CN115873018B - 苯并嘧啶和苯并三嗪类造血祖细胞激酶1降解剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类苯并嘧啶和苯并三嗪类造血祖细胞激酶1降解剂及其应用。本发明利用PROTAC可以实现小分子难以实现的选择性的优势，开发了一类苯并咪唑和苯并三嗪类HPK1 PROTAC降解剂。本发明的PROTAC能够高效、高选择性地降解HPK1蛋白，而对同家族的其他蛋白无降解活性。相对于HPK1小分子抑制剂，能够更高效地刺激T细胞抗肿瘤免疫应答，释放效应细胞因子，具有更强地抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及苯并嘧啶和苯并三嗪类造血祖细胞激酶1降解剂及其应用。
背景技术
免疫疗法彻底改变了癌症的治疗方式，给病人带来了新的希望。特别是，针对PD-1和CTLA-4通路的免疫检查点抑制剂表现出显著的临床效果，但它们只对特定的病患群体、特定类型的肿瘤有效，肿瘤应答率较低(～30％)，并且大多数病人没有表现出持久的症状缓解、用药一段时间后出现耐药性。因此，亟需发现新的肿瘤免疫治疗靶点，改善免疫检查点的临床效果，对肿瘤免疫疗法的应用和推广具有重要意义。
造血祖细胞激酶1(HPK1，MAP4K1)是MAP4K家族的成员之一，它是一种Ste20丝/苏氨酸蛋白激酶。MAP4K家族中除HPK1外还有5个成员，包括MAP4K2、MAP4K3、MAP4K4、MAP4K5和MAP4K6。HPK1主要表达在造血细胞，如T细胞、B细胞、中性粒细胞、树突细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞。大量研究表明，HPK1是T细胞受体和B细胞受体的负调控因子。TCR激活后，细胞质中的HPK1被招募到质膜中，其氨基酸残基Y381、S171和T165磷酸化，获得完全的激酶激活的HPK1激酶。活化的HPK1使其接头蛋白SLP76的氨基酸残基S376磷酸化，为负调控因子14-3-3提供结合位点，促进SLP76发生蛋白酶体降解，最终破坏了TCR信号复合体的稳定，进而阻碍了下游促进T细胞激活和增殖的激酶信号通路。除了TCR信号外，HPK1还通过前列腺素E2(PGE2)受体负调控T细胞信号。另外，在生长因子、压力、炎症因子和分化因子等刺激下，HPK1也可以在B细胞、NK细胞和树突细胞中传递免疫抑制性信号。另外，最近的一项研究表明HPK1的激酶活性抑制多种细胞的免疫功能，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和树突细胞，并且表明抑制HPK1的激酶活性足以诱导抗肿瘤免疫应答。另外，抑制HPK1激酶活性可以进一步促进了T细胞效应功能，显著增加PD-L1单抗的治疗效果。HPK1基因缺失、HPK1抑制剂或HPK1 protac降解剂，均可以增强CAR-T细胞为基础的免疫疗法，在各种临床前血液学和实体瘤小鼠模型中表现出更好的抗肿瘤活性。值得注意的是，HPK1基因敲除和失活激酶敲入小鼠均未表现出致死性炎症反应，而这些在一些其他免疫负调控因子缺失时表现显著，比如CTLA-4和Cbl-b，这说明HPK1抑制剂具有较高的安全性。综上所述，HPK1是一个潜在有效的肿瘤免疫疗法新靶点，HPK1抑制剂的研究与开发对于改善肿瘤免疫疗法当前面临的关键问题具有重要意义。
十多年前，研发人员就发现了HPK1可能是一种潜在的肿瘤免疫治疗靶点，HPK1抑制剂备受各大制药公司和科研机构的青睐，多种结构的HPK1抑制剂被报道，据不完全统计，目前有4个HPK1抑制剂处于早期临床研究阶段，包括Treadwell Therapeutics公司的CFI-402411、百济神州的BGB-15025、珠海宇繁的PRJ1-3024和Nimbus Therapeutics的NDI-101150。目前，它们的结构尚未披露。尽管多种HPK1抑制剂被报道，但是目前还没有相关药物上市。HPK1抑制剂开发所面临的挑战主要是HPK1家族成员功能不同，但是结构同源性非常高，设计高选择性抑制剂难度较大。
与传统的药物相比，PROTAC具有显著优势：作用范围更广、活性更高、可靶向“不可成药”靶点；提高选择性、活性和安全性；克服肿瘤药物耐药性等。PROTAC在某些靶点上可实现小分子难以实现的选择性，因此开发HPK1 PROTAC分子有望解决HPK1抑制剂选择性低、药效无法剂量依赖等问题，而目前HPK1 PROTAC分子鲜有报道。因此，HPK1 PROTAC分子的研究与开发迫在眉睫，具有重要的科学意义和开发价值。
发明内容
针对HPK1小分子抑制剂选择性较低的问题，本发明利用PROTAC可以实现小分子难以实现的选择性的优势，开发靶向HPK1的PROTAC分子，提供了一类苯并咪唑和苯并三嗪类HPK1 PROTAC降解剂。本发明的PROTAC能够高效、高选择性地降解HPK1蛋白，而对同家族的其他蛋白无降解活性。相对于HPK1小分子抑制剂，能够更高效地刺激T细胞抗肿瘤免疫应答，释放效应细胞因子，具有更强地抗肿瘤活性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
如式I所示化合物，或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或者水合物，
式I中：
R1为氢、卤素或氰基；
R2为未取代或R2-1取代的C6-10芳基、未取代或R2-2取代的杂原子选自“N、O或S中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”5～10元杂芳基；
R2-1为卤素、C1-6烷氧基、未取代或R2-1-1取代的C1-6烷基；
R2-1-1为羟基或卤素；
R2-2为卤素、氨基或C1-6烷基；
R3为氢或氨基；
Q为N或C；
A为“/>”端表示与NH相连，“---”端表示与L相连；
B为E3泛素连接酶配体CRBN或VHL；
L为“/>”端表示与A相连，“---”端表示与B相连；
m为0-5之间的整数；
n为0-10之间的整数；
o为1-5之间的整数；
X为C、O、NH、“/>”端表示与L相连，“---”端表示与B相连。
在一些实施方案中，B为或/>Y为氢、氘、氟或氯；W为CH2或羰基；G为氢或甲基；Z为氢或甲基。
在一些具体实施方案中，B为
在一些实施方案中，R2为未取代或R2-1取代的苯基、未取代或R2-2取代的吡啶基、未取代或R2-2取代的吡啶并吗啉基。
在一些具体实施方案中，R2为
在一些实施方案中，如式I所示化合物，或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或者水合物，式I所示化合物的结构式如下所示：
其中，A，L和B的定义如前所述。
在一些实施方案中，式I所示化合物选自以下任一结构的化合物：
如式I所示化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或者水合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述的癌症为骨癌、肺癌、胃癌、结肠癌、膜腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、膀肮癌、宫颈癌、辜丸癌、肾癌、头颈癌、甲状腺癌、食管癌、淋巴癌、白血病或皮肤癌中的一种或多种。
一种药物组合物，其含有如式I所示化合物，或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或者水合物，及药学上可接受的载体或辅料。
在一些实施方案中，在所述的药物组合物中，所述的如式I所示化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或者水合物的用量为治疗有效量。
本发明提供了一种药物组合物在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述的癌症为骨癌、肺癌、胃癌、结肠癌、膜腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、膀肮癌、宫颈癌、辜丸癌、肾癌、头颈癌、甲状腺癌、食管癌、淋巴癌、白血病或皮肤癌中的一种或多种。
所述的药用辅料可为药物生产领域中广泛采用的那些辅料。辅料主要用于提供一个安全、稳定和功能性的药物组合物，还可以提供方法，使受试者接受给药后活性成分以所期望速率溶出，或促进受试者接受组合物给药后活性成分得到有效吸收。所述的药用辅料可以是惰性填充剂，或者提供某种功能，例如稳定该组合物的整体pH值或防止组合物活性成分的降解。所述的药用辅料可以包括下列辅料中的一种或多种：粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂、填充剂、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。
本发明的药物组合物可根据公开的内容使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋或冻干工艺。
本发明所述的药物组合物可以任何形式给药，包括注射(静脉内)、粘膜、口服(固体和液体制剂)、吸入、眼部、直肠、局部或胃肠外(输注、注射、植入、皮下、静脉内、动脉内、肌内)给药。本发明的药物组合物还可以是控释或延迟释放剂型(例如脂质体或微球)。固体口服制剂的实例包括但不限于粉末、胶囊、囊片、软胶囊剂和片剂。口服或粘膜给药的液体制剂实例包括但不限于悬浮液、乳液、酏剂和溶液。局部用制剂的实例包括但不限于乳剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、糊剂、泡沫剂、洗剂、滴剂或血清制剂。胃肠外给药的制剂实例包括但不限于注射用溶液、可以溶解或悬浮在药学上可接受载体中的干制剂、注射用悬浮液和注射用乳剂。所述的药物组合物的其它合适制剂的实例包括但不限于滴眼液和其他眼科制剂；气雾剂：如鼻腔喷雾剂或吸入剂；适于胃肠外给药的液体剂型；栓剂以及锭剂。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的游离体形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的游离体形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸(形成碳酸盐或碳酸氢盐)、磷酸(形成磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、硫酸(形成硫酸盐或硫酸氢盐)、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；有机酸盐还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体化合物，由此再生化合物的游离体形式。化合物的游离体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。
本发明的“药学上可接受的盐”可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。
术语“异构体”是指具有相同化学式而有不同的原子排列的化合物。
术语“代谢产物”是指式I所示化合物或其盐通过体内代谢产生的药学活性产物。这种产物可以从例如所给药的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺、酯化、脱酯、葡糖醛酸化、酶促裂解等产生。因此，本发明包括本发明的化合物的代谢产物，包括使本发明的化合物与哺乳动物接触足够得到其代谢产物的一段时间的方法而产生的化合物。
代谢产物的鉴定典型地通过制备本发明化合物的放射性标记的同位素、将其以可检测的剂量(例如，大于约0.5mg/kg)非肠道给予动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、猴、或人，允许充分的时间以发生代谢(典型地约30秒到30小时)和从尿、血液或其它生物样本分离其转化产物。这些产物容易分离，因为它们是被标记的(其它通过利用能够结合存在于代谢物中的抗原表位的抗体分离)。以常规的方式确定代谢物结构，例如，通过MS，LC/MS或NMR分析。通常，代谢物的分析是以与本领域技术人员公知的常规药物代谢研究相同的方法进行的。只要代谢物产物不是以其它方式在体内不能被发现，否则它们可用于本发明化合物的治疗剂量给药的检定测定法。本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(3H)，碘-125(125I)或C-14(14C)。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。
除了盐的形式，本发明所提供的化合物还存在前药形式。本文所描述的化合物的前药容易地在生理条件下发生化学变化从而转化成本发明的化合物。可在体内转化以提供生物活性物质(即式I所示化合物)的任何化合物是在本发明的范围和主旨内的前药。例如，含有羧基的化合物可形成生理上可水解的酯，其通过在体内水解以得到式I所示化合物本身而充当前药。所述前药优选口服给药，这是因为水解在许多情况下主要在消化酶的影响下发生。当酯本身具有活性或水解发生在血液中时，可使用肠胃外给药。
本领域技术人员可以理解，根据本领域中使用的惯例，本申请描述基团的结构式中所使用的“”和“/>”是指，相应的基团通过该位点与式I所示化合物中的其它片段、基团进行连接。
本发明中的“取代”可为一个或多个，当存在多个“取代”时，所述的“取代”可为相同或不同。
术语“多个”是指2个、3个、4个或5个。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“烷基”是指具有指定的碳原子数的直链或支链烷基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基及其类似烷基。
术语“芳基”是指具有指定的碳原子数的芳香基团，优选单环、双环或者三环的芳香基团，当为双环或者三环时，每个环均满足休克尔规则。本发明的C6-10芳基指含有6～10个碳原子的芳香基团，例如苯基或萘基。
术语“杂芳基”是指含有杂原子的芳香基团，优选含有1个、2个或3个独立选自氮、氧和硫的芳族5～6元单环、芳香族9～10元双环或9～10元芳香杂环并饱和杂环。所述的5～6元的单环包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、呋咱基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑、1,2,5-噁二唑、1,3,4-噁二唑、噻二唑基、二噻唑基、四唑基、吡啶基、吡喃基、噻喃基、二嗪基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁嗪基、噻嗪基、二噁英基、二噻英基、1,2,3-三嗪基、1,2,4-三嗪基、1,3,5-三嗪基或四嗪基。所述的9～10元双环包括但不限于苯并咪唑基、吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁唑基、苯并异唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并吗啉基、苯并哌啶基、吡唑并吗啉基。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的有益在于：
(1)本发明提供的HPK1 PROTAC分子能够高效、高选择降解HPK1蛋白，而对同家族的GLK等蛋白无降解活性。
(2)本发明提供的HPK1 PROTAC分子更高效地刺激T细胞抗肿瘤免疫应答
(3)本发明提供的HPK1 PROTAC分子对癌症具有良好的治疗作用。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1化合物4的合成
a)将2，2，6，6-四甲基哌啶(l87g，1.33mol)溶解在THF(1.4L)中，冷却至-78℃，缓慢滴入2.5M的n-BuLi/THF溶液(400mL，1.00mol)，滴加完毕搅拌30min，将化合物1(140g，663mmol)溶于THF(1.12L)后缓慢滴入反应液，在-78℃下搅拌1h，接着，将甲酸乙酯(59g，796mol)溶于THF(280mL)后滴入反应液并搅拌1h。反应完全后用饱和NH4Cl溶液(2L)淬灭并用乙酸乙酯萃取(1L×3)，合并的有机层，饱和NaCl溶液洗涤，用无水Na2SO4干燥，抽滤除盐，减压浓缩经柱层析纯化得中间体2(42g，27％)。MS(ESI,m/z):239(M++1)。
b)将中间体2(50g，209mmol)，DIPEA(55g，430mmol)，HNPMB2(63g，240mmol)溶于1，4-二氧六环(500mL)中升温至100℃搅拌反应6h。将反应液浓缩，经柱层析纯化得中间体3(90g，90％)。MS(ESI,m/z):476(M++1)。
c)将中间体3(90g，189mmol)，Cs2CO3(122g，374mmol)，碳酸胍(44g，242mmol)溶解在DMA(360mL)中，150℃搅拌反应30min。将反应液冷却至室温，用水稀释并用乙酸乙酯萃取(200mL×3)，合并的有机层，饱和NaCl溶液洗涤，用无水Na2SO4干燥，抽滤除盐，减压浓缩经柱层析纯化得中间体4(31g，33％)。MS(ESI,m/z):497(M++1)。
实施例2化合物6的合成
碳酸胍(2.34g，13.0mmol)和DIPEA(4.42mL，26.0mmol)溶解在NMP(20mL)中，加热至160℃，将化合物5(4.59g，10.0mmol)的NMP(5mL)溶液缓慢加入热反应混合物中。在160℃下搅拌反应2h，冷却至100℃以下，加入冰水混合物(100mL)。在室温下搅拌混合物30min。过滤并用水(20mL)和乙醇(20mL)洗涤，取滤饼用乙醇(20mL)搅拌1h，然后再次过滤。用乙醇(20mL)，乙醇/甲苯混合物(20mL，1:1)和甲苯(20mL)洗涤固体，取固体干燥得产物6(1.91g，40％)。MS(ESI,m/z):479(M++1)。
实施例3化合物8的合成
将原料7(2.17g，5.8mmol)、盐酸胍(1.11g，11.6mmol)、叔丁醇钾(5.2g，46.4mmol)溶解在THF(40mL)中，回流反应2h，反应完全后用水稀释，乙酸乙酯萃取(20mL×3)，合并的有机层，饱和NaCl溶液洗涤，用无水Na2SO4干燥，抽滤除盐，减压浓缩经柱层析纯化得中间体8(672mg，29％)。MS(ESI,m/z):396(M++1)。
实施例4化合物10的合成
在30mL封管中加入原料(548mg，2.7mmol)，碳酸胍(486mg，2.7mmol)溶于DMA(13mL)，100℃反应4h，反应液冷却后倒入50mL冰中，搅拌15min，抽滤，得中间体(553mg，91％)。MS(ESI,m/z):224(M++1)。
实施例5中间体13和15的合成
a)氩气保护，将中间体4(200mg，0.4mmol)、2-氟苯硼酸平哪醇酯(133mg，0.6mmol)、Pd(dppf)Cl2(29mg，0.04mmol)和Na2CO3(85mg，0.8mmol)溶于1，4-二氧六环(2mL)和水(0.4mL)中100℃搅拌反应过夜。反应完全后，将反应液降至室温，用水稀释，二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并的有机层，饱和NaCl溶液洗涤，用无水Na2SO4干燥，抽滤除盐，减压浓缩经柱层析纯化得中间体11(63mg，31％)。MS(ESI,m/z):513(M++1)。
b)氩气保护，将中间体11(513mg，1mmol)、2，2，2-三氟-1-(5-甲氧基-7-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼喹烷-2-基)-3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙烷-1-酮(423mg，1.1mmol)、K3PO4(316mg，1.5mmol)、Pd2(dba)3(92mg，0.1mmol)、t-BuBrettPhos(96mg，0.2mmol)、溶于甲苯(4mL)和水(0.8mL)，110℃反应过夜，反应完全后冷至室温，抽滤取滤液，减压浓缩经柱层析纯化得中间体12(285mg，37％)。MS(ESI,m/z):770(M++1)。
c)将中间体12(674mg，1mmol)溶于甲醇，加入K2CO3(276mg，2mmol)，室温反应2h，反应完全后抽滤除去K2CO3，旋干得中间体13(620mg，92％)。MS(ESI,m/z):674(M++1)。
d)将中间体13(674mg，1mmol)溶于乙腈，加入溴乙酸乙酯(200mg，1.2mmol)，DIPEA室温反应2h，反应完全后冷至室温，乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合并的有机层，饱和NaCl溶液洗涤，用无水Na2SO4干燥，抽滤除盐，减压浓缩经柱层析纯化得中间体14(632mg，85％)。MS(ESI,m/z):743.3(M++1)。
e)将中间体14(743mg，1mmol)溶于四氢呋喃，加入2M NaOH水溶液(1mL)，室温反应2h，反应完全后用2M HCl调PH至酸性，抽滤得滤饼，真空干燥得中间体15(661mg，92％)。MS(ESI,m/z):715(M++1)。
实施例6中间体18和20的合成
合成参照实施例5的合成方法，只需更换相应的原料即可。中间体18：MS(ESI,m/z):715(M++1)。中间体20：MS(ESI,m/z):715(M++1)。
实施例7中间体22和24的合成
合成参照实施例5的合成方法，只需更换相应的原料即可。中间体22：MS(ESI,m/z):715(M++1)。中间体24：MS(ESI,m/z):715(M++1)。
实施例8中间体26的合成
合成参照实施例5的合成方法，只需更换相应的原料即可。中间体26：MS(ESI,m/z):715(M++1)。
实施例9中间体31的合成
合成参照实施例5的合成方法，只需更换相应的原料即可。中间体26：MS(ESI,m/z):715(M++1)。
实施例10中间体34和36的合成
合成参照实施例5的合成方法，只需更换相应的原料即可。中间体26：MS(ESI,m/z):715(M++1)。
实施例11中间体50、52和53的合成
a)将原料47(2.0g，7.25mmol)溶于DMF(10mL)中，向反应体系中加入甘氨酸叔丁酯(1.14g，8.69mmol)和DIPEA(2.1g，9.43mmol)，90℃反应5h，反应完全后冷却至室温，加水稀释，二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，抽滤除盐，减压浓缩经柱层析纯化得中间体48a(1.58g,56％)。MS(ESI,m/z):410(M++1)。只需更换相应的原料，按同样的制备方法即可得到中间体48b，51a-b，53a-e。
b)将中间体48a(387.4mg，1mmol)溶于二氧甲烷(2mL)中，加入三氟乙酸(148μL)，25℃反应8h，直接旋干，得到中间体49a(291mg，88％)。MS(ESI,m/z):332(M++1)。只需更换相应的原料，按同样的方法制得中间体49b，35a-b。
c)将原料49a(331mg，1mmol)溶于DMF中，加入5-溴戊胺(200mg，1.2mmol)和DIPEA(388mg，3mmol),室温反应2h，反应完全后冷却至室温，加水稀释，二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，抽滤除盐，减压浓缩经柱层析纯化得中间体50(249mg,50％)。MS(ESI,m/z):479(M++1)。
d)将中间体51a(1mmol)溶于二氯甲烷(1mmol/5mL)与甲醇(1mmol/1mL)溶液中，0℃下加入4MHCl的二氧六环(0.5mL)溶液，室温反应4h，TLC监测反应完全后将反应液旋干，加入异丙醚打浆，抽滤得中间体。MS(ESI,m/z):317(M++1)。只需更换相应的原料，按同样的方法制得中间体52a和52b。
实施例12中间体55的合成
中间体55a的合成：a)将溴乙酸(139mg，1mmol)加入反应瓶中，向其中加入氯化亚砜(1mL)，80℃搅拌反应5h。反应完全冷却至室温，旋干后加入干燥的四氢呋喃溶解，然后再加入原料54(273mg，1mmol)，50℃反应，TLC监测反应完全后，冷却后抽滤即可得到中间体55a的粗品。MS(ESI,m/z):394(M++1)。
中间体55b的合成：只需更换相应的原料，按同样的方法制得中间体55b。MS(ESI,m/z):450(M++1)。
实施例13中间体58，60和61的合成
中间体58的合成：a)将原料56(1.57g，5.71mmol)溶解在DMF(57mL)中，加入K2CO3(1.19g，8.58mmol)和溴代-四聚乙二醇-丙酸叔丁酯(2.2g，5.71mmol)，室温搅拌反应2h，反应完全后加水淬灭，二氯甲烷萃取(30mL×3)，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，抽滤除盐，减压浓缩经柱层析纯化得中间体57(3.07g，93％)。MS(ESI,m/z):579(M++1)。b)将原料57(576mg，1mmol)溶解在DCM(5mL)中，0℃下滴入TFA(2mmol)，室温搅拌反应3h，减压浓缩得中间体58粗品(470mg，90％)。MS(ESI,m/z):523(M++1)。
中间体60的合成：合成参照中间体58的合成，只需更换相应的原料即可。MS(ESI,m/z):360(M++1)。
中间体61的合成：合成参照中间体58的合成，只需更换相应的原料即可。MS(ESI,m/z):437(M++1)。
实施例14中间体64、67和71的合成
a)氩气保护，将原料62(323mg，1mmol)，9-癸炔-1-醇(185mg，1.2mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(10mol％)、CuI(10mol％)和DIPEA(1.29g，10mmol)溶于THF中，在室温下搅拌反应10h，反应完全后加水淬灭，乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，抽滤除盐，减压浓缩经柱层析纯化得中间体63(309mg，78％)。MS(ESI,m/z):397(M++1)。只需更换相应的原料，按照同样的方法制得中间体66和69。
b)将原料63(397mg，1mmol)溶于丙酮，0℃下滴入2MJones试剂(1mL)。在室温下搅拌反应30min，TLC监测反应完全，乙酸乙酯萃取，无水Na2SO4干燥，减压浓缩得中间体64粗品(229mg，56％)。MS(ESI,m/z):411(M++1)。只需更换相应的原料，按照同样的方法制得中间体67和70。
c)将中间体70(368mg，1mmol)溶于THF(5mL)中，加入10％Pd/C(37mg)，用氢气球换气三次。在室温下搅拌反应12h，硅藻土抽滤，滤液减压浓缩得中间体71粗品(167mg，45％)。MS(ESI,m/z):373(M++1)。
实施例15中间体74和75的合成
中间体74的合成：a)将原料72(444mg，1mmol)，N,N-双Boc-4-氨基丁酸(363mg，1.2mmol)、HATU(562mg，1.5mmol)和DIPEA(388mg，3mmol)溶于THF中，在室温下搅拌反应2h，反应完全后乙酸乙酯萃取，无水Na2SO4干燥，减压浓缩经柱层析纯化得中间体73(693mg，95％)。MS(ESI,m/z):730(M++1)。b)将中间体73(730mg，1mmol)溶于二氯甲烷(1mmol/5mL)与甲醇(1mmol/1mL)溶液中，0℃下加入4MHCl的二氧六环(0.5mL)溶液，室温反应4h，TLC监测反应完全后将反应液旋干，加入异丙醚打浆，抽滤得中间体74(330mg，92％)。MS(ESI,m/z):530(M++1)。
中间体75的合成：合成参照中间体74的合成方法步骤a，只需更换相应的原料即可。MS(ESI,m/z):635(M++1).
实施例16化合物S1的合成
a)将中间体18(798mg，1mmol)，中间体49a(398mg，1.2mmol)、HATU(562mg，1.5mmol)和DIPEA(388mg，3mmol)溶于THF中，在室温下搅拌反应2h，反应完全后加水淬灭，二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，抽滤除盐，减压浓缩经柱层析纯化得中间体76(777mg，70％)。MS(ESI,m/z):1129(M++1)。
b)将中间体75(1111mg，1mmol)，溶于二氯甲烷(5mL)中，滴入TFA(5mL)在室温下搅拌反应2h，反应完全后减压浓缩，经HPLC制备得化合物S1。
S1:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.41(s,1H),8.70(d,J＝1.4Hz,1H),8.20(d,J＝1.4Hz,1H),8.05(s,1H),7.58–7.53(m,2H),7.48(t,J＝7.8Hz,1H),7.41(d,J＝2.3Hz,1H),7.11(ddd,J＝12.1,7.8,1.1Hz,1H),6.00(t,J＝5.1Hz,1H),5.72(t,J＝3.7Hz,1H),5.55(d,J＝7.0Hz,1H),5.45(d,J＝7.0Hz,1H),5.27(t,J＝5.9Hz,1H),4.55(p,J＝5.7Hz,1H),4.32(ddd,J＝5.2,4.5,0.8Hz,2H),4.23(dd,J＝16.8,5.1Hz,1H),4.16(dd,J＝16.9,5.1Hz,1H),3.77(ddd,J＝11.9,7.9,5.6Hz,2H),3.71–3.57(m,2H),3.43(ddd,J＝11.9,7.9,5.6Hz,2H),2.68–2.51(m,2H),2.42(s,3H),2.19–2.03(m,2H),1.98(ddt,J＝11.2,7.9,5.6Hz,2H),1.84(ddt,J＝11.2,7.9,5.6Hz,2H).CMS(ESI,m/z):789(M++1).
实施例17化合物S2的合成
a)将中间体18(798mg，1mmol)，中间体55a(473mg，1.2mmol)和K2CO3(258mg，2mmol)溶于乙腈中，在80℃搅拌反应6h，反应完全后反应完全后加水淬灭，乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，抽滤除盐，减压浓缩经柱层析纯化得中间体77a(777mg，70％)。只需将相应的反应底物替换，即可得到中间体77b。MS(ESI,m/z):1129(M++1)。
b)按照实施例16中步骤b，制得化合物S2.
S2:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.42(s,1H),8.71(d,J＝1.4Hz,1H),8.20(d,J＝1.4Hz,1H),8.03–7.95(m,2H),7.69–7.61(m,2H),7.59(d,J＝2.2Hz,1H),7.47(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H),7.40(d,J＝2.3Hz,1H),5.72(t,J＝3.7Hz,1H),5.55(d,J＝7.0Hz,1H),5.45(d,J＝7.0Hz,1H),5.12(t,J＝5.9Hz,1H),4.37–4.27(m,3H),3.65(ddd,J＝5.2,4.4,3.7Hz,2H),3.19(d,J＝13.2Hz,1H),3.01–2.90(m,3H),2.64(ddd,J＝15.2,8.6,6.4Hz,1H),2.55–2.45(m,4H),2.38(s,3H),2.24–1.98(m,4H),1.88(ddt,J＝11.2,7.9,5.6Hz,2H).MS(ESI,m/z):789(M++1).
实施例18化合物S3的合成
合成方法参照实施例16，只需更换相应的原料即可制得化合物S3。
S3:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.06(s,1H),8.71(d,J＝1.4Hz,1H),8.20(d,J＝1.4Hz,1H),8.03(d,J＝2.0Hz,1H),7.58(d,J＝5.1Hz,1H),7.53–7.45(m,2H),7.36(t,J＝4.4Hz,1H),7.08(ddd,J＝12.4,7.9,1.3Hz,2H),6.88(t,J＝3.8Hz,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.13(t,J＝5.9Hz,1H),4.34–4.24(m,3H),3.65(td,J＝4.9,3.7Hz,2H),3.51(d,J＝13.4Hz,1H),3.38(dtd,J＝14.4,6.3,3.7Hz,1H),3.34–3.22(m,2H),3.20–3.10(m,2H),2.82(ddd,J＝12.1,8.0,5.6Hz,2H),2.69(ddd,J＝15.0,8.5,6.5Hz,1H),2.52(ddd,J＝15.3,8.6,6.4Hz,1H),2.48–2.38(m,2H),2.43(s,3H),2.17–2.00(m,4H),1.85(ddt,J＝11.4,7.9,5.7Hz,2H),1.69(dq,J＝13.0,6.5Hz,1H),1.63–1.50(m,1H),1.53–1.45(m,1H),1.48–1.36(m,3H),1.39–1.29(m,1H).MS(ESI,m/z):874(M++1).
实施例19化合物S4和S5的合成
合成方法参照实施例17，只需更换相应的原料即可制得化合物S4和S5。
S4:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.06(s,1H),8.70(d,J＝1.6Hz,1H),8.15(d,J＝1.4Hz,1H),7.95(d,J＝2.0Hz,1H),7.59(d,J＝4.9Hz,1H),7.52–7.43(m,2H),7.09(ddd,J＝7.7,3.9,1.1Hz,2H),6.92(t,J＝3.8Hz,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.13(t,J＝5.9Hz,1H),4.34–4.24(m,3H),3.65(td,J＝4.9,3.7Hz,2H),3.51(dtd,J＝14.5,6.3,3.8Hz,1H),3.29(dtd,J＝14.5,6.4,3.8Hz,1H),3.01(ddd,J＝11.9,8.0,5.7Hz,2H),2.69(ddd,J＝15.0,8.5,6.5Hz,1H),2.58–2.46(m,3H),2.44(dt,J＝11.9,6.3Hz,1H),2.40(s,2H),2.32(dt,J＝11.9,6.3Hz,1H),2.17–2.07(m,1H),2.11–1.98(m,3H),1.81–1.68(m,3H),1.66–1.53(m,1H),1.50(dq,J＝13.1,6.6Hz,1H),1.47–1.38(m,1H),1.40–1.33(m,1H),1.36–1.27(m,3H),1.30–1.16(m,1H).MS(ESI,m/z):832(M++1).
S5:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.49(s,1H),8.70(d,J＝1.6Hz,1H),8.23(s,1H),8.15(d,J＝1.4Hz,1H),7.96(d,J＝2.0Hz,1H),7.58(d,J＝5.1Hz,1H),7.51(t,J＝7.9Hz,1H),7.10(ddd,J＝7.7,5.3,1.1Hz,2H),6.92(t,J＝3.8Hz,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.15(t,J＝5.9Hz,1H),4.58(p,J＝5.7Hz,1H),4.34–4.28(m,2H),3.65(td,J＝4.9,3.7Hz,2H),3.42(dtd,J＝14.5,6.3,3.8Hz,1H),3.31(dtd,J＝14.5,6.3,3.7Hz,1H),3.05(ddd,J＝11.9,8.0,5.6Hz,2H),2.70(ddd,J＝15.2,8.6,6.3Hz,1H),2.58–2.48(m,3H),2.49–2.32(m,2H),2.40(s,3H),2.13–2.03(m,1H),2.02(ddd,J＝11.4,8.0,5.6Hz,2H),1.94(ddt,J＝11.3,8.6,6.2Hz,1H),1.79–1.65(m,3H),1.60(dp,J＝13.3,6.6Hz,1H),1.54–1.40(m,2H),1.43–1.15(m,12H).MS(ESI,m/z):887(M++1).
实施例20化合物S6的合成
合成方法参照实施例16，只需更换相应的原料即可制得化合物S6。
S6:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.06(s,1H),8.70(d,J＝1.4Hz,1H),8.20(d,J＝1.4Hz,1H),8.04(d,J＝2.0Hz,1H),7.58(d,J＝4.9Hz,1H),7.48(t,J＝7.9Hz,1H),7.23(s,1H),7.10(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.04(dd,J＝7.9,1.3Hz,1H),6.92(t,J＝3.8Hz,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.12(t,J＝5.9Hz,1H),4.44(p,J＝5.6Hz,1H),4.34–4.28(m,2H),3.71(ddd,J＝11.9,7.9,5.7Hz,2H),3.65(td,J＝4.9,3.7Hz,2H),3.49–3.38(m,3H),3.27(dtd,J＝14.5,6.3,3.7Hz,1H),2.69(ddd,J＝15.0,8.5,6.5Hz,1H),2.52(ddd,J＝15.1,8.6,6.4Hz,1H),2.43(s,2H),2.28(t,J＝7.0Hz,2H),2.17–2.07(m,1H),2.10–1.99(m,3H),1.92(ddt,J＝11.2,7.9,5.7Hz,2H),1.70(dq,J＝13.0,6.6Hz,1H),1.58(dp,J＝7.8,6.7Hz,3H),1.44(dp,J＝13.7,6.8Hz,1H),1.33(dq,J＝13.3,6.7Hz,1H).MS(ESI,m/z):845(M++1).
实施例21化合物S7的合成
合成方法参照实施例21，只需更换相应的原料即可制得化合物S7。
S7:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.89(s,1H),9.54(s,1H),8.70(d,J＝1.5Hz,1H),8.20(d,J＝1.5Hz,1H),7.93(d,J＝2.0Hz,1H),7.73(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.63–7.55(m,2H),7.34–7.25(m,2H),6.74(d,J＝7.8Hz,1H),6.45(d,J＝7.8Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.17(t,J＝6.0Hz,1H),4.36–4.27(m,4H),4.11(dt,J＝12.4,6.1Hz,1H),3.85–3.75(m,2H),3.79–3.69(m,2H),3.72–3.61(m,14H),3.65–3.60(m,1H),3.64–3.57(m,1H),3.60–3.47(m,1H),3.42(ddd,J＝11.9,8.0,5.7Hz,2H),2.68(ddd,J＝15.0,8.5,6.5Hz,1H),2.58(t,J＝7.1Hz,2H),2.53(ddd,J＝15.2,8.6,6.4Hz,1H),2.41(s,2H),2.19–2.08(m,1H),2.11–2.03(m,1H),2.02(ddd,J＝11.3,8.0,5.6Hz,2H),1.89(ddt,J＝11.3,8.1,5.7Hz,2H).MS(ESI,m/z):981(M++1).
实施例22化合物S8的合成
合成方法参照实施例21，只需更换相应的原料即可制得化合物S8。
S8:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.81(s,1H),9.06(s,1H),8.70(d,J＝1.4Hz,1H),8.20(d,J＝1.4Hz,1H),7.96–7.86(m,2H),7.61–7.50(m,2H),7.37(t,J＝7.9Hz,1H),7.27(s,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),4.38(d,J＝0.7Hz,2H),4.34–4.24(m,4H),3.65(td,J＝4.9,3.7Hz,2H),3.53(ddd,J＝11.9,8.0,5.7Hz,2H),3.44(ddd,J＝11.9,8.0,5.7Hz,2H),2.70(ddd,J＝15.2,8.6,6.3Hz,1H),2.56(ddd,J＝15.2,8.6,6.4Hz,1H),2.41(s,3H),2.40(dt,J＝12.3,6.1Hz,1H),2.35–2.24(m,2H),2.21(dt,J＝14.2,7.1Hz,1H),2.01–1.85(m,3H),1.87–1.74(m,3H),1.60(dp,J＝9.2,6.7Hz,3H),1.51–1.40(m,1H),1.43–1.20(m,6H).MS(ESI,m/z):868(M++1).
实施例23化合物S9和S10的合成
合成方法参照实施例16，只需更换相应的原料即可制得化合物S9和S10。
S9:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.81(s,1H),9.06(s,1H),8.70(d,J＝1.4Hz,1H),8.20(d,J＝1.4Hz,1H),8.04(d,J＝1.8Hz,1H),7.66–7.55(m,3H),7.49(ddt,J＝7.5,1.8,0.9Hz,1H),7.27(s,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),4.37(dd,J＝13.5,1.1Hz,1H),4.34–4.26(m,3H),4.16–4.04(m,2H),3.65(td,J＝4.8,3.7Hz,2H),3.58(ddd,J＝12.1,8.0,5.7Hz,2H),3.44(ddd,J＝11.9,7.9,5.7Hz,2H),2.67(ddd,J＝15.2,8.7,6.3Hz,1H),2.52(ddd,J＝15.2,8.6,6.3Hz,1H),2.45–2.16(m,8H),2.00(ddt,J＝11.4,8.1,5.7Hz,2H),1.85(dddt,J＝33.0,12.4,8.6,6.0Hz,3H),1.68–1.58(m,1H),1.61–1.51(m,2H),1.52–1.42(m,1H),1.45–1.32(m,1H),1.36–1.24(m,3H),1.28–1.20(m,2H).MS(ESI,m/z):868(M++1).
S10:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.81(s,1H),9.06(s,1H),8.70(d,J＝1.4Hz,1H),8.20(d,J＝1.4Hz,1H),7.93(d,J＝2.0Hz,1H),7.71(s,1H),7.60–7.49(m,3H),7.26(dq,J＝7.7,1.2Hz,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),4.58(p,J＝5.7Hz,1H),4.39–4.28(m,5H),3.83(ddd,J＝11.9,8.1,5.7Hz,2H),3.65(td,J＝4.9,3.7Hz,2H),3.44(ddd,J＝12.1,8.1,5.7Hz,2H),2.66(ddd,J＝15.0,8.5,6.4Hz,1H),2.60–2.43(m,2H),2.40(s,3H),2.44–2.27(m,3H),2.07–1.77(m,8H).MS(ESI,m/z):812(M++1).
实施例24化合物S11的合成
合成方法参照实施例16，只需更换相应的原料即可制得化合物S11。
S11:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.06(s,1H),8.70(d,J＝1.4Hz,1H),8.20(d,J＝1.4Hz,1H),8.03(d,J＝2.0Hz,1H),7.78(dd,J＝7.9,1.3Hz,1H),7.56(d,J＝4.9Hz,1H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.44(dq,J＝7.3,1.1Hz,1H),7.23(s,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.13(t,J＝5.9Hz,1H),4.38–4.28(m,3H),3.68–3.57(m,4H),3.44(ddd,J＝11.9,8.1,5.7Hz,2H),2.84(dtd,J＝14.8,6.4,1.0Hz,1H),2.68(ddd,J＝15.0,8.0,7.0Hz,1H),2.62–2.48(m,2H),2.42(s,2H),2.27(t,J＝7.0Hz,2H),2.16–2.00(m,4H),1.92(ddt,J＝11.4,8.1,5.7Hz,2H),1.74(dt,J＝13.1,6.6Hz,1H),1.73–1.64(m,1H),1.61(p,J＝6.9Hz,2H),1.51–1.34(m,3H).MS(ESI,m/z):830(M++1).
实施例25化合物S12的合成
合成方法参照实施例16，只需更换相应的原料即可制得化合物S12。
S12:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.06(s,1H),8.80(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),8.70(d,J＝1.6Hz,1H),8.15(d,J＝1.4Hz,1H),8.04(d,J＝2.0Hz,1H),7.68(t,J＝7.8Hz,1H),7.52(d,J＝4.9Hz,1H),7.46(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H),7.35(s,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.20(t,J＝5.9Hz,1H),4.35–4.27(m,3H),3.65(td,J＝4.9,3.7Hz,2H),2.99(ddd,J＝12.1,8.1,5.7Hz,2H),2.70(ddd,J＝15.0,8.4,6.2Hz,1H),2.55(ddd,J＝15.2,8.6,6.3Hz,1H),2.49–2.40(m,1H),2.32(s,3H),2.40–2.06(m,7H),1.90(ddt,J＝11.4,8.1,5.7Hz,2H),1.79–1.55(m,6H),1.54–1.44(m,1H),1.48–1.34(m,2H).MS(ESI,m/z):845(M++1).
实施例26化合物S13的合成
合成方法参照实施例17，只需更换相应的原料即可制得化合物S13。
S13:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.06(s,1H),8.70(d,J＝1.6Hz,1H),8.15(d,J＝1.4Hz,1H),7.92(d,J＝2.0Hz,1H),7.56–7.44(m,4H),7.30(dd,J＝7.9,1.3Hz,1H),7.17(dd,J＝7.9,1.3Hz,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),6.17(t,J＝5.1Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.30(t,J＝5.9Hz,1H),4.45(p,J＝5.7Hz,1H),4.34–4.28(m,2H),4.20(dd,J＝17.7,5.0Hz,1H),4.02(dd,J＝17.6,5.1Hz,1H),3.65(td,J＝4.9,3.7Hz,2H),3.05(td,J＝6.1,4.4Hz,2H),2.91(ddd,J＝12.1,8.0,5.7Hz,2H),2.69(ddd,J＝14.9,8.4,6.4Hz,1H),2.61(ddd,J＝15.4,8.6,6.6Hz,1H),2.50–2.34(m,7H),2.18–2.08(m,1H),2.11–2.03(m,1H),2.02(ddd,J＝11.2,8.0,5.6Hz,2H),1.79(ddt,J＝11.4,8.1,5.7Hz,2H),1.67(dq,J＝12.8,6.4Hz,1H),1.56–1.28(m,5H).MS(ESI,m/z):874(M++1).
实施例27化合物S14的合成
合成方法参照实施例17，只需更换相应的原料即可制得化合物S14。
S14:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.89(s,1H),9.06(s,1H),8.70(d,J＝1.6Hz,1H),8.15(d,J＝1.4Hz,1H),8.03(d,J＝2.0Hz,1H),7.64(dd,J＝7.7,1.3Hz,1H),7.61–7.53(m,2H),7.46(s,1H),7.24(dd,J＝7.7,1.3Hz,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.14(t,J＝5.9Hz,1H),4.34–4.28(m,2H),4.28–4.14(m,2H),4.08(dt,J＝11.7,6.0Hz,1H),3.65(td,J＝4.9,3.7Hz,2H),2.99(ddd,J＝12.1,8.0,5.7Hz,2H),2.69(ddd,J＝15.2,8.4,6.5Hz,1H),2.53(ddd,J＝15.2,8.6,6.4Hz,1H),2.48–2.38(m,1H),2.42(s,3H),2.37–2.28(m,1H),2.23–2.00(m,6H),1.91–1.74(m,4H),1.57–1.45(m,1H),1.44–1.29(m,6H).MS(ESI,m/z):832(M++1).
实施例28化合物S15的合成
合成方法参照实施例16，只需更换相应的原料即可制得化合物S15。
S15:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.89(s,1H),9.06(s,1H),8.71(d,J＝1.4Hz,1H),8.20(d,J＝1.4Hz,1H),8.03(d,J＝2.0Hz,1H),7.73(dd,J＝7.9,1.3Hz,1H),7.64–7.54(m,2H),7.50(s,1H),7.43(t,J＝4.4Hz,1H),7.33(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.26(t,J＝5.9Hz,1H),4.35–4.26(m,3H),4.17(dt,J＝12.1,6.1Hz,1H),4.08(dt,J＝11.9,6.1Hz,1H),3.65(td,J＝4.9,3.7Hz,2H),3.50(d,J＝13.2Hz,1H),3.19–3.01(m,3H),2.83(ddd,J＝12.1,8.0,5.6Hz,2H),2.74–2.63(m,1H),2.57(ddd,J＝15.2,8.0,7.1Hz,1H),2.44(s,3H),2.49–2.39(m,2H),2.16–2.01(m,4H),1.83(ddt,J＝11.4,8.1,5.7Hz,2H),1.79–1.41(m,6H).MS(ESI,m/z):875(M++1).
实施例29化合物S16的合成
合成方法参照实施例17，只需更换相应的原料即可制得化合物S16。
S16:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.12(s,1H),8.04(d,J＝2.0Hz,1H),7.63–7.57(m,3H),7.48(t,J＝7.9Hz,1H),7.37(s,1H),7.09(ddd,J＝7.8,4.3,1.3Hz,2H),6.92(t,J＝3.8Hz,1H),6.82–6.71(m,3H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.12(t,J＝5.9Hz,1H),4.34–4.28(m,2H),3.65(td,J＝4.8,3.7Hz,2H),3.41(dtd,J＝14.5,6.2,3.7Hz,1H),3.28(dtd,J＝14.5,6.3,3.7Hz,1H),3.24–3.15(m,4H),2.79–2.70(m,4H),2.73–2.64(m,1H),2.52(ddd,J＝15.3,8.6,6.5Hz,1H),2.42(s,3H),2.47–2.38(m,1H),2.32(dt,J＝12.0,6.4Hz,1H),2.17–2.01(m,2H),1.79–1.68(m,1H),1.66–1.52(m,2H),1.52–1.19(m,11H).MS(ESI,m/z):870(M++1).
实施例30化合物S17的合成
合成方法参照实施例16，只需更换相应的原料即可制得化合物S17。
S17:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.12(s,1H),8.04(d,J＝2.0Hz,1H),7.64–7.57(m,3H),7.48(t,J＝7.9Hz,1H),7.40–7.31(m,2H),7.10(ddd,J＝7.7,4.9,1.2Hz,2H),6.88(t,J＝3.7Hz,1H),6.84–6.77(m,2H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.15(t,J＝5.9Hz,1H),4.34–4.28(m,2H),3.68–3.57(m,3H),3.53–3.42(m,2H),3.37(t,J＝5.3Hz,4H),3.26(dtd,J＝14.3,6.3,4.4Hz,1H),3.22–3.10(m,2H),2.82–2.71(m,4H),2.69(ddd,J＝15.2,8.4,6.5Hz,1H),2.52(ddd,J＝15.2,8.6,6.5Hz,1H),2.42(s,3H),2.16–2.01(m,2H),1.69(dq,J＝13.0,6.5Hz,1H),1.63–1.50(m,1H),1.53–1.41(m,2H),1.45–1.34(m,1H),1.38–1.28(m,1H).MS(ESI,m/z):885(M++1).
实施例31化合物S18的合成
合成方法参照实施例17，只需更换相应的原料即可制得化合物S18。
S18:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.04(s,1H),7.94(d,J＝2.0Hz,1H),7.54–7.45(m,2H),7.13–7.02(m,3H),6.95–6.88(m,2H),6.86(dt,J＝8.4,1.0Hz,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.09(t,J＝5.9Hz,1H),4.35–4.28(m,3H),3.95(dd,J＝13.6,1.1Hz,1H),3.83(s,3H),3.65(td,J＝4.9,3.8Hz,2H),3.51(dtd,J＝14.5,6.3,3.7Hz,1H),3.29(dtd,J＝14.5,6.3,3.7Hz,1H),2.95–2.80(m,3H),2.74–2.63(m,2H),2.59(dt,J＝12.0,6.4Hz,1H),2.57–2.46(m,2H),2.39(s,3H),2.17–2.01(m,2H),1.77–1.65(m,1H),1.64(dt,J＝13.1,6.5Hz,1H),1.56(tt,J＝13.0,6.5Hz,2H),1.45–1.28(m,2H).MS(ESI,m/z):829(M++1).
实施例32化合物S19的合成
合成方法参照实施例16，只需更换相应的原料即可制得化合物S19。
S19:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.04(s,1H),8.03(d,J＝2.0Hz,1H),7.59(d,J＝4.9Hz,1H),7.50(t,J＝7.8Hz,1H),7.32(t,J＝4.3Hz,1H),7.23–7.12(m,3H),7.05(d,J＝8.4Hz,1H),6.91–6.84(m,2H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.15(t,J＝6.0Hz,1H),4.34–4.28(m,2H),3.89–3.82(m,1H),3.84(s,3H),3.65(td,J＝4.9,3.8Hz,2H),3.60(dd,J＝13.5,1.0Hz,1H),3.48–3.38(m,2H),3.32(dtd,J＝14.5,6.4,3.8Hz,1H),3.29–3.19(m,2H),3.07(dtd,J＝14.3,6.3,4.4Hz,1H),2.99(dd,J＝5.6,4.9Hz,2H),2.85(ddd,J＝15.4,5.7,4.8Hz,1H),2.76(dt,J＝15.4,5.2Hz,1H),2.69(ddd,J＝15.2,8.4,6.5Hz,1H),2.53(ddd,J＝15.2,8.5,6.4Hz,1H),2.43(s,3H),2.16–2.02(m,2H),1.76–1.64(m,1H),1.63–1.28(m,5H).MS(ESI,m/z):886(M++1).
实施例33化合物S20的合成
合成方法参照实施例17，只需更换相应的原料即可制得化合物S20。
S20:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.49(s,1H),7.62–7.55(m,2H),7.48(t,J＝7.8Hz,1H),7.46–7.35(m,2H),7.33(t,J＝2.2Hz,1H),7.32–7.24(m,1H),7.11(dd,J＝7.8,1.1Hz,1H),7.10–7.01(m,2H),6.92(t,J＝3.7Hz,1H),6.85(dt,J＝8.4,1.0Hz,1H),5.65(d,J＝7.0Hz,1H),5.52(d,J＝7.0Hz,1H),5.13(t,J＝5.9Hz,1H),4.22–4.15(m,1H),3.83(s,3H),3.77(dd,J＝13.6,1.1Hz,1H),3.48(dtd,J＝14.5,6.3,3.7Hz,1H),3.32(dtd,J＝14.5,6.3,3.7Hz,1H),2.91–2.81(m,3H),2.77–2.59(m,3H),2.57–2.47(m,1H),2.51–2.42(m,1H),2.17–2.02(m,2H),1.76–1.49(m,4H),1.48–1.30(m,2H).MS(ESI,m/z):775(M++1).
实施例34化合物S21的合成
合成方法参照实施例16，只需更换相应的原料即可制得化合物S21。
S21:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.62(s,1H),7.62–7.55(m,2H),7.46(t,J＝7.9Hz,1H),7.46–7.35(m,2H),7.36–7.25(m,3H),7.13–7.02(m,3H),6.88(t,J＝3.7Hz,1H),6.81(dt,J＝8.4,1.0Hz,1H),5.65(d,J＝7.1Hz,1H),5.53(d,J＝7.0Hz,1H),5.04(t,J＝5.9Hz,1H),3.88(dd,J＝13.5,0.9Hz,1H),3.82(s,3H),3.72(dd,J＝13.6,0.9Hz,1H),3.60(dtd,J＝14.5,6.3,3.8Hz,1H),3.41(d,J＝13.2Hz,1H),3.34–3.21(m,2H),3.24–3.14(m,1H),3.10(dtd,J＝14.3,6.3,4.4Hz,1H),2.99(t,J＝5.3Hz,2H),2.90–2.81(m,1H),2.73–2.60(m,2H),2.48(ddd,J＝15.1,8.7,6.3Hz,1H),2.21(ddt,J＝11.2,8.6,6.1Hz,1H),2.05(ddt,J＝11.2,8.6,6.0Hz,1H),1.69(dq,J＝13.0,6.5Hz,1H),1.63–1.51(m,1H),1.53–1.45(m,1H),1.49–1.42(m,1H),1.46–1.28(m,2H).MS(ESI,m/z):832(M++1).
实施例35化合物S22的合成
合成方法参照实施例16，只需更换相应的原料即可制得化合物S22。
S22:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.75(d,J＝2.2Hz,1H),8.70(d,J＝1.6Hz,1H),8.24–8.14(m,3H),8.06(s,1H),7.99(dd,J＝8.6,2.0Hz,1H),7.53(t,J＝7.8Hz,1H),7.36(t,J＝4.4Hz,1H),7.30–7.23(m,2H),7.10(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),6.88(t,J＝3.7Hz,1H),5.60(t,J＝3.7Hz,1H),5.13(t,J＝5.9Hz,1H),4.37–4.27(m,3H),3.65(ddd,J＝5.2,4.6,3.8Hz,2H),3.60–3.47(m,2H),3.25(dtd,J＝14.5,6.3,3.8Hz,1H),3.16(d,J＝13.2Hz,1H),3.08(td,J＝6.3,4.4Hz,2H),2.83(ddd,J＝12.1,8.0,5.7Hz,2H),2.69(ddd,J＝15.2,8.5,6.5Hz,1H),2.57–2.47(m,1H),2.44(ddd,J＝12.1,8.1,5.7Hz,2H),2.39(s,3H),2.17–2.01(m,4H),1.84(ddt,J＝11.4,8.1,5.7Hz,2H),1.76–1.64(m,1H),1.63–1.42(m,3H),1.42–1.28(m,2H).MS(ESI,m/z):841(M++1).
实施例36化合物S23的合成
合成方法参照实施例17，只需更换相应的原料即可制得化合物S23。
S23:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),9.74(d,J＝1.8Hz,1H),8.70(d,J＝1.6Hz,1H),8.24–8.17(m,3H),8.08–8.01(m,2H),7.50(t,J＝7.9Hz,1H),7.26(s,1H),7.20(ddd,J＝16.1,7.9,1.3Hz,2H),6.92(t,J＝3.8Hz,1H),5.60(t,J＝3.7Hz,1H),5.16(t,J＝5.9Hz,1H),4.32(td,J＝4.9,0.8Hz,2H),4.27(p,J＝5.7Hz,1H),3.65(ddd,J＝5.2,4.6,3.8Hz,2H),3.46(dtd,J＝14.5,6.3,3.8Hz,1H),3.23(dtd,J＝14.5,6.3,3.8Hz,1H),3.01(ddd,J＝11.9,8.0,5.6Hz,2H),2.68(ddd,J＝15.0,8.6,6.3Hz,1H),2.52(ddd,J＝15.2,8.8,6.4Hz,1H),2.43(dt,J＝11.9,6.3Hz,1H),2.39(s,3H),2.32(dt,J＝11.9,6.3Hz,1H),2.27–2.17(m,3H),2.12–2.01(m,3H),1.85–1.78(m,1H),1.81–1.75(m,1H),1.78–1.68(m,1H),1.67–1.55(m,1H),1.58–1.27(m,5H),1.30–1.16(m,1H).MS(ESI,m/z):798(M++1).
实施例37化合物S24的合成
合成方法参照实施例17，只需更换相应的原料即可制得化合物S24。
S24:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),7.69(t,J＝2.1Hz,1H),7.62(ddd,J＝8.1,5.0,1.1Hz,1H),7.54–7.45(m,2H),7.48–7.37(m,2H),7.27(ddd,J＝8.3,6.4,2.4Hz,1H),7.10(ddd,J＝7.7,4.5,1.2Hz,2H),7.04(d,J＝8.4Hz,1H),6.98–6.89(m,2H),6.86(dt,J＝8.6,1.0Hz,1H),6.08(d,J＝7.0Hz,1H),5.63(d,J＝7.1Hz,1H),5.17(t,J＝5.9Hz,1H),4.19(dd,J＝13.6,0.9Hz,1H),3.86(s,3H),3.77(dd,J＝13.6,1.1Hz,1H),3.52(dtd,J＝14.5,6.3,3.7Hz,1H),3.33(dtd,J＝14.5,6.3,3.7Hz,1H),2.91–2.82(m,2H),2.73–2.43(m,6H),2.22(ddt,J＝11.3,8.6,6.1Hz,1H),2.08(ddt,J＝11.3,8.6,6.2Hz,1H),1.71(ddq,J＝25.9,13.0,6.6Hz,2H),1.66–1.54(m,1H),1.52–1.35(m,2H),1.38–1.31(m,1H),1.34–1.20(m,4H).MS(ESI,m/z):786(M++1).
实施例38化合物S25的合成
合成方法参照实施例17，只需更换相应的原料即可制得化合物S25。
S25:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.92(s,1H),7.79–7.70(m,2H),7.62(ddd,J＝8.3,5.1,1.3Hz,1H),7.54–7.43(m,2H),7.46–7.35(m,3H),7.28(ddd,J＝8.3,6.9,2.2Hz,1H),7.21(dd,J＝7.9,1.3Hz,1H),7.09–7.00(m,2H),6.99(t,J＝3.7Hz,1H),6.81(dt,J＝8.4,1.0Hz,1H),6.08(d,J＝7.0Hz,1H),5.63(d,J＝7.1Hz,1H),5.14(t,J＝5.9Hz,1H),3.81(dd,J＝13.6,1.1Hz,1H),3.80(s,3H),3.52(dd,J＝13.6,0.9Hz,1H),3.38(dtd,J＝14.3,6.1,3.7Hz,1H),3.33–3.19(m,3H),3.09(dtd,J＝14.4,6.2,4.3Hz,1H),3.03–2.94(m,3H),2.82–2.68(m,2H),2.63(dt,J＝15.4,5.3Hz,1H),2.53(ddd,J＝15.2,8.6,6.3Hz,1H),2.10(ddt,J＝11.3,8.8,6.1Hz,1H),1.94(ddt,J＝11.3,8.8,6.1Hz,1H),1.72–1.41(m,4H).MS(ESI,m/z):801(M++1).
实施例39化合物S26的合成
合成方法参照实施例16，只需更换相应的原料即可制得化合物S26。
S26:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.32(s,1H),8.74(s,1H),7.76(dd,J＝5.0,2.1Hz,1H),7.66(d,J＝9.0Hz,1H),7.52(dddd,J＝8.0,5.0,2.1,1.2Hz,1H),7.51–7.44(m,2H),7.46–7.34(m,3H),7.35–7.28(m,2H),7.29–7.22(m,1H),7.18(d,J＝8.6Hz,1H),7.13(s,1H),7.05(d,J＝8.4Hz,1H),6.84(dt,J＝8.4,1.0Hz,1H),6.58(d,J＝7.9Hz,1H),6.39(d,J＝7.9Hz,1H),5.11(dqt,J＝8.1,6.0,1.0Hz,1H),4.66(d,J＝8.8Hz,1H),4.51(dd,J＝5.9,4.9Hz,1H),4.36(ttd,J＝5.8,4.7,3.3Hz,1H),3.86(dd,J＝13.6,1.1Hz,1H),3.84(s,3H),3.68–3.58(m,2H),3.56(d,J＝5.7Hz,1H),3.46–3.38(m,2H),3.31(dtd,J＝14.3,6.3,4.4Hz,1H),3.19(d,J＝13.2Hz,1H),3.09(dtd,J＝14.3,6.3,4.4Hz,1H),3.03–2.94(m,2H),2.85–2.76(m,1H),2.69(dt,J＝15.6,5.3Hz,1H),2.52(s,3H),2.39–2.24(m,2H),2.18(ddd,J＝13.2,5.9,4.8Hz,1H),2.06(ddd,J＝13.2,5.9,4.9Hz,1H),1.87(tdd,J＝13.3,7.1,6.2Hz,1H),1.72(tdd,J＝13.4,7.0,6.3Hz,1H),1.53(d,J＝6.2Hz,3H),0.96(s,9H).MS(ESI,m/z):1003(M++1).
实施例40化合物S27的合成
合成方法参照实施例17，只需更换相应的原料即可制得化合物S27。
S27:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.31(s,1H),8.74(s,1H),7.76(dd,J＝5.0,2.1Hz,1H),7.58(d,J＝9.0Hz,1H),7.56–7.46(m,3H),7.46–7.34(m,2H),7.38–7.31(m,2H),7.25(ddd,J＝7.9,7.0,1.8Hz,1H),7.18(t,J＝4.3Hz,2H),7.04(d,J＝8.4Hz,1H),6.82(dt,J＝8.4,1.0Hz,1H),6.58(d,J＝7.9Hz,1H),6.39(d,J＝7.9Hz,1H),5.11(dqt,J＝8.1,6.1,1.0Hz,1H),4.58(d,J＝9.0Hz,1H),4.52(dd,J＝5.9,4.9Hz,1H),4.41–4.32(m,1H),4.21(dd,J＝13.5,0.9Hz,1H),3.85–3.76(m,5H),3.64(dd,J＝10.8,4.4Hz,1H),3.59(d,J＝5.7Hz,1H),3.43(dd,J＝10.9,3.4Hz,1H),2.91–2.82(m,2H),2.80(ddd,J＝15.4,5.9,4.8Hz,1H),2.71–2.59(m,2H),2.49(s,3H),2.49(dt,J＝11.9,6.4Hz,2H),2.33–2.19(m,2H),2.07(ddd,J＝13.2,5.9,4.9Hz,1H),1.87(ddd,J＝13.4,6.0,4.9Hz,1H),1.69–1.46(m,7H),1.39–1.29(m,1H),1.32–1.20(m,3H),0.97(s,9H).MS(ESI,m/z):988(M++1).
实施例41化合物S28的合成
合成方法参照实施例17，只需更换相应的原料即可制得化合物S28。
S28:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.51(s,1H),8.73(s,1H),8.11(d,J＝2.0Hz,1H),7.87(d,J＝5.1Hz,1H),7.58(d,J＝9.0Hz,1H),7.44–7.37(m,2H),7.36–7.29(m,2H),7.22–7.15(m,2H),7.04(d,J＝8.4Hz,1H),6.88(dt,J＝8.4,1.0Hz,1H),6.74(d,J＝7.9Hz,1H),6.45(d,J＝7.9Hz,1H),5.78(t,J＝3.7Hz,1H),5.11(dqt,J＝8.1,6.1,1.0Hz,1H),4.66(d,J＝9.0Hz,1H),4.46–4.37(m,1H),4.34–4.27(m,3H),4.21(dd,J＝5.8,5.0Hz,1H),3.84(s,2H),3.72(dd,J＝13.6,1.1Hz,1H),3.68–3.61(m,3H),3.43(dd,J＝10.9,3.4Hz,1H),2.96–2.82(m,2H),2.81–2.72(m,2H),2.74–2.60(m,2H),2.58–2.49(m,1H),2.54(s,3H),2.39(s,2H),2.22(td,J＝7.1,1.8Hz,2H),2.05–1.91(m,2H),1.74(dh,J＝13.0,6.5Hz,1H),1.64(dq,J＝12.9,6.9Hz,1H),1.61–1.48(m,5H),1.43–1.18(m,6H),0.97(s,9H).MS(ESI,m/z):1042(M++1).
实施例42本发明化合物对HPK1激酶活性测试
HPK1激酶结构域(1-307aa)溶解在激酶buffer(20mM HEPES pH7.5,10mM MgCl2,1mM EGTA,0.5mM TCEP,0.01％Brij-35,0.05％BSA)中加到96孔板中，终浓度为20nM，然后加入梯度稀释的待测本发明化合物(每个化合物设置10个浓度点)，HPK1激酶与本发明化合物预孵30min，然后向每孔中加入20μL底物溶液(终浓度为0.5mg/mL SLP76-SH2结构域和10μM ATP)启动酶促反应。室温下孵育1h，然后按照Luminescent Kinase Assay Kit(Beyotime Biotechnology Company)说明书测定每个浓度下本发明化合物对HPK1激酶活性的抑制率。采用GraphPad拟合计算本发明化合物对HPK1激酶的抑制活性IC50值，以默克公司报道的化合物A、B和C作为阳性对照。实验结果如表1所示。
表1本发明化合物对HPK1蛋白的激酶抑制活性(IC50nM)
| 化合物编号 | 酶抑制活性 | 化合物编号 | 酶抑制活性 |
| S1 | 20.5 | S17 | 32.5 |
| S2 | 22.3 | S18 | 25.3 |
| S3 | 9.9 | S19 | 37.3 |
| S4 | 9.5 | S20 | 7.3 |
| S5 | 9.6 | S21 | 8.9 |
| S6 | 30.5 | S22 | 32.6 |
| S7 | 40.8 | S23 | 37.5 |
| S8 | 28.3 | S24 | 8.9 |
| S9 | 29.6 | S25 | 7.6 |
| S10 | 28.7 | S26 | 22.3 |
| S11 | 28.3 | S27 | 26.2 |
| S12 | 10.2 | S28 | 19.6 |
| S13 | 9.9 | A | 7.7 |
| S14 | 10.5 | B | 21.8 |
| S15 | 12.3 | C | 36.8 |
| S16 | 33.2 |
与阳性对照化合物A和B相比，本发明化合物与阳性对照活性基本相当，这说明本发明化合物基本保持了HPK1抑制活性，与HPK1蛋白具有较好的结合。
实施例43本发明部分化合物对HPK1蛋白降解活性测试
(1)收集细胞：Jurkat细胞贴壁培养12h，将本发明部分化合物(0.1μM，1μM，10μM)与细胞共孵育12h。
(2)提取蛋白：弃去原培养基，用预冷的PBS清洗细胞三次，加入适量裂解液，混合均匀置于冰上裂解30min，于4℃下12000rpm离心5min，将离心后的上清转移倒新的离心管中，准备定量。
(3)蛋白定量：采用BCA法定量蛋白，将A液与B液按照50:1的比例混匀后得到BCA工作液。将100μL BCA工作液与9μL三蒸水和1μL蛋白样品加入96孔板中，混匀后37℃孵育30min，用全波长酶标仪测定吸光度，根据标准曲线计算蛋白浓度。定量后的蛋白以4:1的比例与5×loading buffer混合，沸水中变性8min，放置冰上冷却后储存在-20℃备用。
(4)配制SDS-PAGE凝胶，浓缩胶的电压为90V，分离胶的电压为120V，4℃条件下，100V电压转膜1h，转膜完毕后，立即把蛋白膜放置预先准备好的5％BSA溶液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。
(5)参考HPK1 Antibody(4472SCST)、GLK(D1L4G)Rabbit mAb(92427SCST)、RabbitmAb(92711TCST)、β-actin Mouse Monoclonal antibody(BE0021 easybio)的说明书，按照适当比例稀释一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜，再用PBST洗涤3次，10min/次。
(6)根据一抗选择Goat Anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP Conjugated(BE0101easybio)或Goat Anti-Mouse IgG(H&L)-HRP Conjugated(BE0102 easybio)，参考二抗的说明书，按照适当比例稀释二抗，室温缓慢摇动孵育1h，用PBST洗涤3次，10min/次。
(7)加入ECL发光液，通过显影仪观察结果，利用Image J软件对Western结果进行定量，通过与不加化合物的对照组进行对比计算降解率(HPK1和GLK)。实验结果如表2所示。
表2本发明化合物对HPK1蛋白的激酶抑制活性(IC50nM)
实验结果表明，本发明化合物对HPK1蛋白具有较好的降解活性，且呈剂量依赖性，而本发明化合物在1.0μM时对GLK蛋白的降解率较低，说明本发明化合物能够高效、高选择性降低HPK1蛋白。
实施例44 T细胞细胞因子释放量检测
HPK1激酶抑制T细胞效应细胞因子释放，因而通过ELISA法检测本发明化合物是否能够增强T细胞细胞因子释放能力。人PBMC细胞解冻混悬于含有10％牛胎盘血清的RPMI1640(Gibco)培养基中，细胞接种于96孔板中(1×105/孔)。梯度稀释的本发明化合物加到96孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中孵育1h。加入100μLof anti-CD3/CD28抗体(终浓度1μg/mL)激活PBMCs细胞，然后于37℃，5％CO2培养箱中孵育48h.采用8倍PBS稀释上清液，取稀释的上清100μL，采用人源IL-2 ELISA试剂盒(4abio)检测本发明化合物每个浓度下细胞因子IL-2的释放量。采用GraphPad拟合计算本发明化合物的EC50值。实验结果如表3所示。
表3本发明化合物刺激PBMC释放IL-2细胞因子活性测试结果
| 化合物编号 | EC50(nM) |
| S13 | 32nM |
| S20 | 25nM |
| A | 140nM |
本发明化合物S13和S20能够显著增强PBMC细胞释放IL-2，且优于阳性对照化合物A。这说明本发明化合物能够通过降解HPK1蛋白，从而增强T细胞效应细胞因子释放，进而恢复或增强抗肿瘤免疫应答。
Claims (6)
1.如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，
式I中：
R1为氢、卤素或氰基；
R2为
R3为氢或氨基；
Q为N或C；
A为 端表示与NH相连，“---”端表示与L相连；
B为Y为氢、氘、氟或氯；W为CH2或羰基；G为氢或甲基；
Z为氢或甲基；
L为 端表示与A相连，“---”端表示与B相连；
m为0-5之间的整数，n为0-10之间的整数，o为1-5之间的整数；
X为C、O、NH、 端表示与L相连，“---”端表示与B相连。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
B为
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式I所示化合物的结构式如下所示：
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式I所示化合物选自以下任一结构的化合物：
5.权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防与HPK1激酶相关疾病的药物中的用途。
6.一种药物组合物，含有治疗有效量的如权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体或辅料。
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