-5的黄瓜种植田间应用
将保藏号为CGMCC No.11750枯草芽孢杆菌菌株接种到装有15L PB液体培养基的30L发酵罐中，于28℃、180r/min的恒温条件下培养36小时，离心获得枯草芽孢杆菌的芽孢，然后喷雾干燥，用可溶性淀粉混匀该菌的芽孢干粉，形成终浓度为4×109cfu/g~7×109cfu/g的芽孢制剂。
在河北省衡水市和泊头市两地区的黄瓜田地对灰霉病进行芽孢杆菌剂的田间试验。将芽孢制剂和水1：300的重量比悬溶后分别喷施在黄瓜定植10天后和开花期，每次使用剂量为每亩300g芽孢制剂；常规对照使用常规剂量的化学农药高巧作为防治药物，空白对照不施用防治药物但施加与实施例组相同重量的水；每个处理3次重复，调查黄瓜灰霉病的发病情况。
调查方法：
在成熟期采用对角线五点取样法，每个点定株20株，共取样100株调查株发病率与病情指数，记录总调查株数、总发病株数。
黄瓜灰霉病病情指数分级标准：
0 级：无病症；
1 级：接种叶出现少量病斑；
2 级：病斑面积占叶面积的 1/3；
3 级：病斑面积占叶面积的 1/3-1/2；
4 级：病斑面积占叶面积的 1/2-2/3；
5 级：病斑面积占叶面积的 2/3 以上
防效计算方法：
黄瓜株发病率=总发病株数/总调查株数×100
病情指数=∑（发病株数×该发病株级值）/（总调查株数×最高级值）×100
防治效果（%）=（对照区病情指数—处理区病情指数）/对照区病情指数 ×100
利用J-5芽孢菌剂在河北省衡水市和泊头市两地区进行黄瓜灰霉病的防治试验，结果见表2，使用该芽孢菌剂可降低黄瓜灰霉病发病率、降低病情指数，防病效果在80%以上。
表2 不同菌剂施用对黄瓜灰霉病的防治效果
。
实施例12-15 枯草芽孢杆菌J-5的草莓种植田间应用
将保藏号为CGMCC No.11750枯草芽孢杆菌菌株接种到装有15L PB液体培养基的30L发酵罐中，于28℃、180r/min的恒温条件下培养36小时，离心获得枯草芽孢杆菌的芽孢，然后喷雾干燥，用可溶性淀粉混匀该菌的芽孢干粉，形成终浓度为4×109cfu/g~7×109cfu/g的芽孢制剂。
在河北省栾城和邯郸两地区的草莓连作大棚对灰霉病进行芽孢杆菌剂的田间试验。将芽孢制剂和水1：300的重量比悬溶后喷施在草莓初果和植株叶片上，过七天进行调查灰霉病情况，使用剂量为每亩100克芽孢制剂；常规对照使用常规剂量的化学农药高巧作为防治药物，空白对照不施用防治药物但施加与实施例组相同重量的水；每个处理3次重复，调查草莓灰霉病的发病情况和产量。
调查方法：
在成熟期采用对角线五点取样法，每个点定株20株，共取样100株调查株发病率与病情指数，记录总调查株数、总发病株数。
草莓灰霉病病情指数分级标准：
0 级：无病症；
1 级：病斑面积占整个果面的5%以下；
3 级：病斑面积占整个果面的6%~10%以下；
5 级：病斑面积占整个果面的11%~25%以下；
7 级：病斑面积占整个果面的26%~50%以下；
9 级：病斑面积占整个果面的50%以上。
防效计算方法：
番茄株发病率=总发病株数/总调查株数×100
病情指数=∑（发病株数×该发病株级值）/（总调查株数×最高级值）×100
防治效果（%）=（对照区病情指数—处理区病情指数）/对照区病情指数 ×100
防治效果如表3所示，使用该芽孢菌剂可降低草莓灰霉病发病率、降低病情指数，7天防病效果即可达90%以上。
表3 不同菌剂施用对草莓灰霉病的防治效果
。
由上述结果可以看出，本发明筛选出的保藏号为CGMCC No.11750的菌株对草莓灰霉病有良好的拮抗作用，其芽孢菌剂能够有效防治草莓大棚灰霉病的发生。
实施例16-19 枯草芽孢杆菌J-5的甜椒种植田间应用
将保藏号为CGMCC No.11750枯草芽孢杆菌菌株接种到装有15L PB液体培养基的30L发酵罐中，于28℃、180r/min的恒温条件下培养36小时，离心获得枯草芽孢杆菌的芽孢，然后喷雾干燥，用可溶性淀粉混匀该菌的芽孢干粉，形成终浓度为4×109cfu/g~7×109cfu/g的芽孢制剂。
在河北省栾城和邯郸两地区甜椒连作大棚已感染灰霉病的甜椒幼苗（病情指数为1.25%）进行芽孢杆菌剂的田间试验。将芽孢制剂和水1：300的重量比悬溶后喷施在甜椒叶片上，亩用量100g，间隔期7天喷施第二次，分别在第二次喷施后7天、30天和45天进行调查灰霉病情况。
调查方法：
采用对角线五点取样法，每个点定株20株，共取样100株调查病情指数。
甜椒灰霉病病情指数分级标准：
0 级：无病症；
1 级：接种叶出现少量病斑；
2 级：病斑面积占叶面积的 1/3；
3 级：病斑面积占叶面积的 1/3-1/2；
4 级：病斑面积占叶面积的 1/2-2/3；
5 级：病斑面积占叶面积的 2/3 以上
防效计算方法：
病情指数=∑（发病株数×该发病株级值）/（总调查株数×最高级值）×100
防治效果（%）=（初始病情指数-调查时病情指数）/初始病情指数 ×100
表4 不同菌剂施用对甜椒灰霉病的防治效果
。
由表4结果显示，使用该芽孢菌剂可有效防治甜椒灰霉病，施用7天后，不同浓度J-5芽孢菌剂对甜椒灰霉病的防效均在80%以上，与化学农药的常规对照防治效果相当。与常规对照相比，J-5芽孢菌剂更为持久，45天后防效均在60%以上。明显高于对照的28.56%。
由上述结果可以看出，本发明筛选出的保藏号为CGMCC No.11750的菌株对甜椒灰霉病有良好的拮抗作用，其芽孢菌剂能够有效防治甜椒大棚灰霉病。
本发明枯草芽孢杆菌对番茄、黄瓜、茄、甜椒和草莓具有相当的防治效果，以上仅为本发明的较佳实施方式，而非对其保护范围的限制，本领域技术人员在不需要付出创造性劳动的前提下对本发明做出的任何改进，均应认为在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北省科学院生物研究所
<120> 一种枯草芽孢杆菌J-5及其生物菌剂和应用
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1459
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 1
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Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌J-5，该枯草芽孢杆菌于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 11750。
2.含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌J-5的生物菌剂，其特征在于：其中每克菌剂中枯草芽孢杆菌J-5的含量为4×109cfu/g~7×109cfu。
3.根据权利要求2所述的生物菌剂，其特征在于：所述菌剂为枯草芽孢杆菌J-5的芽孢菌剂或芽孢与菌体的混合菌剂。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌J-5在防治作物灰霉病中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述作物为黄瓜、番茄、茄、甜椒或草莓。
6.权利要求2或3所述的生物菌剂在防治作物灰霉病中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述作物为黄瓜、番茄、茄、甜椒或草莓。
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