CN115992075B - 一株可抑制致病菌和促排便的鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株可抑制致病菌和促排便的鼠李糖乳杆菌LRJ‑1及其应用，所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，其菌株号为LRJ‑1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.25104。本发明的鼠李糖乳杆及包含其的产品，能够具有如下功效：1)提高促排便能力；2)提高胃动素水平；3)降低生长抑素水平；4)减少结肠的炎症细胞浸润情况。

Description

一株可抑制致病菌和促排便的鼠李糖乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株可抑制致病菌和促排便的鼠李糖乳杆菌LRJ-1及其应用。

背景技术

胃肠道功能性病变是由胃肠道神经肌肉组织控制障碍引起的，以泛酸、腹胀、便秘、腹泻等胃肠症状为主要表现，常规检查又无结构性或生化改变的一类疾患，常见的如肠易激综合征、功能性消化不良等，均为临床常见病症。胃肠动力下降是胃肠道功能性病变的主要表现之一，临床可出现腹胀、便秘等症状。

便秘是指正常的排便形态发生改变、大便次数减少、排便困难等，便秘是一种临床常见的复杂症状，据悉便秘在人群中的患病率高达27％。慢性便秘在过去相当长的时期内被人们所轻视，近年来可能由于人们饮食结构不合理，久坐、体力劳动减少等原因，便秘的患病率逐年升高，因病因复杂，病程反复缠绵，患者常有许多苦恼，严重影响人们的生活质量。越来越多的研究表明健康的肠道菌群有助于促进肠道蠕动，缺乏有益菌会导致肠道功能障碍甚至促进便秘发生。乳杆菌是可定植于人体肠道的有益共生菌，他们可利用肠道中的营养成分生长并定植在人体内，通过抑制致病菌或条件致病菌调节肠道菌群，促进肠道微生态平衡，对机体产生有益作用。肠道菌群可影响机体的肠内分泌细胞，其分泌的肽类物质如胃动素等在调节肠道运动、吸收和分泌中发挥着重要作用。生长抑素是一种脑肠肽，广泛分布于中枢神经系统及胃肠道中，可强烈抑制胃肠胰等消化道腺体的外分泌，抑制胃肠道蠕动。γ-氨基丁酸是一种重要的神经递质，研究表明其具有助眠、安定、抗惊厥、改善老年痴呆、增强脑活力神经细胞等作用。提供可抑制致病菌、促进胃肠道蠕动及助眠等多功能的益生菌来缓解或治疗便秘、促进人体健康具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株可抑制致病菌和促排便的鼠李糖乳杆菌LRJ-1及其应用。所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，其菌株号为LRJ-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.25104。

所述的鼠李糖乳杆菌在如下任一中的应用也应在本发明的保护范围之中：

1)制备γ-氨基丁酸；

2)抑制沙门氏菌和大肠杆菌；

3)改善胃肠动力。

其中，所述改善胃肠动力为下述至少一种：

1)提高促排便能力；

2)提高胃动素水平；

3)降低生长抑素水平；

4)减少结肠的炎症细胞浸润情况。

本发明提供一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有所述的鼠李糖乳杆菌和/或所述鼠李糖乳杆菌的代谢物，所述代谢物是指鼠李糖乳杆菌在实施例中所述的培养基或者其他类似培养基中进行培养的培养液混合物。

所述的菌剂在如下任一中的应用也应在本发明的保护范围之中：

1)制备γ-氨基丁酸；

2)抑制沙门氏菌和大肠杆菌；

3)改善胃肠动力。

其中，所述改善胃肠动力为下述至少一种：

1)提高促排便能力；

2)提高胃动素水平；

3)降低生长抑素水平；

4)减少结肠的炎症细胞浸润情况。

本发明提供一种用于制备γ-氨基丁酸的组合物，其特征在于，所述产品包括所述的鼠李糖乳杆菌和培养基。

本发明提供一种用于改善胃肠动力的药品，所述药品包括所述的鼠李糖乳杆菌或所述的菌剂。

所述改善胃肠动力为下述至少一种：

1)提高促排便能力；

2)提高胃动素水平；

3)降低生长抑素水平；

4)减少结肠的炎症细胞浸润情况。

本发明的鼠李糖乳杆及包含其的产品，能够具有如下功效：1)提高促排便能力；2)提高胃动素水平；3)降低生长抑素水平；4)减少结肠的炎症细胞浸润情况。

保藏说明

菌种名称：鼠李糖乳杆菌

拉丁名：Lactobacillus rhamnosus

菌株编号：LRJ-1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年7月27日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25104。

附图说明

图1为鼠李糖乳杆菌LRJ-1和蜡状芽孢杆菌在血平板上的培养情况。

图2为鼠李糖乳杆菌LRJ-1的胃肠液耐受性。

图3为鼠李糖乳杆菌LRJ-1和鼠李糖乳杆菌LGG的产γ-氨基丁酸情况。

图4为鼠李糖乳杆菌LRJ-1对沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌情况。

图5为鼠李糖乳杆菌LRJ-1对小鼠粪便粒数、重量和湿度的影响。

图6为鼠李糖乳杆菌LRJ-1对小鼠血液参数的影响。

图7为鼠李糖乳杆菌LRJ-1对便秘小鼠结肠组织形态的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRJ-1的分离和鉴定

鼠李糖乳杆菌LRJ-1分离自健康成人粪便，在MRS培养基中生长良好，经16SrRNA全序列测序鉴定，最终鉴定分离得到一株鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRJ-1，。鼠李糖乳杆菌LRJ-1的16S rRNA序列如序列表中的序列1所示。

2.鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRJ-1的保藏

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRJ-1，已于2022年7月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.25104.

实施例2

1.鼠李糖乳杆菌LRJ-1的溶血活性

以具有溶血性的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)作为阳性对照菌，分别将实施例1中的鼠李糖乳杆菌LRJ-1和阳性对照菌按照划线接种在含4％脱纤维羊血(货号TXWYX100，北京润泽康生物科技有限公司)的MRS平板上培养，37℃条件下培养24小时，结果如图1所示，从图1中可以看出，只有阳性对照菌株具有溶血性，鼠李糖乳杆菌LRJ-1无溶血性。

2.鼠李糖乳杆菌LRJ-1的糖利用特性

利用API 50CHL试剂盒(货号50410，Biomeriuex)对鼠李糖乳杆菌LRJ-1的糖利用特性进行检测，结果如表1所示，从表1中可以看出鼠李糖乳杆菌LRJ-1可利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖等30种糖进行代谢。

表1鼠李糖乳杆菌LRJ-1的糖利用特性

+：有活性；—：无活性；w：活性较弱

3.鼠李糖乳杆菌LRJ-1的胃肠液耐受性将初始活菌数为8.76±0.02(lg CFU/mL)的鼠李糖乳杆菌LRJ-1分别在人工胃液、小肠液和结肠液中孵育2小时后，结果如图2所示，从图2中可以看出，在人工胃液(货号CZ0211，LEAGENE)、小肠液(货号CZ0201，LEAGENE)和结肠液(货号CZ0206，LEAGENE)中孵育2小时后鼠李糖乳杆菌LRJ-1的活菌数分别保持在6.52±0.02(lg CFU/mL)、7.87±0.04(lg CFU/mL),7.81±0.09(lg CFU/mL)。表明鼠李糖乳杆菌LRJ-1具有一定的胃肠液耐受性。

4.鼠李糖乳杆菌LRJ-1具有产γ-氨基丁酸(GABA)的能力

采用比色法进行γ-氨基丁酸定量测定。配制浓度为0.1～0.6g/L的γ-氨基丁酸标准液，用分光光度计在640nm波长处分别测定不同浓度γ-氨基丁酸标准液的吸光值。以OD640 nm吸光值为纵坐标，γ-氨基丁酸标准液浓度为横坐标，制作GABA标准曲线。将鼠李糖乳杆菌LRJ-1单克隆在3ml MRS培养基中进行培养，37℃发酵24h后将菌液10000r/min离心5min，取上清液1mL，稀释10倍后取0.4mL稀释液，测定其OD640 nm吸光值，利用标准曲线计算LRJ-1产生的γ-氨基丁酸的含量。

结果如图3所示，从图3中可看出鼠李糖乳杆菌LRJ-1可产γ-氨基丁酸，实验室条件下(单克隆在MRS培养基中，37℃培养24h)γ-氨基丁酸的产量为1.78±0.59mg/mL，对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG(Thirty years of Lactobacillus Rhamnosus GG：Areview,J ClinGastroenterol.,Lucio Capurso,2019Mar；53Suppl 1:S1-S41)的产量为0.88±0.11mg/mL。

5.鼠李糖乳杆菌LRJ-1的抑菌活性和抑菌谱

1)将鼠李糖乳杆菌LRJ-1活化后按照1％的接种量接种到MRS培养基上，在37℃条件下培养24h时间后，取培养液的上清液。

2)分别将鼠伤寒沙门氏菌14028(Yuehua Jiao,Han Yang,Nditange Shigwedha,Shuang Zhang,Fei Liu,Lanwei Zhang.Probiotic Effects and Metabolic Products ofEnterococcus faecalis LD33 with Respiration Capacity.Foods.2022Feb20；11(4):606)和产毒素大肠杆菌K88(Wang T^#,Teng K^#,Liu G,Liu Y,Zhang J,Zhang X,Zhang M,Tao Y,Zhong J*.Lactobacillus reuteri HCM2 protects mice againstEnterotoxigenic Escherichia coli through modulation of gutmicrobiota.2018.Scientific Reports.Nov 30；8(1):17485.doi:10.1038/s41598-018-35702-y.)添加到LB培养基中(1×10⁶CFU/mL)，制作成指示菌平板，并打孔，将LRJ-1的上清液50ul加入孔中，37℃培养24h后观察有无抑菌圈出现。无菌培养基作为负对照。结果如图4所示。

从图4中可以看出，鼠李糖乳杆菌LRJ-1的培养液上清对致病性鼠伤寒沙门氏菌14028和产毒素大肠杆菌K88的生长具有一定的抑制能力。

实施例3

1小鼠的分组处理

1)取27只SPF小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司、雌性、8周龄、20-22g)，分成3组，每组9只。

2)Control组的9只小鼠在第1至第21天正常培养外，每天灌胃磷酸盐缓冲液(PBS，100μL)。

3)LOP组的9只小鼠，在第一至七天，正常培养之外，按照10mg/kg/d的用量，对每只小鼠每天使用100μL洛哌丁胺(loperamide，LOP)灌胃处理。在第8-21天，正常培养之外，对每只小鼠每天灌胃PBS(100μL)。

4)LRJ-1组的9只小鼠，在第一至七天，正常培养之外，按照10mg/kg/d的用量，对每只小鼠使用洛哌丁胺(loperamide，LOP)处理；在第8-21天，正常培养之外，对每只小鼠使用5×10⁸CFU/只/天的鼠李糖乳杆菌LRJ-1进行灌胃处理。

2.鼠李糖乳杆菌LRJ-1的促排便能力

在第14天和第21天，采集三组小鼠的粪便，对小鼠粪便的颗粒数、重量、湿度以及小鼠的采食量进行统计。结果如图5所示，在第14天，与Control相比，LOP组显著减少了粪便粒数、重量和湿度，说明LOP诱导了小鼠便秘。LOP不影响小鼠的采食量。而鼠李糖乳杆菌LRJ-1的干预显著增加了便秘小鼠的粪便粒数(P<0.05)、重量(P<0.01)和湿度(P<0.05)。在第21天，鼠李糖乳杆菌LRJ-1的干预显著增加了便秘小鼠的采食量(P<0.001)。这些结果说明LRJ-1可以促进小鼠排便和摄食，对小鼠便秘具有一定的缓解作用。

3.鼠李糖乳杆菌LRJ-1对小鼠血液参数的影响

在第21天，采集三组小鼠的血清，对其血液中的胃动素和生长抑素含量进行分析，结果如图6所示。胃动素(Motilin,MTL)是小肠分泌的一种短肽，可改善胃肠动力或蠕动，负责胃肠系统的正常充盈和排空摄取食物和饥饿的刺激和反应。生长抑素(somatostatin,SS)是一种脑肠肽，可强烈抑制胃酸的分泌。图6中的结果表明，鼠李糖乳杆菌LRJ-1显著增加了便秘小鼠血液MTL的水平(P<0.05)，降低了SS的含量(P<0.01)。这说明LRJ-1缓解小鼠便秘与其增加MTL和降低SS相关。

4.鼠李糖乳杆菌LRJ-1对便秘小鼠结肠组织形态的影响

在第21天，采集三组小鼠的结肠组织，切片检测小鼠结肠组织的结构，结果如图7所示。从图7可以看出，Control组的结肠组织结构基本正常，视野可见上皮细胞未见坏死脱落，组织未见炎症细胞浸润。而在LOP组可见较多炎症细胞浸润，这说明LOP诱导便秘的时候可能引起了肠道炎症。LRJ-1干预后结肠组织正常，未见坏死和脱落，因此LRJ-1减少了便秘小鼠结肠组织炎症细胞浸润。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.鼠李糖乳杆菌，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)，其菌株号为LRJ-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.25104。

2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在如下任一中的应用：

1)制备γ-氨基丁酸；

2)制备抑制沙门氏菌和大肠杆菌的药品；

3)制备改善胃肠动力的药品。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述改善胃肠动力为下述至少一种：

1)提高促排便能力；

2)提高胃动素水平；

3)降低生长抑素水平；

4)减少结肠的炎症细胞浸润情况。

4.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌和/或所述鼠李糖乳杆菌的代谢物，所述所述鼠李糖乳杆菌的代谢物指鼠李糖乳杆菌的培养液混合物。

5.权利要求4所述的菌剂在如下任一中的应用：

1)制备γ-氨基丁酸；

2)制备抑制沙门氏菌和大肠杆菌的药品；

3)制备改善胃肠动力的药品。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述改善胃肠动力为下述至少一种：

1)提高促排便能力；

2)提高胃动素水平；

3)降低生长抑素水平；

4)减少结肠的炎症细胞浸润情况。

7.一种用于制备γ-氨基丁酸的组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌和培养基。

8.一种用于改善胃肠动力的药品，所述药品包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌或权利要求4所述的菌剂。

9.根据权利要求8所述的药品，所述改善胃肠动力为下述至少一种：

1)提高促排便能力；

2)提高胃动素水平；

3)降低生长抑素水平；

4)减少结肠的炎症细胞浸润情况。