CN116263446A - 一种基于正相-反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于正相‑反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法，小孔径硅胶在正相模式下具有增强不饱和脂肪酸的保留和分离选择性的特性，并且与反相模式形成良好的正交性。利用这一特性，采用小孔径硅胶，对含有ω‑3，ω‑6和ω‑7等不饱和脂肪酸的原料(如藻油，鱼油，植物油等)进行正相一维纯化，收集一维馏分处理后，采用反相色谱进行二维纯化，获得高纯目标不饱和脂肪酸。该方法能够发挥正相和反相色谱的正交性的优势，能够从纯度较低的藻油等原料中制备得到高纯度不饱和脂肪酸纯化产品。
Description
技术领域
本发明属于色谱分离领域，具体而言，本发明涉及一种基于正相-反相二维色谱的高纯不饱和脂肪酸纯化方法。
背景技术
不饱和脂肪酸根据第一个双键的位置可分为ω-3系、ω-6系、ω-7系等。其中ω-3不饱和脂肪酸有α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等，ω-6有亚油酸(LA)、花生四烯酸(AA)，ω-7有棕榈油酸(PLA)等。不饱和脂肪酸对人体有重要的生理功能：如α-亚麻酸(ALA)为人体必需脂肪酸，除参与构成人体细胞膜和组织的成分外，在抗癌、抗炎、改善脂质代谢和降血脂以及预防糖尿病等方面起着非常重要的作用；二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)具有调节血脂、抗炎的功能，DHA还具有促进脑细胞生长、发育，改善大脑机能，提高记忆力和学习能力以及防治老年痴呆等提高生命质量的功能。
不饱和脂肪酸广泛存在于植物、鱼类及藻类生物中，纯化方法主要有有机溶剂低温结晶法、尿素包合法、超临界流体萃取、银离子络合法、分子蒸馏法等。其中低温结晶法虽然操作简单但是分离效果差，溶剂消耗大；分子蒸馏对设备要求高且不能分离分子量与目标不饱和脂肪酸相近的杂质；银离子络合法分离效果很好但是存在离子脱落，影响产品质量；虽然纯化方法很多，各有弊端，且不能得到高纯的不饱和脂肪酸产品。尽管有专利(CN108250066A)提出了一种高效液相色谱法纯化ω-3不饱和脂肪酸，但是该方法原料的不饱和脂肪酸纯度需要大于60％，对原料纯度要求高。
发明内容
本发明在于提供一种基于正相-反相二维色谱的高纯不饱和脂肪酸纯化方法，本方法利用小孔径硅胶在正相中对不饱和脂肪酸保留强分离选择性好的特点，同时结合与反相色谱选择性互补的优势，能有效去除杂质，从不饱和脂肪酸纯度较低的原料中(如藻油等)获得高纯产品。
为实现上述目标，本发明采用的技术方案为：正相一维采用小孔径硅胶填料填充的色谱柱进行分离纯化，采用有机溶剂作为流动相，收集含有所需不饱和脂肪酸的馏分得到一维纯化产品；小孔径硅胶填料的孔径为1-5nm；将一维产品溶解后进行反相二维纯化，采用有机相和水为流动相，收集含有所需不饱和脂肪酸的馏分得到目标不饱和脂肪酸产品；所述的一维正相色谱柱采用小孔径硅胶填料粒径为1-200μm。
所述的一维正相流动相为正己烷、异丙醚、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇、异戊醇中的一种或几种组合。
所述的溶解样品的试剂为初始流动相。
所述的二维反相色谱柱填料为键合有疏水基团的硅胶填料，疏水基团可为C1～C30烷基或苯基中的一种或几种；填料粒径为1～200μm。所述的二维反相流动相为甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，水的一种或几种组合，其中有机溶剂体积比例大于70％。
所述的上样量为装填填料质量的0.2％-30％。
所述的洗脱速度0.1倍柱体积/min-0.8倍柱体积/min。
所述的转酯化过程为不饱和脂肪酸原料加入含有体积百分数1-10％硫酸的乙醇溶液进行转酯化处理，60-90℃下反应4小时，得不饱和脂肪酸乙酯。
本发明所述一种基于正相-反相二维色谱的高纯不饱和脂肪酸纯化方法，其特征在于具体步骤如下：
将不饱和脂肪酸原料加入含有体积百分数1-10％硫酸的乙醇溶液进行转酯化处理，60-90℃下反应4小时，得不饱和脂肪酸乙酯；
取适量上述转酯化后的原料，初始流动相溶解后上样到小孔径硅胶柱上经洗脱，按时间收集馏分，将每个馏分分析再合并处理合格馏分得到一维纯化产品。一维纯化产品初始流动相溶解后上样到二维反相纯化，按时间收集馏分，每个馏分分析再合并处理合格馏分得到高纯目标不饱和脂肪酸产品。小孔径硅胶柱内径为2-800mm，填料孔径为1-5nm，粒径为1-200μm；一维正相流动相为正己烷、异丙醚、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇、异戊醇中的一种或几种组合；二维反相色谱柱填料为键合有疏水基团的硅胶填料，疏水基团可为C1-C30烷基或苯基中的一种或几种；反相柱径为2-800mm，填料粒径为1～200μm；二维反相流动相为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、水的一种或几种组合，其中有机溶剂体积比例大于70％；上样量为装填填料质量的0.2％-30％；洗脱速度为0.1倍柱体积/min-0.8倍柱体积/min；收集目标分流出到结束的所有馏分。
该方法能够发挥正相和反相色谱的正交性的优势，能够从纯度较低的藻油等原料中制备得到高纯度不饱和脂肪酸纯化产品。
本发明的优点
(1)选用了小孔径硅胶，其在正相模式对不饱和脂肪酸保留强，与杂质的分离选择性好。
(2)充分发挥正相和反相选择性互补，能够从低纯度的复杂样品中制备得到高纯产品。
(3)该方法适用性广，可用于不同不饱和脂肪酸来源的纯化获得高纯产品。
附图说明
图1 PLA藻油粗品色谱图。
图2 PLA一维制备图谱。
图3 PLA一维纯化产品液相色谱图。
图4 PLA一维制备图谱。
图5 PLA二维纯化产品相色谱图。
图6 PLA藻油样品在小孔径硅胶和C18上的保留色谱图。
图7 PLA藻油在小孔径硅胶和常规硅胶上保留色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
分离纯化前，于10mg不饱和脂肪酸原料(分别为：PLA藻油、EPA鱼油)中加入50mL含有体积百分数5％硫酸的乙醇溶液进行转酯化处理，80℃下反应4小时，得不饱和脂肪酸乙酯；白土脱色后作为样品进行正相一维色谱柱分离纯化。
实施例1：PLA藻油粗品纯化
取经转酯化及脱色后的PLA藻油样品(纯度9.4％，如图1)1532.2mg(体积1.6mL)，加入1.4mL体积浓度2.5％异丙醚的正己烷溶液溶解，配制成每1mL中含待测样品510.7mg的样品溶液，一维制备色谱条件如下：
色谱柱：小孔径硅胶色谱柱(孔径：2nm)
规格：10×150mm(直径×长度，下同)，2μm(填料粒径，下同)
流动相：A：体积浓度2.5％异丙醚-正己烷；
洗脱：A：100％
流速：2mL/min；
柱温：30℃；
检测：UV 210nm；
进样量：340μL
上样量(样品质量与填料质量比)：2％
按上述条件进行高效液相色谱一维制备，图2一维制备色谱图。收集42-90min馏分段馏分，每个馏分接取时间为2min，氮气吹干各个馏分并用流动相复溶进行色谱分析，馏分分析方法：采用C18色谱柱(规格4.6*250mm，5um)，流动相体积浓度90％甲醇水，流速：1.0ml/min，检测波长210nm；合并50-68min含有PLA的馏分纯干处理得一维产品，进行纯度分析，如图3所示。取一维所得样品80mg(约100uL)，加215uL体积浓度90％甲醇水溶液溶解完全后过滤，得255.5mg/mL的样品溶液。二维制备色谱条件如下：
色谱柱：C18(硅胶表面键合烷基链长为C18)
规格：4.6×250mm(直径×长度，下同)，10μm(填料粒径，下同)
流动相：A:体积浓度90％甲醇水
洗脱：A：100％
流速：0.3mL/min；
检测波长：UV 210nm；
进样体积：200μL；
上样量(样品质量与填料质量比)：1.01％
按上述条件进行高效液相色谱二维制备，图4二维制备色谱图。收集80-120min馏分段馏分，每个馏分接取时间为2min，色谱法进行馏分分析，馏分分析方法：采用C18色谱柱(规格4.6*250mm，5um)，流动相体积浓度90％甲醇水，流速：1.0ml/min，检测波长210nm；合并86-114min含有PLA的馏分干(除流动相)处理得二维产品，进行纯度分析，如图5所示。得到液相纯度大于98％，两维纯化整体收率80％。
实施例2：PLA藻油粗品纯化
其他条件与实施例1相同，不同之处在于：
色谱柱：C8(硅胶表面键合烷基链长为C8)
规格：4.6×250mm，10μm
流动相：A：80％甲醇水
洗脱：A：100％
流速：0.3mL/min；
检测波长：UV 210nm；
进样体积：200μL；
上样量：0.8％
按上述条件进行高效液相色谱二维制备，收集69-111min馏分段馏分，每个馏分接取时间为2min，馏分进行色谱分析，馏分分析方法：采用C18色谱柱(规格4.6*250mm，5um)，流动相体积浓度90％甲醇水，流速：1.0ml/min，检测波长210nm；合并86-114min馏分吹干(除流动相)处理得二维产品，合并76-91min含有PLA的馏分纯干处理得二维产品，进行纯度分析，得到液相纯度大于98％，二维纯化整体收率80％。
实施例3：EPA鱼油样品纯化
其他条件与实施例1相同，不同之处在于：样品为EPA鱼油，取530.1mg(体积0.4)，加入0.6mL体积浓度2.5％异丙醚正己烷溶液溶解，配制成每1mL中含待测样品530.1mg的样品溶液，上样量2％。纯化后得到纯度大于98％的EPA高纯产品，二维纯化整体收率87％。
实施例4：PLA藻油在小孔径硅胶柱与反相C18柱上的保留
取PLA藻油样品50mg，加5mL体积浓度2.5％异丙醚正己烷溶液溶解，配制成每1mL中含待测样品10mg的样品溶液，色谱条件：
色谱柱：小孔径硅胶色谱柱(孔径：2nm)
规格：4.6×100mm，2μm
流动相：A：2.5％异丙醚-正己烷；
洗脱：A：100％
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测：UV 210nm；
进样量：10μL
按上述条件小孔径硅胶对PLA藻油样品测试，结果见图6a，主要不饱和脂肪酸出峰顺序为EPA，PLA和ARA。
另取PLA藻油样品50mg，加5mL 90％甲醇水溶液溶解，配制成每1mL中含待测样品10mg的样品溶液，一维制备色谱条件如下：
色谱柱：C18(硅胶表面键合烷基链长为C18)
规格：4.6×250mm，5μm
流动相：A：90％甲醇水；
洗脱：A：100％
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测：UV 210nm；
进样量：10μL
按上述条件小孔径硅胶对PLA藻油样品测试，结果见图6b，主要不饱和脂肪酸出峰顺序为PLA，ARA和EPA。比较图6a和b，主要不饱和脂肪酸的出峰顺序和选择性完全不一样，呈现出非常好的正交性。
实施例5：小孔径硅胶和常规硅胶对不饱和脂肪酸的保留
取PLA藻油样品50mg，加5mL体积浓度2.5％异丙醚正己烷溶液溶解，配制成每1mL中含待测样品10mg的样品溶液，色谱条件：
色谱柱分别为：小孔径硅胶柱(孔径2nm)
常规硅胶柱(孔径10nm)
规格：4.6×100mm，2μm
流动相：A：2.5％异丙醚-正己烷；
洗脱：A：100％
流速：1mL/min；
柱温：30℃；
检测：UV 210nm；
进样量：10μL
按上述条件小孔径硅胶对PLA藻油样品测试，结果见图7，主要不饱和脂肪酸出峰顺序一致，相同条件下小孔径硅胶对各不饱和脂肪酸的保留和选择性均大于常规硅胶，孔径10nm的硅胶相同方法制备PLA产品液相纯度仅79％，而小孔径硅胶纯化的PLA产品纯度大于98％,小孔径硅胶具有明显的制备优势。
Claims (10)
1.一种基于正相-反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法，其特征在于：
1)正相一维采用小孔径硅胶填料填充的色谱柱进行分离纯化，采用有机溶剂作为流动相，收集含有所需不饱和脂肪酸的馏分得到一维纯化产品；小孔径硅胶填料的孔径为1-5nm；
2)将一维产品溶解后进行反相二维纯化，采用有机相和水为流动相，收集含有所需不饱和脂肪酸的馏分得到目标不饱和脂肪酸产品；
二维反相色谱柱填料为键合有疏水基团的硅胶填料中的一种或二种以上，疏水基团可为C1-C30烷基或苯基中的一种或二种以上。
2.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：一维正相色谱柱采用小孔径硅胶填料，粒径为1-200μm。
3.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：有机溶剂流动相为正己烷、异丙醚、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇、异戊醇中的一种或二种以上组合。
4.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：对含有ω-3、ω-6和ω-7等中的一种或二种以上不饱和脂肪酸的原料进行正相一维纯化，优选分离纯化的样品原料为藻油、鱼油、植物油中的一种或二种以上；
所需不饱和脂肪酸为ω-3、ω-6或ω-7等中的一种或二种以上不饱和脂肪酸，其中ω-3为α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)中的一种或二种以上，ω-6为亚油酸(LA)、花生四烯酸(AA)中的一种或二种，ω-7为棕榈油酸(PLA)。
5.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：
采用进行正相一维纯化的初始流动相溶解原料后进行正相一维纯化上样。
采用进行反相二维纯化的初始流动相溶解一维产品后进行反相二维纯化上样。
6.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于，二维反相色谱柱填料为键合有疏水基团的硅胶填料，疏水基团可为C1-C30烷基或苯基中的一种或几种；填料粒径为1-200μm。
7.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于，二维反相流动相为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、水的一种或二种以上组合，其中有机相体积比例大于70％。
8.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：正相和/或反相纯化过程的上样量为色谱柱装填填料质量的0.2％-30％。
9.按照权利要求1所述纯化方法，其特征在于：正相和/或反相纯化过程的洗脱速度0.1倍柱体积/min-0.8倍柱体积/min。
10.按照权利要求1或4所述纯化方法，其特征在于，分离纯化前，于不饱和脂肪酸原料中加入含有体积百分数1-10％硫酸的乙醇溶液进行转酯化处理，60-90℃下反应2-8小时，得不饱和脂肪酸乙酯；然后再进行正相一维色谱柱分离纯化。
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| CN202111532486.XA CN116263446A (zh) | 2021-12-15 | 2021-12-15 | 一种基于正相-反相二维色谱的不饱和脂肪酸纯化方法 |
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