[go: up one dir, main page]

CN116103371A - 一种用于评估干细胞分化状态的方法及试剂盒 - Google Patents

一种用于评估干细胞分化状态的方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN116103371A
CN116103371A CN202310150617.0A CN202310150617A CN116103371A CN 116103371 A CN116103371 A CN 116103371A CN 202310150617 A CN202310150617 A CN 202310150617A CN 116103371 A CN116103371 A CN 116103371A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
seq
primer sequence
genes
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202310150617.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116103371B (zh
Inventor
王涛
濮悦
任文静
杜媛媛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Repugene Technology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Repugene Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Repugene Technology Co ltd filed Critical Hangzhou Repugene Technology Co ltd
Publication of CN116103371A publication Critical patent/CN116103371A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116103371B publication Critical patent/CN116103371B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于评估干细胞分化状态的方法及试剂盒，该方法首先筛选出待评估干细胞分化相关基因作为靶标基因，并对筛选出的靶标基因设计引物，进行多重PCR扩增，并对PCR产物进行高通量测序，可以快速高效的获得目标基因的表达情况，从而帮助快速准确地评估干细胞的分化状态。

Description

一种用于评估干细胞分化状态的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种通过检测相关基因表达快速评估体干细胞分化状态的方法及试剂盒。
背景技术
目前文献中对于干细胞分化处理后基因表达的检测常采用的方法是荧光RT-PCR技术或者单细胞RNA测序技术。荧光RT-PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，检测目的基因的表达情况。单细胞RNA测序(scRNA-seq)是一种在单细胞水平上利用RNA测序对特定细胞群体进行基因表达谱定量的高通量实验技术。
利用荧光RT-PCR检测基因表达的优点是时间短、成本低、灵敏度高，但限于荧光通道有限，无法在同一反应中同时检测多种(十几种)基因的表达。
单细胞RNA测序虽然能够对各个细胞的基因表达进行异质性分析，但其流程复杂，耗时久，成本高。
因此有必要开发一种检测方法，既可以覆盖较多基因又可以在干细胞分化处理后通过检测相关基因的表达情况快速地评估干细胞的分化状态。
发明内容
本发明的目的是解决利用现有技术检测覆盖基因较少或者检测流程复杂，耗时久，成本高的问题，提供了一种用于评估体干细胞分化状态的方法及试剂盒，可提高检测的准确度和速度，帮助快速地评估干细胞的分化状态。
本发明通过对靶基因区域附近设计引物，进行多重PCR扩增，并对PCR产物进行高通量测序，可以快速高效的获得目标基因的表达情况。
本发明所采用的技术方案如下：
一种用于评估干细胞分化状态的方法，包括以下步骤：
S1：提取待测干细胞RNA；
S2：合成cDNA；
S3：加入检测目的基因的引物进行第一轮多重PCR扩增，所述目的基因为FEV基因、ONECUT2基因、zkscan1基因、stat1基因、ARID3A基因、RFX6基因、pax4基因、neurod1基因、TPH1基因、LMX1A基因、INS基因、MAFA基因、IAPP基因、FOSB基因、HOPX基因、NR4A1基因、SAMD11基因、SIX3基因、ATF3基因、FOS基因、MEIS2基因、NROB1基因、ATF4基因、CEBPD基因、DDIT3基因、JUNB基因、EGR1基因、SIX2基因、TSC22D1基因、ARNTL2基因、HSF4基因、ELF3基因、HSF2基因、IRF1基因、UCN3基因、ngn3基因、MNX1基因和ZNF358基因；
S4：加入接头序列进行第二轮PCR反应；
S5：磁珠纯化；
S6：测序分析，根据测序结果评估干细胞分化状态。
作为优选，检测目的基因的引物序列如下：
FEV基因引物序列如SEQ ID NO:1～2所示；ONECUT2基因引物序列如SEQ ID NO:3～4
所示；zkscan1基因引物序列如SEQ ID NO:5～6所示；stat1基因引物序列如SEQID NO:7～8
所示；ARID3A基因引物序列如SEQ ID NO:9～10所示；RFX6基因引物序列如SEQ ID
NO:11～12所示；pax4基因引物序列如SEQ ID NO:13～14所示；neurod1基因引物序列如SEQ ID NO:15～16所示；TPH1基因引物序列如SEQ ID NO:17～18所示；LMX1A基因引物序列如SEQ ID NO:19～20所示；INS基因引物序列如SEQ ID NO:21～22所示；MAFA基因引物序列如SEQ ID NO:23～24所示；IAPP基因引物序列如SEQ ID NO:25～26所示；FOSB基因引物序列如SEQ ID NO:27～28所示；HOPX基因引物序列如SEQ ID NO:29～30所示；NR4A1基因、引物序列如SEQ ID NO:31～32所示；SAMD11基因引物序列如SEQ ID NO:33～34所示；SIX3基因引物序列如SEQ ID NO:35～36所示；ATF3基因引物序列如SEQ ID NO:37～38所示；FOS基因引物序列如SEQ ID NO:39～40所示；MEIS2基因引物序列如SEQ ID NO:41～42所示；NROB1基因引物序列如SEQ ID NO:43～44所示；ATF4基因引物序列如SEQ ID NO:45～46所示；CEBPD基因引物序列如SEQ ID NO:47～48所示；DDIT3基因引物序列如SEQ ID NO:49～50所示；JUNB基因引物序列如SEQ ID NO:51～52所示；EGR1基因引物序列如SEQ IDNO:53～54所示；SIX2基因引物序列如SEQ ID NO:55～56所示；TSC22D1基因引物序列如SEQID
NO:57～58所示；ARNTL2基因引物序列如SEQ ID NO:59～60所示；HSF4基因引物序列如SEQ ID NO:61～62所示；ELF3基因引物序列如SEQ ID NO:63～64所示；HSF2基因引物序列如SEQ ID NO:65～66所示；IRF1基因引物序列如SEQ ID NO:67～68所示；UCN3基因引物序列如SEQ ID NO:69～70所示；ngn3基因引物序列如SEQ ID NO:71～72所示；MNX1基因引物序列如SEQ ID NO:73～74所示；ZNF358基因引物序列如SEQ ID NO:75～76所示。
作为优选，步骤S2加入检测目的基因的引物同时，还加入有检测内参基因的引物，所述内参基因为GAPDH基因和ACTB基因。
作为优选，内参基因的引物序列如下：
GAPDH基因的引物序列如SEQ ID NO:77～78所示；ACTB基因的引物序列如SEQ ID
NO:79～80所示。
作为优选，检测目的基因的引物按照下列比例配置引物池溶液：
基因名称 引物浓度 加入体积 基因名称 引物浓度 加入体积
NR4A1 10uM 4ul IAPP 10uM 2ul
CEBPD 10uM 4ul UCN3 10uM 2ul
MAFA 10uM 4ul DDIT3 10uM 2ul
SIX2 10uM 4ul ELF3 10uM 2ul
HSF4 10uM 4ul zkscan1 10uM 2ul
EGR1 10uM 1ul SIX3 10uM 2ul
TSC22D1 10uM 4ul MEIS2 10uM 2ul
INS 10uM 1ul HOPX 10uM 2ul
ARNTL 10uM 4ul ngn3 20uM 2ul
FOS 10uM 2ul ZNF358 10uM 2ul
JUNB 10uM 2ul MNX1 10uM 2ul
FOSB 30uM 2ul ONECUT2 10uM 2ul
SAMD11 10uM 2ul RFX6 10uM 2ul
IRF1 20uM 2ul neurod1 10uM 2ul
ATF4 10uM 2ul ARID3A 10uM 2ul
ATF3 20uM 2ul FEV 10uM 2ul
HSF2 60uM 2ul stat1 10uM 2ul
ACTIN 10uM 2ul pax4 10uM 2ul
GAPDH 10uM 2ul TPH1 10uM 2ul
NROB1 20uM 2ul LMX1A 10uM 2ul
在步骤S3中，每20微升cDNA溶液加入2微升引物池溶液。
优选地，所述干细胞为胰岛干细胞。
本发明还提供了一种用于评估干细胞分化状态的试剂盒，所述试剂盒含有检测目的基因的引物，所述目的基因为FEV基因、ONECUT2基因、zkscan1基因、stat1基因、ARID3A基因、RFX6基因、pax4基因、neurod1基因、TPH1基因、LMX1A基因、INS基因、MAFA基因、IAPP基因、FOSB基因、HOPX基因、NR4A1基因、SAMD11基因、SIX3基因、ATF3基因、FOS基因、MEIS2基因、NROB1基因、ATF4基因、CEBPD基因、DDIT3基因、JUNB基因、EGR1基因、SIX2基因、TSC22D1基因、ARNTL2基因、HSF4基因、ELF3基因、HSF2基因、IRF1基因、UCN3基因、ngn3基因、MNX1基因和ZNF358基因。
作为优选，检测目的基因的引物序列如下：FEV基因引物序列如SEQ ID NO:1～2所示；ONECUT2基因引物序列如SEQ ID NO:3～4所示；zkscan1基因引物序列如SEQ ID NO:5～6所示；stat1基因引物序列如SEQ ID NO:7～8所示；ARID3A基因引物序列如SEQ ID NO:9～10所示；RFX6基因引物序列如SEQ ID NO:11～12所示；pax4基因引物序列如SEQ ID NO:13～14所示；neurod1基因引物序列如SEQ ID NO:15～16所示；TPH1基因引物序列如SEQ ID
NO:17～18所示；LMX1A基因引物序列如SEQ ID NO:19～20所示；INS基因引物序列如SEQ ID NO:21～22所示；MAFA基因引物序列如SEQ ID NO:23～24所示；IAPP基因引物序列如SEQ ID NO:25～26所示；FOSB基因引物序列如SEQ ID NO:27～28所示；HOPX基因引物序列如SEQ ID NO:29～30所示；NR4A1基因、引物序列如SEQ ID NO:31～32所示；SAMD11基因引物序列如SEQ ID NO:33～34所示；SIX3基因引物序列如SEQ ID NO:35～36所示；ATF3基因引物序列如SEQ ID NO:37～38所示；FOS基因引物序列如SEQ ID NO:39～40所示；MEIS2基因引物序列如SEQ ID NO:41～42所示；NROB1基因引物序列如SEQ ID NO:43～44所示；ATF4基因引物序列如SEQ ID NO:45～46所示；CEBPD基因引物序列如SEQ ID NO:47～48所示；DDIT3基因引物序列如SEQ ID NO:49～50所示；JUNB基因引物序列如SEQ ID NO:51～52所示；EGR1基因引物序列如SEQ ID NO:53～54所示；SIX2基因引物序列如SEQ ID NO:55～56所示；TSC22D1基因引物序列如SEQ ID NO:57～58所示；ARNTL2基因引物序列如SEQ IDNO:59～60所示；HSF4基因引物序列如SEQ ID NO:61～62所示；ELF3基因引物序列如SEQ IDNO:63～64所示；HSF2基因引物序列如SEQ ID NO:65～66所示；IRF1基因引物序列如SEQ IDNO:67～68所示；UCN3基因引物序列如SEQ ID NO:69～70所示；ngn3基因引物序列如SEQ IDNO:71～72所示；MNX1基因引物序列如SEQ ID NO:73～74所示；ZNF358基因引物序列如SEQID NO:75～76所示。
作为优选，所述试剂盒还含有检测内参基因的引物，所述内参基因为GAPDH基因和ACTB基因。
作为优选，检测内参基因的引物序列如下：GAPDH基因的引物序列如SEQ ID NO:77～78所示；ACTB基因的引物序列如SEQ ID NO:79～80所示。
近年来，胰岛移植作为新兴的糖尿病治疗方法，在临床应用上取得了一定成功，但供体胰岛的严重不足限制了该治疗手段的进一步普及。因此，发展在体外产生大量表达胰岛素的β细胞的技术方法具有临床应用价值。主要有两种方法，第一种是基于胚胎干细胞(ESCs)和诱导性多能干细胞(iPSCs)的定向诱导分化获取功能性胰岛细胞。第二种是以胰腺组织的细胞为来源，从胰腺导管细胞或胰岛α细胞转分化产生β细胞。尽管如此，体外生成的SC-胰岛与供体胰岛在功能和转录上仍然不完全相等，与来自供体胰岛的β细胞相比，体外来源的SC-β细胞缺乏或低表达许多重要的成熟基因，如MAFA。而移植后SC-β细胞分泌INS的功能和数量增加。这种增加的原因尚不清楚，可能与伴随祖细胞的分化、移植物的重塑以及细胞的成熟状态不受其来源的体外条件所决定有关。然而，对这些移植细胞的进一步评估仅限于免疫染色和体外移植的功能评估。
本发明实施方式中，利用上述的方法，借助多重扩增子测序技术快速检测体外生成的SC-胰岛以及移植的SC-胰岛细胞和原代胰岛相比的基因表达变化。有助于理解和推进当前的定向分化技术，以开发新的细胞治疗糖尿病，为胰岛细胞的移植研究和再生医学应用提供指导。
通过实施上述技术方案，本发明具有如下的优点：本发明通过筛选与待评估干细胞相关基因，并对筛选出的靶标基因设计引物，进行多重PCR扩增，并对PCR产物进行高通量测序，可以快速高效的获得目标基因的表达情况，从而帮助快速准确地评估干细胞的分化状态。
附图说明
附图1为实施例2中对引物浓度优选前后的均一性比较曲线图；
附图2为各样本中目的基因reads的检出情况统计分析柱状图。
具体实施方式
结合以下具体实施，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括于本发明中，并且以所附的权利要求书保护范围为准。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
多重扩增子测序检测干细胞分化相关基因表达的方法学初步构建
一、靶标基因的选择
通过查找相关文献选择以下与干细胞分化相关的基因或胰岛细胞特征基因进行检测，所选靶标基因信息列表见表1。
表1靶标基因信息列表
基因 geneID 基因 geneID 基因 geneID 基因 geneID
FEV 54738 INS 3630 MEIS2 4212 HSF4 3299
ONECUT2 9480 MAFA 389692 NROB1 190 ELF3 1999
zkscan1 7586 IAPP 3375 ATF4 468 HSF2 3298
stat1 6772 FOSB 2354 CEBPD 1052 IRF1 3659
ARID3A 1820 HOPX 84525 DDIT3 1649 UCN3 114131
RFX6 222546 NR4A1 3164 JUNB 3726 ngn3 50674
pax4 5078 SAMD11 148398 EGR1 1958 MNX1 3110
neurod1 4760 SIX3 6496 SIX2 10736 ZNF358 140467
TPH1 7166 ATF3 467 TSC22D1 8848
LMX1A 4009 FOS 2353 ARNTL2 56938
内参基因将从以下表2中所示的4种基因种筛选：
表2内参基因列表
基因 geneID
GAPDH 2597
SDHA 6389
ACTB 60
18S rRNA /
二、引物的设计合成
根据基因的保守区域，采用引物探针设计软件Primer Express 3.0.1设计引物序列，引物位置跨越不同外显子，特异性引物加接头的长度范围47bp-62bp，扩增子长度控制在大于75bp、小于300bp的范围内，上下游引物的TM值差值基本在0℃-3℃。引物通过UCSCblast特异性良好。各引物基因序列见下表3。
表3目的基因与内参基因引物序列表
Figure BDA0004090633820000061
Figure BDA0004090633820000071
Figure BDA0004090633820000081
Figure BDA0004090633820000091
Figure BDA0004090633820000101
上述表1中的各目的基因的引物通过多重引物二聚体分析无引物二聚体存在，分析网站：https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html。
三、多重扩增子测序流程检测样本测试
1、采用凯杰RNA提取试剂盒RNeasy Universal Kits提取正常胰岛细胞样本B_0903islet的RNA，使用分光光度计(Thermo Fisher)检测RNA的浓度和纯度，确保RNA浓度大于50ng/ul且A260/A280在1.9-2.1之间、A260/A230大于1.7，将待测样本的浓度标准化至50ng/ul。
2、将所有目的基因和内参基因的引物干粉离心后加入相应体积的Nuclease-freeWater稀释为100uM，然后再稀释为10uM，将所有基因的上下游引物按照1：1混合成Primer-Mix。
3、cDNA合成
3.1、配制反应体系
按照下表4进行反应体系配制：
表4反应体系
Figure BDA0004090633820000111
轻轻地上下吹打至少10次以彻底混合，然后短暂离心以将溶液收集到试管底部。
3.2、反应程序
按照以下步骤在热循环仪中孵育20μl的反应mix：
Figure BDA0004090633820000112
4、PCR1
4.1按照下表5在冰上配制PCR1反应：
表5PCR1反应体系
Figure BDA0004090633820000113
4.2上下吹打至少10次，轻轻混合，然后短暂离心以将溶液收集到试管底部。
4.3在热循环仪中将盖温度设置为≥100℃孵育反应，并在以下表6所示的循环条件下进行PCR：
表6PCR1反应条件
Figure BDA0004090633820000114
Figure BDA0004090633820000121
5、PCR2(加Index扩增文库)
5.1每管样在样品管上标记编排好的Index号；
5.2按照如下表7所示体系组成在冰上配制PCR Master Mix：
表7PCR2反应体系
Figure BDA0004090633820000122
5.3对于每个反应，将39ul PCR Master Mix加入干净的0.2ml的PCR管中。
5.4将来自PCR1的1ul PCR产物添加到每个PCR管中。
5.5添加5ul的Index Primer Mix到每个样本中。混匀并短暂旋转以收集底部。
5.6在热循环仪中将盖温度设置为≥100℃孵育反应，并在以下表8所示的循环条件下进行PCR：
表8PCR2反应条件
Figure BDA0004090633820000123
5.7PCR反应完成后，简短离心，立即进行下一步的纯化。
6、AMPure XP磁珠纯化
6.1将AMPure XP磁珠室温放置30min以上，使用前充分混匀；
6.2每管样品中加入75ul AMPure XP磁珠(1.5倍体积)，吹吸混匀10次，室温静置5min；
6.3样品管放入磁力架，静置5min至液体澄清；
6.4样品管仍放在磁力架上，小心移去上清液，避免吸到磁珠；
6.5样品管仍放在磁力架上，用200ul 70％乙醇清洗磁珠，静置30s后移去乙醇；
6.6重复步骤5一次；
6.7取下样品管，简短离心，将样本管放回磁力架静置30s后，移去剩余乙醇；
6.8室温开盖晾干5min，使乙醇完全挥发；
6.9样品管仍放在磁力架上，向各管内加入20ul水；
6.10将样品管取下，吹吸混匀后室温静置2min；
6.11样品管放入磁力架，静置3min至液体澄清；
6.12转移18ul上清液至新的1.5ml离心管。
7、Qubit检测文库浓度
采用dsDNAHS Assay Kit for Qubit(翌圣)试剂和Qubit 3.0仪器检测文库浓度。
8、文库质检
使用安捷伦4150分析仪和High Sensitivity D1000芯片和试剂检测文库片段大小，结果见表9。
表9文库片段大小检测结果
Figure BDA0004090633820000131
9、上机测序
采用Illumina HiSeq X Ten 2x 75进行上机测序，目标测序量0.5G，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行上机测序操作。
10、下机数据结果分析
实验数据为两次重复的结果，分析各基因reads的检出情况见表10：
表10各基因reads的检出情况
Figure BDA0004090633820000132
Figure BDA0004090633820000141
结果分析：1、内参基因SDHA检出过低；2、内参基因18S rRNA占比太大，导致其他基因检出偏少。3、目的基因DDIT3、SAMD11、SIX3、FOS、MEIS2、JUNB、EGR1检出偏低。
实施例2
多重扩增子测序检测干细胞分化相关基因表达的流程优化1
实施例1中的结果表明四种内参基因GAPDH、SHDA、ACTB、18S rRNA中SDHA和18SrRNA检出结果偏低和偏高，不适合作为检测内参基因，因此将SDHA和18S rRNA去除，保留GAPDH和ACTB两种内参基因。另外，目的基因DDIT3、SAMD11、SIX3、FOS、MEIS2、JUNB、EGR1检出偏低，因此通过进行普通PCR和凝胶电泳测试筛选合适引物，筛选后将这7种目的基因的引物序列调整如下表11：
表11部分目的基因调整后的引物序列表
Figure BDA0004090633820000142
Figure BDA0004090633820000151
按照实施例1中的实验步骤进行正常胰岛细胞样本B_0903islet测试，下机数据结果分析各基因reads的检出情况见表12：
表12各基因reads的检出情况
Figure BDA0004090633820000152
Figure BDA0004090633820000161
结果分析：经调整后各目的基因均正常检出，其中一些基因检出相对偏少是因为本身该基因为低表达基因，如：LMX1A和NR4A1。
实施例3
多重扩增子测序检测干细胞分化相关基因表达的流程优化2
实施例2中的结果表明经过调整优化后各目的基因均正常检出，但基因检出的均一性较差，因此本实施例进行了引物池浓度的调整，最终得出最佳引物池比例，具体如下表13：
表13最佳的引物池浓度比例
基因名称 引物浓度 加入体积 基因名称 引物浓度 加入体积
NR4A1 10uM 4ul IAPP 10uM 2ul
CEBPD 10uM 4ul UCN3 10uM 2ul
MAFA 10uM 4ul DDIT3 10uM 2ul
SIX2 10uM 4ul ELF3 10uM 2ul
HSF4 10uM 4ul zkscan1 10uM 2ul
EGR1 10uM 1ul SIX3 10uM 2ul
TSC22D1 10uM 4ul MEIS2 10uM 2ul
INS 10uM 1ul HOPX 10uM 2ul
ARNTL 10uM 4ul ngn3 20uM 2ul
FOS 10uM 2ul ZNF358 10uM 2ul
JUNB 10uM 2ul MNX1 10uM 2ul
FOSB 30uM 2ul ONECUT2 10uM 2ul
SAMD11 10uM 2ul RFX6 10uM 2ul
IRF1 20uM 2ul neurod1 10uM 2ul
ATF4 10uM 2ul ARID3A 10uM 2ul
ATF3 20uM 2ul FEV 10uM 2ul
HSF2 60uM 2ul stat1 10uM 2ul
ACTIN 10uM 2ul pax4 10uM 2ul
GAPDH 10uM 2ul TPH1 10uM 2ul
NROB1 20uM 2ul LMX1A 10uM 2ul
按照实施例1中的实验步骤进行正常胰岛细胞样本B_0903islet测试，下机数据结果分析各基因reads的检出情况如表14：
表14各基因reads的检出情况
SampleID R2104018
FEV 1903
ONECUT2 4450
zkscan1 39820
stat1 67
ARID3A 1526
RFX6 2157
pax4 129
neurod1 2574
TPH1 379
LMX1A 1
INS 116097
MAFA 1198
IAPP 109683
FOSB 6745
HOPX 7257
NR4A1 54
SAMD11 361620
SIX3 12737
ATF3 138671
FOS 722225
MEIS2 7849
NROB1 30220
ATF4 241235
CEBPD 10011
DDIT3 131409
JUNB 412908
EGR1 79033
SIX2 672
TSC22D1 2837
ARNTL 1545
HSF4 2501
ELF3 16000
HSF2 166866
IRF1 37854
UCN3 78261
ngn3 240
MNX1 3237
ZNF358 4920
GAPDH 134250
ACTB 118752
统计分析显示，优化后的均一性明细好于优化前，均一性结果见附图1。
实施例4
干细胞分化处理后的细胞与正常胰岛细胞及阴性细胞检测对比
采用凯杰RNA提取试剂盒RNeasy Universal Kits提取阴性细胞(处理前)样本adsc-HFF、干细胞分化处理后的细胞样本B_DFZ10906和正常胰岛细胞样本B_0903islet和的RNA，使用分光光度计(Thermo Fisher)检测RNA的浓度和纯度，确保RNA浓度大于50ng/ul且A260/A280在1.9-2.1之间、A260/A230大于1.7，将待测样本的浓度标准化至50ng/ul。
将所有目的基因和内参基因的引物干粉离心后加入相应体积的Nuclease-freeWater稀释为100uM，然后再稀释为10uM，将所有基因的上下游引物按照优化后的引物池比例混合成Primer-Mix。
按照实施例1中的后续实验步骤进行测试。下机数据结果分析各样本中目的基因reads的检出情况及相对表达水平如下表15：
表15各样本中目的基因reads的检出情况及相对表达水平
Figure BDA0004090633820000181
Figure BDA0004090633820000191
基因表达统计分析见附图2。
结果分析：相比于处理前的阴性细胞样本adsc-HFF，经分化处理后的细胞样本B_DFZ10906大部分胰岛细胞特征基因的表达趋向于正常胰岛细胞，说明干细胞经分化处理后已开始分化，另外还有一部分基因的表达相对于正常胰岛细胞更高，可能由于是分化处理刺激导致。整体结果说明，通过我们所构建的多重扩增子测序可以快速准确的评估干细胞的分化状态。

Claims (10)

1.一种用于评估干细胞分化状态的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：提取待测干细胞RNA；
S2：合成cDNA；
S3：加入检测目的基因的引物进行第一轮多重PCR扩增，所述目的基因为FEV基因、ONECUT2基因、zkscan1基因、stat1基因、ARID3A基因、RFX6基因、pax4基因、neurod1基因、TPH1基因、LMX1A基因、INS基因、MAFA基因、IAPP基因、FOSB基因、HOPX基因、NR4A1基因、SAMD11基因、SIX3基因、ATF3基因、FOS基因、MEIS2基因、NROB1基因、ATF4基因、CEBPD基因、DDIT3基因、JUNB基因、EGR1基因、SIX2基因、TSC22D1基因、ARNTL2基因、HSF4基因、ELF3基因、HSF2基因、IRF1基因、UCN3基因、ngn3基因、MNX1基因和ZNF358基因；
S4：加入接头序列进行第二轮PCR反应；
S5：磁珠纯化；
S6：测序分析，根据测序结果评估干细胞分化状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测目的基因的引物序列如下：FEV基因引物序列如SEQ ID NO:1～2所示；ONECUT2基因引物序列如SEQ ID NO:3～4所示；zkscan1基因引物序列如SEQ ID NO:5～6所示；stat1基因引物序列如SEQ ID NO:7～8所示；ARID3A基因引物序列如SEQ ID NO:9～10所示；RFX6基因引物序列如SEQ ID NO:11～12所示；
pax4基因引物序列如SEQ ID NO:13～14所示；neurod1基因引物序列如SEQ ID NO:15～16所示；TPH1基因引物序列如SEQ ID NO:17～18所示；LMX1A基因引物序列如SEQ IDNO:19～20所示；INS基因引物序列如SEQ ID NO:21～22所示；MAFA基因引物序列如SEQID NO:23～24所示；IAPP基因引物序列如SEQ ID NO:25～26所示；FOSB基因引物序列如SEQ IDNO:27～28所示；HOPX基因引物序列如SEQ ID NO:29～30所示；NR4A1基因、引物序列如SEQID NO:31～32所示；SAMD11基因引物序列如SEQ ID NO:33～34所示；
SIX3基因引物序列如SEQ ID NO:35～36所示；ATF3基因引物序列如SEQ ID NO:37～38所示；FOS基因引物序列如SEQ ID NO:39～40所示；MEIS2基因引物序列如SEQ IDNO:41～42所示；NROB1基因引物序列如SEQ ID NO:43～44所示；ATF4基因引物序列如SEQ ID NO:45～46所示；CEBPD基因引物序列如SEQ ID NO:47～48所示；DDIT3基因引物序列如SEQ ID NO:49～50所示；JUNB基因引物序列如SEQ ID NO:51～52所示；EGR1基因引物序列如SEQ IDNO:53～54所示；SIX2基因引物序列如SEQ ID NO:55～56所示；TSC22D1基因引物序列如SEQID NO:57～58所示；ARNTL2基因引物序列如SEQ IDNO:59～60所示；HSF4基因引物序列如SEQ ID NO:61～62所示；ELF3基因引物序列如SEQID NO:63～64所示；HSF2基因引物序列如SEQ ID NO:65～66所示；IRF1基因引物序列如SEQ ID NO:67～68所示；UCN3基因引物序列如SEQ ID NO:69～70所示；ngn3基因引物序列如SEQ ID NO:71～72所示；MNX1基因引物序列如SEQ ID NO:73～74所示；ZNF358基因引物序列如SEQ ID NO:75～76所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述干细胞为胰岛干细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2加入检测目的基因的引物同时，还加入有检测内参基因的引物，所述内参基因为GAPDH基因和ACTB基因。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，检测内参基因的引物序列如下：GAPDH基因的引物序列如SEQ ID NO:77～78所示；ACTB基因的引物序列如SEQ ID NO:79～80所示。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，检测目的基因的引物按照下列比例配置引物池溶液：
基因名称 引物浓度 加入体积 基因名称 引物浓度 加入体积 NR4A1 10uM 4ul IAPP 10uM 2ul CEBPD 10uM 4ul UCN3 10uM 2ul MAFA 10uM 4ul DDIT3 10uM 2ul SIX2 10uM 4ul ELF3 10uM 2ul HSF4 10uM 4ul zkscan1 10uM 2ul EGR1 10uM 1ul SIX3 10uM 2ul TSC22D1 10uM 4ul MEIS2 10uM 2ul INS 10uM 1ul HOPX 10uM 2ul ARNTL 10uM 4ul ngn3 20uM 2ul FOS 10uM 2ul ZNF358 10uM 2ul JUNB 10uM 2ul MNX1 10uM 2ul FOSB 30uM 2ul ONECUT2 10uM 2ul SAMD11 10uM 2ul RFX6 10uM 2ul IRF1 20uM 2ul neurod1 10uM 2ul ATF4 10uM 2ul ARID3A 10uM 2ul ATF3 20uM 2ul FEV 10uM 2ul HSF2 60uM 2ul stat1 10uM 2ul ACTIN 10uM 2ul pax4 10uM 2ul GAPDH 10uM 2ul TPH1 10uM 2ul NROB1 20uM 2ul LMX1A 10uM 2ul
在步骤S3中，每20微升cDNA溶液加入2微升引物池溶液。
7.一种用于评估干细胞分化状态的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有检测目的基因的引物，所述目的基因为FEV基因、ONECUT2基因、zkscan1基因、stat1基因、ARID3A基因、RFX6基因、pax4基因、neurod1基因、TPH1基因、LMX1A基因、INS基因、MAFA基因、IAPP基因、FOSB基因、HOPX基因、NR4A1基因、SAMD11基因、SIX3基因、ATF3基因、FOS基因、MEIS2基因、NROB1基因、ATF4基因、CEBPD基因、DDIT3基因、JUNB基因、EGR1基因、SIX2基因、TSC22D1基因、ARNTL2基因、HSF4基因、ELF3基因、HSF2基因、IRF1基因、UCN3基因、ngn3基因、MNX1基因和ZNF358基因。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，检测目的基因的引物序列如下：FEV基因引物序列如SEQ ID NO:1～2所示；ONECUT2基因引物序列如SEQ ID NO:3～4所示；zkscan1基因引物序列如SEQ ID NO:5～6所示；stat1基因引物序列如SEQ ID NO:7～8所示；ARID3A基因引物序列如SEQ ID NO:9～10所示；RFX6基因引物序列如SEQ ID NO:11～12所示；pax4基因引物序列如SEQ ID NO:13～14所示；neurod1基因引物序列如SEQ ID NO:15～16所示；TPH1基因引物序列如SEQ ID NO:17～18所示；LMX1A基因引物序列如SEQ IDNO:19～20所示；INS基因引物序列如SEQ ID NO:21～22所示；MAFA基因引物序列如SEQID NO:23～24所示；IAPP基因引物序列如SEQ ID NO:25～26所示；FOSB基因引物序列如SEQ ID NO:27～28所示；HOPX基因引物序列如SEQ ID NO:29～30所示；NR4A1基因、引物序列如SEQ ID NO:31～32所示；SAMD11基因引物序列如SEQ ID NO:33～34所示；SIX3基因引物序列如SEQ IDNO:35～36所示；ATF3基因引物序列如SEQ ID NO:37～38所示；FOS基因引物序列如SEQ IDNO:39～40所示；MEIS2基因引物序列如SEQ IDNO:41～42所示；NROB1基因引物序列如SEQID NO:43～44所示；ATF4基因引物序列如SEQ ID NO:45～46所示；CEBPD基因引物序列如SEQ ID NO:47～48所示；DDIT3基因引物序列如SEQ ID NO:49～50所示；JUNB基因引物序列如SEQ ID NO:51～52所示；EGR1基因引物序列如SEQ ID NO:53～54所示；SIX2基因引物序列如SEQ ID NO:55～56所示；TSC22D1基因引物序列如SEQ ID NO:57～58所示；ARNTL2基因引物序列如SEQ IDNO:59～60所示；HSF4基因引物序列如SEQ ID NO:61～62所示；ELF3基因引物序列如SEQID NO:63～64所示；HSF2基因引物序列如SEQ ID NO:65～66所示；IRF1基因引物序列如SEQ ID NO:67～68所示；UCN3基因引物序列如SEQ ID NO:69～70所示；ngn3基因引物序列如SEQ ID NO:71～72所示；MNX1基因引物序列如SEQ ID NO:73～74所示；ZNF358基因引物序列如SEQ ID NO:75～76所示。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有检测内参基因的引物，所述内参基因为GAPDH基因和ACTB基因。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，检测内参基因的引物序列如下：GAPDH基因的引物序列如SEQ ID NO:77～78所示；ACTB基因的引物序列如SEQ ID NO:79～80所示。
CN202310150617.0A 2022-09-07 2023-02-22 一种用于评估干细胞分化状态的方法及试剂盒 Active CN116103371B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211099098 2022-09-07
CN2022110990981 2022-09-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116103371A true CN116103371A (zh) 2023-05-12
CN116103371B CN116103371B (zh) 2025-06-13

Family

ID=86256056

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310150617.0A Active CN116103371B (zh) 2022-09-07 2023-02-22 一种用于评估干细胞分化状态的方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116103371B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102433300A (zh) * 2011-11-25 2012-05-02 厚朴生物科技（苏州）有限公司 一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建及向胰岛素分泌细胞分化的方法
CN109749986A (zh) * 2019-03-13 2019-05-14 武汉大学 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法
CN111549132A (zh) * 2020-05-07 2020-08-18 南京实践医学检验有限公司 一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法
CN113981050A (zh) * 2021-11-10 2022-01-28 合肥诺为尔基因科技服务有限公司 基于多重扩增子测序技术检测精神类药物相关基因的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102433300A (zh) * 2011-11-25 2012-05-02 厚朴生物科技（苏州）有限公司 一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建及向胰岛素分泌细胞分化的方法
CN109749986A (zh) * 2019-03-13 2019-05-14 武汉大学 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法
WO2020182190A1 (zh) * 2019-03-13 2020-09-17 深圳华源再生医学有限公司 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法
CN111549132A (zh) * 2020-05-07 2020-08-18 南京实践医学检验有限公司 一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法
CN113981050A (zh) * 2021-11-10 2022-01-28 合肥诺为尔基因科技服务有限公司 基于多重扩增子测序技术检测精神类药物相关基因的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L BOUWENS等: "Islet morphogenesis and stem cell markers in rat pancreas", 《J HISTOCHEM CYTOCHEM》, vol. 44, no. 9, 30 September 2016 (2016-09-30) *
任莉莉;陈丽娟;齐晖;李富荣;龚非力;: "胰岛新生相关蛋白肽方案诱导人脂肪源性干细胞体外分化成为胰岛样细胞团的效果评价", 吉林大学学报(医学版), no. 06, 28 November 2010 (2010-11-28) *
张霞等: "ISL1基因腺病毒过表达载体的构建及其诱导犬ADSCs向胰岛样细胞分化", 《中国兽医学报》, vol. 40, no. 8, 15 August 2020 (2020-08-15), pages 1 *
胡利霞;寇亚丽;李琴;陈维平;: "胰腺干细胞的分子标志物的研究现状与展望", 航空航天医药, no. 01, 15 January 2010 (2010-01-15) *
苏仲春;陈家劲;王圳;陈志明;王跃春;: "诱导人脐带MSCs分化为胰岛样细胞团的促成熟方案及机制", 中国病理生理杂志, no. 02, 15 February 2013 (2013-02-15) *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116103371B (zh) 2025-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103468818B (zh) 一种检测cyp2c19基因多态性的试剂盒及方法
CN101748192B (zh) 饮用水中主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒
EP2652147B1 (en) One-step method of elution of dna from blood samples
CN104120184B (zh) 一种利用扩增dna片段长度多态性测定短链rna的方法
CN113481286B (zh) 基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物对及其检测试剂盒
CN105018488B (zh) 用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用
CN112553335A (zh) 肾细胞癌生物标志物及其应用
CN106222243B (zh) 一种用于精神分裂症诊断的circRNA标志物、试剂盒及基因芯片
CN109234399B (zh) miR-532-3p在制备高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤诊断和鉴别诊断制剂中的应用
CN107988436A (zh) 一种检测猪病毒性繁殖障碍性疾病的pcr体系及检测方法
CN103789414B (zh) 17个x染色体短串联重复序列的复合扩增试剂盒
CN116103371A (zh) 一种用于评估干细胞分化状态的方法及试剂盒
CN117431330B (zh) 检测微黄色奈瑟氏菌的引物探针组及其试剂盒和应用
CN105331718A (zh) 检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒
CN116949212A (zh) 一种检测传染性疾病病原体的引物组、试剂盒及其应用
KR102505618B1 (ko) 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
JP7540730B2 (ja) 関節リウマチを検査する方法
CN104928357B (zh) 一种用于致病型霍乱弧菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒
CN105039596B (zh) 一种用于检测副流感病毒的试剂盒及其应用
KR102545543B1 (ko) BK 바이러스 신병증의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
JP2022025456A (ja) 多発性硬化症を検査する方法
CN118389720B (zh) 一种用于检测食源性梭菌的引物探针组合、试剂盒及方法
CN117904334B (zh) 一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物组合物、试剂盒及检测方法
CN118726624A (zh) 一种用于检测结核合并感染的试剂盒
CN116334114A (zh) 一种ppfibp1-ret融合基因及其检测试剂盒、检测方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Country or region after: China

Address after: 7th Floor, Building 3, No. 188, Lianchuang Street, Wuchang Street, Yuhang District, Hangzhou City, Zhejiang Province, 311100

Applicant after: Hangzhou Xingyuan Future Technology Co.,Ltd.

Address before: 7th Floor, Building 3, No. 188, Lianchuang Street, Wuchang Street, Yuhang District, Hangzhou City, Zhejiang Province, 311100

Applicant before: HANGZHOU REPUGENE TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Country or region before: China

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant