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CN116676225B - 一株具有安神助眠功效的鼠李糖乳杆菌lr-28菌株、发酵产物、嘉眠菌群组合剂及应用 - Google Patents

一株具有安神助眠功效的鼠李糖乳杆菌lr-28菌株、发酵产物、嘉眠菌群组合剂及应用 Download PDF

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CN116676225B CN202310645330.5A CN202310645330A CN116676225B CN 116676225 B CN116676225 B CN 116676225B CN 202310645330 A CN202310645330 A CN 202310645330A CN 116676225 B CN116676225 B CN 116676225B
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lactobacillus
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梁立贺
范佳
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Hebei Yuanmin Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一株具有安神助眠功效的鼠李糖乳杆菌LR‑28菌株、发酵产物、嘉眠菌群组合剂及应用，该菌株已于2022年6月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.7.464；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该鼠李糖乳杆菌LR‑28菌株胃肠耐受性高，能进入肠道顺利定植，并可以在人体肠道环境中直接代谢产生GABA，可以应用在改善睡眠质量、预防失眠人群的睡眠障碍、缓解焦躁情绪的产品中。

Description

一株具有安神助眠功效的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株、发酵产 物、嘉眠菌群组合剂及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株具有安神助眠功效的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株、发酵产物、嘉眠菌群组合剂及应用。
背景技术
根据世界卫生组织统计，全球睡眠障碍率达27％。而中国睡眠研究会2016年公布的睡眠调查结果显示，中国成年人失眠发生率高达38.2％，超过3亿中国人有睡眠障碍，且这个数据仍在逐年攀升中。长时间的失眠会对于身体健康会构成严重威胁。
多个研究结果表明，多种神经递质如谷氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)等参与了中枢对睡眠的调节且发挥了相当关键的作用。微生物转化法主要是以谷氨酸钠或谷氨酸为底物，利用微生物的活性，将底物转化为GABA，此方法需要额外提供谷氨酸钠或谷氨酸底物。现有技术中已有通过微生物发酵培养直接转化生产GABA的菌株，但其生产GABA的发酵过程均是在体外发酵罐中进行，该发酵条件使用的培养基以及培养环境与复杂的人体肠道环境差异较大，无法保证上述菌株在人体肠道环境中直接代谢产生GABA。因此，上述菌株产GABA的优势需要通过体外发酵的方式来发挥，却未必能够用作在人体肠道环境中直接代谢产生GABA的产品。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一株具有安神助眠功效的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株、发酵产物、嘉眠菌群组合剂及应用，该菌株对胃液酸性环境以及胆汁盐有良好的耐受性和较强抑菌活性，能够在肠道体外发酵模拟系统中高产γ-氨基丁酸，直接服用或制成相应产品后即可发挥预防睡眠障碍、改善睡眠质量、缓解焦躁情绪的作用。
为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种鼠李糖乳杆菌LR-28，其分类名称为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)，于2022年6月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.7.464；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
相比于现有技术，本发明提供的保藏编号为CGMCC No.7.464的鼠李糖乳杆菌LR-28具备以下优势：
(1)本发明提供的鼠李糖乳杆菌LR-28，从属于乳杆菌属，对胃液酸性环境以及胆汁盐有良好的耐受性。能够在人体消化道内酸性很强，和存在大量消化酶的苛刻条件下生存，并且可以在胃肠道壁上定植，可修复肠上皮细胞损伤及修复肠道黏膜屏障。
(2)本发明提供的鼠李糖乳杆菌LR-28的活菌和代谢产物在肠道环境中能够产高活力谷氨酸脱羧酶，进而催化体内谷氨酸转化生成GABA。GABA和其他的氨基酸继续随血液分布到各个组织器官，其中GABA随血液进入神经细胞内，与神经元之间GABA受体结合，起到抑制神经兴奋的作用，从而发挥预防睡眠障碍、改善睡眠质量、缓解焦躁情绪的作用。
(3)本发明提供的鼠李糖乳杆菌LR-28还具有较强抑菌活性，能够调节微生态平衡、增强宿主肠道抵抗力、预防和治疗腹泻、消除过敏。
其16S rRNA序列如下所示：
第二方面，本发明还提供上述鼠李糖乳杆菌LR-28菌株在制备改善睡眠质量产品中的应用。
本发明提供的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株在人体复杂的肠道环境中依然具有较高的产谷氨酸脱羧酶活性，可以以人体肠道环境中的谷氨酸钠或谷氨酸为底物生产GABA，因此，可以将鼠李糖乳杆菌LR-28菌株加入助眠产品中，通过其生产的GABA起到抑制神经兴奋的作用，以达到改善睡眠质量的目的。该鼠李糖乳杆菌LR-28菌株也可以通过培养基而代谢生产GABA，因此也可以采用体外发酵培养该菌株的方式，用其发酵物或发酵提取物来制备改善睡眠质量的产品。
第三方面，本发明还提供上述鼠李糖乳杆菌LR-28菌株的发酵产物，所述发酵产物由所述鼠李糖乳杆菌LR-28菌株的发酵制得。发酵所得产物经进一步加工可用于改善睡眠质量的产品。
第四方面，本发明还提供利用所述的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株生产γ-氨基丁酸的方法，具体包括以下操作：将菌株在改良MRS液体培养基中进行种子培养，将培养好的发酵液在肠道模型培养基(CMGM)上进行厌氧发酵培养；所述菌株包括所述鼠李糖乳杆菌LR-28。
进一步地，所述菌株还包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP-28和动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BAL-28中的至少一种。其中植物乳杆菌LP-28于2022年6月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.7.463；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。动物双歧杆菌乳亚种BAL-28中于2022年6月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.7.462；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步地，所述菌株为鼠李糖乳杆菌LR-28与植物乳杆菌LP-28。经实验研究发现，鼠李糖乳杆菌LR-28与植物乳杆菌LP-28组合会产生协同作用。
可选地，所述种子培养条件为：接种量3％，37℃培养24h，依次连续活化三代。
进一步，所述厌氧发酵培养条件为：发酵温度为35～37℃，pH5～7，培养48小时以上。
可选地，该方法具体可采用如下操作过程：
种子培养阶段：将鼠李糖乳杆菌LR-28种子液按3％的接种量接种到改良MRS液体培养基，振荡混匀，37℃培养24h，依次连续活化三代，培养好的发酵液取100ml，即得发酵液原液样品，于4℃冷藏备用；当菌株中还有鼠李糖乳杆菌LR-28、动物双歧杆菌BAL-28中的至少一种时，将鼠李糖乳杆菌LR-28、动物双歧杆菌BAL-28分别按上述相同的方法进行活化，将每种发酵液按照特定比例混合得混和发酵液，于4℃冷藏备用。
CMGM组成(g/L)：淀粉，5.0；果胶，2.0；瓜尔豆胶，1.0；粘蛋白(猪胃III型)，4.0；木聚糖，2.0；阿拉伯半乳聚糖，2.0；菊粉，1.0；酪蛋白，3.0；蛋白胨水，5.0；胰蛋白胨，5.0；胆盐，0.4；酵母提取物，4.5；FeSO4·7H2O，0.005；氯化钠，4.5；氯化钾，4.5；KH2PO4，0.5；MgSO4·7H2O，1.25；CaCl2·6H2O，0.15；NaHCO3，1.5；半胱氨酸，0.8；血红素，0.05；吐温80，1.0。
将肠道模型培养基置于肠道体外发酵模拟系统发酵罐中，用于对上述发酵液进行发酵培养：人结肠三阶段连续培养肠道模型系统由三个发酵罐组成，分别为模拟近端发酵罐(V1，280mL)、横向发酵罐(V2，300mL)和远端结肠发酵罐(V3，320mL)。三个串联的发酵罐保持在37℃，pH值分别保持在5.5(V1)、6.2(V2)和6.8(V3)，并通过连续N2引入创造厌氧条件。V1、V2、V3均通过蠕动泵导入CMGM。采集新鲜健康人类粪便样本，保存在厌氧柜(10％H2、10％CO2、80％N2)中，在收集后的15分钟内制备在厌氧PBS(0.1mol/L PBS pH 7.4)中的1∶5(w/w)粪便稀释液。该肠道模型的每个发酵罐都接种100mL粪便稀释液。根据健康个体的平均保留时间，总系统通过时间设定为48小时。接种粪便稀释液后，肠道模型先运行24小时，以便在注入培养基之前稳定细菌种群。24小时后，系统运行8次全容量周转以实现稳定状态，然后将上述发酵液以罐中内容物体积的1％(w/v)的添加量添加到V1中，再进行八次体积周转，达到稳态，再培养24小时。
第五方面，本发明还提供一种嘉眠菌群组合剂，所述嘉眠菌群组合剂由鼠李糖乳杆菌LR-28菌株或其与其它益生菌的组合经发酵后制得；所述其它益生菌包括植物乳杆菌LP-28和动物双歧杆菌BAL-28中的至少一种。
进一步地，所述嘉眠菌群组合剂的制备方法为：将所述鼠李糖乳杆菌LR-28菌株或其与其它益生菌的组合进行发酵，发酵完成后离心获得菌泥，将所述菌泥与冻干保护剂混合均匀后冷冻干燥，粉碎，即得所述嘉眠菌群组合剂。
可选地，该制备方法中发酵所用培养基可采用如下操作过程制得：
将10-90g葡萄糖，3-15g大豆蛋白胨，15-19g酵母浸粉，0-14g柠檬酸氢二胺，2-26g无水乙酸钠，0-10g磷酸氢二钾，3-16g低聚异麦芽糖，0-30g淀粉等食品级物料混合后加入纯水1000g混匀至无肉眼可见颗粒，化料后调节pH至5.0-6.8，采用117.5-118.5℃灭菌20min，制得发酵所用培养基。
采用混合发酵工艺将所述鼠李糖乳杆菌LR-28菌株或其与其它益生菌的组合的种子液按照特定比例混合后加入上述培养基中，34-37℃，培养10-12h，发酵完成后，以5000-9000r/min，离心10-30min得菌泥，将菌泥与冻干保护剂混合均匀后冷冻干燥，再进行粉碎得嘉眠菌群组合剂粉剂。
进一步，所述冻干保护剂的原料包括淀粉、葡萄糖、麦芽糊精、蔗糖、乳糖和脱脂奶粉中的至少一种；所述冻干保护剂的制备方法包括以下操作：将所述冻干保护剂的原料在水中溶解，调节pH至5.0-6.8，灭菌，灭菌后调节pH至6.0-7.3，即得所述冻干保护剂。
附图说明
图1为实施例1中鼠李糖乳杆菌LR-28的显微镜成像图；
图2为实施例1中鼠李糖乳杆菌LR-28与常用商业鼠李糖乳杆菌对人工胃液耐受性比较；
图3为实施例1中鼠李糖乳杆菌LR-28与常用商业鼠李糖乳杆菌对胆盐耐受性比较；
图4为实施例1中鼠李糖乳杆菌LR-28与常用商业鼠李糖乳杆菌粘附能力的比较分析；
图5为实施例1中鼠李糖乳杆菌LR-28抑菌活性分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的下述实施例中所用菌株来源如下：
植物乳杆菌LP-28，其分类名称为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2022年6月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.7.463；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
动物双歧杆菌BAL-28中于2022年6月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.7.462；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
常见商用鼠李糖(菌种编号为ATCC53103)、大肠杆菌(菌种编号为ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(菌种编号为ATCC 43300)。
改良MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨8.0-10.0；牛肉粉，9.0-10.0；酵母粉，3.0-5.0；葡萄糖，15.0-20.0；硫酸镁，0.08-0.1；醋酸钠，1.8-2.0；柠檬酸铵，4.0-5.0；磷酸氢二钾，1.6-2.0；硫酸锰，0.03-0.05；吐温80，0.8-1.0；L-半胱氨酸盐酸盐，0.05-0.07(pH6.2±0.2)。
CMGM(g/L)：淀粉，5.0；果胶，2.0；瓜尔豆胶，1.0；粘蛋白(猪胃III型)，4.0；木聚糖，2.0；阿拉伯半乳聚糖，2.0；菊粉，1.0；酪蛋白，3.0；蛋白胨水，5.0；胰蛋白胨，5.0；胆盐，0.4；酵母提取物，4.5；FeSO4·7H2O，0.005；氯化钠，4.5；氯化钾，4.5；KH2PO4，0.5；MgSO4·7H2O，1.25；CaCl2·6H2O，0.15；NaHCO3，1.5；半胱氨酸，0.8；血红素，0.05；吐温80，1.0。
肠道体外发酵模拟系统：人结肠三阶段连续培养肠道模型系统由三个发酵罐组成，分别为模拟近端发酵罐(V1，280mL)、横向发酵罐(V2，300mL)和远端结肠发酵罐(V3，320mL)。三个串联的发酵罐保持在37℃，pH值保持在5.5(V1)、6.2(V2)和6.8(V3)，并通过连续N2引入创造厌氧条件。V1、V2、V3均通过蠕动泵导入CMGM。采集新鲜健康人类粪便样本，保存在厌氧柜(10％H2、10％CO2、80％N2)中，在收集后的15分钟内制备在厌氧PBS(0.1mol/LPBS pH 7.4)中的1∶5(w/w)粪便稀释液。该肠道模型的每个发酵罐都接种了100mL粪便稀释液。根据健康个体的平均保留时间，总系统通过时间设定为48小时。接种粪便稀释液后，肠道模型先运行24小时，以便在注入培养基之前稳定细菌种群。24小时后，系统运行8次全容量周转以实现稳定状态，然后将上述发酵液以罐中内容物体积的1％(w/v)的添加量添加到V1中，再进行八次体积周转，达到稳态，再培养24小时。
其他实验材料和仪器如无特殊说明，均可通过商业途径购买。
实施例1
本实施例提供了一种具有安神助眠功效的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株，该菌株通过以下步骤筛选得到：
1、鼠李糖乳杆菌LR-28的分离与筛选
1.1分离
取牧民家中传统酸奶(来自塔什库尔干塔吉克自县)10g，加入100ml生理盐水中充分混匀，用PBS分别稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的浓度梯度，各个浓度吸100μL到加有碳酸钙的改良型MRS固体培养基上涂布均匀，每一浓度两个重复。放置于37℃恒温培养箱内培养48h后观察菌落以及透明圈产生的情况，便于进一步分离纯化。
1.2纯化培养
从以上培养的浓度梯度中选择一合适的梯度，挑选边界清晰可见并均有透明圈的单菌落15-25个，挑选出来的菌落采用划线法在新制的MRS固体培养基上传代培养24-48h，再次划线培养，此步骤共重复三次，以获得单克隆菌株。此菌株通过MRS液体培养基培养24h后，将菌液和50％甘油按1∶1的比例混匀(甘油终浓度为25％)，在-75℃保存，同时接种至MRS固体培养基试管斜面用于临时保存。
1.3菌株初筛
取上述甘油保存的菌液按2％接种量接种到1.5mL的MRS液体培养基中并置于37℃恒温培养箱中培养10h作为种子菌液用于接下来的实验。
种子菌液按2％的接种量接种到2mL装有MRS液体培养基的EP管中，37℃条件下培养48h；挑取单菌落于MRS液体培养基上，37℃条件下培养16h；然后转入GYP液体培养基上，37℃，静置培养48h；取发酵液上清液1μL点样于滤纸上(每10样+1标/一张滤纸)，2000rpm离心10min，在展开剂中层析4h后吹干滤纸，将8g/L的茚三酮喷到滤纸上，70℃烘箱中显色5min，初步筛选出具有产γ-氨基丁酸(GABA)的菌株共18株。
1.4菌株复筛
将初筛得到的18株菌株种子菌液按2％的接种量接种到2mL装有MRS液体培养基的EP管中，37℃条件下培养48h；挑取单菌落于MRS液体培养基上，37℃条件下培养16h；然后转入GYP液体培养基上，37℃，静置培养48h。离心取上清，采用高效液相色谱法对18株菌株产GABA能力进行定量测定。实验结果如图1所示菌株显微镜下菌体形态，分离获得的18株菌株均具有产GABA的能力，其中菌株LR-28产GABA能力最强，GABA产量高达3.838g/L。
1.5鼠李糖乳杆菌LR-28菌株的鉴定
1.5.1 LR-28菌株的菌落和菌体形态特征
菌株菌落形态观察：表面光滑有光泽。
菌体形态特征：革兰氏阳性，多形态杆菌。
1.5.2 LR-28菌株的16S rRNA的测序分析
表1 LR-28菌株与参比菌株的16S rRNA序列相似性
综上所述，结合16S rRNA序列分析及生理生化鉴定结果，鉴定LR-28鉴定为一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株。
将鼠李糖乳杆菌LR-28菌株，于2022年6月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.7.464；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2、鼠李糖乳杆菌LR-28菌株的益生特性试验
2.1耐胃酸、耐胆盐试验
耐酸试验：将活化好的实施例1筛选的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株与常用鼠李糖乳杆菌按2％的接种量分别接到pH值为3.0的MRS液体培养基中，37℃培养箱中培养，测定0、4h的活菌数(平板计数法)。结果见图2。
耐胆盐试验：将活化好的实施例1筛选的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株与常用鼠李糖乳杆菌株(菌种编号为ATCC53103)分别接种到含0.03％牛胆盐的MRS液体培养基中，放入37℃培养箱中培养，分别测量0h、4h的活菌数(平板计数法)。结果见图3。
与常用商业菌株相比，鼠李糖乳杆菌LR-28具有非常高的耐酸性能和耐胆盐性能，能够抵抗人工胃液和人工肠液，保证经过胃、肠的消化后有足够的活菌数在肠道定植。
2.2粘附性试验
将传代一次浓度为1×10个/mL的caco-2细胞接种至12孔板，37℃，5％CO环境条件下培养至单层细胞，弃去培养液，无菌PBS缓冲液轻轻洗涤三次，加入1mL DMEM原液，再分别加入鼠李糖乳杆菌LR-28菌株与常用鼠李糖乳杆菌株菌悬液(用DMEM悬浮，浓度约为100cfu/mL)100μL，每株菌做三个孔，培养2h后，弃上清，无菌PBS清洗三次，每孔加入300μL0.25％胰酶消化5-8min，然后加入300μL不完全DMEM培养基(含血清不含双抗)终止消化，然后平板稀释涂布计算粘附的菌株数目。
粘附率(％)＝粘附菌株的数目/初始接种数目×100％。
结果说明见图4，与常用商业鼠李糖乳杆菌相比，鼠李糖乳杆菌LR-28能够更有效地粘附肠粘膜，形成生物屏障，保护肠道，为人体肠道中定植提供重要前提条件。
2.3抑菌性试验
将活化好的鼠李糖乳杆菌LR-28按2％的接种量接种到2mL装有MRS液体培养基的EP管中，并置于37℃恒温培养箱中培养18h。取上述鼠李糖乳杆菌LR-28培养液500g离心10min，得上清备用。
以大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 43300)为指示菌。取100μL已活化指示菌，调整指示菌的浓度为1.0×105CFU/mL，在相应的培养基上进行涂板，涂布后培养皿置于超净工作台半敞开10min，在固体培养基摆好的牛津杯中加鼠李糖乳杆菌LR-28上清液200μL，平稳放在37℃培养16h，观察测量每种菌液的抑菌圈直径，平行做三组实验。
结果说明(见图5)，鼠李糖乳杆菌LR-28可以抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，具备抑菌性，可通过抑制致病菌，调节肠道的菌群失调，维持肠道菌群平衡。
2.4抗氧化能力分析
2.4.1菌株培养方法及样品准备
将保存好的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株、常用商业鼠李糖乳杆菌，分别按3％的接种量接种到改良MRS液体培养基，振荡混匀，37℃培养24h，依次连续活化三代，各自得到发酵液，培养好的发酵液各取100ml，即得发酵液原液样品，于4℃冷藏备用。
2.4.2鼠李糖乳杆菌LR-28清除DPPH自由基功能试验
将DPPH溶于95％乙醇中，配制成0.2mmol/L的溶液。样品组为0.5mL DPPH溶液分别与0.5mL鼠李糖乳杆菌LR-28发酵原液或常用商业鼠李糖乳杆菌发酵原液混合，振荡混匀，室温放置30min后，然后经过10000rpm离心2min，取上清液，测定517nm处的吸光度(OD值)，每组做2个平行。用等体积的生理盐水替代发酵原液作为对照组，并用等体积的生理盐水和无水乙醇的混合液作为空白调零。按照下式计算DPPH自由基的清除率：
DPPH自由基清除率＝(A对照-A样品)/A对照×100％。
表2鼠李糖乳杆菌LR-28菌的DPPH自由基清除率
菌株 DPPH自由基清除率
鼠李糖乳杆菌LR-28 21％
常用商业鼠李糖乳杆菌 11％
2.4.3鼠李糖乳杆菌LR-28清除羟自由基功能试验
在10mL比色管中加入依次加入2.0mmol/L硫酸亚铁溶液2.0mL，1.0mmol/L H2O2溶液2.0mL，摇匀，再分别加入2.0mL鼠李糖乳杆菌LR-28发酵原液或常用商业鼠李糖乳杆菌发酵原液，混匀，再加入6.0mmol/L水杨酸溶液2.0mL。37℃条件下水浴15min后在510nm处测吸光度，每组做2个平行。用等体积按照下式计算清除率：
清除率(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0×100％。
式中：A0为未加发酵原液测定的吸光度；A1为发酵原液的吸光度；A2为不加H2O2溶液所测定的吸光度。
表3鼠李糖乳杆菌LR-28菌的羟自由基清除率
菌株 羟自由基清除率
鼠李糖乳杆菌LR-28 28％
常用商业鼠李糖乳杆菌 16％
结果说明，鼠李糖乳杆菌LR-28较常用商业鼠李糖乳杆菌，其抗氧化活性更高，能有效地清除机体内的自由基数量，缓解机体氧化应激反应，从而使机体细胞免受自由基侵害。
实施例2
本实施例提供了一种鼠李糖乳杆菌LR-28菌株的发酵产物，其制备方法为：将鼠李糖乳杆菌LR-28菌株的种子液按3％的接种量接种到改良MRS液体培养基中，振荡混匀，37℃培养24h，依次连续活化三代，得到发酵液。
取培养好的发酵液，以1％(w/v)的添加量添加到接入已导入CMGM和粪便稀释液并完成8次全容量周转的肠道体外发酵模拟系统的发酵罐(V1)中进行发酵培养，再进行八次体积周转，达到稳态，离心，取上清液，即得。
考虑到结肠模型系统的操作体积(900mL)和保留时间(48h)，每天将发酵液以罐中内容物体积的1％(w/v)的添加量添加到V1中，再进行八次体积周转，达到稳态，离心，取上清液。
实施例3
本实施例提供了一种植物乳杆菌LP-28和鼠李糖乳杆菌LR-28菌株组合的发酵产物，其制备方法为：将植物乳杆菌LP-28和鼠李糖乳杆菌LR-28菌株的种子液分别按3％的接种量接种到改良MRS液体培养基中，振荡混匀，37℃培养24h，依次连续活化三代，得到发酵液，将所得发酵液按2∶5的体积比混合，得混合发酵液。
取混合发酵液，按实施例1的方法在肠道体外发酵模拟系统的发酵罐(V1)中进行发酵培养，即得。
实施例4
本实施例提供了一种鼠李糖乳杆菌LR-28和动物双歧杆菌BAL-28菌株组合的发酵产物，其制备方法为：将鼠李糖乳杆菌LR-28和动物双歧杆菌BAL-28菌株的种子液分别按3％的接种量接种到改良MRS液体培养基中，振荡混匀，37℃培养24h，依次连续活化三代，得到发酵液，将所得发酵液按5∶1的体积比混合，得混合发酵液。
取混合发酵液，按实施例1的方法在肠道体外发酵模拟系统的发酵罐(V1)中进行发酵培养，即得。
实施例5
本实施例提供了一种植物乳杆菌LP-28、鼠李糖乳杆菌LR-28、动物双歧杆菌BAL-28三者菌株组合的发酵产物，其制备方法为：将植物乳杆菌LP-28、鼠李糖乳杆菌LR-28、动物双歧杆菌BAL-28菌株的种子液分别按3％的接种量接种到改良MRS液体培养基中，振荡混匀，37℃培养24h，依次连续活化三代，得到发酵液，将所得发酵液按2∶5∶1的体积比混合，得混合发酵液。
取混合发酵液，按实施例1的方法在肠道体外发酵模拟系统的发酵罐(V1)中进行发酵培养，即得。
对比例1
将植物乳杆菌LP-28菌株的种子液按3％的接种量接种到改良MRS液体培养基中，振荡混匀，37℃培养24h，依次连续活化三代，得到发酵液。
取培养好的发酵液，按实施例1的方法在肠道体外发酵模拟系统的发酵罐(V1)中进行发酵培养，即得。
对比例2
将动物双歧杆菌BAL-28菌株的种子液按3％的接种量接种到改良MRS液体培养基中，振荡混匀，37℃培养24h，依次连续活化三代，得到发酵液。
取培养好的发酵液，按实施例1的方法在肠道体外发酵模拟系统的发酵罐(V1)中进行发酵培养，即得。
对比例3
将植物乳杆菌LP-28与动物双歧杆菌BAL-28菌株的种子液分别按3％的接种量接种到改良MRS液体培养基中，振荡混匀，37℃培养24h，依次连续活化三代，得到发酵液，将所得发酵液按5∶1的体积比混合，得混合发酵液。
取混合发酵液，按实施例1的方法在肠道体外发酵模拟系统的发酵罐(V1)中进行发酵培养，即得。
检验例1
采用高效液相色谱法对实施例2～5以及对比例1～3得到的发酵液中GABA总含量进行定量测定。
实验结果如下：
表4：实施例2～5以及对比例1～3发酵液中GABA总含量
由以上结果可见，植物乳杆菌LP-28、鼠李糖乳杆菌LR-28、动物双歧杆菌BAL-28在肠道体外模拟发酵条件下均能够产生GABA，但鼠李糖乳杆菌LR-28产GABA的能力最强，且鼠李糖乳杆菌LR-28在与植物乳杆菌LP-28和/或鼠李糖乳杆菌LR-28菌株混合发酵的条件下能够显著提高GABA含量，具有明显的协同作用。
实施例6
本实施例提供一种嘉眠菌群组合剂，由实施例1所得的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株经发酵后制得。其制备方法为：
将鼠李糖乳杆菌LR-28菌株种子液，按接种量3％加入培养基进行发酵培养，培养条件为：37℃，培养12小时，发酵完成后，在6000r/min条件下离心30min得菌泥，将菌泥与冻干保护剂混合均匀后冷冻干燥，再进行粉碎得嘉眠菌群组合剂(1.0×1011CFU/g)。
培养基的制备方法：将40g葡萄糖，4g大豆蛋白胨，3g酵母浸粉，2g柠檬酸氢二胺，6g无水乙酸钠，3g磷酸氢二钾，1g低聚异麦芽糖、3g淀粉等食品级物料混合后加入纯水1000g混匀至无肉眼可见颗粒，化料后调节pH至5.0-6.8，采用117.5-118.5℃灭菌20min，即得培养基。
冻干保护剂的制备方法：将100g淀粉、20g葡萄糖，60g麦芽糊精，30g蔗糖，10g乳糖，50g脱脂奶粉等食品原料混合均匀，加入纯水1000g溶解至无肉眼可见颗粒，化料后调节pH至5.0-6.8，采用117.5-118.5℃灭菌20min，灭菌后调节pH至6.0-7.3，即得冻干保护剂。
实施例7
本实施例提供一种嘉眠菌群组合剂，由实施例1所得的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株和植物乳杆菌LP-28菌株组合经发酵后制得。其制备方法为：
将鼠李糖乳杆菌LR-28菌株和植物乳杆菌LP-28菌株种子液，按体积比2∶5混合后，接种量3％加入培养基进行发酵培养，培养条件为：37℃，12小时；发酵完成后，在6000r/min条件下离心30min得菌泥，将菌泥与冻干保护剂混合均匀后冷冻干燥，再进行粉碎得嘉眠菌群组合剂(1.1×1011CFU/g)。
培养基的制备方法：将40g葡萄糖，4g大豆蛋白胨，3g酵母浸粉，2g柠檬酸氢二胺，6g无水乙酸钠，3g磷酸氢二钾，1g低聚异麦芽糖、3g淀粉等食品级物料混合后加入纯水1000g混匀至无肉眼可见颗粒，化料后调节pH至5.0-6.8，采用117.5-118.5℃灭菌20min，即得培养基。
冻干保护剂的制备方法：将100g淀粉、20g葡萄糖，60g麦芽糊精，30g蔗糖，10g乳糖，50g脱脂奶粉等食品原料混合均匀，加入纯水1000g溶解至无肉眼可见颗粒，化料后调节pH至5.0-6.8，采用117.5-118.5℃灭菌20min，灭菌后调节pH至6.0-7.3，即得冻干保护剂。
实施例8
本实施例提供一种嘉眠菌群组合剂，由实施例1所得的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株、植物乳杆菌LP-28菌株和动物双歧杆菌BAL-28菌株组合经发酵后制得。其制备方法为：
将鼠李糖乳杆菌LR-28菌株、植物乳杆菌LP-28菌株和动物双歧杆菌BAL-28菌株种子液，按体积比3∶5∶1混合后，接种量3％加入培养基进行发酵培养，培养条件为：37℃，12小时；发酵完成后，在6000r/min条件下离心30min得菌泥，将菌泥与冻干保护剂混合均匀后冷冻干燥，再进行粉碎得嘉眠菌群组合剂(1.0×1011CFU/g)。
培养基的制备方法：将40g葡萄糖，4g大豆蛋白胨，3g酵母浸粉，2g柠檬酸氢二胺，6g无水乙酸钠，3g磷酸氢二钾，1g低聚异麦芽糖、3g淀粉等食品级物料混合后加入纯水1000g混匀至无肉眼可见颗粒，化料后调节pH至5.0-6.8，采用117.5-118.5℃灭菌20min，即得培养基。
冻干保护剂的制备方法：将100g淀粉、20g葡萄糖，60g麦芽糊精，30g蔗糖，10g乳糖，50g脱脂奶粉等食品原料混合均匀，加入纯水1000g溶解至无肉眼可见颗粒，化料后调节pH至5.0-6.8，采用117.5-118.5℃灭菌20min，灭菌后调节pH至6.0-7.3，即得冻干保护剂。
实施例9
本实施例提供了鼠李糖乳杆菌LR-28菌株作为原料制备改善睡眠质量产品中的应用。
1、试验过程
招募195位失眠患者(筛选标准：PSQI(匹斯堡指数)指数)＞7的人群筛选入组)，按照年龄进行分组，A组(20-35岁)：60人；B组(35-59岁)：70人；C组(60岁以上)：65人。失眠患者服用实施例7所得的嘉眠菌群组合剂，服用剂量，每天服用5-6g，含150-180mg的γ-氨基丁酸，服用周期为2周。对上述三组进行睡眠调查，开展美国匹斯堡睡眠质量指数调研。
2、试验结果与分析
2.1 2周的睡眠调查结果：
A组60人睡眠质量58人都有明显改善，2人无明显效果，有效率96.7％；B组66人睡眠质量有明显改善，4人无明显效果，有效率94.3％；C组65人全部反映有明显改善效果，有效率100％。
2.2 A、B、C三组改善症状研究结果
表5 A组改善症状研究结果
表6 B组改善症状研究结果
表7 C组改善症状研究结果
2.3使用(PSQI)美国匹斯堡睡眠质量指数调研测定改善量
表8 A、B、C三组使用(PSQI)美国匹斯堡睡眠质量指数调研测定改善量
群体编号 服用前 1-7天 8-14天
A组 11 7 5
B组 13 9 7
C组 15 9 8
由上述表5-8可以看出，本发明提供的嘉眠菌群组合剂在预防失眠人群的睡眠障碍、改善睡眠质量、缓解焦躁情绪上，具有很好的改善效果。
综上，本发明提供的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株具有在人肠道环境中高产GABA的活性，且具有较强抑菌活性、胃肠液耐受性，可用于改善睡眠相关的于制备保健品、食品或食品添加剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有安神助眠功效的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株，其特征在于，其分类名称为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus），于2022年6月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.7.464；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株在制备食品中的应用。
3.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物由所述鼠李糖乳杆菌LR-28菌株的发酵制得。
4.利用权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，具体包括以下操作：将菌株在改良MRS液体培养基中进行种子培养，将培养好的发酵液在肠道模型培养基上进行厌氧发酵培养；所述菌株包括所述鼠李糖乳杆菌LR-28。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌株还包括植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-28和动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）BAL-28中的至少一种；
其中，所述LP-28和BAL-28均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述LP-28的保藏编号为CGMCC No.7.463，所述BAL-28的保藏编号为CGMCC No.7.462。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌株为鼠李糖乳杆菌LR-28与植物乳杆菌LP-28。
7.根据权利要求4所述的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述厌氧发酵培养条件为：发酵温度为35~37℃，pH5~7，培养48小时以上。
8.一种菌群组合剂，其特征在于，由权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LR-28菌株或其与其它益生菌的组合经发酵后制得；所述其它益生菌包括植物乳杆菌LP-28和动物双歧杆菌乳亚种BAL-28中的至少一种；
其中，所述LP-28和BAL-28均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述LP-28的保藏编号为CGMCC No.7.463，所述BAL-28的保藏编号为CGMCC No.7.462。
9.根据权利要求8所述的菌群组合剂，其特征在于，所述菌群组合剂的制备方法为：将所述鼠李糖乳杆菌LR-28菌株或其与其它益生菌的组合进行发酵，发酵完成后离心获得菌泥，将所述菌泥与冻干保护剂混合均匀后冷冻干燥，粉碎，即得所述菌群组合剂。
10.根据权利要求9所述的菌群组合剂，其特征在于，所述冻干保护剂的原料包括淀粉、葡萄糖、麦芽糊精、蔗糖、乳糖、乳清蛋白粉和脱脂奶粉中的至少一种；所述冻干保护剂的制备方法包括以下操作：将所述冻干保护剂的原料在水中溶解，调节pH至5.0-6.8，灭菌，灭菌后调节pH至6.0-7.3，即得所述冻干保护剂。
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