CN116209476A - 抗叶酸剂接头-药物和抗体-药物缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的抗叶酸剂接头‑药物、包含这样的抗叶酸剂接头‑药物的缀合物，及其在治疗疾病例如癌症、自身免疫疾病和感染性疾病中的用途，所述抗叶酸剂接头‑药物、包含这样的抗叶酸剂接头‑药物的缀合物任选地与另外的治疗剂组合。
Description
技术领域
本发明涉及新的抗叶酸剂接头-药物、包含这样的抗叶酸剂接头-药物的缀合物，及其在治疗疾病例如癌症、自身免疫疾病和感染性疾病中的用途，所述抗叶酸剂接头-药物、包含这样的抗叶酸剂接头-药物的缀合物任选地与另外的治疗剂组合。
背景技术
抗叶酸剂(antifolate)是一类拮抗叶酸(维生素B9)的作用的抗代谢化合物。
叶酸的分子结构
叶酸充当参与丝氨酸、甲硫氨酸、胸苷和嘌呤生物合成的多种甲基转移酶的辅因子。因此，抗叶酸剂抑制细胞分裂、DNA和RNA合成和修复以及蛋白质合成。大多数抗叶酸剂通过抑制二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)发挥作用。
抗叶酸剂氯胍(proguanil)、乙胺嘧啶和甲氧苄啶在微生物例如细菌、原虫和真菌中选择性地抑制叶酸的作用。另一些抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、普拉曲沙(pralatrexate)和talotrexin用于治疗一些类型的癌症和/或炎性病症，例如自身免疫疾病、类风湿性关节炎。
甲氨蝶呤，以前称为氨甲喋呤(amethopterin)，是最古老且最著名的叶酸类似物。它发现于20世纪50年代并且是化学治疗剂和免疫系统抑制剂。它最初是为化学治疗而开发的，单独或与另一些药剂组合使用，并且仍用于治疗例如膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、妊娠滋养细胞疾病和骨肉瘤。甲氨蝶呤也被用作一些自身免疫疾病的疾病修饰治疗(disease-modifying treatment)，所述自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、幼年性皮肌炎、银屑病、银屑病关节炎、狼疮、结节病、克罗恩病(Crohn's disease)、湿疹和血管炎。另一些用途包括治疗异位妊娠和诱导药物流产。
培美曲塞用于治疗多种癌症适应证，包括间皮瘤、肺癌和头颈癌。它在化学上与叶酸相似，并通过抑制DHFR、胸苷酸合酶(thymidylate synthase，TS)和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶(glycinamide ribonucleotide formyltransferase，GARFT)来发挥作用，这三种酶用于嘌呤和嘧啶合成。通过抑制前体嘌呤和嘧啶核苷酸的形成，培美曲塞阻止了正常细胞和肿瘤细胞二者生长和存活所需的DNA和RNA的形成。
普拉曲沙被批准用于治疗外周T细胞淋巴瘤。它被设计为对还原型叶酸载体1(reduced folate carrier 1，RFC-1)以及叶酸多聚谷氨酸合成酶具有提高的亲和力，分别导致细胞内摄取和细胞毒性代谢物的增加。
Talotrexin是氨蝶呤(aminopterin)的抗代谢类似物，氨蝶呤是叶酸的4-氨基衍生物，并且也是蝶呤的合成衍生物。Talotrexin表现出抗肿瘤活性，并结合DHFR和抑制DHFR的功能。水溶性talotrexin通过还原型叶酸载体(RFC)主动转运到细胞中，并因此不太可能与P-糖蛋白介导的多药抗性相关。
(A)甲氨蝶呤、(B)培美曲塞、(C)普拉曲沙和(D)Talotrexin的分子结构
抗叶酸剂在DNA和RNA合成期间发挥特异性作用，并因此在细胞周期的S期期间主要具有细胞毒性。因此，它们对快速分裂的细胞(更频繁地复制其DNA)(例如恶性细胞和髓样细胞)有更大的毒性作用。然而，它们不仅抑制肿瘤细胞的生长和增殖，而且抑制快速分裂的非癌性细胞例如骨髓细胞以及胃肠和口腔黏膜细胞的生长和增殖，这导致例如骨髓、肠、口腔黏膜、皮肤和毛中的不良事件。
由细胞毒性小分子药物(例如抗叶酸剂)引起的全身性毒副作用可以通过将这样的药物经由化学接头与靶向分子(例如抗体、抗原结合抗体片段或融合蛋白(例如与抗体Fc融合的受体配体))缀合来减少。通过将这两种组分即细胞毒性小分子药物和靶向分子组合成单个的新分子实体，靶向分子可以特异性地将细胞毒性小分子药物递送至靶细胞或组织(在那里，它可以发挥其细胞毒性活性)，从而减少非靶组织向小分子的暴露。
为了提高甲氨蝶呤的靶向性和降低甲氨蝶呤的毒性，在20世纪80年代后期制备了数种甲氨蝶呤的抗体-药物缀合物(antibody-drug conjugate，ADC)。这些赖氨酸缀合ADC的药物与抗体比率(drug-to-antibody ratio，DAR)为9.4至45。虽然ADC的概念是成功的，但是在体外(Shen et al,Cancer Res.1986,46,3912-3916；Umemoto et al,Int.J.Cancer1989,43,677-684)和体内(Deguchi et al,Cancer Res.1986,46,3751-3755；Rowland etal,Br.J.Cancer 1990,61,702-708)获得的这些ADC的效力结果为中等到较差。即使在高DAR下，甲氨蝶呤作为ADC毒素也没有显示出足够有效。
尽管已经制备并测试了培美曲塞的短肿瘤靶向肽缀合物(Miklán et al,J.Pept.Sci.2011,17,805-811)，但没有进一步探讨这个概念。从未报道过更有效的抗叶酸剂(例如培美曲塞、普拉曲沙和talotrexin)的ADC。
因此，需要新的和改善的靶特异性缀合物，其包含抗叶酸剂和抗体、抗原结合片段或其他靶向分子，适于单独或与另外的治疗剂组合用于治疗癌症、自身免疫疾病和感染性疾病。
发明内容
本发明涉及新的抗叶酸剂接头-药物、包含这样的抗叶酸剂接头-药物的缀合物，及其在治疗疾病例如癌症、自身免疫疾病和感染性疾病中的用途，所述抗叶酸剂接头-药物、包含这样的抗叶酸剂接头-药物的缀合物任选地与另外的治疗剂组合。
在第一方面，本发明涉及式(I)的接头-药物化合物
其中，
R1是O、NH2或OH；
R2和R2’独立地是N、CH或CMe；
R3是NH、N(C1-5烷基)、CH2、CH(C1-5烷基)、CH(C2-4烯基)、CH(C2-4炔基)或CH(C1-4烷氧基)；
R4是H、卤素、-COOH、OH、NH2、-CONH2、-CONHR、-CONHR2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、苄氧基、四唑、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-CN或叠氮基，其中R选自H和C1-5烷基，或者R4是选自以下的羧酸生物电子等排体：
其中Ra’选自H、CH2F、CHF2、CF3和C1-6烷基，每个Ra独立地选自H、F、CH2F、CHF2、CF3和C1-6烷基，并且两个Ra取代基可以任选地连接形成环；
R5是H、卤素、CF3、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基或C1-4烷硫基，优选H、F、CH3、CF3、CH2CH3、CH＝CH2、CH2CF3或CF2CF3，更优选H或F；
R6是H、C1-4烷基、C2-4烯基、C3-6环烷基，优选H；
n是1、2、3或4，优选3；
Q是不存在的，或者为-N(R7)-(C＝O)-、-(C＝O)-N(R7)-、-CH2N(R7)-、-N(R7)CH2-、-N(R7)SO2-、或-SO2N(R7)-，其中R7是H、C1-4烷基、C1-4烯基或C1-4炔基，优选H，或者Q是选自以下的酰胺键生物电子等排体：
其中Rb选自H和C1-5烷基，T1、T1’和T1”独立地选自CH和N，并且W1、W1’和W1”独立地选自C、CH、S、N、NH、N(C1-5烷基)和O；V是芳基、杂芳基、杂环或环烷烃，其任选地被一个或更多个R4基团取代，并且独立地选自：
其中U1、U1’、U1”、U2、U2’、U2”和U2”’独立地选自C、CH、S、N、NH、N(C1-5烷基)和O，或者V选自
其中Z是O、S、NH或NRc，并且Rc选自H和C1-5烷基；
s是0或1，优选1；
X是选自O、NH、S、C1-5亚烷基、C1-5亚烯基和C1-5亚炔基的连接基团；
k是1、2、3或4，优选1；
L是接头部分；并且
在第二方面，本发明涉及式(III)的抗体-药物缀合物
Ab-(L-D)y (III)，
其中Ab是抗体或其抗原结合片段，
L-D是根据本发明的接头-药物化合物；
y表示1至16的平均药物与抗体比率；
并且其中根据本发明的接头-药物化合物与抗体或其抗原结合片段缀合，优选通过抗体或抗原结合片段的半胱氨酸残基。
本发明的其他方面包括包含本发明的接头-药物化合物或抗体-药物缀合物的药物组合物、它们的合成方法以及它们作为药物的用途，特别是用于治疗癌症、自身免疫疾病或感染性疾病的用途。
附图说明
图1.在HER2阳性SK-BR-3细胞中，曲妥珠单抗(trastuzumab)-XT17抗叶酸剂ADC相对于非结合对照ADC的体外效力。
图2.在HER2阴性SW-620细胞中，曲妥珠单抗-XT17抗叶酸剂ADC相对于非结合对照ADC的体外效力。
图3A.在小鼠HER2阳性BT-474细胞系异种移植物中，抗叶酸剂ADC1(5mg/kg IV)相对于载剂对照的体内效力。
图3B.在小鼠HER2阳性BT-474细胞系异种移植物中，抗叶酸剂ADC1(5mg/kg IV或1.7mg/kg Q1Wx3)相对于载剂对照的体内效力。
图4A.在小鼠HER2阳性BT-474细胞系异种移植物中，抗叶酸剂ADC1(5mg/kg IV)相对于载剂对照对体重的作用。
图4B.在小鼠HER2阳性BT-474细胞系异种移植物中，抗叶酸剂ADC1(5mg/kg IV或1.7mg/kg Q1Wx3)相对于载剂对照对体重的作用。
图5.在小鼠的HER2 2+MAXF574患者来源异种移植物中抗叶酸剂ADC1(3或10mg/kgIV)相对于载剂对照的体内效力。
具体实施方式
本发明人发现，式(I)的接头-药物化合物特别适合与抗体、抗原结合片段或另外的靶向分子例如融合蛋白(例如与抗体Fc融合的受体配体)缀合。从这些接头-药物缀合物释放的小分子药物化合物作为抗叶酸剂化合物具有良好的效力。它们表现出优异的DHFR抑制活性，并在多种癌细胞系中表现出强的抗增殖作用。
接头-药物化合物
在第一方面，本发明提供了式(I)的接头-药物化合物
其中，
R1是O、NH2或OH；
R2和R2’独立地是N、CH或CMe；
R3是NH、N(C1-5烷基)、CH2、CH(C1-5烷基)、CH(C2-4烯基)、CH(C2-4炔基)或CH(C1-4烷氧基)；
R4是H、卤素、-COOH、OH、NH2、-CONH2、-CONHR、-CONHR2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、苄氧基、四唑、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-CN或叠氮基，其中R选自H和C1-5烷基，或R4是羧酸生物电子等排体；
R5是H、卤素、CF3、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基或C1-4烷硫基，优选H、F、CH3、CF3、CH2CH3、CH＝CH2、CH2CF3或CF2CF3，更优选H或F；
R6是氢、C1-4烷基、C2-4烯基、C3-6环烷基，优选H；
n是1、2、3或4，优选3；
Q是不存在的，或者为-N(R7)-(C＝O)-、-(C＝O)-N(R7)-、-CH2N(R7)-、-N(R7)CH2-、-N(R7)SO2-、或-SO2N(R7)-，其中R7是H、C1-4烷基、C1-4烯基或C1-4炔基，优选H，或者Q是酰胺键生物电子等排体；
V是芳基、杂芳基、杂环或环烷烃，其任选地被一个或更多个R4基团取代，并且独立地选自：
其中U1、U1’、U1”、U2、U2’、U2”和U2”’独立地选自C、CH、S、N、NH、N(C1-5烷基)和O，或者V选自
其中Z是O、S、NH或NRc，并且Rc选自H和C1-5烷基；
s是0或1，优选1；
X是选自O、NH、S、C1-5亚烷基、C1-5亚烯基和C1-5亚炔基的连接基团；
k是1、2、3或4，优选1；
L是接头部分；并且
这样的接头-药物化合物在下文中称为根据本发明的接头-药物或接头-药物化合物。
在本发明的上下文中，卤素是氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。用于根据本发明的接头-药物化合物的优选卤素是氟、氯和溴，更优选的卤素是氟或氯，最优选的卤素是氯。
在本发明的上下文中，部分(moiety)例如烷基、烯基、烷氧基、炔基、环基、杂环基、芳基或杂芳基中的碳原子数表示为例如C1-6，在这种非限制性情况下，表示设想了1至6个碳原子，例如1、2、3、4、5或6个碳原子。类似地，C2-4烯基具有2、3或4个碳原子。碳原子数可以表示为不计算另外的取代的碳原子的总数，碳原子总数，以及在最长的连续内部碳原子序列中可存在的碳原子数。优选地，碳原子数表示为不计算另外的取代的碳原子总数。
在本发明的上下文中，未经取代的烷基基团具有通式CnH2n+1，并且可以是直链或支链的。未经取代的烷基基团也可包含环状部分，并因此具有伴随的通式CnH2n-1。任选地，烷基基团被一个或更多个在本文件中另外说明的取代基取代。合适的烷基基团的实例包括但不限于-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH2CH3、-C(CH3)3等。优选的烷基基团是直链或支链的，最优选直链的。环基基团是环烷基基团；优选的环基基团是环丙基、环丁基和环戊基。杂环基基团是其中至少一个CH2部分被杂原子取代的环基基团。优选的杂原子是S、O和N。优选的杂环基基团是哌啶基、环氧乙烷基和oxolanyl。优选的C1-4烷基是-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH2CH3、-C(CH3)3、环丙基和环丁基，更优选-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH2CH3和-C(CH3)3。
在本发明的上下文中，未经取代的烯基基团具有通式CnH2n-1，并且可以是直链或支链的。合适的烯基基团的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基和戊烯基等。未经取代的烯基基团也可包含环状部分，并因此具有伴随的通式CnH2n-3。优选的烯基基团是直链或支链的，最优选直链的。
在本发明的上下文中，未经取代的炔基基团具有通式CnH2n-3，并且可以是直链或支链的。未经取代的炔基基团也可包含环状部分，并因此具有伴随的通式CnH2n-5。任选地，炔基基团被一个或更多个在本文件中另外说明的取代基取代。合适的炔基基团的实例包括但不限于乙炔基、炔丙基、正丁-2-炔基和正丁-3-炔基。优选的烷基基团是直链或支链的，最优选直链的。
在本发明的上下文中，芳基基团是芳族的并且包含至少六个碳原子并且可以包含单环、双环和多环结构。任选地，芳基基团可以被一个或更多个在本文件中另外说明的取代基取代。芳基基团的实例包括例如苯基、萘基、蒽基等基团。杂芳基基团是芳族的并且包含1至4个选自S、O和N的杂原子。由于杂原子在，杂芳基的环尺寸可以小于6。
在本发明的上下文中，烷氧基部分是前面带有桥接氧原子的烷基部分。合适的烷氧基部分的实例是-OCH3、-OCH2CH3，-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCH(CH3)CH2CH3、-OCH2CH2CH2CH3和-OC(CH3)3。
在本发明中，烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、环基和杂环基的各实例任选地被取代，优选被一个或更多个选自卤素、C1-4烷基例如CH3、OH、C1-4烷氧基例如OCH3和＝O的部分取代，其中烷基、烯基、炔基和烷氧基的各实例可以被杂原子例如O或S中断，并且其中烷基、烷氧基、环基和杂环基的各实例是任选地不饱和的。被杂原子中断意味着被一个或更多个杂原子中断。在这种上下文中，优选不超过20个，更优选3、4或5个杂原子中断。优选所有中断杂原子是相同的元素。作为非限制性实例，当被杂原子中断时，CH2-CH2-CH2-CH2-CH3可以是CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH3。
本发明中提供的分子可以任选地被取代。合适的任选的取代是用卤素替代-H。优选的卤素是F、Cl、Br和I，最优选F。另外的合适的任选的取代是一个或更多个-H被-NH2、-OH、＝O、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、烯烃、卤代烯烃、炔烃、卤代炔烃和环烷基替代。烷基基团具有通式CnH2n+1，并且或者可以是直链或支链的。未经取代的烷基基团也可以包含环状部分，并因此具有伴随的通式CnH2n-1。任选地，烷基基团被一个或更多个在本文件中另外说明的取代基取代。烷基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、2-丙基、叔丁基、1-己基、1-十二烷基等。
在本发明的上下文中，生物电子等排体是具有类似物理或化学性质的化学取代基或基团，其产生与另外的化学化合物大致类似的生物性质。将一种生物电子等排体交换为另一种生物电子等排体的目的是在不显著改变化学结构的情况下增强化合物的期望的生物或物理性质。例如在Meanwell,J.Med.Chem.2011,54,2529-2591和Patani and LaVoie,Chem.Rev.1996,96,3147-3176中描述了生物电子等排体的一般概念。
例如，在Ballatore et al,ChemMedChem.2013,8,385-395和Lassalas et al,J.Med.Chem.2016,59,3183-3203中描述了羧酸生物电子等排体。
羧酸生物电子等排体的优选实例是：
其中Ra’选自H、CH2F、CHF2、CF3和C1-6烷基，每个Ra独立地选自H、F、CH2F、CHF2、CF3和C1-6烷基，并且两个Ra取代基可以任选地连接形成环。
例如，在Kumari et al,J.Med.Chem.2020,63,12290-12358和Recnik et al,Molecules 2020,25,3576中描述了酰胺键生物电子等排体。
酰胺键生物电子等排体的优选实例是
其中Rb选自H和C1-5烷基，T1、T1’和T1”独立地选自CH和N，并且W1、W1’和W1”独立地选自C、CH、S、N、NH、N(C1-5烷基)和O。
Tse et al(J.Med.Chem.2020,63,11585–11601)、Mykhailiuk(Org.Biomol.Chem.,2019,17,2839-2849)、Qiao et al(Bioorg.Med.Chem.Lett.2008,18,4118-4123)和Stepan et al(J.Med.Chem.2012,55,3414-3424)描述了多种非经典和/或饱和苯基生物电子等排体。
这样的苯基生物电子等排体的实例是
如上所述，V是芳基、杂芳基、杂环或环烷烃，其任选地被一个或更多个R4基团取代，并且独立地选自
在一个实施方案中，V是
优选地，V是
更优选地，V是
在一个优选的实施方案中，本发明提供了式(Ia)的接头-药物化合物
更优选地，本发明提供了式(Ia)的接头-药物化合物，
其中
R1是O、NH2或OH，优选地，R1是NH2；
R2和R2’独立地是N、CH或CMe，优选地，R2和R2’是N；
R3是NH、N(C1-5烷基)、CH2或CH(C1-5烷基)，优选地，R3是NH、N(CH3)或CH2；
R4是H、卤素、-COOH、OH、NH2、-CONH2、-CONHR、-
CONHR2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、四唑、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、
-OPO3H2、-CN或叠氮基，其中R选自H和C1-5烷基，优选地，R4是-
COOH或四唑；
Q是不存在的，或者为-N(R7)-(C＝O)-、-(C＝O)-N(R7)-、-CH2N(R7)-、-
N(R7)CH2-、-N(R7)SO2-、或-SO2N(R7)-，其中R7是H、C1-4烷基、C1-4烯基或C1-4炔基，优选H，或者Q是酰胺键生物电子等排体，优选地Q是-N(R7)-(C＝O)-或-(C＝O)-N(R7)-，更优选-N(R7)-(C＝O)-，
X是选自O、NH、S、C1-5亚烷基、C1-5亚烯基和C1-5亚炔基的连接基团，优选地X是NH；
L是接头部分；并且
在一个具体实施方案中，R1是NH2，R2和R2’是N，R4是-COOH，并且Q是-NH(C＝O)-。
在另一个具体实施方案中，R1是NH2，R2和R2’是N，R4是-COOH，并且Q是三唑。
在另一个具体实施方案中，R1是NH2，R2和R2’是N，R4是四唑，并且Q是-NH-(C＝O)-。
在另一个具体实施方案中，R1是NH2，R2和R2’是N，R4是-SO3H，并且Q是-NH-(C＝O)-。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了式(Ib)的接头-药物化合物
更优选地，本发明提供了式(Ib)的接头-药物化合物，其中
R1是O、NH2或OH，优选地，R1是NH2；
R2和R2’独立地是N、CH或CMe，优选地，R2和R2’是N；
R3是NH、N(C1-5烷基)、CH2或CH(C1-5烷基)，优选地，R3是NH、N(CH3)或CH2；
R4是H、卤素、-COOH、OH、NH2、-CONH2、-CONHR、-
CONHR2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、四唑、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、
-OPO3H2、-CN或叠氮基，其中R选自H和C1-5烷基，优选地，R4是-
COOH或四唑；
n是1、2、3或4，优选3；
X是选自O、NH、S、C1-5亚烷基、C1-5亚烯基和C1-5亚炔基的连接基团，优选地X是NH；
L是接头部分；并且
在一个具体实施方案中，R1是NH2，R2和R2’是N，R4是-COOH，并且N是3。
在另一个具体实施方案中，R1是NH2，R2和R2’是N，R4是四唑，并且n是3。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了式(Ic)的接头-药物化合物
更优选地，本发明提供了式(Ic)的接头-药物化合物，
其中
R2和R2’独立地是N、CH或CMe，优选地，R2和R2’是N；
R3是NH、N(C1-5烷基)、CH2或CH(C1-5烷基)，优选地，R3是NH、N(CH3)或CH2；
R4是H、卤素、-COOH、OH、NH2、-CONH2、-CONHR、-
CONHR2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、四唑、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、
-OPO3H2、-CN或叠氮基，其中R选自H和C1-5烷基，优选地，R4是-
COOH或四唑；
X是选自O、NH、S、C1-5亚烷基、C1-5亚烯基和C1-5亚炔基的连接基团，优选地X是NH；并且
L是接头部分。
在一个具体实施方案中，R2和R2’是N，R4是-COOH。
在另一个具体实施方案中，R2和R2’是N，R4是四唑。
在另一个具体实施方案中，R2和R2’是C，R4是H。
在另一个具体实施方案中，R2和R2’是N，R4是H。
在另一个具体实施方案中，R2和R2’是N，R4是OH。
在另一个具体实施方案中，R2和R2’是N，R4是Cl。
在另一个具体实施方案中，R2和R2’是N，R4是-SO3H。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了式(Id)的接头-药物化合物
更优选地，本发明提供了式(Id)的接头-药物化合物，其中
R1是O、NH2或OH，优选地，R1是NH2；
R2和R2’独立地是N、CH或CMe，优选地，R2和R2’是N；
R3是NH、N(C1-5烷基)、CH2或CH(C1-5烷基)，优选地，R3是NH、N(CH3)或CH2；
R4是H、卤素、-COOH、OH、NH2、-CONH2、-CONHR、-
CONHR2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、四唑、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、
-OPO3H2、-CN或叠氮基，其中R选自H和C1-5烷基，优选地，R4是-
COOH或四唑；
n是1、2、3或4，优选4；
X是选自O、NH、S、C1-5亚烷基、C1-5亚烯基和C1-5亚炔基的连接基团，优选地X是NH；
L是接头部分；并且
在一个具体实施方案中，R1是NH2，R2和R2’是N，R4是-COOH，n是4。
在另一个具体实施方案中，R1是NH2，R2和R2’是N，R4是H，n是3。
根据本发明的优选的接头-药物化合物是
根据本发明的更优选的接头-药物化合物是
根据本发明的接头-药物化合物包含接头部分。接头优选是合成接头。接头的结构使得接头可以容易地化学连接到小分子药物上，并且使所得接头-药物化合物可以容易地缀合到另外的物质例如多肽上，以形成抑制剂缀合物。接头的选择可以影响这样的最终缀合物在循环中的稳定性，并且如果被释放的话，其可影响小分子药物化合物的释放方式。合适的接头例如描述于Ducry et al,Bioconjugate Chem.2010,21,5-13，King and Wagner,Bioconjugate Chem.2014,25,825-839，Gordon et al,Bioconjugate Chem.2015,26,2198-2215，Tsuchikama and An(DOI:10.1007/s13238-016-0323-0)，Polakis(DOI:10.1124/pr.114.009373)，Bargh et al.(DOI:10.1039/c8cs00676h)、WO 02/083180、WO2004/043493、WO 2010/062171、WO 2011/133039、WO 2015/177360以及WO 2018/069375中。接头可以是可切割的或不可切割的。可切割接头包含可被切割的部分，例如当暴露于溶酶体蛋白酶或具有酸性pH或较高还原电位的环境时。合适的可切割接头是本领域已知的，并且包括例如二肽、三肽或四肽，即由两个、三个或四个氨基酸残基构成的肽。此外，可切割接头可以包含自我牺牲(selfimmolative)部分，例如ω-氨基氨基羰基环化间隔基，参见Saari et al,J.Med.Chem.,1990,33,97–101，或-NH-CH2-O-部分。接头的切割使得根据本发明的接头-药物化合物中的抗叶酸剂部分对周围环境是可用的。不可切割的接头仍然可以有效地从根据本发明的接头-药物化合物中释放抗叶酸剂部分(的衍生物)，例如当缀合的多肽在溶酶体中降解时。不可切割的接头包括例如琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基(环己烷)-1-羧酸酯和马来酰亚胺基己酸(maleimidocaproic acid)及其类似物。
为了能够将接头或接头-药物部分与多肽例如抗体、其抗原结合片段或另外的靶向分子缀合，接头的将与抗体、其抗原结合片段或另外的靶向分子(共价)结合的侧通常包含能够在相对温和的条件下与抗体、其抗原结合片段或另外的靶向分子的氨基酸残基反应的官能团。该官能团在本文中被称为反应性部分(reactive moiety，RM)。反应性部分的实例包括但不限于氨甲酰基卤化物、酰基卤化物、活性酯、酸酐、α-卤代乙酰基、α-卤代乙酰胺、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯、二硫化物、硫醇、肼、酰肼、磺酰氯、醛、甲基酮、乙烯砜、卤代甲基、甲基磺酸酯和环辛炔。官能团与之反应的这样的氨基酸残基可以是天然或非天然的氨基酸残基。本文使用的术语“非天然氨基酸”旨在表示经(合成)修饰的氨基酸或天然存在的氨基酸的D立体异构体。优选地，官能团与之反应的氨基酸残基是天然氨基酸。
在本发明的一个优选实施方案中，RM是
其中，
X1选自-Cl、-Br、-I、-F、-OH、-O-N-琥珀酰亚胺、-O-(4-硝基苯基)、
-O-五氟苯基、-O-四氟苯基、-O-C(O)-R8和-O-C(O)-OR8，或者C(O)-
X1是活性酯；
X2选自-Cl、-Br、-I、-O-甲磺酰基、-O-三氟甲基苯基和-O-甲苯磺酰基；
R8选自任选地经取代的支化的或非支化的C1-10烷基、C1-10杂烷基、C3-10环烷基、C1-10杂环烷基、C5-10芳基或C1-10杂芳基；
U是O或NR9；并且
R9选自H、支化的或非支化的C1-C12烷基或C4-C12(杂)芳基基团。
优选地，RM是
更优选地，RM是
接头还可包含一个或更多个延伸间隔基，例如
接头还可包含一个或更多个消除间隔基，例如在Alouane et al,Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,7492-7509、Deng et al,Macromol.Rapid Commun.2020,41,e1900531或Bargh et al,Chem.Soc.Rev.2019,48,4361-4374中描述的。
在一个实施方案中，接头L是
其中，
m是1至10的整数，优选5；
AA是氨基酸，优选天然氨基酸；并且
p是0、1、2、3或4；
ES是不存在的，或者是选自以下的延伸间隔基：
RL是不存在的或者是选自以下的消除间隔基：
其中t是1至10的整数，R10是任选地经取代的C1-4烷氧基，并且R11是H、任选地经取代的C1-6烷基、任选地经取代的C6-14芳基或任选地经取代的C-连接的C3-8杂芳基。
在一个优选的实施方案中，m是5，p是0，ES和RL是不存在的，并且L是
在另一个优选的实施方案中，AA是选自丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和瓜氨酸的氨基酸。
在第一具体实施方案中，p是2并且AA2是苯丙氨酰赖氨酸、缬氨酰丙氨酸、缬氨酰瓜氨酸或缬氨酰赖氨酸。更优选地，AA2是缬氨酰丙氨酸或缬氨酰瓜氨酸。最优选地，AA2是缬氨酰丙氨酸或缬氨酰瓜氨酸，并且m是5。
在第二具体实施方案中，p是3，并且AA3是丙氨酰苯丙氨酰赖氨酸。
在第三具体实施方案中，p是4，并且AA4是甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰甘氨酸。
在一个优选的实施方案中，m是5，p是2，并且AA2是缬氨酰丙氨酸或缬氨酰瓜氨酸。
优选地，m是5，p是2，AA2是缬氨酰丙氨酸，ES和RL是不存在的，并且L是
在另一个优选的实施方案中，m是5，p是4，AA4是甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰甘氨酸，ES和RL是不存在的，并且L是
在一个实施方案中，接头L是
其中，
q是1至12的整数，优选2；
AA是氨基酸，优选天然氨基酸；并且
p是0、1、2、3或4；
ES是不存在的，或者是选自以下的延伸间隔基：
RL是不存在的或者是选自以下的消除间隔基：
其中t是1至10的整数，R10是任选地经取代的C1-4烷氧基，并且R11是H、任选地经取代的C1-6烷基、任选地经取代的C6-14芳基或任选地经取代的C-连接的C3-8杂芳基。
在一个优选的实施方案中，AA是选自丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和瓜氨酸的氨基酸。
在第一具体实施方案中，p是2，并且AA2是苯丙氨酰赖氨酸、缬氨酰丙氨酸、缬氨酰瓜氨酸或缬氨酰赖氨酸。更优选地，AA2是缬氨酰丙氨酸或缬氨酰瓜氨酸。最优选地，AA2是缬氨酰丙氨酸或缬氨酰瓜氨酸，并且q是2。
在第二具体实施方案中，p是3，并且AA3是丙氨酰苯丙氨酰赖氨酸。
在第三具体实施方案中，p是4，并且AA4是甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰甘氨酸。
在一个优选的实施方案中，q是2，p是2，并且AA2是缬氨酰丙氨酸或缬氨酰瓜氨酸。优选地，q是2，p是2，AA2是缬氨酰瓜氨酸，RL是不存在的，ES是
并且L是
在另一个优选的实施方案中，q是2，p是2，AA2是缬氨酰瓜氨酸，ES是
RL是
并且L是
在一个实施方案中，接头L是
以下是根据本发明的优选接头-药物化合物：
根据本发明的更优选的接头-药物化合物是
根据本发明的甚至更优选的接头-药物化合物是
根据本发明的甚至更优选的接头-药物化合物是
根据本发明的最优选的接头-药物化合物具有下式
制备根据本发明的接头-药物化合物的方法
根据本发明的接头-药物化合物可以通过实施例中公开的或类似的方法或者通过例如Rosowsky et al(J.Med.Chem.1988,31 1332-1337；J.Med.Chem.1998,41 5310-5319；J.Med.Chem.2000,43 1620-1634)或Itoh et al(Chem.Pharm.Bull.2000,48 1270-1280)来制备。
在一个方面，本发明涉及下式化合物在制备根据本发明的接头-药物化合物或制备包含根据本发明的接头-药物化合物的缀合物的方法中的用途
其中
R1是O、NH2或OH；
R2和R2’独立地是N、CH或CMe；
R3是NH、N(C1-5烷基)、CH2、CH(C1-5烷基)、CH(C2-4烯基)、CH(C2-4炔基)或CH(C1-4烷氧基)；
R4是H、卤素、-COOH、OH、NH2、-CONH2、-CONHR、-CONHR2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、苄氧基、四唑、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-CN或叠氮基，其中R选自H和C1-5烷基，或者R4是羧酸生物电子等排体；
R5是H、卤素、CF3、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基或C1-4烷硫基，优选H、F、CH3、CF3、CH2CH3、CH＝CH2、CH2CF3或CF2CF3，更优选H或F；
R6是H、C1-4烷基、C2-4烯基、C3-6环烷基，优选H；
n是1、2、3或4，优选3；
Q是不存在的，或者为-N(R7)-(C＝O)-、-(C＝O)-N(R7)-、-CH2N(R7)-、-
N(R7)CH2-、-N(R7)SO2-、或-SO2N(R7)-，其中R7是H、C1-4烷基、C1-4烯基或C1-4炔基，优选H，或者Q是酰胺键生物电子等排体；
V是芳基、杂芳基、杂环或环烷烃，其任选地被一个或更多个R4基团取代，并且独立地选自
其中U1、U1’、U1”、U2、U2’、U2”和U2”’独立地选自C、CH、S、N、NH、N(C1-5烷基)和O，或者V选自
其中Z是O、S、NH或NRc，并且Rc选自H和C1-5烷基；
s是0或1，优选1；
x选自O、NH、S、C1-5亚烷基、C1-5亚烯基和C1-5亚炔基；并且
在一个实施方案中，本发明涉及下式化合物在制备根据本发明的接头-药物化合物或制备包含根据本发明的接头-药物化合物的缀合物的方法中的用途
其中
R1是O、NH2或OH；
R2和R2’独立地是N、CH或CMe；
R3是NH、N(C1-5烷基)、CH2或CH(C1-5烷基)；
R4是H、卤素、-COOH、OH、NH2、-CONH2、-CONHR、-
CONHR2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、四唑、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、
-OPO3H2、-CN或叠氮基，其中R选自H和C1-5烷基；
n是1、2、3或4，优选3；
X选自O、NH、S、C1-5亚烷基、C1-5亚烯基和C1-5亚炔基；并且
在一个优选的实施方案中，本发明涉及下式化合物在制备根据本发明的接头-药物化合物或制备包含根据本发明的接头-药物化合物的缀合物的方法中的用途
更优选地，该化合物具有下式
甚至更优选地，该化合物具有下式
多肽和抗叶酸剂接头-药物化合物的抑制剂缀合物
本发明还提供了抑制剂缀合物，其包含与另外的物质(例如多肽或多核苷酸)缀合(以形成适配体)的根据本发明的接头-药物化合物。优选地，另外的物质是多肽。更优选地，多肽是抗体、其抗原结合片段或另外的靶向分子。这样的抑制剂缀合物在下文中被称为根据本发明的抑制剂缀合物。
当与多肽缀合时，本说明书通篇中使用的术语“根据本发明的抑制剂缀合物”是指与一种或更多种根据本发明的接头-药物化合物缀合的多肽，即与通式(I)的一种或更多种接头-药物化合物缀合的多肽。
通常，根据本发明的抑制剂缀合物包含与受体、受体复合物、抗原、酶或者与异常或恶性细胞群相关但优选不与或几乎不与健康细胞群相关的另外的部分结合、反应性缔合或复合的多肽。根据本发明的抑制剂缀合物中的多肽用作将根据本发明的接头-药物化合物靶向异常或恶性细胞群的手段。合适的多肽包括抗体、其抗原结合片段、酶抑制剂、酶底物、受体配体和融合蛋白。
根据本发明的接头-药物化合物可以通过合适多肽中存在的反应性天然氨基酸残基例如赖氨酸或半胱氨酸，或者通过N-端或C-端与合适的多肽缀合。或者，可以将天然或非天然的反应性氨基酸残基遗传改造到合适的多肽中，或者可以通过翻译后修饰引入。此外，如果合适的多肽是糖蛋白，根据本发明的接头-药物化合物可以通过现有的聚糖与糖蛋白缀合。
应当理解，当包含在根据本发明的抑制剂缀合物中时，根据本发明的接头-药物化合物，与当不包含在抑制剂缀合物中时的根据本发明的相同化合物相比，可以缺少某些原子或原子团，例如，缺少氢原子。这可以是例如因为根据本发明的接头-药物化合物通过例如与羟基部分的酯化而与多肽缀合。
优选地，本文所用的多肽是抗体或其抗原结合片段。因此，本发明优选涉及包含根据本发明的接头-药物化合物的抗体-药物缀合物(ADC)。
在一个实施方案中，本发明涉及式(III)的ADC
Ab-(L-D)y (III)，
其中Ab是抗体或其抗原结合片段，
L-D是根据本发明的接头-药物化合物；并且
y表示1至16、优选1至10的平均药物与抗体比率(DAR)。
如本领域众所周知的，DAR和药物负荷分布可以通过例如使用疏水相互作用色谱(hydrophobic interaction chromatography，HIC)或反相高效液相色谱(reversed phasehigh-performance liquid chromatography，RP-HPLC)来确定。HIC特别适用于确定平均DAR。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及式(III)的ADC，其中根据本发明的接头-药物化合物通过抗体或其抗原结合片段的半胱氨酸残基与所述抗体或所述抗原结合片段缀合。
在一个更优选的实施方案中，本发明涉及下式的ADC
其中，
Ab是抗体或其抗原结合片段；并且
y表示1至16、优选1至10的平均DAR。
在一个最优选的实施方案中，本发明涉及下式的ADC
其中，
Ab是抗体或其抗原结合片段；并且
y表示1至16、优选1至10的平均DAR。
在本发明的上下文中，上述ADC式中的Ab可以是任何抗体或其抗原结合片段，优选单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)或其抗原结合片段。
本文使用的术语“抗体”优选指包含两条重链和两条轻链的抗体。通常，抗体或其任何抗原结合片段是具有治疗活性的抗体或其任何抗原结合片段，但如ADC领域中已知的，这样的独立的效力不是必需的。根据本发明使用的抗体可以是任何同种型，例如IgA、IgE、IgG或IgM抗体。优选地，抗体是IgG抗体，更优选IgG1或IgG2抗体。抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。优选地，抗体是人源化的或人的。甚至更优选地，抗体是人源化或人IgG抗体，更优选地是人源化或人IgG1 mAb。抗体可以具有κ(kappa)或λ(lambda)轻链，优选κ(kappa)轻链，即人源化或人IgG1-κ抗体。
本文使用的术语“抗原结合片段”包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或还原IgG(reduced IgG，rIgG)片段、单链(single chain，sc)抗体、单结构域(single domain，sd)抗体、双抗体(diabody)或微抗体(minibody)。
非人(例如啮齿类动物)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人抗体的最少序列的抗体(例如非人-人嵌合抗体)。将非人抗体人源化的多种方法是本领域已知的。例如，重链(heavy chain，HC)和轻链(light chain，LC)的可变区(variable region，VR)中的抗原结合互补决定区(complementarity determining region，CDR)来源于非人物种(通常是小鼠、大鼠或兔)的抗体。这些非人CDR可以与HC和LC的可变区的人构架区(FR(frameworkregion)，即FR1、FR2、FR3和FR4)组合，使得至少部分保留抗体的功能特性，例如结合亲和力和特异性。人FR中的选定氨基酸可以与相应的原始非人物种氨基酸交换，以进一步改进抗体性能，例如提高结合亲和力，同时保持低免疫原性。因此，人源化的可变区通常与人恒定区组合。非人抗体人源化的示例性方法是Winter和同事(Jones et al,Nature 1986,321,522-525；Riechmann et al,Nature 1988,332,323-327；Verhoeyen et al,Science 1988,239,1534-1536)的方法。或者，非人抗体可以通过修饰其氨基酸序列来人源化，以提高与人中天然产生的抗体变体的相似性。例如，原始非人物种FR的选定氨基酸被交换为其相应的人氨基酸以降低免疫原性，同时保留抗体的结合亲和力。关于另外的细节，参见Jones etal,Nature 1986,321,522-525；Riechmann et al,Nature 1988,332,323-327和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.1992,2,593-596。也可参见以下综述文章和其中引用的参考文献：Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma and Immunol.1998,1,105-115；Harris,Biochem.Soc.Transactions 1995,23,1035-1038和Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.1994,5,428-433。
可以使用Kabat(在Kabat中，E.A.et al,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,NIH publication no.91-3242,pp.662,680,689(1991))、Chothia(Chothia et al,Nature 1989,342,877-883)或IMGT(Lefranc,The Immunologist 1999,7,132-136)的方法确定CDR。
通常，抗体是单特异性的(即，对一种抗原具有特异性；这样的抗原在物种之间可以是共有的，或者在物种之间具有相似的氨基酸序列)或双特异性的(即，对物种的两种不同抗原具有特异性)抗体，其包含至少一个与抗原靶标结合的HC和LC可变区，优选膜结合抗原靶标(其可以是内化的或不内化的，优选内化的)。
在一个具体实施方案中，抗原靶标选自：膜联蛋白A1、B7H3、B7H4、BCMA、CA6、CA9、CA15-3、CA19-9、CA27-29、CA125、CA242(癌症抗原242)、CAIX、CCR2、CCR5、CD2、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30(肿瘤坏死因子8)、CD33、CD37、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD40、CD44、CD47(整联蛋白相关蛋白)、CD56(神经细胞黏附分子)、CD70、CD71、CD73、CD74、CD79、CD115(集落刺激因子1受体)、CD123(白介素-3受体)、CD138(黏结蛋白1)、CD203c(ENPP3)、CD303、CD333、CDCP1、CEA、CEACAM、密封蛋白4、密封蛋白7、CLCA-1(C型凝集素样分子-1)、CLL 1、c-MET(肝细胞生长因子受体)、Cripto、DLL3、EGFL、EGFR、EPCAM、EphA2、EPhB3、ETBR(内皮素B型受体)、FAP、FcRL5(Fc受体样蛋白5、CD307)、FGFR3、FOLR1(叶酸受体α)、FRβ、GCC(鸟苷酸环化酶C)、GD2、GITR、GLOBO H、GPA33、GPC3、GPNMB、HER2、p95HER2、HER3、HMW-MAA(高分子量黑素瘤相关抗原，high molecular weight melanoma-associated antigen)、整联蛋白α(例如，αvβ3和αvβ5)、IGF1R、TM4SF1(L6)、路易斯A样碳水化合物、路易斯X、路易斯Y(CD174)、LGR5、LIV1、间皮素(mesothelin，MSLN)、MN(CA9)、MUC1、MUC16、NaPi2b、连接蛋白-4、Notch3、PD-1、PD-L1、PSMA、PTK7、SLC44A4、STEAP-1、5T4(或TPBG、滋养层糖蛋白)、TF(组织因子、凝血活酶、CD142)、TF-Ag、Tag72、TNFα、TNFR、TROP2(肿瘤相关钙信号转导子2)、uPAR、VEGFR和VLA。
合适的抗体的实例包括博纳吐单抗(Blinatumomab)(CD19)、依帕珠单抗(epratuzumab)(CD22)、伊妥木单抗(iratumumab)和布仑妥昔单抗(brentuximab)(CD30)、伐达妥昔单抗(vadastuximab)(CD33)、tetulumab(CD37)、伊沙妥昔单抗(isatuximab)(CD38)、比伐珠单抗(bivatuzumab)(CD44)、洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab)(CD56)、沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumab)(CD70)、米拉珠单抗(milatuzumab)(CD74)、波妥珠单抗(polatuzumab)(CD79)、洛伐妥珠单抗(rovalpituzumab)(DLL3)、伏妥昔单抗(futuximab)(EGFR)、奥珀妥珠单抗(oportuzumab)(EPCAM)、法乐妥珠单抗(farletuzumab)(FOLR1)、格巴妥木单抗(glembatumumab)(GPNMB)、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗(pertuzumab)和马格妥昔单抗(margetuximab)(HER2)、伊瑞西珠单抗(etaracizumab)(整联蛋白)、阿奈妥单抗(anetumab)(间皮素)、潘科曼单抗(pankomab)(MUC1)、恩弗妥单抗(enfortumab)(连接蛋白-4)以及H8、A1、和A3(5T4)。
如果适用的话，抗体或其抗原结合片段可包含(1)经工程化的恒定区，即，可引入一个或更多个突变，以例如提高半衰期、提供接头-药物的连接位点和/或提高或降低效应物功能；或(2)经工程化的可变区，即可引入一个或更多个突变，以例如提供接头-药物的连接位点。抗体或其抗原结合片段可以重组地、合成地或通过其他已知的合适方法产生。
根据本发明的ADC可以是野生型的或位点特异性的或其组合，并且可以通过如下文举例说明的本领域已知的任何方法产生。
用于制备根据本发明的ADC的方法
野生型ADC可如下产生：通过将接头-药物与抗体或其抗原结合片段通过例如抗体的赖氨酸ε-氨基基团缀合，优选使用包含胺反应性基团例如活性酯的接头-药物；通过将活性酯与抗体或其抗原结合片段接触将产生ADC。或者，野生型ADC可如下产生：使用本领域已知的方法和条件，例如参见Doronina et al,Bioconjugate Chem.2006,17,114-124，通过由链间二硫键还原产生的半胱氨酸侧链的游离硫醇来缀合接头-药物。制备方法涉及部分还原暴露于溶剂的链间二硫化物，然后用包含Michael受体的接头-药物例如包含马来酰亚胺的接头-药物、α-卤代乙酰胺或酯来修饰所得硫醇。半胱氨酸连接策略导致对于每个还原的二硫化物，最大两个接头-药物。大多数人IgG分子具有四个暴露于溶剂的二硫键，并因此每个抗体具有0至8个接头-药物的整数范围是可能的。每个抗体的接头-药物的确切数目由二硫化物还原的程度和随后的缀合反应中使用的接头-药物的摩尔当量数决定。全部四个二硫键的完全还原产生均一构建体，其中对于每个抗体，八个接头-药物；而部分还原通常会导致异质混合物，其中对于每个抗体，零、二、四、六或八个接头-药物。
优选通过在突变的抗体或其抗原结合片段的合适位置上经由经工程化半胱氨酸残基的侧链将接头-药物与抗体或其抗原结合片段缀合来产生位点特异性ADC。经工程化半胱氨酸通常被其他硫醇例如半胱氨酸或谷胱甘肽封端，以形成二硫化物。这些经封端的残基需要先解封，然后才能发生接头-药物连接。通过以下步骤可实现接头-药物与经工程化残基的连接：(1)通过对天然链间二硫化物和突变二硫化物二者进行还原，然后使用温和的氧化剂(例如CuSO4或脱氢抗坏血酸)对天然链间半胱氨酸进行再氧化，随后将未封端的经工程化半胱氨酸与接头-药物进行标准缀合；或者(2)通过使用温和的还原剂，其以比链间二硫键更高的速率还原突变二硫化物，随后将未封端的经工程化半胱氨酸与接头-药物进行标准缀合。在最佳条件下，每个抗体或其抗原结合片段将连接两个接头-药物(即DAR为2)(如果将一个半胱氨酸工程化到抗体或片段的HC或LC中)。用于位点特异性地缀合接头-药物的合适方法可例如在以下中找到：WO 2015/177360，其描述了还原和再氧化的过程；WO2017/137628，其描述了使用温和还原剂的方法；以及WO 2018/215427，其描述了用于缀合还原的链间半胱氨酸和解封的经工程化半胱氨酸的方法。
药物组合物
在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的接头-药物化合物或抑制剂缀合物的组合物，优选地其中该组合物是药物组合物，更优选还包含可药用赋形剂。这样的组合物在下文中被称为根据本发明的组合物。该组合物可以是例如液体制剂、冻干制剂或者例如胶囊剂或片剂的形式。通常，包含胶囊剂或片剂形式的小分子例如根据本发明的接头-药物化合物的药物制剂包含稀释剂。合适的水溶性稀释剂包括糖、糖醇、多糖和环糊精。合适的非水溶性稀释剂包括磷酸钙、硫酸钙、淀粉、改性淀粉和微晶纤维素。此外，包含小分子例如根据本发明的接头-药物化合物的药物制剂可以包含黏合剂。合适的黏合剂包括明胶、纤维素衍生物、聚合物例如交联聚乙烯吡咯烷酮(交聚维酮)或共聚维酮，以及聚乙二醇。包含小分子例如根据本发明的接头-药物化合物的药物制剂还可以包含崩解剂。合适的崩解剂包括交联聚合物，例如交聚维酮和交联的羧甲基纤维素钠(交联羧甲基纤维素钠)和羟基乙酸淀粉钠。此外，包含小分子例如根据本发明的接头-药物化合物的药物制剂可以包含助流剂，例如热解法二氧化硅、滑石和碳酸镁；润滑剂，例如滑石或二氧化硅、植物硬脂酸甘油酯、硬脂酸镁或硬脂酸；防腐剂，例如抗氧化剂或对羟基苯甲酸酯；着色剂；甜味剂和/或矫味剂。
通常，包含根据本发明的抑制剂缀合物、ADC或接头-药物化合物的药物组合物采取冻干饼(冻干粉末)的形式，其在静脉内输注之前需要(水性)溶解(即，重构)，或者采取冷冻(水性)溶液的形式，其在使用之前需要解冻。因此，在一些优选的实施方案中，本发明提供了包含根据本发明的接头-药物化合物或抑制剂缀合物的冻干组合物，优选地其中该组合物是药物组合物，更优选地还包含可药用赋形剂。在另一些优选的实施方案中，本发明提供了包含水和根据本发明的接头-药物化合物或抑制剂缀合物的冷冻组合物，优选地其中该组合物是药物组合物，更优选地还包含可药用赋形剂。在这种情况下，冷冻溶液优选在大气压下，并且冷冻溶液优选通过在低于0℃的温度下冷冻根据本发明的液体组合物而获得。用于包含在根据本发明的药物组合物(冷冻干燥之前)中的合适的可药用赋形剂包括缓冲溶液(例如，在水中的柠檬酸盐、氨基酸例如组氨酸，或包含琥珀酸盐的盐)、冻干保护剂(例如，蔗糖、海藻糖)、张力调节剂(例如，氯化物盐例如氯化钠)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)和填充剂(例如甘露醇、甘氨酸)。选择用于冷冻干燥的蛋白质制剂的赋形剂是因为它们能够在冷冻干燥过程以及储存过程中防止蛋白质变性。
医学用途
在另一方面，本发明提供了根据本发明的接头-药物化合物、抑制剂缀合物(优选抗体-药物缀合物)或组合物，其用作药物，优选用于治疗癌症、自身免疫疾病或感染性疾病。这些接头-药物化合物、缀合物和组合物在下文中统称为根据本发明使用的产品。
在一个实施方案中，根据本发明使用的产品用于治疗实体瘤或恶性血液病。
在第二实施方案中，根据本发明使用的产品用于治疗自身免疫疾病。
在第三实施方案中，根据本发明使用的产品用于治疗感染性疾病，例如细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或其他感染。
在本发明的上下文中，癌症优选是表达根据本发明使用的产品所针对的抗原的肿瘤。这样的肿瘤可以是实体瘤或恶性血液病。可以用如上定义的根据本发明使用的产品治疗的肿瘤或恶性血液病的实例可以包括但不限于：乳腺癌；脑癌(例如胶质母细胞瘤)；头颈癌；甲状腺癌；腮腺癌；肾上腺癌(例如，成神经细胞瘤、副神经节瘤或嗜铬细胞瘤)；骨癌(例如骨肉瘤)；软组织肉瘤(soft tissue sarcoma，STS)；眼癌(例如葡萄膜黑素瘤)；食管癌；胃癌；小肠癌；结直肠癌；尿路上皮细胞癌(例如，膀胱、阴茎、输尿管或肾癌)；卵巢癌；子宫癌；阴道癌、外阴癌和宫颈癌；肺癌(尤其是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC))；黑素瘤；间皮瘤(尤其是恶性胸膜和腹部间皮瘤)；肝癌(例如肝细胞癌)；胰腺癌；皮肤癌(例如基底细胞瘤、鳞状细胞癌或隆凸性皮肤纤维肉瘤)；睾丸癌；前列腺癌；急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)；慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)；慢性淋巴白血病(chronic lymphaticleukemia，CLL)；急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)；骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)；母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(blasticplasmacytoid dendritic cell neoplasia，BPDCN)；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma，NHL)(包括滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)、CNS淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL))；轻链淀粉样变性；浆细胞白血病；以及多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)。
在本发明的上下文中，自身免疫疾病优选是与根据本发明使用的产品所针对的抗原相关的自身免疫疾病。自身免疫疾病表示由对正常身体细胞和组织的异常免疫应答引起的病症。存在至少80种类型的广泛多种自身免疫疾病。一些疾病是器官特异性的，并限于影响某些组织，而另一些疾病类似于影响全身许多组织的全身炎性疾病。这些体征和症状的出现和严重程度取决于发生炎性应答的部位和类型，并可随时间而波动。可以用如上定义的根据本发明使用的产品治疗的自身免疫疾病的实例可包括但不限于：类风湿性关节炎；幼年皮肌炎；银屑病；银屑病关节炎；狼疮；结节病；克罗恩病(Crohn's disease)；湿疹；肾炎；葡萄膜炎；多发性肌炎；神经炎，包括格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)；脑炎；蛛网膜炎；系统性硬化；自身免疫介导的肌肉骨骼和结缔组织疾病；神经肌肉变性疾病，包括阿尔茨海默病、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、视神经脊髓炎和大、中、小血管川崎病和过敏性血管炎(HenochSchonlein vasculitis)；冷温凝集素病；自身免疫性溶血性贫血；I型糖尿病；桥本甲状腺炎；格雷夫斯病(Graves’disease)；格雷夫斯眼病；肾上腺炎；垂体炎；寻常性天疱疮；艾迪生病(Addison’sdisease)；强直性脊柱炎；白塞综合征(Behcet’s syndrome)；乳糜泻；古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)；重症肌无力；结节病；硬皮病；原发性硬化性胆管炎、获得性大疱性表皮松解和大疱性类天疱疮。
优选地，在本发明的上下文中治疗的自身免疫疾病是类风湿性关节炎。
本发明上下文中的感染性疾病优选是与根据本发明使用的产品所针对的抗原相关的感染性疾病。这样的感染性疾病可以是细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或其他感染。可以用如上定义的根据本发明使用的产品治疗的感染性疾病的实例可以包括但不限于：疟疾；弓形虫病；杰氏肺囊虫类鼻疽(pneumocystis jirovecii melioidosis)；志贺菌病(shigellosis)；李斯特菌(listeria)；环孢子虫(cyclospora)；麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)；结核病；以及免疫受损个体(例如HIV阳性个体、接受免疫抑制治疗的个体或患有先天性缺陷例如囊性纤维化或良性增殖性疾病(例如mola hydatidosa或子宫内膜异位症)的个体)中的感染预防。
如本文所述的根据本发明使用的产品可以用于制备本文所述的药物。如本文所述的根据本发明使用的产品优选用于治疗方法，其中使用的产品以治疗有效量施用于对象，优选施用于有此需要的对象。因此，替代地，或与任何另外的实施方案组合，在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明使用的产品在制备用于治疗癌症、自身免疫疾病或感染性疾病，特别是用于治疗癌症的药物中的用途。对于待根据本发明治疗的说明性、非限制性癌症或其他疾病：参见上文。
替代地，或与任何另外的实施方案组合，在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症、自身免疫疾病或感染性疾病，特别是癌症的方法，该方法包括向需要所述治疗的对象施用治疗有效量的根据本发明使用的产品。对于待根据本发明治疗的说明性、非限制性癌症或其他疾病：参见上文。
根据本发明使用的产品用于施用于对象。根据本发明使用的产品可以用于上述的通过将有效量的组合物施用于有此需要的对象的治疗方法中。本文所用的术语“对象”是指所有归类为哺乳动物的动物，并且包括但不限于灵长类和人。对象优选是人。表述“治疗有效量”意指足以实现期望应答或改善症状或体征的量。特定对象的治疗有效量可以根据多种因素例如所治疗的病症、对象的整体健康状况、施用的方法、途径和剂量以及副作用的严重程度而变化。
在另一些实施方案中，本发明提供了根据本发明使用的产品，其中该使用与一种或更多种另外的治疗剂组合。根据本发明使用的产品可以与一种或更多种另外的治疗剂同时或顺序使用。
合适的化学治疗剂包括烷化剂，例如氮芥、羟基脲、亚硝基脲、四嗪(例如替莫唑胺)和氮丙啶(例如丝裂霉素)；干扰DNA损伤应答的药物，例如PARP抑制剂、ATR和ATM抑制剂、CHK1和CHK2抑制剂、DNA-PK抑制剂和WEE1抑制剂；抗代谢物，例如抗叶酸剂(例如培美曲塞)、氟嘧啶(例如吉西他滨)、脱氧核苷类似物和硫嘌呤；抗微管剂，例如长春花生物碱和紫杉烷；拓扑异构酶I和II抑制剂；细胞毒性抗生素，例如蒽环素和博来霉素；去甲基化剂，例如地西他滨和阿扎胞苷；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；全反式维甲酸；和三氧化二砷。合适的放射性治疗剂包括放射性同位素，例如131I-间碘苄胍(metaiodobenzylguanidine，MIBG)、作为磷酸钠的32P、223Ra氯化物、89Sr氯化物和153Sm二胺四亚甲基膦酸盐(diaminetetramethylene phosphonate，EDTMP)。用作激素治疗剂的合适药物包括激素合成抑制剂，例如芳香酶抑制剂和GnRH类似物；激素受体拮抗剂，例如选择性雌激素受体调节剂(例如他莫昔芬(tamoxifen)和氟维司群(fulvestrant))和抗雄激素药，例如比卡鲁胺(bicalutamide)、恩扎鲁胺(enzalutamide)和氟他胺(flutamide)；CYP17A1抑制剂，例如阿比特龙(abiraterone)；和生长抑素类似物。
靶向治疗剂是干扰参与肿瘤发生和增殖的特定蛋白质的治疗剂，并且可以是小分子药物；蛋白质，例如治疗性抗体；肽和肽衍生物；或蛋白质-小分子混合物，例如ADC。靶向小分子药物的实例包括mTor抑制剂，例如依维莫司(everolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)和雷帕霉素；激酶抑制剂，例如伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)和尼罗替尼(nilotinib)；VEGF抑制剂，例如索拉非尼(sorafenib)和瑞戈拉非尼(regorafenib)；EGFR/HER2抑制剂，例如吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)和埃罗替尼(erlotinib)；和CDK4/6抑制剂，例如帕博西尼(palbociclib)、瑞博西尼(ribociclib)和玻玛西尼(abemaciclib)。肽或肽衍生物靶向治疗剂的实例包括蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米(bortezomib)和卡非佐米(carfilzomib)。
合适的抗炎药物包括D-青霉胺、硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤、环孢菌素、抗TNF生物制剂(例如英夫利昔单抗(infliximab)、依那西普(etanercept)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(golimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)或(赛妥珠单抗(certolizumabpegol))、来氟米特(lenflunomide)、阿巴西普(abatacept)、托珠单抗(tocilizumab)、阿那白滞素(anakinra)、优特克单抗(ustekinumab)、利妥昔单抗(rituximab)、达雷木单抗(daratumumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、苏金单抗(secukinumab)、阿普斯特(apremilast)、acetretin和JAK抑制剂(例如托法替尼(tofacitinib)、巴瑞克替尼(baricitinib)或乌帕替尼(upadacitinib))。
免疫治疗剂包括诱导、增强或抑制免疫应答的物质，例如细胞因子(IL-2和IFN-α)；免疫调节酰亚胺药物，例如沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)或咪喹莫特(imiquimod)；治疗性癌症疫苗，例如talimogenelaherparepvec；基于细胞的免疫治疗剂，例如树突状细胞疫苗、过继性T细胞或嵌合抗原受体修饰的T细胞；以及当与细胞上的膜结合配体结合时可通过其Fc区触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP)或补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)的治疗性抗体。
在本发明的上下文中，治疗优选地是预防、逆转、治愈、改善和/或延迟癌症、自身免疫疾病或感染性疾病。这可意味着癌症、自身免疫疾病或感染性疾病的至少一种症状的严重程度已经降低，和/或至少与癌症、自身免疫疾病或感染性疾病相关的参数已经改善。优选地，这样的参数与叶酸活性相关。
在本发明的上下文中，对象可以存活和/或可以被认为没有疾病。或者，疾病或病症可能已经停止或延迟。在本发明的上下文中，生活质量的改善和所观察到的疼痛缓解可意指对象可能需要比治疗开始时更少的疼痛缓解药物。在这种情况下，“更少”可意指少5％、少10％、少20％、少30％、少40％、少50％、少60％、少70％、少80％、少90％。对象可能不再需要任何疼痛缓解药物。与所述对象治疗开始时的生活质量和所观察到的疼痛缓解相比，治疗至少一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间后，在对象中可以观察、检测或评估到生活质量和所观察到的疼痛缓解的这种改善。
通用定义
根据本发明的接头-药物化合物可以包含一个或更多个手性中心和/或双键，并因此可作为立体异构体存在，例如双键异构体(即，几何异构体)、区域异构体、对映体或非对映体。因此，本文中描述的化学结构涵盖了所示或所鉴定化合物的所有可能的对映体和立体异构体，包括立体异构纯形式(例如，几何纯的、对映体纯的或非对映体纯的)以及对映体和立体异构混合物。可使用本领域技术人员公知的分离技术或手性合成技术将对映异构体和立体异构体混合物拆分成它们的组分对映体或立体异构体。化合物也可以以数种互变异构形式存在，包括烯醇形式、酮形式及其混合物。因此，本文中描述的化学结构涵盖了所示或所鉴定的化合物的所有可能的互变异构形式。还应理解，本领域技术人员可以通过物理和/或化学方法分离一些异构体形式，例如非对映体、对映体和几何异构体。当技术人员理解结构式或化学名称具有手性中心，但没有指出手性时，对于每个手性中心，单独提及外消旋混合物、纯R对映体和纯S对映体中的全部三种。当化合物的结构被描述为特定的对映体时，应当理解本申请的发明不限于该特定的对映体。当说两个部分一起形成键时，这意味着这些部分不作为原子存在，并且通过替换电子键来满足化合价。所有这些在本领域中都是已知的。
本说明书和权利要求书中公开的化合物还可以作为外位和内位区域异构体存在。除非另有说明，否则说明书和权利要求书中对任何化合物的描述都意指着包括化合物的单独外位和单独内位区域异构体二者，以及它们的混合物。此外，本说明书和权利要求书中公开的化合物可以以顺式和反式异构体存在。除非另有说明，否则说明书和权利要求书中对任何化合物的描述都意指着包括化合物的单独顺式和单独反式异构体二者，以及它们的混合物。例如，当化合物的结构被描述为顺式异构体时，应当理解，相应的反式异构体或顺式和反式异构体的混合物不排除在本申请发明之外。
在本文件及其权利要求书中，动词“包含/包括”及其变化形式以其非限制性意义使用，意指包括在该词之后的项目，但是不排除未具体提及的项目。此外，除非上下文明确要求存在一个且仅一个要素，否则通过不定冠词对要素的提及不排除存在多于一个要素的可能性。因此，未用数量词限定的名词通常是指“至少一个/种”。
当与数值(例如，约10)一起使用时，词语“约”或“大约”优选意指该值可以是该值的大或少约1％的给定值。
每当在本发明的上下文中讨论物质的参数时，假设除非另有说明，否则该参数是在生理条件下确定、测量或显示的。生理条件是本领域技术人员已知的，并且包括水性溶剂体系、大气压、6至8的pH值、室温(room temperature，RT)至约37℃(约20℃至约40℃)的温度以及缓冲盐或其他组分的合适浓度。应当理解，电荷通常与平衡有关。被称为携带或带有电荷的部分是以如下状态存在的部分：在所述状态下，它携带或带有这样的电荷的次数比它不携带或带有这样的电荷的次数多。因此，如本领域技术人员所理解的，在本公开内容中所示的带电荷的原子在特定条件下可以不带电，并且中性部分在特定条件下可以带电。
本说明书中引用的所有专利和文献参考均通过引用在此整体并入。
提供以下实施例仅用于举例说明的目的，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
通用
使用的所有溶剂均是来自不同供应商的试剂级或HPLC级。在Bruker AVANCE400(对于1H为400MHz；对于13C为100MHz)上记录NMR谱。化学位移相对于作为内标的四甲基硅烷或残留未氘化溶剂以ppm报告。使用带有反相C18桥连乙基硅氧烷-二氧化硅混合柱(WatersACQUITY
BEH C18 1.7μm粒径，2.1x50mm)的Waters UPLC-MS(ESI，配备有SQ-detector 3100)，以0.4mL/分钟的流量(乙腈(MeCN)/水x0.1％甲酸(formic acid，FA))记录质谱。使用配备有Waters SunFire Prep C18 OBD 5μm柱(19x150mm)的ShimadzuProminence 20AP系统，以17mL/分钟的流量(MeCN/水x0.1％三氟乙酸(trifluoroaceticacid，TFA))通过制备型HPLC进行纯化。微波反应在Biotage引发剂+仪器中进行。
用于表征ADC的疏水作用色谱(HIC)
对于分析型HIC，将5至10μL样品(1mg/mL)注射到TSKgel Butyl-NPR柱(4.6mm IDx 3.5cm L,Tosoh Bioscience,Cat.no.14947)上。洗脱方法由20分钟内以0.4mL/分钟从100％缓冲液A(25mM磷酸钠，1.5M硫酸铵，pH 6.95)到100％缓冲液B(25mM磷酸钠，pH6.95，20％异丙醇)的线性梯度组成。使用配备有PDA检测器和Empower软件的Waters Acquity H-Class UPLC系统。在214nm下测量吸光度，并确定ADC的保留时间。
用于表征ADC的尺寸排阻色谱(Size Exclusion Chromatography，SEC)
对于分析型SEC，将5μL样品(1mg/mL)注射到配备有TSKgel SWXL保护柱(7μm,6.0mm ID x 4.0cm L,Tosoh Bioscience,Cat.no.08543)的TSKgel G3000SWXL柱(5μm,7.8mm ID x 30cm L,Tosoh Bioscience,Cat.no.08541)上。洗脱方法由30分钟内以0.6mL/分钟的具有100％50mM磷酸钠，300mM NaCl，pH 7.5的洗脱组成。柱温保持在25℃。使用配备有PDA检测器和Empower软件的Waters Acquity H-Class UPLC系统。在214nm下测量吸光度，以量化HMW物质的量。
通用方案XXA：HATU辅助的酰胺偶联
将羧酸(1.0当量)和胺(1.0至1.5当量)溶解在二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF；0.175M)中。在室温下添加1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶
3-氧化六氟磷酸盐(六氟磷酸盐氮杂苯并三唑四甲基脲，hexafluorophosphate azabenzotriazole tetramethyl uronium，HATU；1.2当量)和N,N-二异丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine，DIPEA；6.0当量)，并将混合物搅拌30分钟。浓缩之后，按照指示将产物从甲醇(MeOH)中重结晶或通过快速色谱纯化。
通用方案XXB：用Pd/C和氢还原苯基叠氮化物
在N2下，向叠氮化物(1.0当量)在DMF中的溶液(0.074M)添加10wt％的“钯，在活性炭上，10wt％”。用氢气吹扫混合物并剧烈搅拌，直到UPLC分析表明完全转化为止(约45分钟)。用N2吹扫反应物，并在
上过滤。将滤液在真空中浓缩，并按照指示进行纯化。
通用方案XXC：甲酰胺脱保护和/或酯水解
将酯(1.0当量)溶解/悬浮在甲醇/二甲基亚砜(MeOH/DMSO；5:1，0.36M)中并冷却至0℃。滴加NaOH水溶液(2.0M，3至24当量)，并将所得溶液在室温下搅拌直至UPLC分析显示完全为止(1至6小时)。用水(约4x)稀释反应混合物，并在冷却至0℃之后，用HCL水溶液(1.0M)将pH调节至pH约8.5。如果没有沉淀发生，则用乙酸乙酯(EtOAc；3x)洗涤溶液。对于悬浮液，省略这一步骤。用水(约3x)进一步稀释水相，并用乙酸水溶液(AcOH；1.0M)将pH调节至约pH 4.7。将所得悬浮液剧烈搅拌30分钟并过滤。偶尔地，获得凝胶状的混合物，并随后用热风枪轻轻加热，得到悬浮液。用MeOH和乙醚洗涤固体，并在真空下干燥。
(S)-5-(4-叠氮基苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺
基)戊酸(XX5)和(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲
酰胺基)戊酸(XX7)的制备
(S)-2-氨基-5-(4-叠氮基苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XX3)
在N2下将亚硫酰氯(3.76mL，51.5mmol)和DMF(5滴)添加到4-叠氮基苯甲酸(7.00g，42.9mmol)在二氯甲烷(DCM；150mL)中的悬浮液中。将反应物加热至温和回流，持续2小时，冷却至室温，浓缩，并将固体温和破碎成粉末。在独立的烧瓶中，在室温下用CuSO4·5H2O(4.86g，19.5mmol)在水(67mL)中的溶液处理L-鸟氨酸盐酸盐(L-Orn-OH·HCl)(6.70g，38.9mmol)和NaOH(3.11g，77.8mmol)在水(67mL)中的溶液，得到深蓝色溶液。向该溶液中添加NaHCO3(3.93g，46.7mmol)。一旦溶解，在室温下将深蓝色溶液直接倒在粗制固体4-叠氮基苯甲酰氯(7.78g，42.8mmol)上，并将混合物在室温下剧烈搅拌16小时。过滤悬浮液，并用水(2x20mL)、乙醇(2x20mL)和乙醚(3x40mL)洗涤固体，得到4.97g固体。将该物质溶解在MeOH(140mL)中，并在N2下，在0℃下，于45分钟内添加亚硫酰氯(13.0mL)。然后将反应物在室温下搅拌18小时，并随后浓缩。随后，通过固相萃取(solid phase extraction，SPE；Biotage，SCX-2)纯化该物质的一部分，以得到作为蜡状无色固体的XX3(1.20g)。
对于C13H18N5O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为292.14，实测值为292.20。
4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酸甲酯(XX1)
将嘧啶-2,4,5,6-四胺硫酸盐(6.00g，25.2mmol)、氯化钡二水合物(6.16g，25.2mmol)和水(145mL)的混合物在室温下搅拌90分钟。将混合物温热至70℃，过滤，并将滤液冷却至室温，并用10％NaOH(水溶液)将pH调节至pH 3.5。将该溶液的一部分(116mL)与MeCN(43.8mL)中的粗制4-(3-溴-4-氧代丁基)苯甲酸甲酯(6.06g，21.2mmol)(如下描述制备：Chen et al,J.Heterocycl.Chem.2015,52,1565-1569)混合，并随后使用室温水浴在搅拌下添加AcOH(34.7mL)。5分钟之后，添加MnO2(11.6g)并将混合物在室温下搅拌1小时45分钟。将反应物在
上过滤，并用MeCN/水(7:3)洗涤剩余物。浓缩滤液，并用水(125mL)洗涤。残留的水与MeCN共沸来除去。然后在热MeCN(125mL)下研磨剩余物两次，并随后用乙醚洗涤固体，并在真空下干燥，以得到作为褐色固体的XX1(1.31g，20％)。
对于C16H17N6O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为325.14，实测值为325.12。
4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酸(XX2)
将酯(XX1)(245mg，0.755mmol)悬浮于2-甲氧基乙醇(6mL)中，并在室温下添加0.5N NaOH(水溶液)(6mL)。将悬浮液搅拌24小时，并随后过滤。用2-甲氧基乙醇/水(1:1，1mL)洗涤剩余物，并随后用冰AcOH(0.325mL)将滤液酸化至pH 4.5。在4℃下储存16小时，过滤，并用水(2x3mL)洗涤固体，并在真空下干燥，以得到作为褐色固体的XX2(140mg，60％)。
对于C15H15N6O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为311.13，实测值为311.34。
(S)-5-(4-叠氮基苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XX4)
根据通用方案XXA，将酸XX2(235mg，0.757mmol)与胺XX3(243mg，0.833mmol)反应，并通过从MeOH中重结晶来纯化，以得到作为褐色固体的酯XX4(321mg，73％)。
对于C28H30N11O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为584.25，实测值为584.49。
(S)-5-(4-叠氮基苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XX5)
根据通用方案XXC用NaOH(3当量)进行酯XX4(36mg，0.062mmol)的水解，以得到作为黄色固体的酸XX5(27mg，75％)。
对于C27H28N11O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为570.23，实测值为570.54。
(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XX6)
根据通用方案XXB进行叠氮化物XX4(250mg，0.482mmol)的还原。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化，得到作为黄色固体的苯胺XX6(151mg，63％)。
对于C28H32N9O4w[M+H]+，MS(ESI+)计算值为558.26，实测值为558.51。
(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XX7)
根据通用方案XXC，用NaOH(3当量)进行酯XX6(151mg，0.271mmol)的水解，以得到作为黄色固体的酸XX7(112mg，75％)。
对于C27H30N9O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为544.24，实测值为544.52。
(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)(甲基)氨
基)-苯甲酰胺基)戊酸(XX12)的制备
4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)苯甲酸(XX9)
将(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲醇盐酸盐(8.80g，38.5mmol)溶解在热水(300mL)中。冷却至室温之后，添加NaOH水溶液(40mL，1.0M)，直到pH>7。过滤，用水(2×25mL)洗涤，并在室温下，在真空下干燥3小时。残留的水与乙醇(EtOH)共沸来除去。在热EtOH下研磨剩余物，冷却至室温之后，过滤，用EtOH(50mL)和乙醚(2×50mL)洗涤，并在真空下干燥，得到作为游离碱的(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲醇(6.41g)。在单独的烧瓶中，在50分钟内将溴(1.60mL，31.2mmol)滴加到PPh3(8.19g，31.2mmol)在二甲基乙酰胺(DMA；13.5mL)中的冷却(0℃)悬浮液中。添加速率使得内部温度不超过8℃。在室温下将黏稠浆料搅拌75分钟，以得到橙色浆料。添加固体游离碱(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲醇(2.00g，10.4mmol)，并将温度升至38℃。将混合物在室温下搅拌24小时，然后添加4-(甲基氨基)苯甲酸(2.36g，15.6mmol)，随后添加DIPEA(3.81mL，21.9mmol)。搅拌5天，并倒入NaOH水溶液(136mL，0.33M)中，使用DMA(4mL)，以完成转移。添加水(40mL)并过滤出沉淀。用在水中的10％AcOH(约25.0mL)将滤液酸化至pH 4.5。通过过滤收集沉淀，用水洗涤，在热MeOH(16mL)下研磨，过滤并将剩余物悬浮在二
烷中并冻干，以得到作为黄色固体的酸XX9(3.55g，定量)。
对于C15H16N7O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为326.14，实测值为326.38。
(S)-5-(4-叠氮基苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)苯甲酰胺基)-戊酸甲酯(XX10)
根据通用方案XXA，将酸XX9(250mg，0.768mmol)与胺XX3(323mg，1.11mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化，得到作为黄色固体的酯XX10(434mg，94％)。
对于C28H30N11O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为584.25，实测值为584.49。
(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)苯甲酰胺基)-戊酸甲酯(XX11)
根据通用方案XXB进行叠氮化物XX10(195mg，0.326mmol)的还原。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化，得到作为黄色固体的苯胺XX11(111mg，60％)。
对于C28H33N10O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为573.27，实测值为573.52。
(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XX12)
根据通用方案XXC进行酯XX11(111mg，0.194mmol)的水解，得到作为黄色固体的酸XX12(72mg，66％)。
对于C27H31N10O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为559.25，实测值为559.53。
(S)-2-氨基-5-(5-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)戊酸甲酯(XT6)的制备
5-氨基异吲哚啉-1,3-二酮(XT2)
将在水(25mL)中的NH4Cl(11.1g，208mmol)添加到化合物XT1(10.0g，52.0mmol)在四氢呋喃(THF；75mL)中的溶液中。然后小心地分批添加锌粉(13.6g，208mmol)(小心！放热反应)并将所得悬浮液搅拌1小时。将黄色反应混合物在
上过滤，并然后用甲醇(250mL)冲洗，并在真空中浓缩，以得到收获物(crop)1。将
饼悬浮在DMF(40mL)中并搅拌过夜，然后过滤并在真空中浓缩，以得到收获物2。将收获物1在水(50mL)中搅拌15分钟，过滤，并用乙醚洗涤饼并在空气中干燥过夜。将收获物2在乙醚(150mL)中搅拌过夜，过滤，并将固体在水(100mL)中搅拌15分钟。过滤后，用乙醚洗涤饼，并将固体在空气中干燥。将两个批次组合，以得到作为黄色固体的XT2(12g，定量)。
对于C8H7N2O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为163.05，实测值为163.06。
N-(1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)甲酰胺(XT3)
向装有FA(22.2mL，578mmol)的250mL圆底烧瓶中缓慢添加Ac2O(10.9mL，116mmol)，并将混合物搅拌10分钟。随后，添加磨碎的苯胺XT2(3.75g，23.1mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌15分钟。在真空中浓缩反应混合物，向粗制产物中添加水(25mL)，并将所得悬浮液搅拌15分钟。过滤后，将固体在空气中干燥过夜，以得到作为黄色固体的甲酰胺XT3(2.70g，14.2mmol)，61％)。
对于C9H7N2O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为191.05，实测值为191.13。
5-甲酰胺基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-羧酸乙酯(XT4)
向甲酰胺XT3(2.50g，13.2mmol)在DMF(25mL)中的冷却(0℃)溶液中添加Et3N(1.83mL，13.2mmol)，随后滴加在DMF(12.5mL)中的氯甲酸乙酯(1.25mL，13.2mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌1小时。添加在DMF(12.5mL)中的更多的Et3N(1.83mL，13.2mmol)和氯甲酸乙酯(1.25mL，13.2mmol)(对于后者，滴加)，并在0℃下搅拌30分钟。最后，添加在DMF(6mL)中的Et3N(0.92mL，6.6mmol)和氯甲酸乙酯(0.625mL，6.6mmol)，并在0℃下搅拌最后的30分钟。将反应混合物在真空中浓缩，并通过快速色谱(硅胶，EtOAc:DCM 0:1至1:0)纯化粗制产物，以得到作为黄色固体的甲酰胺XT4(1.4g，41％)。
对于C12H11N2O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为263.07，实测值为263.14。
(S)-2-氨基-5-(5-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)戊酸甲酯(XT6)
在室温下，向L-Orn-OH·HCl(0.835g，4.85mmol)和NaOH(0.388g，9.71mmol)在水(9mL)中的溶液中添加CuSO4·5H2O(0.606g，2.43mmol)在水(9mL)中的溶液，得到深蓝色溶液。向该溶液中添加NaHCO3(0.489g，5.82mmol)和磨碎的甲酰胺XT4(1.40g，5.34mmol)，并将淡蓝色悬浮液在室温下搅拌4小时。过滤混合物，并用水(2x2.5mL)、乙醇(2x2.5mL)和乙醚(2x2.5mL)洗涤固体，并风干过夜，以得到黄色/灰色铜盐(1.6g)。将该物质悬浮于甲醇(45mL)中，并冷却至-20℃。在45分钟时间内添加亚硫酰氯(4.21mL，57.7mmol)，同时保持温度低于0℃。升温至室温并搅拌18小时后，将反应混合物在真空中浓缩，并与甲苯(12mL)共蒸发。在MeOH(4mL)/EtOAc(3.6mL)/丙酮(3.6mL)的混合物下研磨粗制剩余物，过滤固体，用乙醚(20mL)洗涤，并在真空下干燥，以产生作为黄色固体的琥珀酰亚胺XT6(1.50g，87％)。
对于C14H18N3O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为292.13，实测值为292.17。
(S)-4-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺 基)丁基)氨甲酰基)-苯甲酸(XT9)和(S)-5-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶- 6-基)甲基)-氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT10)的制备
(S)-5-(5-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)-甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT8)
在室温下，向酸XT7(470mg，1.39mmol)(如在US2004/0072837中所述合成)和Et3N(2.32mL，16.6mmol)在DMF(10mL)中的悬浮液中添加氯甲酸异丁酯(0.182mL，1.385mmol)。将所得混合物搅拌1小时，然后添加琥珀酰亚胺XT6(499mg，1.52mmol)并搅拌1小时。添加更多的氯甲酸异丁酯(0.091mL，0.692mmol)，20分钟后添加琥珀酰亚胺XT6(250mg，0.762mmol)，并将混合物搅拌1小时。最后，添加更多的氯甲酸异丁酯(0.045mL，0.347mmol)，20分钟后添加琥珀酰亚胺XT6(125mg，0.381mmol)，并将混合物搅拌1小时。浓缩后，通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至20:80)纯化粗制产物。将产物悬浮于水(6mL)中，过滤，并用水(2mL)和Et2O(4mL)洗涤，以产生作为黄色固体的甲酰胺XT8(552mg，65％)。
对于C29H29N10O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为613.23，实测值为613.30。
(S)-4-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)-苯甲酸(XT9)和(S)-5-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)-氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT10)
根据通用方案XXC用NaOH(6当量)进行甲酰胺XT8(120mg，0.196mmol)的水解。将固体溶解在含有0.1％TFA的10％MeCN水溶液中，并通过制备型RP-HPLC纯化(水×0.1％TFA/MeCN×0.1％TFA，梯度5％至35％)。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并将水溶液冻干，以产生作为黄色固体的酸XT9(25mg，22％)和酸XT10(5mg，4％产率)。
对于C27H29N10O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为589.23，实测值为589.37。
对于C27H29N10O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为589.23，实测值为589.47。
2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-丁 基)氨甲酰基)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)- 3-甲基-丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XT16)和2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶- 6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XT17)的制备。
(S)-5-(5-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT11)
在0℃下，向琥珀酰亚胺XT8(170mg，0.278mmol)在吡啶(5mL)中的悬浮液中添加被分成六部分的(9H-芴-9-基)甲基(S)-(1-氯-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(Fmoc-Ala-Cl，320mg，0.971mmol)(根据Unsworth et al,Angew.Chem.Int.Ed.2015,52,15794-15798制备)。一旦MeOH淬灭样品的UPLC分析表明完全转化，就用MeOH(6mL)淬灭反应混合物并在真空中浓缩。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至20:80)纯化粗制产物，以产生作为黄色固体的酰胺XT11(298mg，定量)。
对于C47H44N11O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为906.33，实测值为906.40。
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT12)
向25mL圆底烧瓶中填充酰胺XT11(250mg，0.276mmol)和四丁基氟化铵三水合物(TBAF·3H2O)(178mg，0.552mmol)，并用N2彻底吹扫烧瓶(最少3真空/N2循环)。添加DMF(6mL)并且一旦所有固体溶解，就在室温下通过注射器将癸硫醇(0.608mL，2.76mmol)直接添加到溶液中，并将混合物搅拌90分钟。接下来，添加Boc-Val-OSu(130mg，0.414mmol)和DIPEA(0.096mL，0.552mmol)，并将所得混合物搅拌1.5小时。添加第二部分的Boc-Val-OSu(130mg，0.414mmol)，并将混合物搅拌另外的30分钟。随后在真空中浓缩反应混合物，并通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至20:80)纯化粗制产物，以得到被四丁基铵盐污染的二肽XT12。
对于C42H51N12O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为883.38，实测值为883.71。
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT13)
在0℃下，向不纯的二肽XT12(244mg，0.276mmol)在DCM(3mL)中的溶液中添加TFA(3mL)。将所得混合物搅拌15分钟，同时温热至室温。将反应混合物在真空中浓缩，并与DCM共蒸发，以产生作为橙色TFA盐的粗制脱保护胺XT13，其无需进一步分析即可直接使用。
对于C37H43N12O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为783.33，实测值为783.32。
4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT14)和5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT15)
根据通用方案XXC进行甲酰胺XT13(190mg，0.243mmol)的水解，但有以下修改：甲酰胺XT13首先与NaOH(12当量)在0℃反应1小时，并然后在添加第二部分的NaOH(12当量)后，在室温下反应6小时。用水(3mL)洗涤代替用MeOH洗涤固体。获得二酸XT14和XT15的混合物(约1:2比例)。任选地，这些可以通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度5％至35％)纯化，以得到作为黄色固体的二酸XT14(15mg，8％，3步)和XT15(30mg，16％，3步)。
对于C35H43N12O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为759.33，实测值为759.50。
对于C35H43N12O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为759.33，实测值为759.68。
2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XT16)和2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-丁基)氨甲酰基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基-丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XT17)
向二酸XT14和XT15在DMF(10mL)中的冷却(0℃)混合物(约1:2)(0.209g，0.276mmol)中添加6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.085g，0.276mmol)，然后添加DIPEA(0.289mL，1.66mmol)。将所得混合物在室温下搅拌3小时，并随后在真空中浓缩。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化粗制固体。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并且将水溶液冻干，以产生作为黄色固体的XT16和XT17的混合物(1:2)(65mg，25％，4步)。用同分异构地纯的XT14或XT15进行反应可以分别分离出纯的XT16或XT17。
对于C45H54N13O11 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为952.41，实测值为952.75。
对于C45H54N13O11 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为952.41，实测值为952.82。
(S)-4-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)-苯
甲酰胺基)丁基)-氨甲酰基)苯甲酸(XT20)和(S)-5-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨
基蝶啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT21)的制备
(S)-5-(5-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)(甲基)-氨基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT19)
在室温下向酸XX9(150mg，0.461mmol)和三乙胺(1.16mL，8.30mmol)在DMF(5mL)中的悬浮液中添加氯甲酸异丁酯(0.061mL，0.461mmol)，并将反应物搅拌1小时。添加胺XT6(166mg，0.507mmol)，并将反应物搅拌1小时。添加更多的氯甲酸异丁酯(0.030ml，0.230mmol)，并且在20分钟之后添加更多的胺XT6(83mg，0.254mmol)。添加第三份且为最后一部分的氯甲酸异丁酯(0.015mL，0.115mmol)，随后在20分钟后添加更多的XT6(42mg，0.127mmol)。尽管多次添加氯甲酸酯，反应仍停止在30％的转化率。在室温下30分钟内添加HATU(175mg，0.461mmol)，随后添加胺XT6(166mg，0.507mmol)。30分钟之后，在真空中浓缩反应混合物，并通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至25:75)纯化粗制产物，以产生作为黄色固体的苯胺XT19(294mg，定量)。
对于C29H31N10O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为599.25，实测值为599.29。
(S)-4-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)-氨甲酰基)苯甲酸(XT20)和(S)-5-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT21)
根据通用方案XXC用NaOH(12当量)进行酯XT19(276mg，0.461mmol)的水解，但有以下修改：在通过过滤收集固体时，仅用乙醚洗涤固体。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度5％至35％)纯化粗制物。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并且将水溶液冻干以产生作为黄色固体的二酸XT20(10mg，0.017mmol，4％)和XT21(76mg，0.126mmol，27％)。
对于C28H31N10O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为603.24，实测值为603.40。
对于C28H31N10O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为603.24，实测值为603.27。
(S)-4-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-
丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT24)和(S)-5-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-
基)乙基)苯甲酰胺基)丁基)-氨甲酰基)苯甲酸(XT25)的制备
(S)-5-(5-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-戊酸甲酯(XT23)
根据通用方案XXA，将酸XX2(140mg，0.451mmol)与胺XT6(222mg，0.677mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化，以得到作为黄色固体的酯XT23(263mg，定量)。
对于C29H30N9O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为584.24，实测值为584.24。
(S)-4-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT24)和(S)-5-氨基-2-((4-羧基-4-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)丁基)-氨甲酰基)苯甲酸(XT25)
根据通用方案XXC用NaOH(3当量)进行酯XT23(263mg，0.451mmol)的水解，但有以下修改：在通过过滤收集固体时，仅使用乙醚洗涤固体。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度5％至35％)纯化粗制物。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并且将水溶液冻干以产生作为无色固体的二酸XT24(7mg，0.012mmol，3％)和XT25(93mg，0.158mmol，35％)。
对于C28H30N9O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为588.23，实测值为588.46。
对于C28H30N9O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为588.23，实测值为588.48。
(S)-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)-苯甲酰胺基)丁
基)氨甲酰基)-4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)苯甲酸(XT31)和
(S)-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰
基)-5-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)苯甲酸(XT32)的制备
(S)-5-(5-(6-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)己酰胺基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT27)
在0℃下，向苯胺XT8(100mg，0.163mmol)在吡啶(3mL)中的悬浮液中逐份(每份30mg)添加酰基氯XT26(182mg，0.490mmol)(根据Unsworth et al,Angew.Chem.Int.Ed.2015,52,15794-15798制备)，并且通过UPLC-MS间歇地检查转化。一旦完成，就用MeOH(2mL)淬灭反应并在真空中浓缩。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM0:1至1:4)纯化，得到与痕量吡啶一起的酰胺XT27(160mg，定量)。
对于C50H50N11O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为948.38，实测值为948.45。
(S)-4-(6-氨基己酰胺基)-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT28)和(S)-5-(6-氨基己酰胺基)-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT29)
根据通用方案XXC用NaOH(12当量)进行酯XT27(145mg，0.153mmol)的水解，但有以下修改：在通过过滤收集固体时，仅使用乙醚洗涤固体。由此获得的二酸XT28和XT29的粗制混合物(80mg，75％，比例1:2)不经任何进一步纯化就继续使用。
对于C33H40N11O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为702.31，实测值为702.56。
(S)-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)-4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)苯甲酸(XT31)和(S)-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)-5-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)苯甲酸(XT32)
在室温下，向二酸XT28和XT29(60mg，0.086mmol，1:2比例)在DMF(3mL)中的悬浮液中添加Na2CO3水溶液(260μl，1M)，然后添加N-甲氧基羰基马来酰亚胺XT30(13.3mg，0.086mmol)。以20分钟的间隔将更多的Na2CO3水溶液(0.170mL，1M)添加3次，然后最后添加Na2CO3水溶液(0.085mL，1M)。2小时后，将反应混合物冷却至0℃，用水性AcOH(2.06mL，1M)淬灭，并将所得悬浮液在真空中浓缩。通过制备型RP-HPLC(水×0.1％TFA/MeCN×0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化粗制固体。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并且将水溶液冻干，以产生比例为1:2、作为黄色固体的酰胺XT31和XT32的混合物(15mg，22％)。
对于C37H40N11O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为782.30，实测值为782.52。
(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰
胺基)戊酸(XT35)的制备
(S)-5-(4-叠氮基苯甲酰胺基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-戊酸甲酯(XT33)
根据通用方案XXA，将酸XT7(150mg，0.442mmol)与胺XX3(142mg，0.486mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化，得到作为黄色固体的酯XT33(270mg，定量)。
对于C28H29N12O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为613.24，实测值为613.50。
(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-戊酸甲酯(XT34)
根据通用方案XXB进行叠氮化物XX33(270mg，0.441mmol)的还原。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化，得到作为黄灰色固体的苯胺XT34(190mg，0.324mmol，74％产率)。
对于C28H31N10O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为587.25，实测值为587.55。
(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XT35)
根据通用方案XXC用NaOH(6当量)进行酯XT34(190mg，0.324mmol)的水解，但有以下修改：过滤和洗涤固体后，将该物质溶解在2％的水性氨溶液中并冻干以产生作为黄橙色固体的XT35(143mg，0.26mmol，81％)。
对于C26H29N10O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为545.24，实测值为545.23。
2-(((S)-4-羧基-4-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲
酰基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁
酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XT41)的制备。
(S)-5-(5-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT36)
根据XT11的方案，将苯胺XT23(280mg，0.480mmol)与Fmoc-Ala-Cl(396mg，1.20mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM0:1至1:4)纯化，得到作为黄色固体的酰胺XT36(350mg，83％)。
对于C47H45N10O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为877.34，实测值为877.44。
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT37)
根据XT12的方案，用TBAF·3H2O和癸硫醇对Fmoc保护的胺XT36(350mg，0.399mmol)脱保护，并随后与Boc-Val-OSu和DIPEA反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化，得到被四丁胺盐污染的二肽XT37(定量)。
对于C42H52N11O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为854.39，实测值为854.49。
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT38)
根据XT13的方案将二肽XT37(340mg，0.400mmol)脱保护。浓缩后，将TFA盐XT38直接用于下一步。
对于C27H44N11O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为754.34，实测值为754.47。
5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(((S)-4-羧基-4-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT40)
根据通用方案XXC进行甲酰胺XT38(300mg，0.400mmol)的水解，但有以下修改。将甲酰胺XT38首先与NaOH(12当量)在0℃下反应1小时，并然后在添加第二部分的NaOH(12当量)后，在室温下反应6小时。用水(3mL)洗涤代替用MeOH洗涤固体。以适度的选择性进行邻苯二甲酰亚胺的开环，这有利于期望的区域异构体XT40(比例约为1:2)。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度5％至25％)纯化该物质，以得到作为白色固体的XT40(50mg，16％，3步)。
对于C36H44N11O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为758.34，实测值为758.61。
2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基-丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XT41)
根据XT17的方案，将胺XT40(45mg，0.059mmol)与6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(28mg，0.089mmol)和DIPEA(0.062mL，0.36mmol)反应。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化，得到作为白色固体的XT41(30mg，53％)。
对于C45H55N13O11 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为951.41，实测值为951.91。
(S)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-
(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酰
胺基)戊酸(XT46)的制备
(S)-5-(4-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT42)
根据XT11的方案，将苯胺XX6(150mg，0.269mmol)与Fmoc-Ala-Cl(310mg，0.942mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化，得到作为灰白色固体的酰胺XT42(180mg，79％)。
对于C46H47N10O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为851.36，实测值为851.82。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT43)
向XT42(180mg，0.212mmol)在DMF(4mL)中的溶液中添加哌啶(0.419mL，4.23mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌15分钟。将反应混合物浓缩并与甲苯共蒸发。添加乙醚(50mL)并将所得悬浮液在室温下搅拌10分钟。过滤后，收集固体，并将粗制胺溶于DMF(4mL)中。接下来，添加Boc-Val-OSu(100mg，0.317mmol)和DIPEA(0.074mL，0.42mmol)，并将所得混合物搅拌4小时。随后浓缩反应混合物，并通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化粗制产物，以得到二肽XT43(170mg，97％)。
对于C41H54N11O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为828.42，实测值为828.81。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT44)
根据XT13的方案将二肽XT43(340mg，0.400mmol)脱保护。浓缩后，TFA盐XT44直接用于下一步。
对于C36H46N11O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为728.36，实测值为728.66。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XT45)
根据通用方案XXC用NaOH(12当量)进行酯XT44(145mg，0.153mmol)的水解，但有以下修改：用水性AcOH(1M)处理后产物没有固化，并因此在MeOH蒸发之后将所得溶液冻干。将所得饼与DMF(5mL)一起搅拌并过滤，将获得的包含XT45的DMF溶液直接用于下一步。
对于C35H44N11O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为714.35，实测值为714.71。
(S)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸(XT46)
根据XT17的方案，将胺XT45与6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(49mg，0.16mmol)和DIPEA(0.168mL，0.960mmol)反应。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化，得到作为白色固体的XT46(67mg，46％，3步)。
对于C45H55N12O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为907.42，实测值为907.84。
(S)-5-氨基-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)-苯甲酰胺基)戊
酸甲酯盐酸盐(XT48)的制备
(S)-5-((叔-丁氧基羰基)氨基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)-苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT47)
根据通用方案XXA，将酸XT7(1.30g，3.83mmol)与H-Orn(Boc)-OMe(1.30g，4.60mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化，得到作为橙色/红色固体泡沫的酯XT47(1.80g，83％)。
对于C26H34N9O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为568.26，实测值为568.56。
(S)-5-氨基-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯盐酸盐(XT48)
将酯XT47(1.60g，2.82mmol)在二
烷(16mL)中加热直至溶解。冷却至室温后，然后在剧烈搅拌下，将溶液滴加到二
烷中的HCl(4M，30mL)中。将所得黄色悬浮液搅拌2小时。然后过滤反应混合物，并用乙醚(50mL)洗涤剩余物，将其溶于水(30mL)中并冻干，以产生作为黄色固体的XT48(1.42g，100％)。
对于C21H26N9O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为468.21，实测值为468.52。
5-((S)-5-苄基-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,7,10,13-四氧代-
3,6,9,12-四氮杂十八酰胺基)-2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨
基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT54)的制备
(2,2,2-三氟乙酰基)甘氨酸酰氯(XT49)
向Et3N(6.96mL，50.0mmol)和甘氨酸(2.50g，33.3mmol)在MeOH(33mL)中的溶液中添加三氟乙酸乙酯(5.17mL，43.3mmol)。将所得混合物在室温下搅拌18小时。将溶液浓缩，并将剩余物溶于EtOAc(75mL)中，用HCl水溶液(1M，150mL)洗涤有机溶液，用EtOAc(2x75mL)反萃取水溶液层。用盐水(50mL)洗涤合并的有机萃取物，在MgSO4上干燥，过滤，并将滤液浓缩，以产生作为白色固体的(2,2,2-三氟乙酰基)甘氨酸(5.3g，93％)。将一部分产物(1.00g，5.85mmol)悬浮在DCM(30mL)中，冷却至0℃并逐滴添加草酰氯(1.54mL，17.54mmol)，然后滴加2滴DMF。将所得混合物在室温下搅拌1小时，随后浓缩并与甲苯(2x)共蒸发，以产生XT49(定量)。用MeOH淬灭产物，得到相应的甲酯。
对于C5H7F3NO3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为186.04，实测值为186.36。
(S)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-5-(1,3-二氧代-5-(2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)乙酰胺基)异吲哚啉-2-基)戊酸甲酯(XT50)
将XT8(90.0mg，0.147mmol)在吡啶(2.5mL)中的悬浮液冷却至0℃，并在1小时时间内分6部份添加XT49(167mg，0.88mmol)。一旦UPLC-MS显示完全转化，用MeOH(3mL)淬灭反应并在真空中浓缩。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化粗制剩余物，得到作为黄色固体的XT50(118mg，定量)。
对于C33H31F3N11O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为766.23，实测值为766.61。
(S)-5-(2-氨基乙酰胺基)-2-((4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT52)
根据通用方案XXC进行甲酰胺XT50(107mg，0.14mmol)的水解，但有以下修改。甲酰胺XT50首先在0℃下与NaOH(12当量)反应1小时，并然后在添加第二部分的NaOH(12当量)之后在室温下反应3小时。用水(3mL)洗涤代替用MeOH洗涤固体。以适度的选择性进行邻苯二甲酰亚胺的开环，这有利于期望的区域异构体XT52(比例约为1:2)。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度5％至35％)纯化粗制物，得到作为黄色固体的二酸XT52(36mg，40％，2步)。
对于C29H32N11O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为646.25，实测值为646.67。
5-((S)-5-苄基-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,7,10,13-四氧代-3,6,9,12-四氮杂十八酰胺基)-2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯甲酸(XT54)
向三肽XT53(按照EP 2907824中所述合成)(105mg，0.22mmol)在THF(4mL)中的悬浮液中添加N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC；46mg，0.22mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(26mg，0.22mmol)，并将所得悬浮液搅拌18小时。将所得悬浮液过滤，并将一部分滤液(1.0mL)添加到二酸XT52(32mg，0.05mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中。添加DIPEA(0.052mL，0.30mmol)，并将所得溶液在室温下搅拌30分钟。浓缩之后，通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化粗制固体。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并将水溶液冻干，以产生作为黄色固体的XT54(22mg，40％)。
对于C52H58N15O13 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为1100.43，实测值为1100.85。
2-(((S)-5-羧基-5-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-戊
基)氨基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲
基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XT63)的制备
(S)-2-((5-(((苄氧基)羰基)氨基)-6-甲氧基-6-氧代己基)氨基)-5-硝基苯甲酸甲酯(XT57)
将XT55(1.42g，7.13mmol)、XT56(2.0g，7.13mmol)和K2CO3(1.48g，10.7mmol)在MeCN(15mL)中的悬浮液在密封管中加热至90℃，持续2小时。在室温下添加浓HCl(0.89mL，11mmol)，并浓缩粗制反应混合物。接下来，将羧酸中间体溶于冷却至0℃的MeOH(100mL)中，并添加亚硫酰氯(5.8mL，79mmol)。将所得溶液在0℃下搅拌1小时，并然后在1小时内逐渐温热至室温。一旦完成，在Celite上过滤反应混合物，并在真空中浓缩滤液。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:9)纯化粗制产物，以得到作为黄色泡沫的苯胺XT57(2.8g，83％)。
对于C23H28N3O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为474.19，实测值为474.31。
(S)-2-((5-氨基-6-甲氧基-6-氧代己基)氨基)-5-硝基苯甲酸甲酯氢溴酸盐(XT58)
使XT57(750mg，1.58mmol)在DCM(8mL)中的溶液冷却至0℃。添加在AcOH中的冰冷的HBr(33％，10mL)，并将所得溶液在0℃下搅拌2小时。随后将反应混合物在真空中浓缩，并与甲苯共蒸发，以得到作为黄色固体的胺XT58(660mg，99％)。
对于C15H22N3O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为340.15，实测值为340.44。
(S)-2-((5-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-6-甲氧基-6-氧代己基)氨基)-5-硝基苯甲酸甲酯(XT59)
根据通用方案XXA，将胺XT58(310mg，0.74mmol)与酸XT7(150mg，0.74mmol)反应。将产物在MeOH(8mL)中重结晶，以产生作为橙色固体的XT59(390mg，80％)。
对于C30H33N10O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为661.25，实测值为661.65。
(S)-5-氨基-2-((5-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-6-甲氧基-6-氧代己基)氨基)苯甲酸甲酯(XT60)
向XT59(150mg，0.23mmol)在DMF(1.5mL)中的溶液中添加饱和NH4Cl水溶液(0.375mL)和锌粉(445mg，6.81mmol)。将所得悬浮液在室温下搅拌2小时。接下来，用DMF(4mL)稀释反应混合物，并在Celite上过滤。在室温下将滤液在空气下搅拌18小时。搅拌16小时之后，浓缩反应混合物，并将粗制产物悬浮在MeOH(6mL)中，过滤，并用乙醚(4mL)洗涤剩余物，以得到作为灰色固体的苯胺XT60(145mg，定量)。
对于C30H35N10O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为631.27，实测值为631.15。
5-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(((S)-5-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-6-甲氧基-6-氧代己基)氨基)苯甲酸甲酯(XT61)
根据通用方案XXA，将苯胺XT60(140mg，0.22mmol)与Fmoc-Ala-OH(70mg，0.22mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM0:1至1:3)纯化产物，以产生所得的酰胺(60mg，82％)。根据XT43的方案将一部分产物(40mg，0.04mmol)用哌啶脱保护，并使其与Boc-Val-OSu反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化产物，以得到作为黄色固体的XT61(30mg，77％)。
对于C43H57N12O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为901.43，实测值为901.54。
5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(((S)-5-羧基-5-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊基)氨基)苯甲酸(XT62)
将氨基甲酸酯XT61(15mg，0.02mmol)悬浮在DCM(1.5mL)中，冷却至0℃并添加TFA(1.5mL)。将所得混合物在0℃下搅拌15分钟，并然后浓缩并与DCM共蒸发。随后根据通用方案XXC，用NaOH(24当量)水解粗制物，但有以下修改。用1M AcOH处理后，产物不容易沉淀。通过在真空中蒸发除去甲醇，并将水溶液冻干。用DMF(5mL)搅拌所得饼，过滤，并将所得包含XT62的DMF溶液直接用于下一步。
对于C35H45N12O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为745.35，实测值为745.52。
2-(((S)-5-羧基-5-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊基)氨基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XT63)
根据XT17的方案，将胺XT62(25mg，0.034mmol)与6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(10mg，0.034mmol)和DIPEA(0.06mL，0.34mmol)反应。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至30％)纯化，得到作为黄色固体的XT63(8mg，25％)。
对于C45H56N13O18 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为938.43，实测值为938.70。
5-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁
基)-氨基)-2-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲
基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XT723)的制备
(S)-5-((4-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊基)氨基)-2-硝基苯甲酸甲酯(XT66)
根据XT57的方案，将XT64(1.50g，7.51mmol)与XT65(2.00g，7.51mmol)反应。将第一步反应时间延长至7天。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:9)纯化，得到作为黄色/橙色油状物的XT66(2.00g，58％)。
对于C22H26N3O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为460.17，实测值为460.33。
(S)-5-((4-(((苄氧基)羰基)(叔-丁氧基羰基)氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊基)(叔-丁氧基羰基)氨基)-2-硝基苯甲酸甲酯(XT67)
向苯胺XT66(2.00g，4.35mmol)在THF(25mL)中的溶液中添加Boc2O(3.03mL，13.06mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP；53mg，0.44mmol)。将所得混合物在室温下搅拌18小时。随后浓缩反应混合物，并通过快速色谱(硅胶，EtOAc:DCM 0:1至1:3)纯化粗制产物，以得到作为黄色油状物的双-Boc保护产物XT67(1.90g，66％)。
对于C22H26N3O8 +[M-2xBoc+H]+，MS(ESI+)计算值为460.17，实测值为460.30。
(S)-2-氨基-5-((4-(((苄氧基)羰基)(叔-丁氧基羰基)氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊基)(叔-丁氧基羰基)氨基)苯甲酸甲酯(XT68)
根据XT60的方案，将化合物XT67(1.70g，2.58mmol)与锌粉(2.50g，38.7mmol)反应，但有以下修改：通过快速色谱(硅胶，EtOAc:DCM 0:1至1:1)纯化粗制产物，以得到作为橙色泡沫的苯胺XT68(1.5g，92％)。
对于C32H44N3O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为630.30，实测值为630.40。
2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-5-(((S)-4-(((苄氧基)羰基)(叔-丁氧基羰基)氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊基)(叔-丁氧基-羰基)氨基)苯甲酸甲酯(XT69)
根据XT11的方案，将苯胺XT68(1.43g，2.27mmol)与Fmoc-Ala-Cl(824mg，2.50mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，EtOAc:DCM0:1至1:3)纯化，以得到作为黄色泡沫的酰胺XT69(2.1g，定量)。
对于C50H59N4O13 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为923.41，实测值为923.39。
2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-5-(((S)-4-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊基)氨基)苯甲酸甲酯(XT70)
向双-Boc保护的XT69(2.10g，2.28mmol)在二
烷(2mL)中的溶液中添加二
烷中的HCl(4M，12mL)，并将所得混合物在室温下搅拌1小时。浓缩反应混合物，并通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM0:1至1:9)纯化粗制产物，以得到作为黄色泡沫的苯胺XT70(1.45g，88％)。
对于C40H43N4O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为723.30，实测值为723.51。
5-(((S)-4-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊基)氨基)-2-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸甲酯(XT71)
根据XT43的方案用哌啶对Fmoc保护的胺XT70(1.45g，2.00mmol)脱保护，并然后使其与Boc-Val-OSu反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化，得到作为黄色固体的二肽XT71(600mg，43％)。
对于C35H50N5O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为700.36，实测值为700.56。
5-(((S)-4-氨基-5-甲氧基-5-氧代戊基)氨基)-2-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸甲酯(XT72)
在N2气氛下，将化合物XT71(600mg，0.86mmol)溶于DMF(8.5mL)中。添加Pd/C(91mg，10mol％，在活性炭上)，并将所得黑色悬浮液在氢气氛下于室温下剧烈搅拌90分钟。用N2吹扫烧瓶，并在Celite上过滤反应混合物。浓缩滤液，以得到作为深绿色固体的XT71(定量)。
对于C27H44N5O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为566.32，实测值为566.43。
2-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-5-(((S)-4-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-5-甲氧基-5-氧代戊基)氨基)苯甲酸甲酯(XT721)
根据通用方案XXA，将胺XT72(167mg，0.295mmol)与酸XT7(100mg，0.295mmol)反应。从MeOH(5mL)中重结晶产物，以得到作为橙色固体的XT721(216mg，83％)。
对于C42H55N12O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为887.42，实测值为887.90。
2-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-5-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨基)苯甲酸(XT722)
向酯XT721(210mg，0.24mmol)在THF(1.5mL)中的溶液中添加LiOH(28mg，1.2mmol)在水(1.5mL)中的溶液。将所得混合物搅拌72小时，并在-78℃下储存过夜。完成后，用水性AcOH(1.0M，2.5mL)将反应混合物酸化，并将所得悬浮液在室温下搅拌60分钟。过滤混合物，并用水(10mL)、MeOH(4mL)和乙醚(10mL)洗涤剩余物。将所得固体在空气中干燥过夜，以得到黄色固体(150mg)。接下来，将该物质悬浮在DCM(3mL)中，冷却至0℃并添加TFA(3mL)。将所得溶液搅拌15分钟，同时温热至室温。浓缩反应混合物并与DCM共蒸发，以得到TFA盐XT722(定量)，其直接用于下一个反应。
对于C34H43N12O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为731.34，实测值为731.52。
5-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨基)-2-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基-丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XT723)
根据XT17的方案，将胺XT722(132mg，0.18mmol)与6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(56mg，0.18mmol)和DIPEA(0.314mL，1.80mmol)反应。通过在MeOH中研磨、然后进行过滤和制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化剩余物以得到作为黄色固体的XT723(72mg，43％，3步)。
对于C44H54N13O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为924.41，实测值为924.45。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-((4-((S)-2-
((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)
丙酰胺基)苯基)氨基)戊酸(XT80)的制备
(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-((4-硝基苯基)氨基)戊酸甲酯(XT74)
将XT73(795mg，5.63mmol)、XT65(500mg，1.88mmol)、NaOH(75mg，1.88mmol)和NaHCO3(473mg，5.63mmol)在水(10mL)/EtOH(6mL)中的混合物在密封管中加热至90℃，持续5天。冷却至室温后，用水(20mL)稀释反应混合物，并用乙醚(40mL)洗涤。然后用6M HCl将水溶液酸化至pH约为3，并将所得混合物用DCM中的5％MeOH(2x75mL)萃取。用水洗涤合并的有机萃取物，在Na2SO4上干燥，过滤并浓缩，以产生作为黄色泡沫的中间体羧酸(610mg，84％)。将该物质悬浮在MeOH(50mL)中，冷却至0℃，并逐滴添加亚硫酰氯(1.26mL，17.3mmol)。将所得混合物在0℃搅拌45分钟，并然后使其在1小时内达到RT。完成后，浓缩反应混合物，并通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:9)纯化粗制产物，得到作为黄色泡沫的酯XT74(670mg，定量)。
对于C20H24N3O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为402.17，实测值为402.33。
(S)-2-氨基-5-((4-硝基苯基)氨基)戊酸甲酯氢溴酸盐(XT75)
根据XT58的方案，对酯XT74(480mg，1.20mmol)进行脱保护。随后浓缩反应混合物，并与甲苯共蒸发。将剩余物溶于水中并冻干，以得到黏性胶质。在乙醚中搅拌该物质，直至得到悬浮液，然后过滤。将剩余物与MeOH共蒸发，以得到作为黄色泡沫的胺XT75(550mg定量)。
对于C12H18N3O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为268.13，实测值为268.27。
(S)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-5-((4-硝基苯基)-氨基)戊酸甲酯(XT76)
根据通用方案XXA，将胺XT75(250mg，0.718mmol)与酸XT7(244mg，0.718mmol)反应。从MeOH(8mL)中重结晶产物，以产生作为橙色固体的XT76(310mg，73％)。
对于C27H29N10O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为589.23，实测值为589.59。
(S)-5-((4-氨基苯基)氨基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)-苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT77)
根据XT60的方案，使用锌粉(1133mg，17.3mmol)还原硝基苯胺XT76(340mg，0.578mmol)，以产生作为灰色固体的苯胺XT77(305mg，95％)。
对于C27H31N10O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为559.25，实测值为559.14。
(S)-5-((4-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-苯基)氨基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT78)
根据通用方案XXA，将苯胺XT77(300mg，0.54mmol)与Boc-ValAla-OH(170mg，0.59mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化，得到作为黄色固体的XT78(240mg，54％)。
对于C40H53N12O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为829.41，实测值为829.58。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯基)氨基)戊酸(XT80)
将氨基甲酸酯XT78(240mg，0.29mmol)悬浮在DCM(3mL)中，冷却至0℃并添加TFA(3mL)。将所得混合物在0℃下搅拌15分钟，并然后浓缩并与DCM共蒸发。根据通用方案XXC用NaOH(36当量)进行中间体酯的水解，但有以下修改：用1M AcOH处理后，产物未充分固化，并因此在MeOH蒸发后将所得溶液冻干。用DMF(4mL)搅拌所得饼并过滤。根据XT17的方案，然后将包含脱保护产物的滤液与6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(31mg，0.100mmol)和DIPEA(0.105mL，0.600mmol)反应。在MeOH下研磨粗制物，并在过滤后通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化固体，以得到作为黄色固体的XT80(37mg，15％，3步)。
对于C43H54N13O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为880.42，实测值为880.52。
2-(((S)-5-羧基-5-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-戊
基)氨基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲
基丁酰胺基)丙酰胺基)烟酸(XT89)的制备
(S)-2-((5-(((苄氧基)羰基)氨基)-6-甲氧基-6-氧代己基)氨基)-5-硝基烟酸甲酯(XT83)
根据XT57的方案，将胺XT82(500mg，1.78mmol)与XT81(386mg，1.78mmol)反应。从MeOH(8mL)中重结晶产物，以产生作为黄色固体的XT83(370mg，44％)。
对于C22H27N4O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为475.18，实测值为475.34。
(S)-2-((5-氨基-6-甲氧基-6-氧代己基)氨基)-5-硝基烟酸甲酯氢溴酸盐(XT84)
根据XT58的方案将Cbz保护的胺XT83(370mg，0.78mmol)脱保护。将产物溶于水中，并然后冻干。将剩余物悬浮在乙醚中，并然后过滤，得到作为黄色固体的XT84(定量)。
对于C14H21N4O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为341.15，实测值为341.22。
(S)-2-((5-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-6-甲氧基-6-氧代己基)氨基)-5-硝基烟酸甲酯(XT85)
根据通用方案XXA，将胺XT84(360mg，0.86mmol)与酸XT7(264mg，0.78mmol)反应。从MeOH(5mL)中重结晶产物，以产生作为橙色固体的XT85(280mg，55％)。
对于C29H32N11O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为662.24，实测值为662.44。
(S)-5-氨基-2-((5-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-6-甲氧基-6-氧代己基)氨基)烟酸甲酯(XT86)
根据XT60方案，使用锌粉(830mg，12.7mmol)还原化合物XT85(280mg，0.42mmol)，以产生作为灰色固体的苯胺XT86(240mg，90％)。
对于C29H34N11O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为632.27，实测值为632.42。
5-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(((S)-5-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-6-甲氧基-6-氧代己基)氨基)烟酸甲酯(XT87)
根据通用方案XXA，将苯胺XT86(120mg，0.19mmol)与Boc-ValAla-OH(60mg，0.21mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化，得到作为黄色固体的XT87(100mg，58％)。
对于C42H56N13O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为902.43，实测值为902.49。
2-(((S)-5-羧基-5-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊基)氨基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)烟酸(XT89)
将氨基甲酸酯XT87(100mg，0.11mmol)悬浮在DCM(3mL)中，冷却至0℃并添加TFA(3mL)。将所得混合物在0℃下搅拌15分钟，并然后浓缩并与DCM共蒸发。根据通用方案XXC用NaOH(18当量)进行中间体酯的水解。用DMF(3mL)搅拌剩余的饼并过滤。根据方案XT17，用6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(31mg，0.10mmol)和DIPEA(0.105mL，0.600mmol)处理滤液。浓缩混合物并通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至30％)纯化，以得到作为黄色固体的XT89(12mg，13％，3步)。
对于C44H55N14O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为939.42，实测值为939.37。
(S)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-
(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-
(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)戊酸(XT94)的制备
(S)-5-(4-氨基-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT90)
根据通用方案XXA，将DMF(1mL)中的粗制四唑XX21(55mg，0.271mmol)与胺XX29(150mg，0.271mmol)反应。将产物从MeOH(5mL)中重结晶，并用乙醚(5mL)洗涤，以产生作为橙色固体的XT90(定量)。
对于C29H32N13O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为626.27，实测值为626.38。
(S)-5-(4-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT91)
根据通用方案XXA，将苯胺XT90(150mg，0.240mmol)与Fmoc-Ala-OH(112mg，0.360mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM x 1％Et3N 0:1至1:1)纯化粗制产物。将分离的产物溶于MeOH中，并用乙醚沉淀。将所得悬浮液过滤，并用乙醚洗涤固体，并在空气中干燥过夜，以产生作为黄色固体的酰胺XT91(75mg，34％)。
对于C47H47N14O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为919.37，实测值为919.79。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT92)
根据XT43的方案用哌啶(0.16mL，1.6mmol)将Fmoc保护的胺XT91(75mg，0.08mmol)脱保护，并随后与Boc-Val-OSu(34mg，0.11mmol)反应。通过用乙醚从极少量的甲醇中沉淀来纯化，然后过滤并在空气中干燥剩余物，得到作为黄色固体的二肽XT92(75mg，78％)。
对于C42H54N15O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为896.43，实测值为896.54。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XT93)
向酯XT92(75mg，0.084mmol)在THF(1mL)中的溶液中添加在水(1mL)中的LiOH(10mg，0.419mmol)。将所得溶液在室温下搅拌1小时，冷却至0℃，并用AcOH(0.05mL，0.84mmol)处理。搅拌5分钟之后，浓缩悬浮液并与甲苯共蒸发。将剩余物悬浮在DCM(1mL)中，冷却至0℃并添加TFA(1mL)。将所得溶液搅拌60分钟，同时逐渐温热至室温。将反应混合物与DCM共蒸发，以得到粗制胺XT93(定量)。
对于C36H44N15O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为782.36，实测值为782.73。
(S)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)戊酸(XT94)
根据方案XT17，将粗制胺XT93(62.5mg)与6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(25mg，0.080mmol)和DIPEA(0.140mL，0.800mmol)反应。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至30％)纯化，得到作为白色固体的XT94(22mg，28％，3步)。
对于C46H55B16O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为975.43，实测值为976.02。
(S)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-5-(5-((S)-2-((S)-2-
(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)噻吩-
2-羧酰胺基)戊酸(XT97)的制备
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)噻吩-2-羧酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT95)
根据通用方案XXA，将胺XX29(334mg，0.61mmol)与酸XR23(250mg，0.61mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化产物，以产生作为黄色固体的XT95(定量)。
对于C39H52N11O8S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为834.37，实测值为834.53。
(S)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-5-(5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)噻吩-2-甲酰胺基)戊酸(XT97)
根据XT93的方案，进行酯XT95的水解和脱保护。根据XT17的方案，将粗制胺与6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(92mg，0.3mmol)和DIPEA(388mg，3.00mmol)反应。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至30％)纯化，得到作为白色固体的XT97(43mg，16％，3步)。
对于C43H53N12O9S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为913.38，实测值为913.83。
(2S,2'S)-5,5'-((5,5'-(((14S,14'S,17S,17'S)-1,1'-(((((S)-2-(6-(2,5-二
氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)戊二醇基)双(氮烷二基))双(亚甲基))双(1H-1,
2,3-三唑-4,1-二基))双(14-异丙基-17-甲基-12,15-二氧代-3,6,9-三氧杂-13,16-二氮
杂十八烷-18-酰基))双(氮烷二基))双(噻吩-5,2-二基-2-羰基))双(氮烷二基))双(2-(4-
(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸)(XT100)的制备
(S)-5-(5-((14S,17S)-1-叠氮基-14-异丙基-17-甲基-12,15-二氧代-3,6,9-三氧杂-13,16-二氮杂十八烷-18-酰胺基)噻吩-2-羧酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT98)
将二肽XT95(250mg，0.30mmol)溶于DCM(1mL)中，冷却至0℃，并添加TFA(1mL)。将所得溶液搅拌15分钟，同时逐渐升温至室温。然后用DCM稀释反应混合物，浓缩并与DCM共蒸发。将剩余物悬浮在乙醚(4mL)中，过滤，用乙醚洗涤，并在空气中干燥，以得到作为TFA盐的中间体胺。接下来，将胺溶于DMF中，并添加3-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(74mg，0.30mmol)，将混合物冷却至0℃，然后添加HATU(137mg，0.36mmol)和DIPEA(0.31mL，1.80mmol)。将所得混合物在室温下搅拌1小时。随后浓缩反应混合物，并通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化粗制产物，以得到作为黄色玻璃的叠氮化物XT98(定量)。
对于C43H59N14O10S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为963.43，实测值为963.56。(S)-5-(5-((14S,17S)-1-叠氮基-14-异丙基-17-甲基-12,15-二氧代-3,6,9-三氧杂-13,16-二氮杂十八烷-18-酰胺基)噻吩-2-羧酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XT99)
根据XT93的方案，用LiOH水解酯XT98(290mg，0.30mmol)。(省略了用TFA进行的Boc-脱保护步骤。)通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至30％)纯化，得到作为白色固体的XT99(27mg，9％)。
对于C42H57N14O10S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为949.41，实测值为949.88。
(2S,2'S)-5,5'-((5,5'-(((14S,14'S,17S,17'S)-1,1'-(((((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)戊二醇基)双(氮烷二基))双(亚甲基))双(1H-1,2,3-三唑-4,1-二基))双(14-异丙基-17-甲基-12,15-二氧代-3,6,9-三氧杂-13,16-二氮杂十八烷-18-酰基))双(氮烷二基))双(噻吩-5,2-二基-2-羰基))双(氮烷二基))双(2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸)(XT100)
用N2吹扫XT99(22mg，0.019mmol)和XS2(3.1mg，7.5μmol)在DMF(2.5mL)中的溶液5分钟。然后顺序地添加在水(60μl)中的Cu(II)SO4(1.44mg，5.8μmol)和在水(60μl)中的抗坏血酸钠(2.22mg，0.011mmol)。将所得混合物在室温下搅拌24小时。浓缩反应混合物，通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至30％)纯化粗制产物，得到XT100(12.1mg，70％)。
对于C105H140N32O25S2 2+[M+2H]2+，MS(ESI+)计算值为1156.5，实测值为1157.10。
(S)-5-氨基-2-(N-(4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰
胺基)-丁基)-氨磺酰)苯甲酸(XT101)的制备
(S)-2-(N-(4-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-5-甲氧基-5-氧代戊基)氨磺酰)-5-硝基苯甲酸甲酯(XJ22)
将2-(氯磺酰基)-5-硝基苯甲酸甲酯(0.25g，0.894mmol)与胺XT48(0.416g，0.770mmol)在DMF(5mL)中在DIPEA(0.33mL，1.92mmol)存在下于室温下反应0.5小时。反应混合物浓缩之后，通过快速色谱(硅胶，DCM:MeOH 1:0至95:5)纯化剩余物，以得到作为黄色固体的磺酰胺XJ22(0.159g，29％)。
对于C29H31N10O10S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为711.7，实测值为711.6。
(S)-5-氨基-2-(N-(4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)-氨磺酰)苯甲酸(XT101)
苯胺XT101的制备与XR22的制备类似，从磺酰胺XJ22(160mg，0.225mmol)开始。使用锌粉(442mg，6.75mmol)和在DMF(1.5mL)中的饱和NH4Cl水溶液(0.375mL)进行还原，随后用在THF(2.5mL)和水(2.5mL)中的LiOH(54mg，2.25mmol)水解。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度5％至35％)纯化一部分粗制产物，以得到XT101(13mg)。
对于C26H29N10O7S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为625.19，实测值为625.32。
(S)-4-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-5-甲氧基-5-氧代戊
烷-1-铵三氟乙酸盐(XX29)的制备
(E)-4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙烯基)苯甲酸(XT103)
在N2下，向PPh3(31.5g，120mmol)在DMA(120mL)中的冷却(0℃)溶液中滴加溴(6.17mL，120mmol)。一旦添加完成，就将XT102(7g，36.4mmol)一次添加到冰冷的溶液中。(游离碱XT102是按照如对于XX9所述的制备的。)将所得混合物在0℃下搅拌1小时，并在室温下搅拌90分钟。滴加乙醇(2.4mL)，并将混合物在室温下搅拌15分钟。然后在剧烈搅拌下将溶液倒入甲苯(380mL)中。过滤后，在乙醚(400mL)中搅拌固体，直至形成细密的悬浮液。过滤悬浮液，并将剩余物在空气中干燥过夜。将所得浅褐色粉末在氮气氛下重新溶解于DMA(500mL)中，并向溶液中添加PPh3(9.55g，36.4mmol)。将所得混合物加热至65℃，持续75分钟，冷却至0℃并添加KOtBu(18.4g，164mmol)。在0℃下搅拌10分钟后，添加4-甲酰基苯甲酸甲酯(5.98g，36.4mmol)。将混合物在室温下搅拌45分钟，此时添加更多的KOtBu(12.3g，109mmol)。30分钟后，用冰浴冷却反应混合物，添加AcOH(25mL，437mmol)，并将混合物搅拌5分钟。然后将该溶液倒入冰冷的水(2.1L)中。过滤所得悬浮液，并随后将剩余物用MeCN(2x180mL)、甲苯(2x180mL)和乙醚(2x180mL)洗涤，并在空气中干燥过夜，以产生作为黄色固体的羧酸XT103(10.4g，93％)。
对于C15H13N6O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为309.11，实测值为309.21。
(S,E)-5-((叔-丁氧基羰基)氨基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙烯基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT104)
根据通用方案XXA，使用10当量的DIPEA将酸XT103(9.2g，29.8mmol)与H-Orn(Boc)-OMe(9.3g，32.8mmol)反应。将粗制反应混合物倒入水(2.4L)中，搅拌15分钟，并然后过滤。用乙醚(3x250mL)洗涤所得固体剩余物，并在空气中干燥2天，以得到作为黄色固体的酯XT104(1.8g，83％)。
对于C26H33N8O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为537.26，实测值为537.67。
(S)-5-((叔-丁氧基羰基)氨基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XT105)
向装有XT104(11.2g，20.9mmol)在AcOH(450mL)中的溶液的经氮气吹扫的烧瓶中添加Pd/C(5g，10％，在活性炭上)。引入氢气，并在室温下于氢气氛下搅拌混合物。以3小时的间隔添加额外的3部份Pd/C(2.5g)。24小时后，用N2吹扫烧瓶，并然后将反应混合物在Celite上过滤。向滤液中添加MnO2(18.2g，209mmol)，并将悬浮液搅拌30分钟。在Celite上过滤后，浓缩滤液，并通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至15:85)纯化粗制产物，以得到作为沙色固体的XT105(6.9g，61％)。
对于C26H35N8O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为539.27，实测值为539.62。
(S)-4-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-5-甲氧基-5-氧代戊烷-1-铵三氟乙酸盐(XX29)
将化合物XT105(1.10g，2.04mmol)悬浮于DCM(10mL)中，并在室温下添加TFA(10mL)。在室温下搅拌20分钟后，将混合物浓缩。将剩余物与iPrOH(2x)共蒸发，并随后悬浮在iPrOH(10mL)中。用乙醚(60mL)稀释悬浮液，并过滤出固体并在真空下干燥，以得到作为黄色固体的TFA盐XX29(1.03g，88％)。
对于C21H27N8O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为439.22，实测值为439.56。
2,5-二氧代吡咯烷-1-基(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰)甘氨酰
基甘氨酰基-L-苯基丙氨酸酯(XX30)的制备
在室温下，将DCC(459mg，2.222mmol)添加到XT53(1.05mg，2.22mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(256mg，2.222mmol)在THF(40mL)中的悬浮液中。搅拌3.5小时后，过滤混合物并使用DCM彻底洗涤剩余物。用EtOAc稀释滤液，并然后浓缩。将白色固体悬浮在小体积的EtOAc中，并然后过滤，以得到作为白色固体的OSu-酯XX30(612mg，48％)。
对于C27H32N5O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为570.22，实测值为570.43。
5-((S)-5-苄基-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,7,10,13-四氧代-
3,6,9,12-四氮杂十八酰胺基)-2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨
基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯磺酸钠(XX19)的制备
2-(氯磺酰基)-4-硝基苯甲酸甲酯(XX14)
在0℃下，向在EtOAc(21mL)和浓HCl(22mL)中的苯胺XX13(2.47g，12.6mmol)中滴加NaNO2(0.912g，13.2mmol)在水(5.7mL)中的溶液。在0℃下搅拌30分钟后，添加Cu(II)Cl2二水合物(0.966g，5.67mmol)、NaHSO3(13.1g，126mmol)、AcOH(16mL)和浓HCl(5.7mL)的悬浮液，并在室温下搅拌反应物30分钟。将反应混合物倒到冰上，并滤出沉淀的磺酰氯并用水洗涤。在真空下干燥固体，以得到作为黄色固体的产物XX14(2.58g，73％)。
2-(异丁氧基磺酰基)-4-硝基苯甲酸(XX15)
将磺酰氯XX14(0.971g，3.47mmol)溶于DCM(20mL)中，并将黄色溶液冷却至0℃。添加异丁醇(1.61mL，17.4mmol)和Et3N(0.726mL，5.21mmol)，并将反应物在0℃下搅拌1小时。将溶液浓缩，溶于EtOAc中，并用KHSO4(0.5M，2x)、饱和NaHCO3和盐水洗涤。在MgSO4上干燥有机层，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，庚烷:DCM 1:0至0:1)纯化，得到作为淡黄色油状物的产物XX15(911mg，83％)。将一部分该物质(791mg，2.49mmol)溶于二
烷(25mL)和水(16mL)中。在室温下添加LiOH(2M，4.99mL，9.97mmol)。20分钟后，用水稀释反应物，并用1MHCl酸化至pH 3。用EtOAc(3x)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，在Na2SO4上干燥，过滤并浓缩，以得到作为黄色油状物的酸XX15(756mg，定量)。
对于C11H12NO7S-[M-H]-，MS(ESI-)计算值为302.03，实测值为302.35。
4-氨基-2-(异丁氧基磺酰基)苯甲酸(XX16)
在室温下在N2气氛下，将钯(42mg，10％，在活性炭上)添加至在MeOH(4mL)中的酸XX15(104mg，0.342mmol)。然后将混合物在氢气氛下搅拌30分钟。用N2吹扫烧瓶，并在Celite上过滤混合物。然后浓缩得到作为白色固体的苯胺XX16(83mg，89％)。
对于C11H14NO5S-[M-H]-，MS(ESI-)计算值为272.06，实测值为272.34。
(S)-5-(4-氨基-2-(异丁氧基磺酰基)苯甲酰胺基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XX17)
根据通用方案XXA，将酸XX16(83mg，0.304mmol)与HATU(121mg，0.319mmol)和胺XT48(153mg，0.304mmol)反应。浓缩反应混合物后，将剩余物与MeCN(2x)共蒸发，重新悬浮在MeCN中并过滤。通过快速色谱(硅胶，DCM:MeOH 1:0至4:1)纯化固体，以得到作为黄色固体的苯胺XX17(136mg，62％)。
对于C32H39N10O8S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为723.27，实测值为723.45。
(S)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-5-(2-(异丁氧基磺酰基)-4-(2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)乙酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XX18)
在N2下制备了粗制XT49(205mg，1.08mmol)在THF(0.5mL)中的储备溶液。在单独的小瓶中，在N2下，将苯胺XX17(130mg，0.180mmol)和DIPEA(0.094mL，0.540mmol)溶于DMF(2mL)中。在室温下将一部份储备溶液(285μL)添加到苯胺中。5分钟后，添加第二份储备溶液(285μL)，并继续搅拌5分钟。将反应物浓缩并干燥负载在硅胶上。通过快速色谱(硅胶，DCM:MeOH 1:0至4:1)纯化，得到酰胺XX18(106mg，67％)。
对于C36H41F3N11O10S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为876.27，实测值为876.21。
5-((S)-5-苄基-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,7,10,13-四氧代-3,6,9,12-四氮杂十八酰胺基)-2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)苯磺酸钠(XX19)
根据通用方案XXC，将酯XX18(79.2mg，0.090mmol)水解，但有以下修改：i)不将反应物温热至室温，而保持在0℃下，ii)分两部分添加NaOH(12当量)，间隔20分钟，iii)用MeOH洗涤固体，并省略乙醚。将固体在真空下干燥过夜，得到粗制酸(68mg)。然后在室温下向黄色固体中添加在DMF(1.0mL)中的活化酯XX30(52.5mg，0.092mmol)，然后添加DIPEA(0.097mL，0.553mmol)。搅拌20分钟后，添加更多的XX30(10.5mg，0.018mmol)。继续搅拌2分钟，此时浓缩反应物。将剩余物悬浮于MeCN(5mL)中并搅拌1小时。过滤悬浮液，并用MeCN和乙醚洗涤固体。将黄色固体(107mg)悬浮于丙酮(11mL)中，并添加NaI(207mg，1.384mmol)。将小瓶加盖，并在60℃下加热90分钟。冷却至室温后，过滤悬浮液，并用丙酮(1mL)洗涤固体。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化一部分粗制产物，以得到作为黄色固体的XX19(4.8mg)。
对于C51H58N15O14S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为1136.40，实测值为1136.95。
(S)-5-(4-氨基-2-磺苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)
苯甲酰胺基)戊酸(XX37)的制备
(S)-5-(4-氨基-2-(异丁氧基磺酰基)苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)-苯甲酰胺基)戊酸(XX36)
根据通用方案XXC进行粗制酯XX17(128mg，0.177mmol)的水解，以得到作为黄色固体的XX36。
对于C30H37N10O7S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为681.26，实测值为681.46。(S)-5-(4-氨基-2-磺苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XX37)
将在丙酮(6mL)中的烷基磺酸酯XX36(35.7mg，0.052mmol)和NaI(118mg，0.787mmol)在密封小瓶中于60℃加热8小时。浓缩反应物并通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度5％至20％)纯化部分粗制产物，以得到作为黄色固体的XX37(4.0mg)。
对于C26H29N10O7S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为625.19，实测值为625.20。
(S)-5-(4-氨基-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-
基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XX35)的制备
4-氨基-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酸(XX21)
将4-氨基-2-氰基苯甲酸(XX20；250mg，1.542mmol)和NaN3(203mg，3.13mmol)在DMF(4mL)中的溶液在密封小瓶中在110℃下在N2下加热16小时。冷却至室温后，过滤溶液，并将滤液直接用于下一步。
对于C8H8N5O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为206.07，实测值为206.22。
(S)-5-(4-氨基-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XX34)
向XT48(100mg，0.185mmol)和DIPEA(0.194mL，1.110mmol)在DMF(1.0mL)中的溶液添加等分试样的XX21(0.5mL粗制滤液，在DMF中)。在室温下添加HATU(70.4mg，0.185mmol)，并将所得混合物搅拌30分钟。添加更多的XT48(20mg，0.037mmol)和HATU(14.07mg，0.037mmol)，并在15分钟后将反应物浓缩并悬浮于MeCN(6mL)中。搅拌45分钟后，过滤悬浮液，并用MeCN和乙醚洗涤固体，以得到作为膏状固体的粗制XX34(126mg)。
对于C29H31N14O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为655.26，实测值为655.42。
(S)-5-(4-氨基-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XX35)
根据通用方案XXC进行粗制酯XX34(58mg，0.089mmol)的水解。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度10％至25％)纯化粗制产物，得到作为黄色固体的XX35(14.8mg)。
对于C27H29N14O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为613.25，实测值为613.34。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-(4-((S)-2-
((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺
基)-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)戊酸(XX23)的制备
(S)-5-(4-((S)-2-氨基丙酰胺基)-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XX22)
在N2下，在室温下向粗制XX34(245mg，0.374mmol)在DMF(1.8mL)中的溶液中添加Fmoc-Ala-OH(175mg，0.561mmol)、HATU(213mg，0.561mmol)和DIPEA(0.392mL，2.25mmol)。30分钟后，添加更多的Fmoc-Ala-OH(23.3mg，0.075mmol)和HATU(28.5mg，0.075mmol)，并继续搅拌30分钟。将反应物浓缩，悬浮于MeCN(6mL)中，并在室温下搅拌45分钟。过滤后，将黄色固体(355mg)溶于DMF(6mL)中，并在室温下添加哌啶(0.593mL，5.99mmol)。搅拌5分钟后，将反应物浓缩，悬浮于乙醚(10mL)中，并在室温下搅拌1小时。过滤出固体，用乙醚洗涤并在真空下干燥，以得到作为淡黄色固体的粗制胺XX22(270mg)。
对于C32H36N15O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为726.30，实测值为726.27。
(S)-5-(4-((S)-2-氨基丙酰胺基)-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XX31)
将一部分粗制胺XX22(169mg)溶于DMF(0.5mL)中。在室温下添加Boc-Val-OSu(72.1mg，0.229mmol)和DIPEA(0.073mL，0.417mmol)。2小时后，在室温下添加更多的Boc-Val-OSu(10mg，0.032mmol)和DIPEA(0.025mL，0.146mmol)，并将混合物搅拌过夜。浓缩后，将剩余物悬浮于MeCN(275mL)中，并加热至回流。将悬浮液热过滤，并然后使其冷却至室温。将溶液浓缩至约15mL体积，并然后过滤，以得到作为膏状固体的粗制二肽(59mg)。将该固体悬浮于DCM(2mL)中，并在室温下添加TFA(2mL)。搅拌10分钟后，浓缩反应物，并通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度10％至25％)纯化。通过旋转蒸发从产物级分中除去MeCN，并将水相冻干，以得到作为白色固体的胺XX31(22.2mg)。
对于C37H45N16O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为825.37，实测值为825.50。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(2H-四唑-5-基)苯甲酰胺基)戊酸(XX23)
将胺XX31(22.2mg，0.021mmol)溶于THF(0.6mL)/水(0.15mL)中。在室温下添加氢氧化锂水合物(6.19mg，0.148mmol)，并将混合物搅拌90分钟。冷却至0℃后，添加AcOH(0.014mL，0.253mmol)，然后添加甲苯(5mL)，并将混合物浓缩。将剩余物重新溶于DMF(0.5mL)中，并在室温下添加6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(6.8mg，0.022mmol)和DIPEA(0.015mL，0.084mmol)。将混合物在室温下搅拌90分钟，并然后浓缩。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20至50％)纯化剩余物。通过旋转蒸发从产物级分中除去MeCN，并将水相冻干，以得到作为黄色固体的四唑XX23(9.9mg)。
对于C45H54N17O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为976.43，实测值为976.48。
(S)-5-(4-(4-氨基-2-氰基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基
蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XX41)的制备
5-氨基-2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苄腈(XX39)
在N2下，于室温下向碘化物XX38(5.13g，18.7mmol，根据以下制备：Ozaki et al,Tetrahedron,2017,73,7177-7184)在EtOH(40mL)中的悬浮液中添加SnCl2二水合物(21.1g，93.5mmol)。20分钟后，悬浮液变成深橙红色溶液。用室温水浴冷却烧瓶，以消散随时间产生的一些放热。搅拌2小时后，形成新的悬浮液。然后将反应物倒入NaOH(15.0g)在水(120mL)中的冷却的(0℃)溶液。将混合物搅拌5分钟，并然后过滤。用冰冷NaOH水溶液(2M)和水洗涤固体。在真空下干燥后，获得作为淡黄色固体的苯胺(3.94g，86％)。
将苯胺(3.94g，16.2mmol)装入50mL三颈烧瓶中，并添加CuI(61.5mg，0.323mmol)和PdCl2(PPh3)2(227mg，0.323mmol)。用N2吹扫烧瓶，在室温下添加Et3N(17.7mL，127mmol)和乙炔基三甲基硅烷(2.457mL，17.76mmol)，并将悬浮液剧烈搅拌4小时。在此期间缓慢溶解悬浮液。然后浓缩反应物并通过快速色谱(硅胶，庚烷:DCM1:0至0:1)纯化。浓缩产物级分后，沉淀出白色片状物。此时添加更多庚烷(30mL)，并将悬浮液浓缩至约35mL的体积。过滤出固体，并在真空下干燥，以得到作为灰白色片状物的炔烃XX39(3.06g，76％，2步)。
对于C12H15N2Si+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为215.10，实测值为215.15。
5-氨基-2-乙炔基苄腈(XX40)
在室温下用K2CO3(3.16g，22.9mmol)处理XX39(2.45g，11.43mmol)在MeOH(50mL)中的溶液15分钟。将反应物浓缩并溶解于EtOAc和水中。分离各层，用EtOAc(1x)萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，在Na2SO4上干燥，过滤并浓缩，以得到作为膏状固体的炔烃XX40(1.64g，定量)。
对于C9H7N2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为143.06，实测值为143.05。
(S)-5-(4-(4-氨基-2-氰基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XX41)
用N2吹扫炔烃XX40(29.7mg，0.209mmol)和叠氮化物XS21(94mg，0.209mmol)在DMF(1.7mL)中的溶液5分钟。顺序地添加在水(1.1mL)中的CuSO4·5H2O(39.1mg，0.157mmol)和在水(1.1mL)中的抗坏血酸钠(62.0mg，0.313mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌40小时。添加更多的DMF(1mL)，然后添加在水(0.5mL)中的CuSO4·5H2O(19.54mg，0.078mmol)和在水(0.5mL)中的抗坏血酸钠(31.0mg，0.157mmol)，并将反应物在室温下额外搅拌3天。然后将反应物倒入水(25mL)中并添加AcOH水溶液(1M，1mL)。用热风枪加热混合物，使细密的悬浮液破碎。冷却至室温后，可以过滤悬浮液，并用MeCN(1mL)洗涤固体。通过RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度10％至35％)纯化一部分固体，以得到作为黄色固体的酸XX41。
对于C29H29N12O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为593.25，实测值为593.49。
(S)-5-(4-(4-氨基-2-氰基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶
啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XX47)的制备
(S)-5-叠氮基-2-(((苄氧基)羰基)氨基)戊酸甲酯(XX43)
在0℃下，将SOCl2(1.73mL，23.9mmol)添加到在MeOH(50mL)中的叠氮化物XR19(3.49g，11.9mmol)中。将溶液加热至60℃，持续15分钟。冷却至室温后，浓缩混合物，并将剩余物与甲苯(2x)共蒸发。通过快速色谱(硅胶，庚烷:EtOAc 1:0至2:1)纯化，得到作为无色油状物的甲酯XX43(3.52g，96％)。
对于C14H19N4O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为307.14，实测值为307.21。
(S)-5-(4-(4-氨基-2-氰基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-戊酸甲酯(XX44)
在室温下，将在水(52mL)中的CuSO4·5H2O(1.05g，4.22mmol)添加到叠氮化物XX43(1.70g，5.55mmol)和炔烃XX40(0.789g，5.55mmol)在THF(280mL)中的溶液中。用N2吹扫该溶液20分钟，然后在室温下添加在水(52mL)中的抗坏血酸钠(1.649g，8.32mmol)。搅拌30分钟后，添加DMF(40.0mL)并在室温下继续搅拌88小时。添加水/盐水(1:1，220mL)混合物，并然后用EtOAc/庚烷(1:1，2x200mL)萃取产物。用盐水(2×100mL)洗涤合并的有机层，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，庚烷:EtOAc 1:0至0:1)纯化，得到作为黄色黏性油状物的三唑XX44(2.09g，84％)。
对于C23H25N6O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为449.19，实测值为449.31。
(S)-2-氨基-5-(4-(4-氨基-2-氰基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)戊酸甲酯(XX45)
在室温下，在H2气氛下，在EtOAc(22mL)中，将三唑XX44(1.12g，2.497mmol)与Pd/C(10％钯，在活性炭上，0.133g，0.125mmol)反应。16小时后，用N2吹扫烧瓶，并在室温下添加更多的Pd/C(10％钯，在活性炭上，0.200g，0.188mmol)。重新引入氢气，并将混合物在室温下另外搅拌4.5小时。用N2吹扫烧瓶，并在Celite上过滤。然后向滤液中添加在二
烷中的HCl(4.0N，2.0mL)。通过旋转蒸发将滤液体积减少至约50mL，并然后过滤悬浮液，并用EtOAc和乙醚洗涤固体。在真空下干燥白色固体，以得到作为二盐酸盐的胺XX45(849mg，88％)。
对于C15H19N6O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为315.16，实测值为315.25。
(S)-5-(4-(4-氨基-2-氰基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XX46)
根据通用方案XXA，将胺XX45(498mg，1.29mmol)在DMF(10mL)中的二盐酸盐与胺XT48(397mg，1.17mmol)反应。浓缩后，将粗制产物在MeCN(10mL)中在室温下搅拌3天，并然后过滤。用MeCN和乙醚洗涤固体，并最后在真空下干燥，以得到作为橙色固体的酰胺XX46(688mg，93％)。
对于C30H30N13O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为636.25，实测值为636.45。
(S)-5-(4-(4-氨基-2-氰基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XX47)
根据通用方案XXC进行酯XX46(330mg，0.519mmol)的水解。通过RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度10％至30％)纯化一部分粗制产物，以得到作为黄色固体的酸XX47。
对于C28H28N13O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为594.24，实测值为594.39。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-(4-((S)-2-
((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺
基)-2-羟基苯甲酰胺基)戊酸(XX28)的制备
(S)-4-(2-氨基丙酰胺基)-2-(苄氧基)苯甲酸苄酯(XX25)
在0℃下，向4-氨基-2-羟基苯甲酸(XX24；5.00g，32.7mmol)在DMF(150mL)中的搅拌溶液中添加KOtBu(4.03g，35.9mmol)。15分钟后，逐滴添加BnBr(4.27mL，35.9mmol)，并将悬浮液在室温下进一步搅拌4小时，然后将反应容器再次冷却至0℃。此时添加更多的KOtBu(4.03g，35.9mmol)和BnBr(4.27mL，35.9mmol)。将反应物搅拌过夜，并随后用水淬灭，并用EtOAc(3x)萃取。用庚烷以2:1稀释合并的有机层，并然后用水(2x)和盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，并在硅胶上浓缩。通过快速色谱(硅胶，庚烷中的0至60％EtOAc)纯化，得到苄酯(5.30g)。
根据XT11的方案，将产物与Fmoc-Ala-Cl反应。浓缩反应混合物后，将粗制物溶于EtOAc，并用HCl(0.1M)洗涤，直至水层保持酸性。用EtOAc反萃取合并的水层，并用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤合并的有机层，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩，以得到黏性浅黄色胶质(11.08g)。
对于C39H34N2NaO6[M+Na]+，MS(ESI+)计算值为649.23，实测值为649.44。
将粗制物溶于DMF(122mL)中，并在室温下添加哌啶(49mL)。3分钟后，浓缩反应物，并通过快速色谱(硅胶，在DCM中的0至20％MeOH)纯化粗制物，得到胺XX25(4.45g，34％，3步)。
对于C24H25N2O4[M+H]+，MS(ESI+)计算值为405.18，实测值为405.29。
2-(苄氧基)-4-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XX26)
在室温下，将DIPEA(4.81mL，27.5mmol)和Boc-Val-OSu(3.81g，12.1mmol)添加到胺XX25(4.45g，11.0mmol)在DMF(50mL)中的溶液中。将混合物搅拌5小时，并然后倒入水中。用EtOAc/庚烷(1:1，3x)萃取混合物。用水(2x)和盐水洗涤合并的有机层，在MgSO4上燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(在庚烷中的0至100％EtOAc)纯化，得到二肽(6.57g)。
将粗制产物溶于THF(39mL)/MeOH(8mL)中，并在室温下添加在水(15.7mL)中的氢氧化锂水合物(1.69g，40.3mmol)。将混合物搅拌19小时，在此之后，然后通过旋转蒸发除去有机物。添加水(300mL)，并过滤混合物，用水(100mL)洗涤，并用乙醚(2x150mL)洗涤固体。两种醚级分单独用于洗涤水层。向水层中添加EtOAc(250mL)，并添加HCl(1.0M，41mL)，然后添加固体。混合后，将产物溶于有机相。用EtOAc(2x100mL)洗涤水层，并用盐水洗涤合并的有机层(包括醚级分)，在Na2SO4上干燥，过滤并浓缩。形成悬浮在约1:1EtOAc/庚烷(～20mL)中的白色固体，并过滤出，以得到作为白色固体的酸XX26(3.78g，67％，2步)。
对于C27H36N3O7[M+H]+，MS(ESI+)计算值为514.26，实测值为514.61。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-羟基苯甲酰胺基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XX27)
根据通用方案XXA，将酸XX26(421mg，0.820mmol)与HATU(374mg，0.983mmol)和XT48(413mg，0.820mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，DCM:MeOH 1:0至4:1)纯化，得到悬浮在热MeCN(6mL)中的黄色固体。冷却至室温后，过滤出固体并在水中搅拌10分钟。过滤和干燥后，将粗制苄基醚(200mg，0.208mmol)与Pd(OH)2/C(20％，在活性炭上，100mg)在AcOH(2.0mL)中在H2气氛下于室温下反应20分钟。然后用N2吹扫反应物，并在Celite上过滤。浓缩后，将该物质与甲苯共蒸发。将固体溶于DMF(1mL)/DCM(3mL)中，并在室温下添加MnO2(300mg)。搅拌3小时后，过滤并浓缩反应物。通过快速色谱(硅胶，DCM中0至20％的MeOH)纯化，得到苯酚XX27(79mg，11％，2步)。
对于C41H53N12O10[M+H]+，MS(ESI+)计算值为873.40，实测值为873.90。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-羟基苯甲酰胺基)戊酸(XX28)
按照通用方案XXC中所述的将苯酚XX27(79mg，0.090mmol)与NaOH反应，以得到作为绿色/灰色固体的酸(75mg)。将该物质悬浮在DCM(2.0mL)中，并在0℃下添加TFA(2.0mL)。30分钟后，浓缩反应物。将褐色油状物溶于DMF(3mL)中，并在室温下添加6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(29.1mg，0.094mmol)和DIPEA(0.063mL，0.360mmol)。在20分钟和90分钟之后分别添加更多的DIPEA(0.031mL，0.180mmol)和6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(5.55mg，0.018mmol)，并在2小时后停止该反应。将混合物浓缩并通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeOH:MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化剩余物。通过旋转蒸发去除有机溶剂并然后将水溶液冻干。使用不同的洗脱剂通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeOH:MeCN(1:1)x0.1％TFA，梯度20％至50％)再次纯化固体。通过旋转蒸发去除有机溶剂并然后将水溶液冻干，以得到作为黄色固体的苯酚XX28(3.1mg)。
对于C44H54N13O10[M+H]+，MS(ESI+)计算值为924.41，实测值为924.91。
(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基喹唑啉-6-基)乙基)苯甲酰胺
基)戊酸(XJ4)的制备
(S)-5-(4-叠氮基苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基喹唑啉-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XJ2)
根据通用方案XXA，使酸XJ1(514mg，1.67mmol，按照US 2005/0020833和US 2009/0253719中所述合成)与胺XX3(534mg，1.83mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化，得到作为黄色固体的酯XJ2(474mg，49％)。
对于C30H32N9O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为582.25，实测值为582.62。
(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基喹唑啉-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XJ3)
根据通用方案XXB进行叠氮化物XJ2(474mg，0.815mmol)的还原，以得到作为黄色固体的苯胺XJ3(453mg，定量)。
对于C30H34N7O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为556.26，实测值为556.62。
(S)-5-(4-氨基苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基喹唑啉-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XJ4)
根据通用方案XXC进行酯XJ3(45mg，0.081mmol)的水解，以得到作为黄色固体的酸XJ4(9mg，20％)。
对于C29H32N7O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为542.24，实测值为542.62。
(S)-2-(4-(2-(2,4-二氨基喹唑啉-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-5-(4-((S)-2-((S)-
2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)戊酸
(XJ9)的制备
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基喹唑啉-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XJ6)
根据XT11的方案，将苯胺XJ3(405mg，0.729mmol)与Fmoc-Ala-Cl(481mg，1.45mmol)反应，得到作为黄色固体的酰胺XJ5(定量)。
对于C48H49N8O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为849.36，实测值为849.49。
用TBAF·3H2O和癸硫醇对经Fmoc保护的胺XJ5(619mg，0.729mmol)进行脱保护，并随后与Boc-Val-OSu反应，类似于XT11向XT12的转化。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化粗制产物，得到被四丁基胺盐污染的二肽XJ6(317mg，52％)。
对于C43H56N9O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为826.42，实测值为826.83。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酰胺基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基喹唑啉-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XJ8)
根据XT13的方案，对二肽XJ6(310mg，0.375mmol)进行脱保护。根据通用方案XXC，用NaOH水解粗制产物(272mg)，以得到作为灰白色固体的XJ8(84mg，32％)。
对于C37H46N9O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为712.35，实测值为712.80。
(S)-2-(4-(2-(2,4-二氨基喹唑啉-6-基)乙基)苯甲酰胺基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)戊酸(XJ9)
根据XT17的方案，将胺XJ8(76mg，0.107mmol)与6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(32.9mg，0.107mmol)和DIPEA(0.112mL，0.64mmol)反应。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度5％至95％)纯化粗制固体。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并将水溶液冻干，以得到作为白色固体的XJ9(21.6mg，22％)。
对于C47H57N10O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为905.42，实测值为905.94。
(S)-5-氨基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸
(XJ11)和(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-((((4-((2S,
5S)-13-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-4,7-二氧代-2-(3-脲基丙基)-
8,11-二氧杂-3,6-二氮杂十三酰胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)戊酸(XJ13)的制备
(S)-5-氨基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XJ11)
根据通用方案XXC用NaOH(12当量)进行甲酰胺XT47(270mg，0.476mmol)的水解。然后根据XT13的方案，用TFA对产物(178mg)进行脱保护。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度5％至35％)纯化一部分粗制产物(40mg)。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并将水溶液冻干，以产生作为黄色固体的XJ11(6.7mg)。
对于C19H24N9O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为426.19，实测值为426.31。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-4,7-二氧代-2-(3-脲基丙基)-8,11-二氧杂-3,6-二氮杂十三酰胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)戊酸(XJ13)
在0℃下，在Et3N(0.150mL，1.07mmol)存在下，将胺XJ11(234mg，0.358mmol)与XJ12(271mg，0.358mmol)(参见：Elgersma et al,Mol.Pharm.2015,12,1813–35)在DMF(4mL)中反应1.5小时，在此期间让温度逐渐达到RT。浓缩后，通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度25％至75％)纯化粗制固体。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并将水溶液冻干，以得到作为黄色固体的XJ13(99mg，27％)。
对于C47H60N15O13 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为1042.44，实测值为1042.92。
(S)-2-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酰胺基)-N1,N5-二(丙-2-
炔-1-基)戊二酰胺(XS2)的制备
叔丁基(S)-(1,5-二氧代-1,5-双(丙-2-炔-1-基氨基)戊烷-2-基)氨基甲酸酯(XS1)
将Et3N(1.74mL，12.5mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(1.49g，7.78mmol)在0℃下添加到Boc-Glu-OH(769mg，3.11mmol)和炔丙基胺(438μL，6.85mmol)在DCM(15mL)中的悬浮液中。使反应混合物达到室温并搅拌过夜。浓缩反应混合物，将其溶于EtOAc(30mL)中，并用水(30mL)洗涤。用EtOAc(2x30mL)萃取水层，并用饱和NaHCO3水溶液(2x30mL)和盐水(30mL)洗涤合并的有机层，在Na2SO4上干燥并浓缩。用DCM(2x20mL)萃取根据UPLC-MS分析仍然包含产物的水层，用盐水(30mL)洗涤合并的DCM层，在Na2SO4上干燥，与EtOAc萃取步骤的粗制产物合并，并在真空中蒸发。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化粗制物，以得到作为浅黄色固体的二炔烃XS1(440mg，44％)。
对于C16H24N3O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为322.18，实测值为322.44。
(S)-2-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酰胺基)-N1,N5-二(丙-2-炔-1-基)戊二酰胺(XS2)
将二炔烃XS1(430mg，1.34mmol)溶于DCM(5.0mL)中并冷却至0℃。添加TFA(5.0mL)，并使反应混合物达到室温并搅拌1小时。将反应混合物与甲苯(5.0mL)和甲苯:DCM(6mL，5:1)共蒸发并在高真空下干燥，以得到作为红褐色油状物的胺。将该物质溶于DMF(10mL)中，并然后在室温下添加6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(495mg，1.61mmol)和DIPEA(1.40mL，8.03mmol)。18小时后，将反应混合物浓缩，并与DCM:甲苯(15mL，2:1)共蒸发。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化粗制物，以得到作为白色固体的马来酰亚胺XS2(307mg，55％，2步)。
对于C21H27N4O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为415.20，实测值为415.34。
(S)-5-(2-氯-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰
胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨
基)苯甲酰胺基)戊酸(XS6)的制备
(S)-4-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-2-氯苯甲酸甲酯(XS3)
根据XT11的方案，将4-氨基-2-氯苯甲酸甲酯(1.00g，5.39mmol)与Fmoc-Ala-Cl反应。在将淬灭的反应混合物浓缩并与甲苯(20mL)共蒸发后，将混合物部分溶于EtOAc(40mL)中，并用0.1M HCl(2x15mL)萃取。用EtOAc(20mL)萃取水层，并用NaHCO3水溶液(2x15mL)和盐水(2x15mL)洗涤合并的有机层，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩，以产生作为淡黄色固体的酰胺XS3(2.63g，定量，2步)。
对于C26H24ClN2O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为479.14，实测值为479.30。4-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-氯苯甲酸甲酯(XS4)
向氨基甲酸酯XS3(2.63g，5.49mmol)中添加哌啶(39.0mL，395mmol)，并将所得溶液搅拌15分钟。将反应混合物浓缩并通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化，以产生作为浅褐色油状物的脱保护产物(1.17g，83％)。将一部分物质(1.15g，4.48mmol)溶于DMF(20mL)中。然后在室温下添加DIPEA(1.96mL，11.2mmol)和Boc-Val-OSu(1.55g，4.93mmol)，并将所得溶液在室温下搅拌3小时。将反应混合物倒入水(240mL)中，并用EtOAc:庚烷(1:1，3x80mL)萃取水层。用水(100mL)和盐水(2x50mL)洗涤合并的有机层，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，EtOAc:庚烷0:1至1:1)纯化粗制物，以产生作为灰白色固体的酰胺XS4(1.51g，74％)。
对于C21H31ClN3O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为456.19，实测值为456.56。
(S)-5-(4-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-氯苯甲酰胺基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XS5)
将酯XS4(0.750g，1.65mmol)悬浮在二
烷(17mL)和水(10mL)中。添加LiOH水溶液(2.0M，3.29mL，6.58mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌4小时。添加更多的二
烷(10mL)，并继续搅拌1小时。添加水(25mL)，并用1M HCl将反应混合物酸化至PH 3。用EtOAc(3x35mL)萃取产物，并用盐水(2x50mL)洗涤合并的有机层，在Na2SO4上干燥，过滤并浓缩。根据通用方案XXA，将粗制酸(0.125g，0.284mmol)与胺XT48(0.146g，0.270mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化，得到作为黄色黏性固体的酰胺XS5(0.159g，66％，2步)。
对于C41H52ClN12O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为891.37，实测值为891.83。
(S)-5-(2-氯-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XS6)
在10℃下，向甲基酯XS5(0.159g，0.178mmol)在DMSO(0.16mL)和MeOH(0.80mL)中的悬浮液中滴加NaOH(2.0M，0.535mL，1.07mmol)。使反应混合物达到室温并搅拌15分钟。添加更多的NaOH(2.0M，0.535mL，1.07mmol)，并在2小时后用DMSO(0.32mL)和MeOH(1.6mL)稀释反应混合物。搅拌反应物2小时，然后最终添加NaOH(2.0M，0.535mL，1.07mmol)，并搅拌4小时。然后通过添加AcOH(1.0M，6.0mL)来使产物沉淀，过滤，用水(2.0mL)、MeCN(2.0mL)和Et2O(2.0mL)洗涤。将粗制物质悬浮于DCM(5.0mL)中，并将混合物冷却至0℃。滴加TFA(5.0mL)，并将反应混合物搅拌30分钟。浓缩反应物，并随后与甲苯(10mL)共蒸发，以产生作为黄色油状物的粗制胺。将该物质溶于DMF(6.0mL)中，并在0℃下添加6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(55.1mg，0.179mmol)和DIPEA(0.125mL，0.715mmol)。15分钟后，添加更多的DIPEA(0.125mL，0.715mmol)，然后2.5小时后添加6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(11.0mg，0.036mmol)。总反应时间3.5小时之后，浓缩反应混合物，并随后与甲苯(5mL)共蒸发。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化粗制物。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并将水溶液冻干，以产生作为黄色固体的马来酰亚胺XS6(22.3mg，13％，3步)。
对于C44H53ClN13O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为942.38，实测值为942.9。
2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)-2-氟苯甲酰胺基)
丁基)氨甲酰基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺
基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XS12)的制备
4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)-2-氟苯甲酸(XS7)
在0℃下，在10分钟内将溴(0.804mL，15.6mmol)滴加到PPh3(4.09g，15.6mmol)在DMA(14mL)中的悬浮液中。搅拌30分钟后，添加(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲醇(1.00g，5.20mmol，如对XX9所述制备)，并将所得混合物在室温下搅拌18小时。最后，添加4-氨基-2-氟苯甲酸(1.07g，6.90mmol)和BaO(1.11g，6.50mmol)，并将悬浮液在55℃下加热24小时。冷却至室温后，将反应混合物倒入DCM:MeOH(150mL，29:1)中并通过过滤收集固体。将剩余物在水(50mL)中搅拌，过滤，在热MeCN(60mL)中搅拌，并在冷却至室温后过滤，以产生作为褐色固体的苯胺XS7(1.30g，76％)。
对于C14H13FN7O2 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为330.11，实测值为330.35。
4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)-2-氟苯甲酸(XS8)
将乙酸酐(11.1mL，118mmol)在甲酸(48.3mL，1.26mol)中的溶液在室温下搅拌40分钟，然后添加苯胺XS7(1.30g，3.94mmol)。将所得悬浮液在回流下搅拌2.5小时。将反应混合物冷却至室温并浓缩。将剩余物溶于水(88mL)/NH4OH水溶液(35％，12.6mL)中并然后加热至70℃，持续30分钟。过滤混合物，并用AcOH将滤液酸化至pH约5.5。通过过滤收集沉淀，并随后将沉淀在50℃下在水/AcOH(55mL，10:1)中搅拌45分钟。过滤后，用水(2x10mL)、EtOH(2x5mL)和Et2O(2x5mL)洗涤固体，并在真空下干燥，以产生作为浅褐色粉末的甲酰胺XS8(0.788g，55％)。
对于C15H13FN7O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为358.11，实测值为358.38。
(S)-5-(5-氨基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)-2-氟苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XS9)
根据通用方案XXA，将酸XS8(760mg，2.13mmol)与胺XT6(871mg，2.66mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:3)纯化，得到作为黄色固体的酰胺XS9(406mg，30％)。
对于C29H28FN10O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为631.22，实测值为631.66。
(S)-5-(5-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)-2-氟苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XS10)
根据XT11的方案，将苯胺XS9(315mg，0.500mmol)与Fmoc-Ala-Cl反应。将淬灭的反应混合物浓缩并与MeOH:甲苯(30mL，1:2)共蒸发后，通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化该物质，以产生作为黄色固体的酰胺XS10(0.352g，76％)。
对于C47H43FN11O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为924.32，实测值为924.86。
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)-2-氟苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XS11)
用TBAF·3H2O和癸硫醇将经Fmoc保护的胺XS10(0.150g，0.162mmol)脱保护，并随后与Boc-Val-OSu反应，类似于XT11向XT12的转化。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至1:4)纯化，得到作为黄色膜状物的酰胺XS11(85mg，46％，2步)。
对于C42H50FN12O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为901.38，实测值为901.90。
2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)-2-氟苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XS12)
在0℃下向氨基甲酸酯XS11(85mg，0.094mmol)在DCM(3.0mL)中的悬浮液中滴加TFA(3.0mL)。使反应混合物达到室温并搅拌1小时。浓缩溶液，并与DCM:甲苯(7mL，2:5)和甲苯(5mL)共蒸发，以产生作为深黄色膜状物的粗制胺。将该物质溶于MeOH/DMSO(0.60mL，5:1)中并在10℃下滴加NaOH水溶液(2.0M，0.285mL，0.569mmol)。除去冷却浴，并将混合物在室温下搅拌1小时。添加更多的NaOH水溶液(0.285mL，0.569mmol)，并将混合物搅拌5小时。将反应物冷却至0℃，并添加AcOH水溶液(1.0M，1.0mL)，然后添加水(2.0mL)。滤出固体，并然后用水(2mL)和MeCN(2mL)洗涤，然后溶于DMF(15mL)中。然后在室温下向该溶液中添加6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.035g，0.11mmol)和DIPEA(0.100mL，0.572mmol)。将反应物搅拌4小时，并然后浓缩，与DCM:甲苯(10mL，1:4)共蒸发，并通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并将水溶液冻干，以产生作为浅黄色固体的马来酰亚胺XS12(19.6mg，21％，3步)。
对于C45H53FN13O11 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为970.40，实测值为971.00。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-(4-羟基苯甲酰
胺基)戊酸(XS14)的制备
(S)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-5-(4-羟基苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XS13)
根据通用方案XXA，将胺XT48(97mg，0.18mmol)与4-羟基苯甲酸反应。浓缩反应混合物后，将粗制物与DCM/甲苯(4mL，1:1)、甲苯(5mL)和MeCN(2x2mL)共蒸发。将剩余物在MeOH/MeCN(3mL，1:1)中搅拌5分钟，并然后过滤。用MeCN(2mL)和Et2O(2mL)洗涤固体，并在真空下干燥后，得到作为黄色固体的酰胺XS13(44mg，44％)。
对于C28H30N9O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为588.23，实测值为588.66。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-(4-羟基苯甲酰胺基)戊酸(XS14)
将酯XS13(44mg，0.074mmol)在MeOH/DMSO(0.48mL，5:1)中的悬浮液冷却至10℃并然后滴加NaOH水溶液(2.0M，0.223mL，0.446mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。然后将混合物冷却至0℃并添加AcOH水溶液(1.0M，0.6mL)，然后添加水(1.3mL)。将悬浮液搅拌20分钟。通过过滤收集固体，用水(1mL)、MeCN(1.0mL)和Et2O(2x1mL)洗涤，并在高真空下干燥。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度10％至55％)纯化剩余物。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并将水溶液冻干，以产生作为淡黄色固体的酸XS14(21.2mg，52％)。
对于C26H28N9O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为546.22，实测值为546.63。
(S)-5-(5-氨基噻吩-2-羧酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XS16)的制备
(S)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-5-(5-硝基噻吩-2-羧酰胺基)戊酸甲酯(XS15)
将5-硝基噻吩-2-羧酸(67mg，0.389mmol)在亚硫酰氯(0.621mL，8.51mmol)中的溶液在回流下加热4小时。将反应混合物冷却至室温，并与庚烷(2x1mL)共蒸发。将剩余物溶于DMF(0.48mL)中，并将其在0℃下添加到胺XT48(0.200g，0.370mmol)和Et3N(0.103mL，0.740mmol)在DMF(0.48mL)中的搅拌溶液中。将反应混合物在室温下搅拌20分钟，然后用MeOH(5mL)淬灭。将混合物浓缩，并与甲苯(2x5mL)共蒸发。将剩余物溶于MeOH(10mL)中，并添加MeCN(20mL)以诱导沉淀。将MeOH部分蒸发，并将剩余溶液在4℃下储存过夜。通过过滤收集固体，并用MeCN(1mL)和Et2O(2mL)洗涤。浓缩滤液，并通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM0:1至1:4)纯化剩余物。将分离的产物与剩余物组合，以产生酰胺XS15(0.122g，53％)。
对于C26H27N10O7S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为623.18，实测值为623.52。
(S)-5-(5-氨基噻吩-2-羧酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XS16)
将酰胺XS15(0.122g，0.196mmol)溶于DMF(2.0mL)/NH4Cl水溶液(7.2M，0.383mL，2.74mmol)中。在室温下添加锌粉(0.128g，1.96mmol)，并将反应混合物搅拌3小时。将反应混合物在Celite上过滤，并将滤液在空气中搅拌18小时。将混合物浓缩并与MeCN(2mL)共蒸发。将剩余物悬浮于MeCN(10mL)中，并通过过滤收集固体。用MeCN(1mL)和Et2O(2mL)洗涤固体，然后在真空下干燥，得到褐色固体。将该物质悬浮于MeOH/DMSO(0.48mL，5:1)中，滴加NaOH(2.0M，0.187mL，0.375mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌5小时。添加AcOH水溶液(1.0M，0.40mL)，并将混合物搅拌15分钟。添加水(1.6mL)，并搅拌30分钟后，将混合物在4℃下储存过夜。通过过滤收集沉淀，并用水(0.5mL)、MeCN(0.5mL)和Et2O(1mL)洗涤固体。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度10％至25％)纯化。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并将水溶液冻干，以产生作为淡黄色蓬松固体的酸XS16(4.7mg，4％，2步)。
对于C24H27N10O4S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为551.19，实测值为551.37。
5-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-乙炔
基苯甲酸甲酯(XS19)的制备
(S)-5-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)-2-碘苯甲酸甲酯(XS17)
将胺XS99(0.800g，2.89mmol，按照以下所述制备：Ozaki et al,Tetrahedron,2017,73,7177-7184)和Fmoc-Ala-OH(0.944g，3.03mmol)溶于DMF(9.6mL)中。添加DIPEA(2.02mL，11.6mmol)，然后在1小时内分批添加HATU(1.59g，4.18mmol)。然后将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物浓缩并溶于EtOAc(50mL)中。用KHSO4水溶液(0.5M，2x25mL)、饱和NaHCO3水溶液(25mL)和盐水(100mL)洗涤有机层，在Na2SO4上干燥并浓缩。通过快速色谱(硅胶，EtOAc:DCM 0:1至30:70)纯化粗制产物，以产生作为浅黄色固体的酰胺XS17(1.17g，71％)。
对于C26H24IN2O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为571.07，实测值为571.27。
5-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-碘苯甲酸甲酯(XS18)
将哌啶(0.989mL，9.99mmol)添加到酰胺XS17(1.14g，2.00mmol)在DMF(10mL)中的搅拌溶液中。搅拌15分钟后，浓缩反应混合物，并与甲苯(2x20mL)共蒸发，并在真空下干燥。通过快速色谱(硅胶，MeOH:DCM 0:1至20:80)纯化粗制产物，以产生脱保护产物(0.740g，定量)。将产物和Boc-Val-OSu(0.735g，2.34mmol)溶于DMF(9.7mL)中。在室温下添加DIPEA(0.928mL，5.31mmol)，并将反应混合物搅拌过夜。将反应混合物添加到水(100mL)中，并用EtOAc:庚烷(1:1，3x50mL)萃取水层。用水(2x75mL)和冰冷的盐水(2x100mL)洗涤合并的有机层，在Na2SO4上干燥并浓缩。通过快速色谱(硅胶，EtOAc:庚烷20:80至70:30)纯化粗制产物，以产生作为灰白色固体的酰胺XS18(0.790g，68％)。
对于C21H31IN3O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为548.13，实测值为548.32。
5-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-乙炔基苯甲酸甲酯(XS19)
在微波小瓶中添加碘代芳烃XS18(0.720g，1.32mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(18mg，0.026mmol)和Cu(I)I(13mg，0.066mmol)。用N2吹扫小瓶，并顺序地添加DMF(4.5mL)、乙炔基三甲基硅烷(0.273mL，1.97mmol)和Et3N(0.183mL，1.32mmol)。将反应混合物在80℃微波下加热3.5小时。将反应混合物浓缩，并与甲苯(10mL)共蒸发。通过快速色谱(硅胶，EtOAc:DCM0:1至1:1)纯化粗制产物，以产生作为黄色固体的受保护炔烃(0.466，68％)。将一部分中间体(0.450g，0.869mmol)溶于MeOH(4.4mL)中，并添加K2CO3(12mg，0.087mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后用EtOAc(25mL)稀释反应混合物，并随后用饱和NaHCO3水溶液(2x20mL)、水(20mL)和盐水(20mL)洗涤，在Na2SO4上干燥，过滤并浓缩，以产生作为黄色膜状物的炔烃XS19(0.365g，94％)。
对于C23H32N3O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为446.23，实测值为446.35。
2-(1-((S)-4-羧基-4-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)丁基)-
1H-1,2,3-三唑-4-基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰
胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XS23)的制备
(S)-5-((叔-丁氧基羰基)氨基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XS20)
将酯XT105(0.300g，0.557mmol)悬浮在DMSO(0.33mL)和MeOH(1.65mL)中。将混合物冷却至10℃，并滴加2M NaOH(2.23mL，4.46mmol)。使反应混合物达到室温并搅拌5小时。将反应混合物冷却至0℃，并用1M AcOH水溶液(6mL)淬灭，并用水(10mL)稀释。将混合物温热至室温，并然后过滤。用MeCN(5mL)和Et2O(2x5mL)洗涤剩余物，以产生粗制酸。将该物质溶于冰冷的DCM(5mL)中。添加TFA(5mL)，并将混合物在0℃下搅拌15分钟。将反应混合物浓缩并与甲苯(2x10mL)共蒸发，以产生作为褐色油状物的胺XS20(0.292g，定量，2步)。
对于C20H25N8O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为425.20，实测值为425.41。
(S)-5-叠氮基-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XS21)
向NaN3(0.361g，5.56mmol)在水(0.95mL)/DCM(1.6mL)中的冰冷的溶液中滴加三氟甲磺酸酐(0.188mL，1.11mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌4小时。分离有机层并用DCM(2x1mL)萃取水相。用1M Na2CO3(1mL)洗涤合并的有机层，并添加到K2CO3(0.123g，0.890mmol)和CuSO4·5H2O(2.8mg，0.011mmol)以及胺XS20(0.236g，0.556mmol)在水(1.8mL)/MeOH(3.7mL)中的室温溶液中。将所得混合物在室温下搅拌过夜。用水稀释反应混合物，并用AcOH(1.0M)酸化至pH约5。将混合物轻轻加热，使其沉淀，并冷却至室温。通过过滤收集固体，用水(1mL)、MeCN(1mL)和Et2O(5mL)洗涤，并在真空下干燥，以产生作为绿褐色固体的叠氮化物XS21(0.103g，41％)。
对于C20H23N10O3 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为451.19，实测值为451.50。
(S)-5-(4-(4-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-(甲氧基羰基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)戊酸(XS22)
用N2吹扫炔烃XS19(0.070g，0.16mmol)和叠氮化物XS21(0.078g，0.17mmol)在DMF(1.7mL)中的溶液5分钟。然后顺序地添加在水(889μl)中的Cu(II)SO4(33mg，0.13mmol)和在水(942μl)中的抗坏血酸钠(51mg，0.26mmol)。将所得混合物在室温下搅拌18小时。将反应混合物添加至水(25mL)中。添加AcOH水溶液(1.0M，0.5mL)，并将混合物搅拌30分钟。将混合物轻轻加热，使其沉淀，并冷却至室温。通过过滤收集固体，并用MeCN(20mL)、EtOAc(2x20mL)和Et2O(10mL)洗涤，在EtOAc(15mL)中搅拌，通过过滤收集并使用Et2O(10mL)洗涤。然后在真空下干燥固体，以产生作为褐色固体的三唑XS22(0.103g，66％)。
对于C43H54N13O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为896.42，实测值为896.65。
2-(1-((S)-4-羧基-4-(4-(2-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)苯甲酰胺基)丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苯甲酸(XS23)
将酯XS22(0.100g，0.112mmol)悬浮在THF(2.0mL)中并冷却至10℃。逐滴添加LiOH(0.4M，1.40mL，0.558mmol)，并将反应混合物搅拌4.5小时。添加更多的LiOH(0.4M，0.698mL，0.279mmol)，并继续搅拌1小时。将反应混合物冷却至0℃并添加AcOH(96μL，1.67mmol)。将混合物浓缩，并与甲苯(2x5mL)共蒸发。然后将粗制物质溶于TFA(3.0mL)在DCM(3.0mL)中的0℃溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟，并然后浓缩并与甲苯(2x5mL)共蒸发，并在真空下干燥，以产生作为褐色油状物的粗制胺。将该物质溶于DMF(5.0mL)中，并在0℃下添加6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(38mg，0.12mmol)和DIPEA(0.117mL，0.668mmol)。添加DIPEA(0.117mL，0.668mmol)，并分别在15分钟和3小时后添加6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(15mg，0.049mmol)。24小时后，将反应混合物浓缩至1mL，并继续搅拌192小时。添加更多的DIPEA(0.117mL，0.668mmol)，并在总反应时间240小时之后，将反应混合物浓缩并与甲苯(5mL)共蒸发。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至40％)纯化一部分粗制物。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并将水溶液冻干，以产生作为浅黄色固体的马来酰亚胺XS23(13.9mg，13％，3步)。
对于C47H55N14O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为975.42，实测值为975.60。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-(4-(((2-
((((4-((2S,5S)-13-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-甲基-4,7-二氧代-2-(3-
脲基丙基)-8,11-二氧杂-3,6-二氮杂十三酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲
基)氨甲酰基)氧基)苯甲酰胺基)戊酸(XR4)的制备
4-(((2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)苯甲酸甲酯(XR1)
在0℃下，向4-羟基苯甲酸甲酯(1.00g，6.57mmol)在THF(25mL)中的溶液中添加Et3N(2mL，14.5mmol)。然后添加4-硝基苯基氯甲酸酯(1.46g，7.23mmol)。用THF(30mL)稀释所得悬浮液，并将混合物温热至室温。1小时后，添加叔丁基甲基(2-(甲基氨基)乙基)-氨基甲酸酯(1.24g，6.57mmol)，并将混合物搅拌1小时。将混合物浓缩并溶解于EtOAc。用KHSO4(0.5M，2x)、饱和NaHCO3水溶液(2x)、Na2CO3水溶液(1M)和盐水洗涤EtOAc层。在MgSO4上干燥有机层并浓缩。通过快速色谱(硅胶，庚烷:EtOAc，1:0至3:7)纯化粗制产物，以得到氨基甲酸酯XR1(2.07g，85％)。
对于C18H27N2O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为367.19，实测值为367.35。
4-(((2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)苯甲酸(XR2)
将氨基甲酸酯XR1(2.07g，5.66mmol)溶于THF/水(1:1，30mL)中，并添加NaOH(0.293g，7.33mmol)。将反应混合物在45℃下加热2小时，冷却至室温并用KHSO4水溶液(0.5M，约50mL)酸化。用EtOAc(3x)萃取反应混合物，并用盐水洗涤合并的有机层，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩，以得到酸XR2。
对于C17H25N2O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为353.17，实测值为353.27。
(S)-5-(4-(((2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)苯甲酰胺基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XR3)
根据通用方案XXA，将胺XT48(40mg，0.079mmol)与酸XR2(28.0mg，0.079mmol)反应。通过快速色谱(硅胶，DCM:MeOH，1:0至1:1)纯化，得到酰胺XR3(定量)。
对于C38H48N11O9 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为802.36，实测值为802.80。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-(4-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-甲基-4,7-二氧代-2-(3-脲基丙基)-8,11-二氧杂-3,6-二氮杂十三酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)苯甲酰胺基)戊酸(XR4)
将酯XR3(38mg，0.047mmol)溶于水/THF(1:1，1mL)中，并用LiOH(5.7mg，0.238mmol)处理3小时，随后用AcOH(10当量)淬灭反应。将混合物浓缩，与甲苯(2x)共蒸发，并在真空中干燥。
对于C36H46N11O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为760.35，实测值为760.77。
将获得的中间体悬浮在HCl/二
烷(2mL，4M)中，并搅拌30分钟。浓缩反应混合物，与氯仿共蒸发，并在真空中干燥。接下来，将Boc-脱保护的中间体和XJ12(45mg，0.06mmol)溶于DMF(1mL)中，在冰浴上冷却，并添加DIPEA(0.082mL，0.47mmol。15分钟后，将反应混合物温热至室温并搅拌2小时。浓缩混合物，并通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA)纯化粗制产物。合并包含产物的级分，蒸发乙腈，并将剩余溶液冻干，以产生XR4(25mg，42％)。
对于C59H75N17O16 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为1277.56，实测值为1277.12。
2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)
氨甲酰基)-5-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙
基-4,7-二氧代-2-(3-脲基丙基)-8,11-二氧杂-3,6-二氮杂十三酰胺基)苄基)氧基)羰基)
(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)苯甲酸(XR8-p和XR8-m)的制备
4-(((2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)邻苯二甲酸二甲酯(XR6)
向4-羟基邻苯二甲酸二甲酯(XR5；500mg，2.38mmol)在DCM(20mL)中的冷却(0℃)溶液中添加4-硝基苯基氯甲酸酯(527mg，2.62mmol)，然后添加Et3N(0.66mL，4.76mmol)。将反应物在0℃下搅拌2小时。然后，一次性添加DCM(2mL)中的叔丁基甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸酯(537mg，2.85mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时，并然后浓缩。通过快速色谱(硅胶，庚烷:EtOAc，1:0至3:7)纯化粗制产物，以得到氨基甲酸酯XR6(57％，580mg)。
(为清楚起见，来源于氨基甲酸酯旋转异构体的分裂但部分重叠的单峰被报道为单峰)。
对于C20H28N2NaO8 +[M+Na]+，MS(ESI+)计算值为447.17，实测值为447.50。(S)-5-(5-(((2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XR7)
在室温下，将在水(4mL)中的NaOH(269mg，6.71mmol)添加到氨基甲酸酯XR6(570mg，1.34mmol)在THF(5mL)中的溶液中。20小时后，使用KHSO4水溶液(0.5M)将反应混合物酸化，并然后用EtOAc(2x25mL)萃取反应混合物。在MgSO4上干燥合并的有机层，过滤并浓缩。使用在DMF(0.5mL)中的HATU(83mg，0.219mmol)和DIPEA(0.061mL，0.350mmol)，如通用方案XXA所述将一部分所获得的粗制二酸(34.7mg，0.087mmol)与胺XT48(52mg，0.096mmol)反应，反应时间为20小时。浓缩后，通过快速色谱(硅胶，DCM:MeOH，1:0至1:1)纯化粗制产物以得到邻苯二甲酰亚胺XR7(58.2mg，80％)。
对于C39H46N11O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为828.34，实测值为828.83。
2-(((S)-4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)氨甲酰基)-5-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-4,7-二氧代-2-(3-脲基丙基)-8,11-二氧杂-3,6-二氮杂十三酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)苯甲酸(XR8-p和XR8-m)
将邻苯二甲酰亚胺XR7(58.2mg，0.070mmol)溶于水/THF(1:1，1mL)中，并在室温下用LiOH(13.5mg，0.56mmol)处理3小时。通过添加AcOH沉淀产物，并随后通过过滤分离固体。粗制物质(18mg，32％)。
对于C37H46N11O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为804.34，实测值为804.48。
将经皂化中间体(18mg)悬浮在HCl/二
烷(4M，0.5mL)中，并将橙色悬浮液搅拌30分钟，然后浓缩并在真空中干燥。将Boc脱保护的中间体和XJ12(16.9mg，0.022mmol)溶于DMF(0.5mL)中，然后添加DIPEA(0.023mL，0.134mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，并然后浓缩。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA)纯化，得到作为黄色固体的对位和间位开放的邻苯二甲酰亚胺接头-药物XR8-p和XR8-m的混合物。
对于C60H74N17O18 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为1320.54，实测值为1320.74。
(S)-5-(2-(苄氧基)-4-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡
咯-1-基)-5-甲基-4,7-二氧代-2-(3-脲基丙基)-8,11-二氧杂-3,6-二氮杂十三酰胺基)苄
基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨
基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XR12)的制备
4-(((2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)-2-羟基苯甲酸甲酯(XR9)
将Et3N(1.71mL，12.3mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(1.36g，6.74mmol)顺序地添加到2,4-二羟基苯甲酸甲酯(1.03g，6.13mmol)在THF(50mL)中的冷却(0℃)溶液中。在0℃下1小时后，添加在THF(10mL)中的叔丁基甲基(2-(甲基氨基)乙基)-氨基甲酸酯(1.27g，6.74mmol)，并将混合物在室温下搅拌1小时。浓缩反应混合物后，通过快速色谱(硅胶，庚烷:EtOAc，1:0至1:1)纯化粗制物，以得到氨基甲酸酯XR9(1.64g，70％)。
(为清楚起见，来源于氨基甲酸酯旋转异构体的分裂但部分重叠的单峰被报道为单峰)
对于C18H27N2O7 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为383.18，实测值为383.27。
2-(苄氧基)-4-(((2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)苯甲酸甲酯(XR10)
在室温下，将BnBr(0.253mL，2.13mmol)和K2CO3(321mg，2.32mmol)添加到氨基甲酸酯XR9(740mg，1.935mmol)在DMF(10mL)中的溶液中，并将混合物搅拌16小时。接下来，将混合物浓缩并溶于EtOAc(约75mL)中。用KHSO4水溶液(0.5M)和盐水洗涤有机层。在MgSO4上干燥EtOAc层，过滤并浓缩。通过快速色谱纯化粗制产物两次(1；硅胶，庚烷:EtOAc，1:0至1:1，2；DCM:MeOH，1:0至4:1)，以得到苄基醚XR10(585mg，64％)。
对于C25H32N2NaO7 +[M+Na]+，MS(ESI+)计算值为495.21，实测值为495.55。
(S)-5-(2-(苄氧基)-4-(((2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)苯甲酰胺基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XR11)
在室温下，将LiOH(148mg，6.2mmol)添加到XR10(585mg，1.24mmol)在THF(10mL)中的溶液中，并将混合物搅拌过夜。添加更多的LiOH(59.4mg，2.48mmol)，并使反应继续24小时。用KHSO4水溶液(0.5M)酸化反应物，并用EtOAc(2x25mL)萃取。在MgSO4上干燥合并的有机层，过滤并浓缩，以得到粗制酸(518mg)。
(为清楚起见，来源于氨基甲酸酯旋转异构体的分裂但部分重叠的单峰被报道为单峰)。
根据通用方案XXA，将一部分该物质(52.5mg，0.115mmol)与胺XT48(57.7mg，0.115mmol)、HATU(52.2mg，0.137mmol)和DIPEA(0.123mL，0.687mmol)在DMF(1mL)中反应。通过快速色谱(硅胶，DCM:MeOH，1:0至1:1)纯化粗制产物，得到酰胺XR11(100mg，87％)。
对于C45H54N11O10 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为908.40，实测值为908.55。
(S)-5-(2-(苄氧基)-4-(((2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-甲基-4,7-二氧代-2-(3-脲基丙基)-8,11-二氧杂-3,6-二氮杂十三酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(甲基)氨甲酰基)氧基)苯甲酰胺基)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)戊酸(XR12)
马来酰亚胺XR12的合成与描述XR3向XR4转化的方案类似。获得作为黄色固体的产物。
对于C66H80N17O17 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为1382.59，实测值为1382.81。
5-((R)-2-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-丙酰胺基)噻吩-
2-羧酸(XR23)的制备
5-氨基噻吩-2-羧酸苄酯(XJ16)
向5-硝基噻吩-2-羧酸苄酯(XJ15)(1.55g，5.89mmol，如WO2007/018508中所述制备)在MeOH(50mL)中的悬浮液中添加饱和NH4Cl水溶液(7mL)和锌粉(3.8g)。将悬浮液在室温下搅拌2.5小时，并然后在Celite上过滤。用MeOH洗涤固体，并浓缩滤液。添加EtOAc，并用盐水洗涤有机溶液，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩，并使用快速色谱(硅胶，DCM:EtOAc 1:0至4:1)纯化，以得到作为紫色固体的XJ16(0.90g，66％)。
对于C12H12NO2S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为234.05，实测值为234.06。
(S)-5-(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酰胺基)噻吩-2-羧酸苄酯(XJ17)
在0℃下，向Fmoc-Ala-OH(1.82g，5.84mmol)在DCM(18mL)中的悬浮液中添加草酰氯(1.0mL，11.7mmol)和10滴DMF。将混合物在室温下搅拌1小时，并然后浓缩。将粗制酰基氯溶于DCM(8mL)中，并然后添加到XJ16(0.90g，3.90mmol)在DCM(8mL)中的冷却(0℃)溶液中。添加Et3N(1.6mL，11.7mmol)，并将混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物浓缩，并通过快速色谱(硅胶，DCM:EtOAc 1:0至1:1)纯化粗制产物，以得到作为黄色泡沫的XJ17(0.66g，32％)。
对于C30H27N2O5S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为527.16，实测值为527.36。
5-((R)-2-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)噻吩-2-羧酸苄酯(XJ18)
将经Fmoc保护的胺XJ17(0.66g，1.25mmol)溶于DMF(10mL)中。在室温下添加哌啶(0.62mL，6.2mmol)，并将混合物搅拌30分钟。浓缩反应混合物，并与甲苯/DCM共蒸发，以得到作为黄色固体的脱保护胺。将该物质重新溶解于DCM(10mL)中，在0℃下添加DIPEA(0.54mL，3.1mmol)和在DCM(10mL)中的Boc-L-Val-OSu(0.55g，1.75mmol)，并然后将混合物在室温下搅拌2.5小时。浓缩后，通过快速色谱(硅胶，DCM:EtOAc 1:0至4:1)纯化粗制物，以得到作为无色糖浆的酰胺XJ18(0.48g，77％)。
对于C25H34N3O6S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为504.21，实测值为504.31。
5-((R)-2-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)噻吩-2-羧酸(XR23)
在N2气氛下，向酰胺XJ18(0.48g，0.95mmol)在EtOAc(10mL)中的溶液中添加钯(0.3g，10％，在活性炭上)，并将混合物在氢气氛下于室温下搅拌2天。用N2吹扫反应混合物，并在Celite上过滤。用EtOAc洗涤剩余物并浓缩滤液，以得到作为白色固体的XR23(0.28g，72％)。
对于C18H28N3O6S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为414.16，实测值为414.29。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-(5-((S)-2-
((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺
基)噻吩-2-羧酰胺基)戊酸(XR16)的制备
(S)-5-(5-((S)-2-((S)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)噻吩-2-羧酰胺基)-2-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)戊酸甲酯(XR15)
根据通用方案XXA，将胺XT48(50mg，0.1mmol)与XR23(41.0mg，0.099mmol)、HATU(45.3mg，0.119mmol)和DIPEA(0.104mL，0.595mmol)在DMF(1.0mL)中反应。通过快速色谱(硅胶，DCM:MeOH，1:0至4:1)纯化粗制产物，得到不纯的XR15(105mg)，其无需进一步纯化即可用于下一步。
对于C39H51N12O9S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为863.36，实测值为863.83。
(S)-2-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-(5-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)噻吩-2-羧酰胺基)戊酸(XR16)
使用LiOH(6mg，0.25mmol)在室温下处理酰胺XR15(43mg，0.050mmol)在THF/水(1:1，1mL)中的溶液，持续90分钟。添加AcOH(0.03mL，0.5mmol)和甲苯(5mL)，并将混合物浓缩。将粗制物溶于DCM(2mL)中，并在0℃下添加TFA(1mL)。40分钟后，将混合物浓缩，与DCM共蒸发并在真空中干燥。将脱保护的中间体溶于DMF(0.5mL)中，并在室温下添加6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(18.43mg，0.060mmol)，然后添加DIPEA(0.017mL，0.100mmol)。添加更多的DIPEA(>5当量)以使反应混合物具有足够的碱性并补偿残留的酸。将混合物在室温下搅拌3小时，并然后浓缩。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度)纯化，得到作为黄色固体的XR16(11.6mg，26％)。
对于C42H52N13O9S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为914.37，实测值为914.49。
(R)-2-(4-(((2,5-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)-5-(5-((R)-2-
((R)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基-丁酰胺基)丙酰胺
基)噻吩-2-羧酰胺基)戊酸甲酯(XJ21)的制备
将XR15(83mg，0.096mmol)溶于MeOH(1.5mL)中并添加HCl水溶液(6N，0.9mL，5.51mmol)。将混合物在50℃下搅拌1小时，并然后冷却至室温，用MeOH稀释，与甲苯(2x)共蒸发，并在真空中干燥。将产物溶于DMF(1mL)中，并在0℃下顺序地添加6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.029g，0.095mmol)和DIPEA(0.1mL，0.57mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2小时，并然后浓缩。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度20％至50％)纯化粗制固体。合并产物级分，通过旋转蒸发除去MeCN，并将水溶液冻干，以产生作为黄色泡沫的XJ21(25mg，28％)。
对于C43H54N13O9S+[M+H]+，MS(ESI+)计算值为928.38，实测值为928.60。
2-乙炔基-5-硝基苯甲酸甲酯(XR18)的制备
5-硝基-2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯甲酸甲酯(XR17)
在微波小瓶中添加乙炔基三甲基硅烷(0.71mL，5.2mmol)、2-碘-5-硝基苯甲酸甲酯(1.06g，3.44mmol)和Cu(I)I(33mg，0.17mmol)以及DMF(15mL)，并用N2吹扫溶液。添加Pd(PPh3)2Cl2(48mg，0.069mmol)和Et3N(0.48mL，3.4mmol)，再次用N2吹扫混合物。将小瓶封盖，并在80℃下在微波中加热3.5小时。然后浓缩混合物，并通过快速色谱(硅胶，庚烷:EtOAc，1:0至0:1)纯化粗制产物，以得到TMS-炔烃XR17(620mg，65％)。
2-乙炔基-5-硝基苯甲酸甲酯(XR18)
室温下，将炔烃XR17(822mg，2.96mmol)和K2CO3(41.0mg，0.296mmol)溶于MeOH(15mL)中，并将混合物搅拌30分钟。添加EtOAc(50mL)，并用饱和Na2CO3水溶液(2x)、水和盐水洗涤混合物。在MgSO4上干燥有机层，过滤并浓缩，以得到XR18(定量，产率)。
(S)-5-叠氮基-2-(((苄氧基)羰基)氨基)戊酸(XR19)的制备
向NaN3(10g，154mmol)在水(25mL)/DCM(44mL)中的冰冷溶液中滴加三氟甲磺酸酐(5.2mL，30.8mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌2小时。分离有机层，并用DCM(2x20mL)萃取水相。用Na2CO3水溶液(1M)洗涤合并的有机层，并添加到Z-Orn-OH(4.10g，15.4mmol)、K2CO3(3.40g，24.6mmol)和CuSO4·5H2O(0.077g，0.308mmol)在水/MeOH(1:2，150mL)混合物中的室温溶液中。在室温下搅拌18小时后，蒸发有机溶剂并用水(150mL)稀释水性浆料，并用浓HCl将其酸化至pH 2。用EtOAc(3x)萃取水层，并将合并的有机层在MgSO4上干燥，过滤并在真空中浓缩，以产生粗制XR19(4.5g)，其无需进一步纯化即可用于下一步。
对于C13H17N4O4 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为293.12，实测值为293.39。
(S)-5-氨基-2-(1-(4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰
胺基)丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯甲酸(XR22)的制备
(S)-2-(1-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-5-硝基苯甲酸甲酯(XR20)
在室温下，向叠氮化物XR19(533mg，0.912mmol)、炔烃XR18(187mg，0.912mmol)在THF(7mL)中的溶液中添加在水(1.5mL)中的CuSO4·5H2O(175mg，0.702mmol)。用N2吹扫溶液5分钟，然后添加在水(1.5mL)中的抗坏血酸钠(271mg，1.39mmol)。将黄色溶液搅拌5分钟，此时UPLC-MS分析显示完全转化。添加EtOAc(20mL)和水/盐水(1:1，10mL)，分离各层并用EtOAc(2x)萃取水相。用盐水洗涤合并的有机层，在MgSO4上干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(硅胶，庚烷:EtOAc，1:0至0:1)纯化，得到三唑产物。将分离的产物溶于DMF(10mL)，在室温下添加Cs2CO3(163mg，0.500mmol)和MeI(60μl，0.964mmol)，并将反应物搅拌16小时。浓缩后，通过快速色谱(硅胶，庚烷:EtOAc，1:0至0:1)纯化粗制物，以得到酯XR20(380mg，81％，2步)。
对于C24H26N5O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为512.18，实测值为512.33。
(S)-2-(1-(4-(4-(N-((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)甲酰胺基)苯甲酰胺基)-5-甲氧基-5-氧代戊基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-5-硝基苯甲酸甲酯(XR21)
在0℃下，将乙酸中的HBr(33％，5mL)添加到酯XR20(300mg，0.587mmol)的溶液中，并将反应物在0℃下搅拌75分钟。将混合物浓缩，并用甲苯(2x)、氯仿和乙醚共蒸发。
对于C16H20N5O6 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为378.14，实测值为378.19。
根据通用方案XXA，将粗制产物与XT7(166mg，0.489mmol)、HATU(223mg，0.59mmol)和DIPEA(0.513mL，2.93mmol)在DMF(5mL)中反应。通过快速色谱(硅胶，DCM:MeOH，1:0至4:1)纯化，得到酰胺XR21(240mg，70％)。
对于C31H31N12O8 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为699.24，实测值为699.62。
(S)-5-氨基-2-(1-(4-羧基-4-(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)氨基)苯甲酰胺基)丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯甲酸(XR22)
向酰胺XR21(280mg，0.423mmol)在DMF(3mL)中的溶液中添加饱和NH4Cl水溶液(600μl)和锌粉(830mg，12.7mmol)。一旦UPLC分析显示完全转化(约3小时)，用DMF(6mL)稀释反应混合物，并在Celite上过滤。将滤液在空气下搅拌过夜，并然后浓缩，悬浮在MeOH(6mL)中，搅拌30分钟，并过滤。收集固体并用乙醚洗涤，在空气中干燥，并无需进一步纯化即可用于下一步。将粗制中间体(109mg)溶于THF/水(1:1，2mL)中。添加LiOH(36mg，0.85mmol)，并将混合物搅拌6小时。使用AcOH(0.100mL，1.7mmol)酸化反应混合物，浓缩并与甲苯(2x)共蒸发。通过制备型RP-HPLC(水x0.1％TFA/MeCN x 0.1％TFA，梯度)纯化一部分粗制产物，以得到XR22(11mg)。
对于C28H29N12O5 +[M+H]+，MS(ESI+)计算值为613.24，实测值为613.37。
化合物的用途
癌细胞系
从美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD,USA)获得人肿瘤细胞系SK-BR-3、SW-620、A-549、BT-474、AU-565和SK-OV-3。从Essen BioScience Inc.(Ann Arbor，MI，USA)获得Jurkat NucLight红细胞。在湿润的培养箱中，在37℃下在5％CO2气氛下，将SK-BR-3和SK-OV-3细胞在补充有10％v/w胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)(热灭活的)(Heat-inactivated，HI)(Gibco-Life Technologies；Carlsbad，CA)和80U/mL Pen/Strep(Gibco-Life Technologies)的McCoys 5A培养基(Lonza；Walkersville，MD，USA)中培养。将SW-620细胞类似地维持在含有10％v/w FBS HI和80U/mL Pen/Strep的RPMI 1640培养基(Lonza)中。将A-549细胞类似地维持在补充有80U/mLPen/Strep和符合条件的(qualified，Q)(Gibco-Life Technologies)5％v/w FBS的F-12K营养混合物(1x)(Gibco-LifeTechnologies)培养基中。将BT-474和AU-565细胞类似地维持在包含符合条件的(Q)(Gibco-Life Technologies)10％v/w FBS和80U/mL Pen/Strep的RPMI 1640培养基(Lonza)中。将Jurkat NucLight红细胞类似地维持在包含10％v/w FBS HI、80U/mL Pen/Strep和0.5μg/mL嘌呤霉素(Gibco-Life Technologies)的RPMI 1640培养基(Lonza)中。
体外细胞生存力测定
将完全生长培养基中的细胞平板接种于96孔板中(90μL/孔)，并在37℃、5％CO2下以下列细胞密度孵育：6500SK-BR-3、4000SW-620、2500A-549、10000BT-474、5000AU-565、3000Jurkat NucLight红和4000SK-OV-3细胞/孔。孵育过夜之后，在DMSO(Sigma-Aldrich)中对游离药物进行10个连续对数10的稀释。这些游离药物剂量-响应曲线在完全生长培养基中进一步稀释10倍。对于根据本发明的ADC，在完全生长培养基中进行10个连续对数10的稀释。将10μL根据本发明的包含游离药物或ADC的组合物添加到测定板(对于游离药物，最终DMSO含量为1％)。6天之后，根据制造商的说明，使用发光测定试剂盒(CellTiter-GloTM(CTG，Promega Corporation))评估细胞生存力。通过以下计算细胞存活百分比：将测得的每种游离药物或ADC的根据浓度的发光除以未经处理细胞(1％DMSO对照(对于游离药物)或100％完全生长培养基(对于ADC))的平均值乘以100。
使用曲线拟合软件(GraphPad Prism,Windows版本8.4.0,GraphPad,San Diego，CA或Electronic Laboratory Notebook(ELN)add-in BioAssay,版本12.1.8.11,PerkinElmer,Waltham,MA)用具有可变斜率的S型剂量响应方程(四个参数)，通过非线性回归拟合曲线。当使用4参数逻辑拟合时，相对IC50值计算为浓度，其给出在曲线底部和顶部之间中间时的响应。数据以至少一项重复进行的实验的平均IC50值报告。
使用游离抗叶酸剂药物的实验
结果
表1：游离抗叶酸剂药物的IC50值
*用GraphPad Prism软件确定Talotrexin、XJ4、XX35、XX37、XX47、XR22和XS14的IC50。用BioAssay软件确定其他化合物的IC50；#没有完整的剂量-响应曲线，底部缺失；$陡的hill斜率；-没有测试。
比较化合物1
比较化合物1是根据Rosowsky et al,J.Med.Chem.1998,41,5310-5319中的方案合成的。
在苯环上不具有COOH取代基的化合物XJ4、XX5、XX7、XX12和XT35的活性低于talotrexin和其他具有COOH取代基的抗叶酸剂化合物。将COOH取代基替换为SO3H或四唑对抗叶酸剂活性影响不大，而将COOH取代基替换为CN看起来降低了在SK-BR-3细胞中的活性。将酰胺键(Q)替换为三唑(酰胺键生物电子等排体)对抗叶酸剂活性也几乎没有影响。在苯环上在对位引入NH2-或OH-取代基，产生抗叶酸剂活性与talotrexin相当的化合物。当与相应的对位化合物和talotrexin(不具有NH2-取代基)相比时，具有间位NH2-取代基的化合物的抗叶酸剂活性约为十分之一。
抗体-药物缀合物的实验
DAR2位点特异性缀合物的制备
向HC41C工程化曲妥珠单抗(10mg/mL，100mM组氨酸，pH 5)溶液中添加2-(二苯基膦基)苯磺酸(2-(diphenylphosphino)benzenesulfonic acid，diPPBS)(16至32摩尔当量/每摩尔当量经工程化抗体，10mM，在水
中)，并将所得混合物在室温下孵育16至24小时。使用4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)通过离心浓缩器(Vivaspin过滤器，30kDa截留，PES)或通过碳过滤除去过量的diPPBS。添加DMA，随后添加接头-药物溶液(DMA中10mM，3.5当量)。DMA的最终浓度为10％。将所得混合物在无光条件下室温孵育3小时。为了除去过量的接头-药物，添加活性炭，并将混合物在室温下孵育至少0.5小时。使用0.2μm PES或PVDF过滤器除去炭，并使用Vivaspin离心浓缩器(30kDa截留，PES)将所得ADC在4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)中配制。最后，使用0.2μm PVDF过滤器对ADC溶液进行无菌过滤。
DAR2和DAR4野生型缀合物的制备
向曲妥珠单抗溶液(12mg/mL，在4.2mM组氨酸、50mM海藻糖中，pH 6)中添加EDTA(水中25mM，4％v/v)和TRIS(水中1M，pH 8，1％v/v)。添加TCEP(水中10mM，对于DAR2为1.1当量，对于DAR4为2.2当量)，并将所得混合物在室温下孵育过夜。使用4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)，通过离心浓缩器(Vivaspin过滤器，30kDa截留，PES)除去反应物。添加DMA，随后添加接头-药物溶液(DMA中10mM，对于DAR2为4当量，对于DAR4为8当量)。DMA的最终浓度为10％。将所得混合物在没有光的情况下在室温下孵育3小时。为了除去过量的接头-药物，添加活性炭，并将混合物在室温下孵育1小时。使用0.2μm PES或PVDF过滤器除去炭，并且使用Vivaspin离心浓缩器(30kDa截留，PES)将所得ADC在4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)中配制。最后，使用0.2μm PVDF过滤器对ADC溶液进行无菌过滤。
DAR8野生型缀合物的制备
向曲妥珠单抗或非结合对照抗体利妥昔单抗的溶液(12mg/mL，在4.2mM组氨酸、50mM海藻糖中，pH 6)中添加EDTA(水中25mM，4％v/v)和TRIS(水中1M，pH 8，2％v/v)。添加TCEP(水中10mM，30当量)，并将所得混合物在室温下孵育过夜。使用4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)，通过离心浓缩器(Vivaspin过滤器，30kDa截留，PES)除去反应物。添加DMA，然后添加接头-药物溶液(DMA中10mM，14当量)。DMA的最终浓度为10％。将所得混合物在无光条件下室温孵育3小时或过夜。为了除去过量的接头-药物，添加活性炭并将混合物在室温下孵育1小时。使用0.2μm PES或PVDF过滤器除去炭，并使用Vivaspin离心浓缩器(30kDa截留，PES)将所得ADC在4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)中配制。最后，使用0.2μm PVDF过滤器对ADC溶液进行无菌过滤。
DAR10位点特异性和野生型缀合物的制备
向抗5T4抗体825a的溶液(12mg/mL，4.2mM组氨酸、50mM海藻糖中，pH 6)中添加EDTA(水中25mM，4％v/v)和TRIS(水中1M，pH 8，2％v/v)。添加TCEP(水中10mM，大于30当量)，并将所得混合物在室温下孵育过夜。由于TCEP过量，因此野生型和经工程化的半胱氨酸二者均减少。使用4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH6)，通过离心浓缩器(Vivaspin过滤器，30kDa截留，PES)除去反应物。添加DMA，随后添加接头-药物溶液(DMA中10mM，14当量)。DMA的最终浓度为10％。将所得混合物在无光条件下室温孵育3小时或过夜。为了除去过量的接头-药物，添加活性炭并将混合物在室温下孵育1小时。使用0.2μm PES或PVDF过滤器除去炭，并使用Vivaspin离心浓缩器(30kDa截留，PES)将所得ADC在4.2mM组氨酸、50mM海藻糖(pH 6)中配制。最后，使用0.2μm PVDF过滤器对ADC溶液进行无菌过滤。
表2：抗叶酸剂ADC的特性
*用GraphPad Prism软件拟合的数据。**用BioAssay软件拟合的数据；#没有完整的剂量-响应曲线，底部缺失；$陡的hill斜率；-没有测试。
在HER2阳性SK-BR-3人肿瘤细胞系中，(位点特异性)曲妥珠单抗-XT17抗叶酸剂ADC的细胞毒性随DAR提高(图1)。曲妥珠单抗-XT17 DAR8和其他曲妥珠单抗DAR8缀合物的细胞毒性大多表现相当，例外在于曲妥珠单抗-XT46和曲妥珠单抗-XR12看起来活性略低，而曲妥珠单抗与XT41、XX19、XR16、XX23和XT94的缀合物显示出更高的活性。DAR10 825a缀合物在SK-BR-3细胞中的活性低于其各自相应的DAR8曲妥珠单抗缀合物。正如预期，非结合对照ADC(利妥昔单抗-XT17)仅在高浓度下对表达HER2的肿瘤细胞的生长具有作用。所有曲妥珠单抗-XT17抗叶酸剂ADC对SW620(HER2阴性人肿瘤细胞系)均无活性(IC50>10nM)(图2)。
体内效力实验
体内方案
在CByJ.Cg-Foxn1nu/J小鼠的BT-474细胞系(来自60岁高加索人女性患者的浸润性导管乳腺癌；Lasfargues et al,J.Natl.Cancer Inst.1978,61(4),967–978)异种移植模型中和在雌性NMRI裸鼠(Crl:NMRI-Foxn1nu)的MAXF574患者来源的异种移植模型(浸润性导管乳腺癌；三阴性乳腺癌)中评价了曲妥珠单抗抗叶酸剂ADC1(表2和表3中的DAR8–XT17野生型缀合的曲妥珠单抗ADC)的体内效力。
BT-474模型
在37℃下在湿润气氛(5％CO2，95％空气)中，将黏附性BT-474细胞以单层培养在包含补充有10％FBS的4mM L-谷氨酰胺的杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco's ModifiedEagle Medium，DMEM)中。使用之前，通过用胰蛋白酶-EDTA处理5分钟来从培养瓶中分离肿瘤细胞，并通过添加完全培养基进行中和。使用0.25％台盼蓝排除测定对细胞进行计数并评估生存力。
通过以下来诱导肿瘤：在用γ源(2Gy(裸鼠)，60Co,BioMep,France)全身辐照射之后24至72小时，将200μL包含50％(v/v)基质凝胶(356237，BD Biosciences，France)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中的2x107个BT-474细胞皮下注射到健康雌性BalB/c裸ByJ(CByJ.Cg-Foxn1nu/J)小鼠的右胁腹。
当值达到150至250mm3的平均值时，使用Vivo 
软件(Biosystemes，France)按单个肿瘤体积将动物随机分配到不同的处理组(n＝3/处理组；小鼠临床试验形式)。通过方差分析(analysis of variance，ANOVA)测试组间的均一性。随机分配之后，通过静脉内注射(intravenous injection，IV)到尾静脉中来施用治疗剂。
MAXF574模型
在裸鼠中连续传代从异种移植物获得肿瘤片段。在从供体小鼠中取出之后，将肿瘤切成片段(边缘长度为3至4mm)，并在胁腹单侧植入SC。当肿瘤植入体体积接近80至250mm3的目标范围时，将小鼠在处理组之间随机化，以达到相当的组肿瘤体积的中位值和平均值。在同一天或第二天，以3或10mg/kg抗叶酸剂ADC1的单次IV给药注射到尾静脉内来向小鼠(n＝3/处理组；小鼠临床试验形式)给药。
每周测量体重和肿瘤尺寸两次或三次。使用卡尺测量肿瘤的长度和宽度，然后使用以下公式估计肿瘤体积：肿瘤体积＝0.5x长度x宽度2(Simpson-Herren et al,CancerChemother.Rep.1970,54,143-174)。
结果
图3A显示，在5mg/kg IV的单剂量下，抗叶酸剂ADC1(曲妥珠单抗-XT17；DAR8)在小鼠BT-474细胞系异种移植模型中使肿瘤体积减小。当以一周的间隔以1.7mg/kg IV的三个单独剂量给予抗叶酸剂ADC1时，肿瘤减小作用相似(Q1Wx3，图3B)。
荷BT-474瘤的小鼠发生恶病质，如图4A和4B所示。这种体重减轻通常在施用有效治疗之后恢复，并且其被认为是敏感的效力生物标志项。抗叶酸剂ADC1(5mg/kg IV或1.7mg/kg IV Q1Wx3)的处理导致体重恢复(图4B)，两种给药方案相似。
图5显示，在3或10mg/kg IV的单剂量下，抗叶酸剂ADC1(曲妥珠单抗-XT17；DAR8)在小鼠MAXF574患者来源异种移植模型中使肿瘤体积减小。肿瘤减小作用是剂量依赖性的，并且观察到几乎完全缓解直到单次IV注射10mg/kg之后20天。
Claims (18)
1.式(I)的接头-药物化合物
其中，
R1是O、NH2或OH；
R2和R2’独立地是N、CH或CMe；
R3是NH、N(C1-5烷基)、CH2、CH(C1-5烷基)、CH(C2-4烯基)、CH(C2-4炔基)或CH(C1-4烷氧基)；
R4是H、卤素、-COOH、OH、NH2、-CONH2、-CONHR、-CONHR2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、苄氧基、四唑、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-CN或叠氮基，其中R选自H和C1-5烷基，或者R4是选自以下的羧酸生物电子等排体：
其中Ra’选自H、CH2F、CHF2、CF3和C1-6烷基，每个Ra独立地选自H、F、CH2F、CHF2、CF3和C1-6烷基，并且两个Ra取代基可以任选地连接形成环；
R5是H、卤素、CF3、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基或C1-4烷硫基，优选H、F、CH3、CF3、CH2CH3、CH＝CH2、CH2CF3或CF2CF3，更优选H或F；
R6是H、C1-4烷基、C2-4烯基、C3-6环烷基，优选H；
n是1、2、3或4，优选3；
Q是不存在的，或者为-N(R7)-(C＝O)-、-(C＝O)-N(R7)-、-CH2N(R7)-、-N(R7)CH2-、-N(R7)SO2-、或-SO2N(R7)-，其中R7是H、C1-4烷基、C1-4烯基或C1-4炔基，优选H，或者Q是选自以下的酰胺键生物电子等排体：
其中Rb选自H和C1-5烷基，T1、T1’和T1”独立地选自CH和N，并且W1、W1’和W1”独立地选自C、CH、S、N、NH、N(C1-5烷基)和O；
V是芳基、杂芳基、杂环或环烷烃，其任选地被一个或更多个R4基团取代，并且独立地选自：
其中U1、U1’、U1”、U2、U2’、U2”和U2”’独立地选自C、CH、S、N、NH、N(C1-5烷基)和O，或者V选自：
其中Z是O、S、NH或NRc，并且Rc选自H和C1-5烷基；
s是0或1，优选1；
X是选自O、NH、S、C1-5亚烷基、C1-5亚烯基和C1-5亚炔基的连接基团；
k是1、2、3或4，优选1；
L是接头部分；并且
2.式(Ia)的根据权利要求1所述的接头-药物化合物
3.式(Ic)的根据权利要求1或2所述的接头-药物化合物
4.根据权利要求1至3中任一项所述的接头-药物化合物，其中L是
其中，
m是1至10的整数，优选5；
AA是氨基酸，优选天然氨基酸；并且
p是0、1、2、3或4；
q是1至12的整数，优选2；
ES是不存在的，或者是选自以下的延伸间隔基：
RL是不存在的或者是选自以下的消除间隔基：
其中t是1至10的整数，R10是任选地经取代的C1-4烷氧基，并且R11是H、任选地经取代的C1-6烷基、任选地经取代的C6-14芳基或任选地经取代的C-连接的C3-8杂芳基；
优选地其中L是：
5.根据权利要求1至3中任一项所述的接头-药物化合物，其中L是
6.根据权利要求1至4中任一项所述的接头-药物化合物，其中所述接头-药物化合物具有下式：
7.根据权利要求1至4中任一项所述的接头-药物化合物，其中所述接头-药物化合物具有下式：
8.式(III)的抗体-药物缀合物，
Ab-(L-D)y (III)，
其中Ab是抗体或其抗原结合片段；
L-D是根据权利要求1至7中任一项所述的接头-药物化合物；
y表示1至16的平均药物与抗体比率；
并且其中所述接头-药物化合物与所述抗体或其抗原结合片段缀合，优选地通过所述抗体或所述抗原结合片段的半胱氨酸残基。
9.根据权利要求8所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物具有下式：
其中，
Ab是抗体或其抗原结合片段；并且
y表示1至16、优选1至10的平均药物与抗体比率。
10.根据权利要求8或9所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段与选自以下的抗原靶标结合：
膜联蛋白Al，B7H3，B7H4，BCMA，CA6，CA9，CA15-3，CA19-9，CA27-29，CA125，CA242，CAIX，CCR2，CCR5，CD2，CD19，CD20，CD22，CD24，CD30，CD33，CD37，CD38，CD40，CD44，CD47，CD56，CD70，CD71，CD73，CD74，CD79，CD115，CD123，CD138，CD203c，CD303，CD333，CDCP1，CEA，CEACAM，密封蛋白4，密封蛋白7，CLCA-1，CLL1，c-MET，Cripto，DLL3，EGFL，EGFR，EPCAM，EphA2，EPhB3，ETBR，FAP，FcRL5，FGFR3，FOLR1，FRβ，GCC，GD2，GITR，GLOBO H，GPA33，GPC3，GPNMB，HER2，p95HER2，HER3，HMW-MAA，整联蛋白α，IGF1R，TM4SF1，路易斯A样碳水化合物，路易斯X，路易斯Y，LGR5，LIV1，间皮素，MN，MUC1，MUC16，NaPi2b，连接蛋白-4，Notch3，PD-1，PD-L1，PSMA，PTK7，SLC44A4，STEAP-1，5T4，TF，TF-Ag，Tag72，TNFα，TNFR，TROP2，uPAR，VEGFR和VLA。
11.药物组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的接头-药物化合物或根据权利要求8至10中任一项所述的抗体-药物缀合物，以及一种或更多种可药用赋形剂。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的接头-药物化合物、根据权利要求8至10中任一项所述的抗体-药物缀合物或根据权利要求11所述的药物组合物，其用作药物。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的接头-药物化合物、根据权利要求8至10中任一项所述的抗体-药物缀合物或根据权利要求11所述的药物组合物，其用于治疗实体瘤或恶性血液病。
14.根据权利要求1至7中任一项所述的接头-药物化合物、根据权利要求8至10中任一项所述的抗体-药物缀合物或根据权利要求11所述的药物组合物，其用于治疗自身免疫疾病，优选类风湿性关节炎。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的接头-药物化合物、根据权利要求8至10中任一项所述的抗体-药物缀合物或根据权利要求11所述的药物组合物，其用于治疗细菌感染、病毒感染、寄生虫感染或其他感染。
16.根据权利要求1至7中任一项所述的接头-药物化合物、根据权利要求8至10中任一项所述的抗体-药物缀合物或根据权利要求11所述的药物组合物，其用于与一种或更多种另外的治疗剂组合治疗。
17.下式化合物在制备根据权利要求1至7中任一项所述的接头-药物化合物或根据权利要求8至10中任一项所述的抗体-药物缀合物的方法中的用途：
其中
R1是O、NH2或OH；
R2和R2’独立地是N、CH或CMe；
R3是NH、N(C1-5烷基)、CH2、CH(C1-5烷基)、CH(C2-4烯基)、CH(C2-4炔基)或CH(C1-4烷氧基)；
R4是H、卤素、-COOH、OH、NH2、-CONH2、-CONHR、-CONHR2、C1-4烷基、C1-4烷氧基、苄氧基、四唑、-SO3H、-OSO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-CN或叠氮基，其中R选自H和C1-5烷基，或者R4是选自以下的羧酸生物电子等排体：
其中Ra’选自H、CH2F、CHF2、CF3和C1-6烷基，每个Ra独立地选自H、F、CH2F、CHF2、CF3和C1-6烷基，并且两个Ra取代基可以任选地连接形成环；
R5是H、卤素、CF3、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基或C1-4烷硫基，优选H、F、CH3、CF3、CH2CH3、CH＝CH2、CH2CF3或CF2CF3，更优选H或F；
R6是H、C1-4烷基、C2-4烯基、C3-6环烷基，优选H；
n是1、2、3或4，优选3；
Q是不存在的，或者为-N(R7)-(C＝O)-、-(C＝O)-N(R7)-、-CH2N(R7)-、-N(R7)CH2-、-N(R7)SO2-、或-SO2N(R7)-，其中R7是H、C1-4烷基、C1-4烯基或C1-4炔基，优选H，或者Q是选自以下的酰胺键生物电子等排体：
其中Rb选自H和C1-5烷基，T1、T1’和T1”独立地选自CH和N，并且W1、W1’和W1”独立地选自C、CH、S、N、NH、N(C1-5烷基)和O；
V是芳基、杂芳基、杂环或环烷烃，其任选地被一个或更多个R4基团取代，并且独立地选自：
其中U1、U1’、U1”、U2、U2’、U2”和U2”’独立地选自C、CH、S、N、NH、N(C1-5烷基)和O，或者V选自：
其中Z是O、S、NH或NRc，并且Rc选自H和C1-5烷基；
s是0或1，优选1；
X选自O、NH、S、C1-5亚烷基、C1-5亚烯基和C1-5亚炔基；并且
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述化合物是：
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