CN110964644B

CN110964644B - 一种青霉菌及其发酵方法与应用

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Publication number: CN110964644B
Application number: CN201911001383.3A
Authority: CN
Inventors: 秦宝福; 尚瑞芬; 刘雨晨; 张静娴; 胡仲秋; 周乐; 吴文君; 曹让; 王娜娜; 郑立飞; 徐虹
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2019-10-21
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2039-10-21
Also published as: CN110964644A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体公开一种青霉菌及其发酵方法与应用。通过显微观察和16S rDNA序列分析，将分离得到的青霉菌鉴定为草酸青霉属真菌，其保藏编号为CGMCC No.18544。所述青霉菌菌株的发酵液对桃树、草莓、苹果、花椒等果蔬上的蚜虫具有较好的防治效果，可制备用于防治农作物蚜虫危害或其他防治蚜虫相关领域的药剂。

Description

一种青霉菌及其发酵方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及微生物及其应用，具体涉及一种隶属于草酸青霉属的菌株，以及其在防治作物蚜虫方面的应用。

背景技术

蚜虫是农林生产的重大害虫，其种类很多，分布极广，遍及全国各地。蚜虫不仅直接影响植物的正常发育，导致产量和品质的下降，更重要的是蚜虫还是多种病毒的传播介体。目前已知病毒的昆虫传播介体有600种，其中275种属于蚜虫，居世界传病毒昆虫之首，例如桃蚜是超过110种植物病毒的载体。近年来，鉴于蚜虫对农林产业严重的危害性，对蚜虫防治技术的研发已进入了一个崭新的阶段。微生物杀虫剂是目前生物农药的一个最重要组成部分，不论在基础研究还是产业化方面均走在了整个生物农药研究领域的前列。

现在市面上用于防治蚜虫的农药多为化学农药，其存在用药量大、毒性大、农药残留超标等问题，因此开发及应用高效、安全、害虫不易产生抗药性的微生物农药防治蚜虫，已成为各国科研工作者的研究热点。化学农药使用量“零增长”计划的提出，为微生物源农药发展带来了良好的发展机遇。随着化学农药“双减”政策的实行，众多高残留、高毒性的农药品种的生产厂已停产，而低毒性、环保不达标的厂家也同样面临停产危机，同时，也严重影响了特色农作物的出口创汇，所以更加绿色、低残的生物农药取代化学农药势在必行。推广使用微生物农药防治病虫害，对生态平衡的维持、农林资源的保护、生态环境的改善及社会经济的可持续发展，具有重要的促进意义。

相关研究显示，真菌、细菌、病毒等蚜虫病原性微生物都可广泛用于防治蚜虫，如白僵菌、绿僵菌、蜡蚧轮枝菌、菊欧文氏杆菌、链霉菌等病原微生物对蚜虫的防治都取得了显著效果。关于青霉菌防治蚜虫的研究现状，仅有报道提出可从青霉菌中提取杀蚜虫的活性物质，但未有实质性的研究成果公布于众。

发明内容

基于蚜虫病原性微生物的研究现状，本发明旨在探索开发新型、高效、广谱、低毒、环保的杀蚜虫微生物药剂。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本专利申请发明人从甜瓜叶片中分离出一种杀蚜虫活性的青霉菌，具体地，发明人于2018年3月在陕西省咸阳市杨凌示范区桶张村一甜瓜(品种为绿宝石)种植大棚采集获得。该菌(生物材料)的保藏信息为：

名称：QLhf-1；

保藏编号：CGMCC No.18544；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏时间：2019年09月06日。

从甜瓜叶片中分离所述青霉菌的方法简述为：用水冲洗采摘的甜瓜叶，放置于超净台，剪成3cm×3cm小片备用；先将叶片放入75％乙醇中浸泡30s，取出后用无菌水冲洗若干次，再用0.1％HgCl₂分别浸泡1mim、2min、3min、4min、5min，取出后再用无菌水冲洗；上述灭菌操作完成后，将叶片剪成1cm×1cm小块，接种至培养皿中，用小刀将叶片表面划破，使其流出汁液，每个培养皿接3～4个叶片；用保鲜膜将培养皿封口，置于28℃培养箱倒置培养5～7d；待叶片周围有菌落长出后，用接种环挑取菌体，在PDA培养基上划线，封口并做好标记后于28℃恒温培养箱培养；待有菌落长出后重复此步骤，反复划线，得到单菌落后，用PDA斜面培养基于4℃保藏备用。

本发明通过16S rDNA序列方法对菌株进行了分类鉴定。提取此菌的DNA，扩增16SrDNA的序列。16S rDNA基因PCR扩增中所使用的引物委托北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成，其序列为：ITSI：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’；ITS4：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’，扩增片段大小约500bp～700bp。扩增产物进行sanger双向测序，测序结果在NCBI上比对分析，以同源性在97％以上且同源性最高的物种判断为该菌株的种属。测序结果表明：所述青霉菌菌株16S rDNA基因序列与最近有效菌株Penicillium oxalicum strain TGQM01(MK036020.1)的相似率为99.66％。

经测定，该菌株的16S rDNA序列如下所示：

CGGCTTCCGTAGGGGTGACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACACAAACGAACTCTTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGTACTTGACTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCTCGCCCCCCGCTTCCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGAACACCATCAATCTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCGGGAGGAAATTCGG

所述青霉菌菌株在GenBank上的登录号为：MN416225。

同时，本发明还结合形态学特征对所述青霉菌菌株进行了分类鉴定。图1为所述青霉菌菌株在PDA培养基上培养2d后的菌落形态图。图2为所述青霉菌菌株在发酵培养7d后的菌体形态图。图3为所述青霉菌菌株放大100倍的菌丝体形态图。将所述青霉菌菌株接种在培养基上，呈现的形态学特征为：菌株生长迅速，菌落直径达2cm～3cm，质地致密，菌落平展，初期为白色短绒状菌丝，向四周平铺生长，菌落边缘规则，后期菌落中央颜色变绿，长出大量绿色孢子，并伴有小液滴渗出至菌落表面；菌株气生菌丝有隔，分生孢子梗由气生菌丝生出，有隔，光滑，经过多次分枝，产生多轮对称的小梗，形如扫帚；分生孢子单胞，呈椭圆形，一端略尖，一端稍钝，孢子表面光滑，大部分生长时呈绿色。

结合菌株形态观察、培养特性及16S rDNA的鉴定结果，本发明所述青霉菌归属于草酸青霉属，本专利申请发明人将其命名为QLhf-1。

另一方面，本发明给出了所述青霉菌的发酵方法，其包括：

所述青霉菌菌株活化，所述菌株活化选用的培养基为PDA培养基，活化的条件为：28℃、培养3～4天；

配制所述青霉菌孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度控制在10⁶个/mL数量级；

接种发酵，孢子悬浮液以2％体积比例的接种量接入发酵培养基中，发酵条件为：28℃、130r/min振荡培养60h。具体地，在接种发酵步骤中，所述发酵培养基的组成为：可溶性淀粉22.4g/L，酵母浸粉11.6g/L，MgSO₄1.1g/L，蒸馏水1L。

还有，本发明给出了所述青霉菌在防治蚜虫方面的应用。

基于所述应用，在本发明技术方案的启示下，本领域普通技术人员利用所述青霉菌制备用于防治蚜虫活性物质，并可基于现有技术，对该活性物质作进一步拓展应用，比如将该活性物质作为制备用于防治蚜虫的药剂的组分，或者通过适宜的途径或手段直接用该活性物质防治蚜虫。

根据本发明的试验结果或探索，所述活性物质来源于所述青霉菌的发酵液。制备所述的方法，可大致包括：(1)活化所述青霉菌菌株，所述菌株活化选用的培养基可以为PDA培养基，活化的条件可以为：28℃、培养3～4天；(2)配制所述青霉菌孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度可以控制在10⁶个/mL数量级；(3)接种发酵，在某一实施中，孢子悬浮液以2％体积比例的接种量接入发酵培养基中，发酵条件可以为：28℃、130r/min振荡培养60h。具体地，在接种发酵步骤中，所述发酵培养基的组成为：可溶性淀粉22.4g/L，酵母浸粉11.6g/L，MgSO₄1.1g/L，蒸馏水1L。在另一实施例中，本领域普通技术人员可以采用发酵方法制备所述青霉菌的发酵液。

根据本发明的试验结果，所述青霉菌的发酵液可用于防治桃树、草莓上的蚜虫。

鉴于所述青霉菌的发酵液具有杀蚜虫的活性或功用，本领域普通技术人员易于得出，所述青霉菌的发酵液可用于制备防治蚜虫的药剂。需要指出的是，所述药剂可以是单一地含有所述青霉菌的菌丝体、孢子、子实体、发酵液等与助剂、载体等的混合物或组合物；或是所述青霉菌的发酵产物与另外其它活性成分的组合物。

与现有技术相比，本发明至少具有下述的有益效果或优点：

本发明提供一种新的具有杀蚜虫活性的青霉菌，该菌株可作为研制高效、广谱、低毒、环保的蚜虫防治制剂的生物材料，根据本发明的试验结果，所述青霉菌的发酵液能够直接用于防治桃树、草莓、苹果、花椒等果蔬上的蚜虫，尤其是，所述青霉菌的发酵液对桃树蚜虫、草莓蚜虫具有较好的防治作用。基于本发明的技术方案，可以预测该菌在微生物农药、微生物制剂及其他防治蚜虫相关领域具有较好的开发应用前景。

附图说明

图1为所述青霉菌菌株在PDA培养基上培养2d后的菌落形态图。

图2为所述青霉菌菌株在发酵培养7d后的菌体形态图。

图3为所述青霉菌菌株放大100倍的菌丝体形态图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细阐述。

实施例1：桃树蚜虫防治的田间试验

本实施例给出在防治桃树蚜虫时的田间试验，具体试验操作描述如下：

田间试验施药时间为2018年5月7日，试验地位于陕西杨凌国家节水灌溉杨凌工程技术研究中心，供试植物为桃树，蚜虫害严重，基本无人管理。试验设QLhf-1(本发明所述青霉菌)发酵液原液为试验组，设喷清水为对照组，共6个处理，每个处理做3个平行试验，每个平行试验选取一片叶子进行试验。采用手动喷雾器喷药一次，使叶片正反面均匀铺满药液，同时使该叶片附近的叶片均喷满药液。于喷药前调查药前活虫数，喷药后1d、3d、5d、7d、9d、11d分别调查各叶片活蚜虫数，计算虫口减退率和防治效果。QLhf-1发酵液桃树田间杀虫药效试验结果见表1。

虫口减退率和防治效果的计算公式如下：

表1 QLhf-1发酵液桃树田间杀虫药效试验结果

注：菌种名指该菌种的发酵液

本实施例试验结果(表1)：药后1d防效为16.2％，药后3d防效为72.5％，药后5d防效为89.3％，药后7d防效为91.0％，药后9d防效为92.4％，药后11d防效为93.1％。由此可以看出，QLhf-1菌株的发酵液具有杀蚜虫的作用，并且发酵液原液试验组的防效逐步提升，药效持效期超过11天，具体地，药后1d发酵液基本无防治蚜虫的效果，药后3d防治率开始增高，药后11d的防效达到93.1％。

实施例2：草莓蚜虫防治的田间试验

本实施例给出在防治草莓蚜虫时的田间试验，具体试验操作描述如下：

田间试验施药时间为2019年3月4日，试验地位于陕西杨凌区创新园对面果蔬园三号大棚内进行，供试植物为花芽坐果时期草莓，蚜虫为害严重。试验共分为三组：QLhf-1发酵液原液、QLhf-1发酵液10倍稀释液和清水对照3组，每组设3个重复，每个重复选取一片叶子进行试验。试验时观察草莓植株虫害状况，选取虫害明显的植株茎叶，病害处活蚜虫数统计完毕并记录后，用喷雾器将药液均匀喷于嫩芽、嫩叶等蚜虫为害处，直至滴水为止。做好标记后，于施药后1d、3d、5d、7d、9d、11d分别检查并记录各株的活蚜虫数，计算虫口减退率和防治效果。QLhf-1发酵液草莓田间杀虫药效试验结果见表2。

虫口减退率和防治效果的计算公式如下：

表2 QLhf-1发酵液草莓田间杀虫药效试验结果

注：菌种名指该菌种的发酵液，菌种后“×10”意为该菌种的发酵液稀释10倍

QLhf-1发酵液原液试验结果：药后1d防效为25.71％，药后3d防效为65.65％，药后5d防效为88.34％，药后7d防效为95.09％，药后9d防效为98.49％，药后11d防效为99.30％。可以得出，发酵液原液喷施后表现出显著的杀虫活性，且在施药后第11天达到校正防效最大值。

QLhf-1发酵液10倍稀释液试验结果：药后1d防效为-8.84％，药后3d防效为55.97％，药后5d防效为90.42％，药后7d防效为93.55％，药后9d防效为96.05％，药后11d防效为97.37％。可以得出，发酵液10倍稀释液喷施后在施药初期防治效果不佳，但随着药液作用时间的推移，其防治效果逐渐显现，并在第11天达到最高。

上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种青霉菌及其发酵方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 605

<212> DNA

<213> 草酸青霉菌QLhf-1(Penicillium SP.)

<400> 3

cggcttccgt aggggtgacc tgcggaagga tcattaccga gtgagggccc tctgggtcca 60

acctcccacc cgtgtttatc gtaccttgtt gcttcggcgg gcccgcctca cggccgccgg 120

ggggcatccg cccccgggcc cgcgcccgcc gaagacacac aaacgaactc ttgtctgaag 180

attgcagtct gagtacttga ctaaatcagt taaaactttc aacaacggat ctcttggttc 240

cggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga 300

atcatcgagt ctttgaacgc acattgcgcc ccctggtatt ccggggggca tgcctgtccg 360

agcgtcattg ctgccctcaa gcacggcttg tgtgttgggc tctcgccccc cgcttccggg 420

gggcgggccc gaaaggcagc ggcggcaccg cgtccggtcc tcgagcgtat ggggcttcgt 480

cacccgctct gtaggcccgg ccggcgcccg ccggcgaaca ccatcaatct taaccaggtt 540

gacctcggat caggtaggga tacccgctga acttaagcat atcaataaag cgggaggaaa 600

ttcgg 605

Claims

1.一种青霉菌（Penicillium sp .），该菌于2019年09月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No .18544。

2.权利要求1所述青霉菌的发酵方法，其特征在于，包括：

接种发酵，孢子悬浮液以2％体积比例的接种量接入发酵培养基中，发酵条件为：28℃、130r/min振荡培养60h。

3.根据权利要求2所述青霉菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：可溶性淀粉22.4g/L，酵母浸粉11.6g/L，MgSO₄ 1.1g/L，蒸馏水1L。

4.权利要求1所述青霉菌在防治蚜虫方面的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述青霉菌在制备防治蚜虫活性物质方面的

应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述活性物质来源于所述青霉菌的发酵液。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述青霉菌的发酵液用于制备防治蚜虫的药剂。