CN115990126A

CN115990126A - 一种具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN115990126A
Application number: CN202211447267.6A
Authority: CN
Inventors: 于讴
Original assignee: Beijing Jiuyousan Brand Operation Management Co ltd
Current assignee: Beijing Jiuyousan Brand Operation Management Co ltd
Priority date: 2022-11-18
Filing date: 2022-11-18
Publication date: 2023-04-21

Abstract

本发明涉及一种具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物及其制备方法。所述护肤组合物包括如下重量份的组分：脱羧肌肽盐酸盐组分1～4份、迷迭香叶提取物组分1～5份、茶叶提取物组分1～2份和红毛丹果皮提取物组分1～8份；其中：所述脱羧肌肽盐酸盐组分由脱羧肌肽盐酸盐、1,3丙二醇和水组成；所述迷迭香叶提取物组分由迷迭香叶提取物、丁二醇和水组成；所述茶叶提取物组分由茶叶提取物和丁二醇组成；所述红毛丹果皮提取物组分由红毛丹果皮提取物、甘油和水组成。所述护肤组合物配比科学合理，通过生物化学、细胞生物学、分子生物学等技术方式验证得到所述护肤组合物具有显著的抗糖化、抗氧化、抗炎作用。

Description

一种具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于功能化妆品领域，具体涉及一种具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物及其制备方法。

背景技术

“糖化反应”是导致肌肤老化、松弛、皱纹、暗黄的元凶之一。约在20岁时，皮肤中开始能观察到糖化胶原蛋白。随着年龄的增长，皮肤中被观察到的晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products，AGEs)会增多，并且糖化的胶原蛋白无法再进行更新，因此，一旦有所损伤很难修复。

糖化(Glycation)是在碳水化合物(主要是还原性葡萄糖)和具有游离氨基的分子(例如蛋白质)之间发生的一种非酶促反应，又称为美拉德(Maillard)反应，主要影响蛋白质、核酸和脂质。研究发现，身体中的糖化蛋白主要来源是食物摄入和内源产生。糖基化会产生有害反应，其主要发生在细胞外基质中或细胞胞质溶胶和细胞器内。糖化产品的摄入，特别是在烹饪过程中形成的糖化产物，可能对人体的健康有潜在危害。糖化蛋白分为早期糖基化产物和晚期糖基化终末产物(AGEs)，其中对人体造成损伤的主要是AGEs。

在皮肤老化过程中，皮肤会干燥、变薄、弹性降低并且还会出现黑斑和皱纹，皮肤的感官能力也会发生变化。研究发现，糖化可以以多种方式促进皮肤老化。真皮和表皮细胞外基质的糖基化会增加皮肤的刚性，降低皮肤弹性；还会激活晚期糖基化终末产物受体(Receptor of advanced glycation end products，RAGE)，促进细胞因子和生长因子的分泌；诱导成纤维细胞的衰老和凋亡以及角质形成细胞的损伤；使细胞外基质和金属蛋白酶组分的正常合成发生变化。细胞内糖基化会使蛋白酶体的有效性降低；在成纤维细胞中累积糖化波形蛋白并降低胶原的收缩活性。此外，紫外线诱导的AGEs在细胞内积聚会产生活性氧(Reactive oxygens pecies，ROS)，破坏真皮蛋白并触发炎症反应。

目前的抗糖产品大多通过口服针对体内抗糖化，有效成分要到达皮肤器官发挥抗糖化作用必须要经过消化系统和血液循环系统，起效时间较长，且功能单一。

故基于此，提出本发明技术方案。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物及其制备方法。所述护肤组合物，配比科学合理，将脱羧肌肽盐酸盐组分、迷迭香叶提取物组分、茶叶提取物组分和红毛丹果皮提取物组分有机地进行结合，并通过生物化学、细胞生物学、分子生物学等技术方式验证得到所述护肤组合物具有显著的抗糖化、抗氧化、抗炎作用；本发明所述的制备方法，工艺简单易控，有利于规模化产出。

本发明的方案是提供一种具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物，其包括如下重量份的组分：脱羧肌肽盐酸盐组分1～4份、迷迭香叶提取物组分1～5份、茶叶提取物组分1～2份和红毛丹果皮提取物组分1～8份；其中：

所述脱羧肌肽盐酸盐组分(生产公司：EXSYMOL SAM)由脱羧肌肽盐酸盐、1,3丙二醇和水组成；

所述迷迭香叶提取物组分(生产公司：ICHIMARU PHARCOS CO.,LTD.)由迷迭香(ROSMARINUS OFFICINALIS)叶提取物、丁二醇和水组成；

所述茶叶提取物组分(生产公司：特科诺宝有限公司)由茶(CAMELLIA SINENSIS)叶提取物和丁二醇组成；

所述红毛丹果皮提取物组分(生产公司：BASF(China)Co.,Ltd.)由红毛丹(NEPHELIUM LAPPACEUM)果皮提取物、甘油和水组成。

优选地，所述具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物包括如下重量份的组分：脱羧肌肽盐酸盐组分1份、迷迭香叶提取物组分1份、茶叶提取物组分2份和红毛丹果皮提取物组分1份。

优选地，所述脱羧肌肽盐酸盐组分中，脱羧肌肽盐酸盐、1,3丙二醇和水的重量比为10:20:70。

优选地，所述迷迭香叶提取物组分中，迷迭香叶提取物、丁二醇和水的重量比为0.6:49.7:49.7。

优选地，所述茶叶提取物组分中，茶叶提取物和丁二醇的重量比为50:50。

优选地，所述红毛丹果皮提取物组分中，红毛丹果皮提取物、甘油和水的重量比为0.45:80:19.55。

基于相同的技术构思，本发明的再一方案是提供一种具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物的制备方法，所述制备方法为：将所有组分进行混合，搅拌均匀后即得到护肤组合物。

优选地，所述搅拌的时间为30～40min。

为便于理解本发明，对本发明的研究思路进行说明，具体如表1所示：

表1

注：本发明使用GraphPad Prism 5数据软件对实验数据进行统计和分析，数据表示为平均值±SD，差异性分析使用的是双尾Student’s T检验，p值表示数据组与对照组之间的差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

本发明的有益效果为：

1、本发明所述的护肤组合物，配比科学合理，将脱羧肌肽盐酸盐组分、迷迭香叶提取物组分、茶叶提取物组分和红毛丹果皮提取物组分有机地进行结合，并通过生物化学、细胞生物学、分子生物学等技术方式验证得到所述护肤组合物具有显著的抗糖化、抗氧化、抗炎作用。

2、本发明所述的制备方法，工艺简单易控，有利于规模化产出。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是试验例中，自制AGEs的鉴定结果图。

图2是试验例中，自制AGEs的浓度测定结果图。

图3是试验例中，ATT抑制AGEs合成的统计学分析结果图。

图4是试验例中，ATT清除DPPH自由基效果的统计学分析结果图。

图5是不同处理组对HaCaT细胞的活性影响图。

图6是ATT抑制AGEs诱导的ROS生成的荧光显色实验结果图；其中：

图6A是ATT抑制AGEs诱导的ROS生成的荧光显色第一次实验结果图；

图6B是ATT抑制AGEs诱导的ROS生成的荧光显色第二次实验结果图；

图6C是ATT抑制AGEs诱导的ROS生成的荧光显色第三次实验结果图。

图7是ATT抑制AGEs诱导的ROS生成的定量分析图。

图8是ATT抑制AGEs诱导的炎症因子表达的实验结果图；其中：

图8A是ATT抑制AGEs诱导的炎症因子表达的第一次实验结果图；

图8B是ATT抑制AGEs诱导的炎症因子表达的第二次实验结果图；

图8C是ATT抑制AGEs诱导的炎症因子表达的第三次实验结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物的制备方法，具体为：

将100g脱羧肌肽盐酸盐组分、100g迷迭香叶提取物组分、100g茶叶提取物组分和100g红毛丹果皮提取物组分进行混合，搅拌30min，即得到护肤组合物。

其中，100g脱羧肌肽盐酸盐组分中含有10g脱羧肌肽盐酸盐、20g1,3丙二醇和70g水。100g迷迭香叶提取物组分中含有0.6g迷迭香叶提取物、49.7g丁二醇和49.7g水。100g茶叶提取物组分中含有50g茶叶提取物和50g丁二醇。100g红毛丹果皮提取物组分中含有0.45g红毛丹果皮提取物、80g甘油和19.55g水。

实施例2

将400g脱羧肌肽盐酸盐组分、500g迷迭香叶提取物组分、200g茶叶提取物组分和800g红毛丹果皮提取物组分进行混合，搅拌40min，即得到护肤组合物。

其中，400g脱羧肌肽盐酸盐组分中含有40g脱羧肌肽盐酸盐、80g1,3丙二醇和280g水。500g迷迭香叶提取物组分中含有3g迷迭香叶提取物、248.5g丁二醇和348.5g水。200g茶叶提取物组分中含有100g茶叶提取物和100g丁二醇。800g红毛丹果皮提取物组分中含有3.6g红毛丹果皮提取物、640g甘油和156.4g水。

实施例3

将100g脱羧肌肽盐酸盐组分、100g迷迭香叶提取物组分、200g茶叶提取物组分和100g红毛丹果皮提取物组分进行混合，搅拌35min，即得到护肤组合物。

其中，100g脱羧肌肽盐酸盐组分中含有10g脱羧肌肽盐酸盐、20g1,3丙二醇和70g水。100g迷迭香叶提取物组分中含有0.6g迷迭香叶提取物、49.7g丁二醇和49.7g水。200g茶叶提取物组分中含有100g茶叶提取物和100g丁二醇。100g红毛丹果皮提取物组分中含有0.45g红毛丹果皮提取物、80g甘油和19.55g水。

试验例

(一)抗糖化功能验证

1、AGEs的制备

甘油醛是AGEs生成过程中的重要中间产物，本发明利用甘油醛和BSA在37℃避光条件下反应模拟人体内晚期糖基化的条件合成晚期糖基化终末产物AGEs。经过七天的反应，原本澄清透明的反应液变为深黄棕色，初步认为AGEs合成成功。具体按照以下程序进行：

使用万分之一天平称量牛血清白蛋白(BSA)粉末600mg(20mg/mL)、甘油醛粉末54.1mg(20mM)置于50ml离心管中。在细胞房超净台中加入30mL无菌PBS溶液，振荡，放于37℃培养箱中溶解30min，使离心管中粉末充分溶解。之后在细胞房超净台中使用孔径为0.22μm的滤膜过滤反应液。过滤后于37℃培养箱中避光放置一周。

一周后从细胞房培养箱中取出AGEs溶液，利用孔径为3500Da的半透膜对AGEs溶液进行透析。半透膜使用前先用超纯水浸泡15min，使之展开。配制1×PBS溶液作为透析液。将装有1×PBS溶液的烧杯放于磁力搅拌器上，并放入搅拌子。将半透膜一头用透析夹夹住，另一头倒入AGEs溶液后也用透析夹夹住，将装有AGEs的半透膜浸泡于透析液中，使用保鲜膜封住烧杯口。打开磁力搅拌器，每次透析6h。6h后更换新的1×PBS透析液继续透析，共完成三次透析。

在细胞房超净台内，将透析结束的AGEs溶液用0.22μm的滤膜进行过滤，然后进行分装。近期要用的放于4℃保存，一周内不用的放于-20℃，长期不用的放于-80℃冰箱保存。

2、AGEs的鉴定：Western blot检测

按照WesternBlot的操作进行配胶，点样和电泳，电泳后将蛋白胶放入考马斯亮蓝染液中，摇床静置过夜。第二天倒掉染色液，加入脱色液，在摇床上脱色。一段时间后，更换新的脱色液，反复三次，直至胶上的蛋白条带清晰显示出来后拍照。

3、AGEs的浓度检测：酶标仪检测

取等量透析后的自制AGEs溶液和标准品AGEs(10mg/mL)，使用PBS分别进行等倍稀释，在荧光酶标仪上以370nm激发光，440nm发射光检测荧光值。以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，作标准曲线，根据二者公式获得自制AGEs和标准品AGEs的浓度比。

4、抑制AGEs合成的效果测定

使用PBS配置5mg/mL的BSA溶液和5mM的甘油醛溶液，现配现用。按1:1的比例将上述两种溶液混合，根据实验设计加入不同药物，然后加入96孔板中，每组至少3个复孔，周围孔使用PBS液封，置于37℃细胞培养箱中。使用荧光酶标仪在370nm激发光，440nm发射光下每天测定各孔的荧光强度值，3天后进行数据统计。

5、处理方式

阳性对照：氨基胍(简称AMI，其为研究最多的一种AGEs抑制剂，具有抗氧化性，能够消灭羟自由基并切断AGEs的交联)

试验组：将脱羧肌肽盐酸盐组分、迷迭香叶提取物组分、茶叶提取物组分和红毛丹果皮提取物组分按照1:1:2:1进行混合制备得到护肤组合物(命名为“Autotelic抗糖组方”，简称ATT抗糖组方，在附图说明及下述实验中以“ATT”描述)，并以PBS稀释5倍、10倍、20倍，分别处理后检测反应下AGEs的含量。

6、结果

6.1、AGEs制备成功检测结果

BSA的分子量一般在65kD左右，当发生糖基化后，蛋白质之间会发生明显交联，使得分子量变大，从图1中蛋白检测图可以看出，自制的AGEs和标准品相似，在100kD以上出现了明显的拖尾，说明AGE制备成功。

由于AGEs在440nm处会有自发荧光，并且荧光强度和浓度成正比，所以本发明将自制AGEs与标准品稀释了相同的倍数，用荧光酶标仪检测荧光值以确定自制AGEs的浓度，用于后续实验。以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作标准曲线，通过斜率比较计算可以得出自制的AGE浓度大约在11mg/ml(见图2)

6.2、抑制AGEs合成的效果的实验结果(重复三次实验进行统计学分析)

由图3可明显看出，相比阳性对照，稀释后5/10/20倍的ATT具有良好的抑制AGEs的效果；具体的，ATT稀释20/10/5倍后，对AGEs合成的抑制率分别可达92.08％、93.67％、94.92％。即ATT在糖基化过程中可以很好的抑制AEGs的形成。

其中，荧光检测的原理说明为：AGEs种类很多，其中具有荧光的产物会在370nm和440nm之间发出荧光，因此利用酶标仪检测荧光量可检测出AGEs的含量，可推算出不同药物糖基化过程中抑制AGEs的合成情况。

(二)抗氧化功能验证

(I)验证DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一种很稳定的氮中心的自由基，是样本抗氧化能力的重要指标之一。DPPH自由基有单电子，其醇溶液呈紫色，在515nm处有强吸收，可通过酶标仪检测，通过吸光度下降的程度来反映样本清除DPPH自由基的能力。

1、实验方法(按照索莱宝公司的DPPH自由基清除能力检测试剂盒进行检测)

工作液制备：试剂盒中DPPH粉末，临用前加入4.05mL无水乙醇振荡溶解配制成工作液，现配现用。维生素C(Vitamin C，VC)是一种高效抗氧化剂，在本实验中作为阳性对照，ATT稀释5倍、10倍、20倍，分别测定清除效果。按照表2所示的反应体系在96孔板中加入相应试剂。

之后涡旋混匀，室温避光静置30min，于515nm处的吸光度。分别记为ATT空白、ATT测定、ATT对照、ATT阳性对照。阳性对照为维生素C。每个测定管需设一个对照管。

表2 DPPH自由基清除能力测定反应体系

2、计算公式

阳性对照的自由基清除率计算公式：

DPPH自由基清除率％＝[(ATT空白-ATT阳性对照)÷ATT空白]×100％

样本的自由基清除率计算公式：

DPPH自由基清除率％＝[[ATT空白-(ATT测定-ATT对照)]÷ATT空白]×100％

3、DPPH自由基清除能力的实验结果(重复三次实验进行统计学分析)

由图4可知，ATT能显著清除DPPH自由基，且清除效果远高于阳性对照的Vc，ATT稀释20/10/5倍后，对DPPH自由基的清除率分别可达94.67％、95.41％、95.68％；即ATT具有抗氧化功效。

(II)活性氧(ROS)检测

抗氧化实验原理：利用自制AGEs，诱导人表皮角质形成细胞HaCaT进行糖基化，通过不同浓度的ATT处理后，检测糖基化过程中SOD的变化，以验证抗氧化功能，本实验技术需确保细胞活性不受影响，需前置测定ATT不对细胞产生毒性的合理稀释浓度。

细胞毒性检测原理：Cell Counting Kit-8(CCK-8)是一种氧化还原反应的指示剂，在电子载体1-MethoxyPMS存在的条件下，利用活细胞中的脱氢酶催化四唑盐WST-8生成甲臜染料，而且甲臜染料的生成量与活细胞的数量成线性关系，不同药物处理后通过酶标仪检测显色，继而确定细胞活性的合适浓度。

AGEs制备及检测：本实验需要用自制的AGEs诱导细胞糖基化，需检测自制AGEs成功才可，可参考抗糖化实验中具体内容。

ROS检测原理介绍：按照碧云天公司的ROS检测试剂盒进行检测。先用药物处理细胞6h。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于6孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1mL。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。处理完的细胞在488nm激发波长，525nm发射波长下会发出绿色荧光，用荧光显微镜拍摄照片，通过ImageJ进行荧光强度定量分析。

其中，ROS检测试剂盒是一种利用荧光探针DCFH-DA进行ROS检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

1、实验方法

1.1、细胞活性检测

细胞复苏：

(1)从液氮罐中取出冻存的细胞，于37℃水浴锅中化冻，在融化过程中用镊子夹住不断晃动，加快解冻；

(2)1000rpm离心3min；

(3)弃去上清，用1mL完全培养基吹打细胞直至均匀，将细胞悬液转移至6cm培养皿中，补足培养基至3mL，十字摇晃，晃匀后放入培养箱(37℃，5％CO₂)中培养；

(4)24h后在显微镜下观察长势，细胞长到一定密度时可开展后续实验，例如铺细胞板、传代等。

细胞传代：

(1)从培养箱中取出细胞，吸除旧的培养基，用1mL磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一遍，以洗尽没有吸净的培养基，防止培养基对胰酶的消化能力产生影响；

(2)随后加入1mL胰酶，细胞被消化变圆，吹打细胞使之脱离皿底；

(3)用1mL完全培养基终止消化，重悬细胞，转移到15mL离心管中，1000rpm离心3min；

(4)弃去上清，用1mL完全培养基吹打细胞直至均匀，按照后续实验所需的密度，分装细胞并加入相对应的培养基，轻轻晃动后，放入培养箱(37℃，5％CO₂)中静置培养。

细胞活性检测：

(1)接种细胞悬液100μL于96孔板，在细胞培养箱中(37℃，5％CO₂)培养；

(2)取出需要检测的细胞，于细胞培养液中直接加入1/10体积的CCK-8，充分混合，保证孔中颜色均一性，但不可有气泡产生。对96孔板，每100μL培养基加入10μL检测试剂；

(3)继续于细胞培养箱中孵育1-4小时；

(4)酶标仪读数之前，置孔板于摇床振荡上约1min，确保孔板颜色均匀；

(5)用酶标仪读取450nm光吸收值，计算细胞活性。

1.2、AGEs制备及检测

参考抗糖功能中具体实验步骤。

1.3、SOD活性氧检测

以自制AGEs处理人表皮角质形成细胞HaCaT，诱导细胞氧化应激反应；

以不同的稀释倍数的ATT处理细胞6h，去除细胞培养液后加入稀释DCFH-DA，37℃细胞培养箱内孵育20分钟；

充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，荧光显微镜拍摄照片，在488nm至525nm之间；通过ImageJ进行荧光强度定量分析。

2、实验结果

2.1、细胞活性检测，确定合理的AAT稀释浓度

如图5所示，与对照组相比，ATT的稀释比例大于等于1000倍时，对HaCaT细胞无毒性。因此，后续本发明选用了安全作用浓度范围内的浓度来进行细胞实验，分别是稀释4000倍、2000倍和1000倍。

2.2、AGEs制备及检测：见抗糖部分实验验证结果

2.3、SOD活性氧检测(重复三次实验)

由图6(图6A～图6C)可看出，通过细胞检测相比只加入AGEs引起氧化应激的阳性对照组，加入分别稀释4000/2000/1000倍的ATT后，其荧光显著降低，表明ATT可显著抑制AGEs。

由图7可看出，利用ImageJ对荧光强度进行定量分析，ATT稀释4000/2000/1000倍后，对AGEs诱导的ROS生成的抑制率分别可达82.28％、84.15％、85.56％。

(三)抗炎功能验证

抗炎实验原理：AGEs可以诱导细胞炎症的产生，而长期的慢性炎症会使组织细胞的正常功能受到损伤。本发明发现用2mg/mL的AGEs刺激3小时，可以使HaCaT细胞内炎症因子IL-6、IL-1β的mRNA表达明显上升。

实验原理：通过不同ATT稀释1000、2000、4000倍处理AGEs诱导后的HaCaT细胞，提取细胞总RNA，进行RNA逆转录后，进行实时荧光定量PCR检测不同药物处理后细胞IL-6、IL-1β两种基因的表达，推算不同稀释倍数后的ATT的抗炎效果。

1、实验方法

1.1、细胞炎症反应：以自制AGEs处理人表皮角质形成细胞HaCaT，诱导细胞炎症反应；以不同的稀释倍数的ATT处理细胞。

1.2、细胞RNA提取：RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过去除蛋白质、DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。可用于后续的实时荧光定量PCR。具体步骤如下：

(1)对于贴壁细胞，彻底去除培养基，对6孔板每孔加入500μL MagZol^TM Reagent，移液枪吹打3-5次，让细胞充分裂解；

(2)按500μL MagZol^TM Reagent加入100μL氯仿至裂解液中。用手剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；

(3)4℃，12000×g离心15min；

(4)小心转移上清液(约200μL)至新的1.5mL离心管中；加入等倍体积异丙醇，颠倒或涡旋混匀，室温静置10min；

(5)4℃，12000×g离心10min沉淀RNA；

(6)倒弃上清液，加入1mL75％乙醇。涡旋或颠倒混匀；

(7)4℃，7500×g离心5min；

(8)倒弃上清液，把离心管反扣于干净的吸水纸上吸弃残留的液体。空气干燥10-15min；

(9)加入适量的缓冲液、100％甲酰胺、DEPC处理水或无核酸酶的水至RNA沉淀中。涡旋重悬RNA沉淀。冰上放置10-30min让RNA充分溶解，测浓度。

1.3、RNA逆转录：

由于RNA极易降解，而DNA比较稳定，便于保存和使用，所以在提取RNA后，需根据

Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix的说明书尽快将总RNA中的mRNA逆转录成cDNA，以便后续通过实时荧光定量PCR检测mRNA的表达水平。通过反应体系如下表：

程序设置为37℃30min，85℃变性5s，12℃Forever。反应产物稀释一定倍数后放-20℃进行保存。逆转录体系如表3所示。

表3 RNA逆转录体系

1.4、实时荧光定量PCR：

使用

qPCR SYBR Green Master Mix进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，扩增出大量目标基因以达到可检测水平，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增中每一个循环扩增产物量的变化，并进行定量分析，以检测目的基因的表达水平；反应条件为：95℃变性15s，60℃复性30s，72℃延伸30s，总共40个循环。相关信息如表4所示。

表4 qRT-PCR反应体系

表4中引物信息如表5所示。

表5引物信息

2、实验结果(重复三次实验)

由图8(图8A～图8C)可看出，ATT稀释4000/2000/1000倍后均能显著抑制AGEs诱导的炎症因子IL-6、IL-1β的mRNA表达，且具有浓度依赖性；ATT稀释4000/2000/1000倍后，对AGEs诱导的炎症因子IL-6表达的抑制率分别可达11.49％、27.67％、37.27％，对IL-1β表达的抑制率分别可达40.95％、53.87％、62.93％；ATT具有一定的抗炎功效，可缓解细胞糖基化过程的炎症反应。

(四)结论：

1、通过模拟糖基化过程，体外检测对糖基化终产物AGEs的抑制作用，相对阳性对照氨基胍，抗糖组方具有显著的抑制AGEs的功效。

2、通过体外模拟糖基化过程中自由基的清除以及作用人永生化表皮角质形成细胞(HaCaT)糖基化诱导细胞氧化，进行抗氧化功能检测抗糖组分同时也具备抗氧化功效。

3、通过糖基化诱导HaCaT细胞炎症反应，检测抗糖组分同时具有的抗炎作用。

4、本发明的ATT通过生物化学、细胞生物学、分子生物学等技术方式验证脱羧肌肽盐酸盐组分、迷迭香提取物组分、茶叶提取物组分、红毛丹果皮提取物组分组成护肤产品具有抗糖、抗氧化及抗炎功效，可用于抗糖抗衰功效的护肤品中。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物，其特征在于，包括如下重量份的组分：脱羧肌肽盐酸盐组分1～4份、迷迭香叶提取物组分1～5份、茶叶提取物组分1～2份和红毛丹果皮提取物组分1～8份；其中：

所述脱羧肌肽盐酸盐组分由脱羧肌肽盐酸盐、1,3丙二醇和水组成；

所述迷迭香叶提取物组分由迷迭香叶提取物、丁二醇和水组成；

所述茶叶提取物组分由茶叶提取物和丁二醇组成；

所述红毛丹果皮提取物组分由红毛丹果皮提取物、甘油和水组成。

2.根据权利要求1所述具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物，其特征在于，包括如下重量份的组分：脱羧肌肽盐酸盐组分1份、迷迭香叶提取物组分1份、茶叶提取物组分2份和红毛丹果皮提取物组分1份。

3.根据权利要求1所述具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物，其特征在于，所述脱羧肌肽盐酸盐组分中，脱羧肌肽盐酸盐、1,3丙二醇和水的重量比为10:20:70。

4.根据权利要求1所述具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物，其特征在于，所述迷迭香叶提取物组分中，迷迭香叶提取物、丁二醇和水的重量比为0.6:49.7:49.7。

5.根据权利要求1所述具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物，其特征在于，所述茶叶提取物组分中，茶叶提取物和丁二醇的重量比为50:50。

6.根据权利要求1所述具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物，其特征在于，所述红毛丹果皮提取物组分中，红毛丹果皮提取物、甘油和水的重量比为0.45:80:19.55。

7.权利要求1～6任一所述具有抗糖化、抗氧化、抗炎作用的护肤组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将所有组分进行混合，搅拌均匀后即得到。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌的时间为30～40min。