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CN115768485A - 包含sting激动剂的抗体药物缀合物 - Google Patents

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CN115768485A
CN115768485A CN202180039592.6A CN202180039592A CN115768485A CN 115768485 A CN115768485 A CN 115768485A CN 202180039592 A CN202180039592 A CN 202180039592A CN 115768485 A CN115768485 A CN 115768485A
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CN
China
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conjugate
alkyl
cancer
antibody
scaffold
Prior art date
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Pending
Application number
CN202180039592.6A
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English (en)
Inventor
J·R·杜瓦尔
K·W·本特利
R·A·布哈立德
N·塞廷巴斯
M·I·达梅林
E·W·凯勒赫
T·B·洛欣格
J·D·托马斯
D·托阿德
L·徐
杨丽萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mersana Therapeutics Inc
Original Assignee
Mersana Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本公开提供支架和包含干扰素基因刺激因子(STING)的抗体‑药物缀合物(ADC)。本公开还提供ADC在治疗，例如癌症治疗中的用途。

Description

包含STING激动剂的抗体药物缀合物
相关申请
本申请要求2020年4月2日递交的美国临时申请第63/004,108号、2020年6月18日递交的美国临时申请第63/040,755号和2020年11月10日递交的美国临时申请第63/111,820号的优先权。这些申请中每一个的内容通过参考以其全部并入本文。
通过参考并入的序列表
创建于2021年3月31日且大小为49KB的名为“MRSN-033_001WO_SeqList.txt”的文本文件的内容，通过参考以其全部并入本文。
背景技术
干扰素基因刺激因子(STING)为内质网中的受体，其传播胞质病原体衍生的和自身DNA的先天免疫感应。STING为一种378个氨基酸的蛋白，其主要含有3个结构域：(i)N-末端跨膜结构域(aa 1-154)；(ii)中央球状结构域(aa 155-341)；和(iii)C-末端尾部(aa342-379)。STING可与其配体组合形成呈V形构象的对称二聚体，而不完全覆盖结合的配体。STING激动剂可结合到STING的口袋区域中。然而，在一些严重疾病状态下，STING激活过程容易被抑制，导致STING通路失活。因此，筛选和设计有效的STING激动剂对于癌症免疫疗法和其他感染性疾病治疗具有重要意义，包括但不限于肥胖症、肝损伤、糖脂代谢和病毒感染。免疫通路的特异性靶向为癌症疗法提供机会，可能提供比基于细胞群的治疗方法更大的特异性。
抗体-药物缀合物(ADC)由共价连接于抗体的类药性小分子组成。抗体代表一种针对特定作用部位的靶向机制。到达部位后，ADC设计为释放小分子(药物)，使其能够以靶向方式执行其设计功能，而不是全身扩散至受试者的整个身体。这种靶向方法使得能够用原本需要很高剂量以至于当全身给予时具有毒性的药物进行治疗。
先天免疫系统的一个关键特征为识别和清除外来物质。通过宿主识别进化上保守的微生物结构(称为病原体相关分子模式(PAMP))，可鉴别这些病原入侵者。宿主识别可通过多种途径发生，比如激活模式识别受体(PRR)，其最终导致下游信号传导事件并最终导致产生免疫反应。
本公开的抗体-药物缀合物调节STING的活性，并且因此，可在治疗其中STING(干扰素基因刺激因子)的调节为有益的疾病、病症和/或病况(包括但不限于炎症、过敏和自身免疫性疾病、感染性疾病、癌症、癌前综合征以及作为疫苗佐剂)提供有益的治疗影响。仍然需要新的免疫疗法来治疗疾病，特别是癌症。
发明内容
在一些方面，本公开提供以下式(I)的缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
PBRM-[A1-(LC)0或1-D]d15 (I)
其中：
PBRM表示基于蛋白的识别分子；
当存在时，LC为接头单元；
当LC存在时，A1为使PBRM与LC连接的二价接头部分，或当LC不存在时，A1为使PBRM与D连接的二价接头部分；
D为STING激动剂药物部分；和
d15为约1-约20范围内的整数。
在一些方面，本公开提供用于与PBRM缀合的支架，其中支架具有以下式(II)或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
A1’-(LC)0或1-D (II)
其中：
PBRM表示基于蛋白的识别分子；
当存在时，LC为接头单元；
A1’为包含能够与PBRM的官能团形成共价键的官能团的一价接头部分；
D为STING激动剂药物部分；和
d15为约1-约20范围内的整数。
在一些方面，本公开提供包含本文所述的缀合物和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
在一些方面，本公开提供激活或增强受试者干扰素基因刺激因子(STING)的活性的方法，包括给予受试者本文所述的缀合物或其药学上可接受的盐。
在一些方面，本公开提供预防或治疗受试者疾病或病症的方法，包括给予受试者治疗有效量的本文所述的缀合物或其药学上可接受的盐。
在一些方面，本公开提供本文所述的缀合物或其药学上可接受的盐，用于激活或增强受试者STING的活性。
在一些方面，本公开提供本文所述的缀合物或其药学上可接受的盐，用于预防或治疗受试者的疾病或病症。
在一些方面，本公开提供本文所述的缀合物或其药学上可接受的盐在制造用于激活或增强受试者STING的活性的药物中的用途。
在一些方面，本公开提供本文所述的缀合物或其药学上可接受的盐在制造用于预防或治疗受试者疾病或病症的药物中的用途。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在说明书中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数。尽管在本公开的实践或测试中可使用与本文描述的方法和材料类似或等效的那些，但以下描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过参考并入。本文引用的参考文献不承认为所要求保护的发明的现有技术。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性的，并且不旨在为限制性的。在本文公开的化学结构与化合物名称之间存在冲突的情况下，以化学结构为准。
本公开的其他特征和优势将从以下具体实施方式和权利要求中显而易见。
附图说明
图1A绘制缀合物8b-1和缀合物8f(每种在100、10和1nM下)及缀合物8c-1和化合物1(每种在100和10nM下)(缀合物浓度基于有效负载)的红色物体融合度随时间变化的图表。
图1B绘制缀合物8l和化合物1(每种在100、10和1nM下)及缀合物8m(100nM)(缀合物浓度基于有效负载)的红色物体融合度随时间变化的图表。
图2显示PBMC、富集的单核细胞和CD16耗尽的单核细胞群中的CD14-/CD3+细胞。
图3A和图3B绘制缀合物8a-3、缀合物8j、缀合物8c-2和化合物1每种在100、25、5和1nM下(缀合物浓度基于有效负载)的红色物体融合度随时间变化的图表并且分别显示PBMC对STING野生型(sgNT-2)和敲除型(sg#3-2)SKBR3 NucRed细胞的杀伤。
图4A绘制在SKBR3癌细胞/PBMC共培养中，红色物体融合度随缀合物8a-3、缀合物8-j、野生型Fc曲妥珠单抗和AAG Fc突变体曲妥珠单抗对STING野生型SKBR3癌细胞杀伤活性的剂量反应变化的图表。
图4B绘制在SKBR3癌细胞/PBMC共培养中，红色物体融合度随缀合物8a-3、缀合物8-j、野生型Fc曲妥珠单抗和AAG Fc突变体曲妥珠单抗对STING敲除型SKBR3癌细胞杀伤活性的剂量反应变化的图表。
图5A绘制缀合物8b-1和化合物1两者在20和4nM下(缀合物浓度基于有效负载浓度)的OVCAR3-NucRed癌细胞的红色物体融合度经PBMC的变化随时间变化的图表。
图5B绘制缀合物8b-1和化合物1两者在20和4nM下(缀合物浓度基于有效负载浓度)的OVCAR3-NucRed癌细胞的红色物体融合度经富集的单核细胞的变化随时间变化的图表。
图5C绘制缀合物8b-1和化合物1两者在20和4nM下(缀合物浓度基于有效负载浓度)的OVCAR3-NucRed癌细胞的红色物体融合度经CD16耗尽的单核细胞的变化随时间变化的图表。
图6为显示曲妥珠单抗(3/0mg/kg)、diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)、缀合物8c-1(1/0.04mg/kg或3/0.12mg/kg)、缀合物8a-1(1/0.03mg/kg或3/0.09mg/kg)(所有剂量由抗体/有效负载给出)在小鼠SKOV3异种移植模型中的抗肿瘤效力的图表。
图7A-7H显示在SKOV3小鼠模型给予diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)、缀合物8c-1(3/0.12mg/kg)或缀合物8a-1(3/0.09mg/kg)(所有剂量写为抗体/有效负载)后随时间变化的鼠CXCL-10(IP-10；图7A)、IL-6(图7B)、TNFα(图7C)、IFNγ(图7D)、CXCL1(KC)(图7E)、MIG(图7F)、MIP-1a(图7G)和RANTES(图7H)的细胞因子水平。每幅图中的插图显示相对于媒介物由缀合物8a-1和缀合物8c-1诱导的细胞因子水平。
图8A-8C显示在给予缀合物8c-1(3/0.12mg/kg)、缀合物8a-1(3/0.09mg/kg)、缀合物8c-1(3/0.12mg/kg)或缀合物8a-1(3/0.09mg/kg)(所有剂量写为抗体/有效负载)后12h和72h小鼠SKOV3异种移植模型中小鼠CXCL10(图8A)、干扰素-β(图8B)和IL-6(图8C)mRNA的水平。
图9为在12和72小时用兔抗CD45单克隆抗体对缀合物8a-1(3/0.09mg/kg)、缀合物8c-1(3/0.12mg/kg)或媒介物进行的CD45免疫组织化学(IHC)染色。
图10为显示给予CB.17 SCID小鼠缀合物8a-1(3/0.1mg/kg)(剂量作为抗体/有效负载给出)后总抗体和缀合药物的循环血浆浓度的图表。
图11显示IFNλ1(IL29)或IFNλ2(IL28A)中和抗体(10、2、0.4、0.08μg/mL)在癌细胞和PBMC共培养中对缀合物8a-3(1nM或0.1nM，基于有效负载)杀伤活性的作用。
图12为显示diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)、缀合物8c-1(3/0.12mg/kg)、缀合物8b-1(3/0.09mg/kg)或缀合物8f(3/0.12mg/kg)(所有剂量通过抗体/有效负载给出)在小鼠OVCAR3异种移植中的抗肿瘤效力的图表。
图13为显示缀合物8d-2(3/0.1mg/kg)或缀合物8e(3/0.1mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)在小鼠OVCAR3异种移植中的抗肿瘤效力的图表。
图14为显示diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)、缀合物8c-1(1/0.04mg/kg)或缀合物8h(1/0.04mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)在小鼠三阴性乳腺癌异种移植中的抗肿瘤效力的图表。
图15A为显示缀合物8d-3(1/0.04mg/kg)或缀合物8g(0.88/0.04mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)在结肠癌同源小鼠模型中的抗肿瘤效力的图表。
图15B显示缀合物8d-3(1/0.04mg/kg)或缀合物8g(0.88/0.04mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)在结肠癌同源小鼠模型中的Kaplan Meier存活曲线。
图16A为显示缀合物8g(0.9/0.04mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)对于结肠癌同源小鼠模型中单个小鼠的抗肿瘤效力的图表。
图16B为显示当用同源鼠结肠癌细胞再激发时，缀合物8g(0.9/0.04mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)的抗肿瘤效力的图表。
图16C为显示当用同源鼠肺癌细胞再激发时，缀合物8g(0.9/0.04mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)的抗肿瘤效力的图表。
图17为显示diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)、缀合物8d-3(5.5/0.18mg/kg)或缀合物8i(3.2/0.18mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)在同源鼠胚胎癌模型中的抗肿瘤效力的图表。
图18为显示缀合物20a(3/0.09mg/kg)、缀合物34a(3/0.11mg/kg)、缀合物34(3/0.11mg/kg)或缀合物20-1(3/0.10mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)在小鼠SKOV3异种移植中的抗肿瘤效力的图表。
图19为显示缀合物28(0.3/0.01mg/kg或1/0.03mg/kg)、缀合物29(0.2/0.01mg/kg或0.8/0.02mg/kg)、缀合物8-2(0.3/0.01mg/kg或1/0.04mg/kg)、缀合物25(0.3/0.01mg/kg或1/0.04mg/kg)或缀合物45(0.3/0.01mg/kg或1/0.04mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)在小鼠SKOV3异种移植中的抗肿瘤效力的图表。
图20为显示diABZI STING激动剂(1.5mg/kg每三天一次x3或0.128mg/kg qdx1)、化合物30(1.5mg/kg每三天一次x3或0.128mg/kg qdx1)、缀合物32b-2(3.42/0.128mg/kgqdx1)、XMT-1519(3.00mg/kg qdx1)、缀合物32-5(0.100/0.004、0.300/0.013、1.00/0.042或3.00/0.128mg/kg qdx1)、缀合物32e(1.00/0.039或3.00/0.117mg/kg qdx1))(所有剂量作为抗体/有效负载给出)在小鼠SKOV3异种移植中的抗肿瘤效力的图表。
图21A为显示缀合物8d-3(1/0.04mg/kg)或缀合物8k(0.9/0.04mg/kg)在同源小鼠模型中的抗肿瘤效力的图表。
图21B显示缀合物8d-3(1/0.04mg/kg)在同源小鼠模型的单个小鼠中的抗肿瘤效力。
图21C显示缀合物8k(0.9/0.04mg/kg)在同源小鼠模型的单个小鼠中的抗肿瘤效力。
图22为显示缀合物8c-2(3.17/0.10mg/kg)、缀合物8a-2(2.7/0.10mg/kg或0.81/0.03mg/kg)、缀合物8j(2.71/0.10mg/kg或0.81/0.03mg/kg)或diABZI IV STING激动剂(0/5mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)在小鼠SKOV3异种移植中的抗肿瘤效力的图表。
图23为显示缀合物32b-1(3.39/0.10mg/kg)、缀合物32a(0.93/0.03或3.12/0.10mg/kg)、缀合物32c(2.12/0.10mg/kg)、缀合物32d(2.20/0.10mg/kg)或diABZI IVSTING激动剂(0/5mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出)在小鼠OVCAR3异种移植中的抗肿瘤效力的图表。
图24为显示利妥昔单抗AF-HPA ADC(0.75/0.023mg/kg)和缀合物8c-2(4.0/0.126mg/kg)的组合、XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)、缀合物8b-2(2.0/0.071或4.0/0.142mg/kg)、XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和缀合物8c-2(4.0/0.126mg/kg)的组合、利妥昔单抗AF-HPA ADC(0.75/0.023mg/kg)和缀合物8b-2(4.0/0.142mg/kg)的组合、利妥昔单抗AF-HPA ADC(0.75/0.023mg/kg)和缀合物8b-2(2.0/0.071mg/kg)的组合、XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和缀合物8b-2(4.0/0.142mg/kg)的组合、XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和缀合物8b-2(2.0/0.071mg/kg)的组合、XMT-1535AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和XMT-1535(4.0/0mg/kg)的组合或XMT-1535(4.75/0mg/kg)在小鼠OVCAR3异种移植中的抗肿瘤效力的图表。
图25为显示缀合物32b(0.85/0.03mg/kg)、缀合物32-2(0.90/0.03mg/kg)、缀合物88(0.87/0.03mg/kg)、缀合物85(2.87/0.10mg/kg)、缀合物92(2.36/0.10mg/kg)、缀合物100(2.23/0.10mg/kg)、缀合物89(0.99/0.030mg/kg)、缀合物85a(2.59/0.10mg/kg)、缀合物93(2.85/0.10mg/kg)或缀合物101(2.70/0.10mg/kg)在小鼠SKOV3异种移植模型中的抗肿瘤效力的图表。
图26为显示媒介物、缀合物28(0.99/0.0325mg/kg)或缀合物62(0.92/0.0325mg/kg)在小鼠SKOV3异种移植模型中的抗肿瘤效力的图表。
图27为显示在给予CB.17 SCID小鼠缀合物28(3.0/0.10mg/kg)或缀合物62(2.84/0.10mg/kg)(剂量作为抗体/有效负载给出)后缀合药物的循环血浆浓度的图表。
具体实施方式
本公开提供新的抗体-药物缀合物、用于制备缀合物或支架的合成方法、含有它们的药物组合物及缀合物的各种用途。
定义
为本文所述的中间体化合物和/或本公开化合物提供的化学名称可指这种化合物的任何一种互变异构表示(在一些情况下，这种替代名称以实验提供)。应当理解，对指定化合物(中间体化合物或本公开化合物)或结构描绘的化合物(中间体化合物或本公开化合物)的任何指涉旨在涵盖所有互变异构形式，包括这种化合物的两性离子形式及其任何混合物。
应当理解，术语“在一些实施方案中”、“在本公开的一些实施方案中”和“在本公开化合物的一些实施方案中”可在适当时互换使用。
当连同数值一起使用时，术语“约”、“大约”或“近似”意指包括值的集合或范围。在一些实施方案中，“约X”包括X的±25％、±20％、±15％、±10％、±5％、±2％、±1％、±0.5％、±0.2％或±0.1％的值范围，其中X为数值。在一些实施方案中，术语“约”是指比指定值多或少5％的值范围。在一些实施方案中，术语“约”是指比指定值多或少2％的值范围。在一些实施方案中，术语“约”是指比指定值多或少1％的值范围。
除非本文另外指明，否则值范围的列举仅旨在用作单独指涉落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值并入说明书中如同其在本文中单独列举一样。除非另外指定，否则本文使用的范围包括范围的两个极限。在一些实施方案中，表达“x为1-6之间的整数”和“x为1-6的整数”两者均意指“x为1、2、3、4、5或6”，即术语“在X和Y之间”和“在X到Y的范围内”包括X和Y以及之间的整数。
如本文使用的术语“抗体”在最广泛意义上使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。抗体氨基酸的编号按照Kabat EU Index(参见Kabat,E.A.等人,Sequences of Protein of immunological interest,Fifth Edition,US Department ofHealth and Human Services,US Government Printing Office(1991))。
术语“抗体片段”是指除完整抗体以外的包含完整抗体的一部分并结合完整抗体结合的抗原的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文使用的术语“与相同表位结合的抗体”作为参考抗体，是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原结合达50％或更多的抗体，并且相反地，参考抗体在竞争测定中阻断抗体与其抗原结合达50％或更多。本文提供一种示例性竞争测定。
抗体的术语“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。抗体有5种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可进一步分成子类(同种型)，例如IgGi、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质性抗体群体中得到的抗体，即包含该群体的单个抗体为相同的和/或结合相同表位，除可能的变体抗体之外，例如含有自然发生的突变或在单克隆抗体制剂产生期间出现的，这种变体通常以少量存在。与一般地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体均针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特性为从基本上均质性抗体群体中得到，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这种方法和其他用于制备本文描述的单克隆抗体的示例性方法。
术语“表位”是指抗原分子上抗体结合的特定位点。
术语“基于蛋白的识别分子”或“PBRM”是指识别并与细胞表面标志物或受体比如跨膜蛋白、表面固定蛋白或蛋白聚糖结合的分子。在一些实施方案中，PBRM包含工程化半胱氨酸。PBRM的实例包括但不限于抗体、肽、脂质运载蛋白、蛋白、肽或肽模拟物等。基于蛋白的识别分子，除靶向与特定细胞、组织或位置的缀合之外，还可对靶细胞或通路具有一定治疗效果，比如抗增殖(细胞抑制和/或细胞毒性)活性。基于蛋白的识别分子包含或可工程化为包含至少一个化学反应性基团，比如-COOH、伯胺、仲胺-NHR、-SH，或者化学反应性氨基酸部分或侧链，比如酪氨酸、组氨酸、半胱氨酸或赖氨酸。在一些实施方案中，PBRM可为针对给定靶细胞群与细胞表面分子(比如细胞表面受体或抗原)特异性地结合或复合的配体(LG)或靶向部分。在配体与其受体特异性结合或复合后，细胞允许摄取配体或配体-药物缀合物，然后将其内化到细胞中。如本文使用的“特异性结合或复合”或“靶向”细胞表面分子的配体经分子间力优选与细胞表面分子缔合。在一些实施方案中，配体可以小于约50nM、小于约5nM或小于500pM的Kd优选与细胞表面分子缔合。用于测量配体与细胞表面分子的结合亲和性的技术为众所周知的；例如一种合适的技术称为表面等离子体共振(SPR)。在一些实施方案中，配体用于靶向，并且当与其递送的药物分离时没有可检测的治疗效果。在一些实施方案中，配体起靶向部分和治疗或免疫调节剂(例如增强活性药物或前药的活性)两者作用。如本文使用的术语“PEG单元”是指具有式
Figure BDA0003975405560000111
的聚乙二醇亚单元。在一些实施方案中，PEG单元包含多个PEG亚单元。
如本文使用的术语“烷基”表示具有指定数量碳原子的饱和、直形或分支烃基。术语“C1-C6烷基”或“C1-6烷基”是指甲基部分或包含2-6个碳原子的直形或分支烷基部分。示例性的烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。
如本文使用的术语“卤代(烷基)”表示具有指定数量(n)的碳原子和一个或多个(最多2n+1个)卤素原子的饱和、直形或分支烃基。“卤代(C1-4烷基)”基团的实例包括但不限于-CF3(三氟甲基)、-CCl3(三氯甲基)、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基和六氟异丙基。
如本文使用的术语“烯基”是指具有指定数量的碳原子及至少1个和最多3个碳-碳双键的直形或分支烃基。实例包括乙烯基和丙烯基。
如本文使用的术语“炔基”是指具有指定数量的碳原子及至少1个和最多3个碳-碳三键的直形或分支烃基。实例包括乙炔基和丙炔基。
如本文使用的术语“烷氧基-”或“(烷基)氧基-”是指包含通过氧连接原子附着的具有指定数量碳原子的烷基部分的“烷基-氧基-”基团。示例性的“C1-4烷氧基-”或“(C1-4烷基)氧基-”基团包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。
如本文使用的术语“卤代(烷氧基)-”表示通过氧连接原子附着的具有指定数量(n)的碳原子和一个或多个(最多2n+1个)卤素原子的饱和、直形或分支烃基。示例性的“卤代(C1-4烷氧基)-”基团包括但不限于-OCHF2(二氟甲氧基)、-OCF3(三氟甲氧基)、-OCH2CF3(三氟乙氧基)和-OCH(CF3)2(六氟异丙氧基)。
如本文使用的术语“氨基”是指包含至少一个氮原子的取代基。具体地讲，-NH2、-NH(C1-4烷基)、烷基氨基或(C1-4烷基)氨基-或(C1-4烷基)(C1-4烷基)氨基-或二烷基氨基、酰胺-、碳酰胺-、脲和磺酰胺取代基包括在术语“氨基”中。
如本文使用的术语“碳环基团或部分”是指其中环成员为碳原子的环状基团或部分，其可为饱和的、部分不饱和的(非芳族的)或完全不饱和的(芳族的)。
如本文使用的术语“环烷基”是指环中包含指定数量碳原子的非芳族、饱和烃环基团。例如，术语“C3-6环烷基”是指具有3-6个环碳原子的环状基团。示例性的“C3-6环烷基”基团包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文使用的术语“芳基”是指包括具有一个或多个芳族环的“缀合”或多环体系，环结构中不含任何杂原子的具有芳香性的基团。术语芳基包括一价种类和二价种类两者。芳基的实例包括但不限于苯基、联苯基、萘基等。在一些实施方案中，芳基为苯基。
如本文使用的术语“杂环基团或部分”是指具有至少两种不同元素的原子作为环成员的环状基团或部分，其中环状基团或部分可为饱和的、部分不饱和的(非芳族的)或完全不饱和的(芳族的)。
如本文使用的术语“杂原子”是指氮、硫或氧原子，例如氮原子或氧原子。
如本文使用的术语“杂环烷基”是指包含3-10个环原子并包含一个或多个(通常为一个或两个)独立地选自氧、硫和氮的杂原子环成员的非芳族单环或双环基团。杂环烷基的附着点可为通过任何合适的碳或氮原子。
如本文使用的术语“杂芳基”是指包含包括1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5-10个环原子的芳族单环或双环基团，其中基团的至少一部分为芳族的。例如，该术语包括涵盖稠合于杂环部分的苯环或稠合于碳环部分的杂芳基环部分的双环杂环-芳基。杂芳基的附着点可为任何合适的碳或氮原子。
如本文使用的术语“卤素”和“卤代”是指卤素基团，例如氟、氯、溴或碘取代基。
如本文使用的术语“氧代”是指双键键合的氧部分；例如，如果直接附着于碳原子则形成羰基部分(C＝O)。
如本文使用的术语“羟基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”旨在意指基团-OH。
如本文使用的术语“氰基”是指腈基-C≡N。
如本文使用的术语“任选取代的”表示基团(比如烷基、环烷基、烷氧基、杂环烷基、芳基或杂芳基)或环或部分可为未取代的，或者基团、环或部分可由一个或多个取代基取代。在其中基团可选自许多备选基团的情况下，选择的基团可为相同或不同的。合适的取代基可包括例如烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸基(phosphonato)、次膦酸基(phosphinato)、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚硫酰基、磺酸基、氨基磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或者芳族或杂芳族部分。
如本文使用的术语“独立地”意指当多于一个取代基选自许多可能的取代基时，那些取代基可为相同或不同的。
如本文使用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、缀合物、材料、组合物和剂型。
如本文使用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treat)”描述出于对抗疾病、病况或病症的目的而对患者的管理和护理，并且包括给予本公开的化合物或其药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物，以减轻疾病、病况或病症的症状或并发症，或者消除疾病、病况或病症。术语“治疗”也可包括体外细胞或动物模型的治疗。
如本文使用的术语“预防(preventing)”、“预防(prevent)”或“防止”描述减少或消除这种疾病、病况或病症的症状或并发症的发作。
术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物，优选地为哺乳动物，最优选地为人类。
术语“治疗有效量”是指在研究人员、兽医、医生或其他临床医师探寻的组织系统、动物或人类中引发生物或医学反应的活性化合物或药剂的量，包括本公开的缀合物，其包括减轻或部分减轻所治疗疾病、综合征、病况或病症的症状。
治疗“有效量”旨在意指当给予需要这种治疗的患者时，足以有效治疗或预防的如本文定义的缀合物的量。对应于这种量的给定缀合物的量将取决于因素比如特定缀合物(例如特定缀合物的效力(pIC50)、功效(EC50)和生物半衰期)、疾病状况及其严重性、需要治疗的患者身份(例如年龄、尺寸和体重)，但是仍然可由本领域技术人员常规确定。同样，缀合物的治疗持续时间和给予时间段(剂量之间的时间段和剂量的时间，例如餐前/中/餐后)应根据需要治疗的哺乳动物身份(例如体重)、特定缀合物及其特性(例如药代动力学特性)、疾病或病症及其严重性和所使用的具体组合物和方法而变化，但是仍然可由本领域技术人员确定。
术语“组合物”是指含有治疗有效量的指定成分的产物以及直接或间接地由指定量的指定成分的组合产生的任何产物。
如本文使用的术语“药学上可接受的赋形剂”意指用于制备药物组合物的通常为安全无毒的并且在生物学或其他方面均不是不合期望的赋形剂，并且包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。如说明书和权利要求中使用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种和多于一种这种赋形剂两者。
如本文使用的术语“STING激动剂”是指能够与STING相互作用的化合物或部分，例如通过与STING结合和/或诱导下调信号转导(例如其特征为激活与STING功能相关的分子)。这包括STING、IRF3和/或NF-kB的直接磷酸化，并且还可包括STAT6。在一些实施方案中，STING通路激活导致1型干扰素(主要为IFN-α和IFN-β)的产生和/或干扰素刺激基因的表达增加。
如本文使用的术语“STING激动剂药物部分”是指衍生于STING激动剂并且能够与STING相互作用的部分。在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为衍生于STING激动剂以使得该部分连接于本公开缀合物的其余部分的部分。
本公开的缀合物在用于治疗或改善通过STING的激动影响的病毒感染、疾病、综合征、病况或病症的方法中为有用的。这种方法包括以下、由以下组成和/或基本上由以下组成：给予需要这种治疗、改善和/或预防的受试者(包括动物、哺乳动物和人类)治疗有效量的本公开缀合物，或其对映体、非对映体、溶剂合物或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本公开的缀合物或其对映体、非对映体、溶剂合物或药学上可接受的盐形式对于治疗或改善疾病、综合征、病况或病症比如黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎为有用的。
如本文使用的术语“一种或多种公开的缀合物”或“一种或多种本公开的缀合物”意指呈任何形式的如本文定义的缀合物，即其任何互变异构形式、任何异构体形式、任何盐或非盐形式(例如作为游离酸或碱形式，或作为盐，特别是其药学上可接受的盐)和任何物理形式(例如包括非固体形式(例如液体或半固体形式)和固体形式(例如无定形或结晶形式、特定多晶形、溶剂合物形式，包括水合物形式(例如一水合物、二水合物和半水合物))以及各种形式的混合物。
因此，在本公开中包括如本文公开的呈任何盐或非盐形式及其任何物理形式的缀合物以及各种形式的混合物。尽管这种均包括在本公开内，但应当理解，本公开呈任何盐或非盐形式及其任何物理形式的缀合物可具有用于配制目的的不同水平的活性、不同生物利用度和不同治疗特性。
除非另外指明，否则如本文使用的表达“A、B或C中的一个或多个”、“一个或多个A、B或C”、“A、B和C中的一个或多个”、“一个或多个A、B和C”、“选自A、B和C”、“选自A、B和C”等可互换使用，并且均指选自A、B和/或C，即一个或多个A、一个或多个B、一个或多个C或其任何组合。
应当理解，在整个描述中，当组合物描述为具有、包括或包含特定组分时，考虑组合物还基本上由所列举的组分组成或由其组成。类似地，当方法或程序描述为具有、包括或包含特定程序步骤时，程序还基本上由所列举的程序步骤组成或由其组成。进一步地，应当理解，只要本发明仍然为可操作的，步骤的顺序或进行某些动作的顺序是无关紧要的。此外，可同时执行两个或更多个步骤或动作。
除非另外指明，否则本文使用的所有百分比和比率为按重量计。本公开的其他特征和优势从不同实例中为显而易见的。提供的实例说明用于实践本公开的不同组分和方法。实例并不限制所要求保护的公开。基于本公开，技术人员可鉴别并采用可用于实践本公开的其他组分和方法。
本文引用的所有出版物和专利文件均通过参考并入，如同每个这种出版物或文件被具体地和单独地指出通过参考并入本文。出版物和专利文件的引用并不旨在承认任何一个为相关的现有技术，也不构成对其内容或日期的承认。本发明现已通过书面描述进行描述，本领域的技术人员将认识到，本发明可在多种实施方案中实践，并且上述描述和以下实例仅出于说明的目的而不是对所附权利要求的限制。
本公开的缀合物和支架
在一些方面，本公开提供以下式(I)的缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
PBRM-[A1-(LC)0或1-D]d15 (I)
其中：
PBRM表示基于蛋白的识别分子；
当存在时，LC为接头单元；
当LC存在时，A1为使PBRM与LC连接的二价接头部分，或当LC不存在时，A1为使PBRM与D连接的二价接头部分；
D为STING激动剂药物部分；和
d15为约1-约20范围内的整数。
在一些实施方案中，缀合物具有以下式(I-A)或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
PBRM-[A1-D]d15 (I-A)
在一些实施方案中，缀合物具有以下式(I-B)或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
PBRM-[A1-LC-D]d15 (I-B)
在一些实施方案中，缀合物具有式(I-B’)或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure BDA0003975405560000181
在一些方面，本公开提供可用于与PBRM缀合的支架，其中支架具有以下式(II)或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
A1’-(LC)0或1-D (II)
其中：
PBRM表示基于蛋白的识别分子；
当存在时，LC为接头单元；
A1’为包含能够与PBRM的官能团形成共价键的官能团的一价接头部分；和
D为STING激动剂药物部分。
在一些实施方案中，支架具有以下式(II-A)或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
A1’-D(II-A)
在一些实施方案中，支架具有以下式(II-B)或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
A1’-LC-D(II-B)
在一些实施方案中，支架具有以下式(II-B’)或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure BDA0003975405560000182
应当理解，对于式(I)、(I-A)、(I-B)、(I-B’)、(II)、(II-A)、(II-B)或(II-B’)中任何一个的缀合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，变量PBRM、LC、A1、T1、MA、LD、D和d15在适用的情况下可各自选自本文描述的组，并且本文对变量PBRM、LC、A1、T1、MA、LD、D和d15中的任何一个描述的任何组在适用的情况下可与本文对变量PBRM、LC、A1、T1、MA、LD、D和d15的剩余部分中的一个或多个描述的任何组组合。
变量d15
在一些实施方案中，d15为约2-约14、约2-约12、约2-约10、约2-约8、约2-约6、约2-约4、约4-约10、约4-约8、约4-约6、约6-约14、约6-约12、约6-约10、约6-约8、约8-约14、约8-约12或约8-约10范围内的整数。
在一些实施方案中，d15为约2-约8范围内的整数。
在一些实施方案中，d15为2、4、6或8。在一些实施方案中，d15为6或8。
在一些实施方案中，d15为8。在一些实施方案中，d15为6。
变量A1和A1’
在一些实施方案中，每个A1独立地为使PBRM与LC(当LC存在时)或D(当LC不存在时)连接的二价接头部分。
在一些实施方案中，每个A1独立地为
Figure BDA0003975405560000191
Figure BDA0003975405560000192
其中：
R7为-O-、-NR8、-(C1-C10烷基)-、-(C1-C10烯基)-、-(C1-C10炔基)-、-(C3-C8环烷基)-、-芳基-、-O-(C1-C8烷基)-、-O-(C1-C10烯基)-、-O-(C1-C10炔基)-、-(C1-C10烷基)-(C3-C8环烷基)-、-(C1-C10烷基)-芳基-、-(C2-C10烯基)-(C3-C8环烷基)-、-(C2-C10烯基)-芳基-、-(C2-C10炔基)-(C3-C8环烷基)-、-(C2-C10炔基)-芳基-、-(C3-C8环烷基)-(C1-C10烷基)-、-芳基-(C1-C10烷基)-、-(C3-C8环烷基)-(C2-C10链稀基)-、-芳基-(C2-C10烯基)-、-(C3-C8环烷基)-(C2-C10炔基)-、-芳基-(C2-C10炔基)-、-(3至8元杂环烷基)-、-(5至8元杂芳基)-、-(C1-C10烷基)-(3至8元杂环烷基)-、-(C1-C10烷基)-(5至8元杂芳基)-、-(C2-C10烯基)-(3至8元杂环烷基)-、-(C2-C10烯基)-(5至8元杂芳基)-、-(C2-C10炔基)-(3至8元杂环烷基)-、-(C2-C10炔基)-(5至8元杂芳基)-、-(3至8元杂环烷基)-(C1-C10烷基)-、-(5至8元杂芳基)-(C1-C10烷基)-、-(3至8元杂环烷基)-(C2-C10烯基)-、-(5至8元杂芳基)-(C2-C10烯基)-、-(5至8元杂芳基)-(C2-C10炔基)-、-(5至8元杂芳基)-(C2-C10炔基)-、-O-C(O)-(CH2CH2O)r-(CH2)2-、-(CH2CH2O)r-或-(CH2CH2O)r-(CH2)2-，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基被任选取代；
R8为H、羟基或C1-4烷基；
r为约1-约12范围内的整数；和
*表示附着于PBRM，而当LC存在时**表示附着于LC，或当LC不存在时**表示附着于D。
在一些实施方案中，R7为-O-、-NR8、-(C1-C10烷基)-、-(C3-C8环烷基)-、-芳基-、-O-(C1-C8烷基)-、-(C1-C10烷基)-芳基-、-芳基-(C1-C10烷基)-、-(C1-C10烷基)-(C3-C8环烷基)-、-(C3-C8环烷基)-(C1-C10烷基)-、-(3至8元杂环烷基)-、-(5至8元杂芳基)-、-(C1-C10烷基)-(3至8元杂环烷基)-、-(C1-C10烷基)-(5至8元杂芳基)-、-(3至8元杂环烷基)-(C1-C10烷基)-、-(5至8元杂芳基)-(C1-C10烷基)-、-O-C(O)-(CH2CH2O)r-(CH2)2-、-(CH2CH2O)r-或-(CH2CH2O)r-(CH2)2-。
在一些实施方案中，R7为-(C1-C10烷基)-、-O-(C1-C8烷基)-、-(CH2CH2O)r-、-O-C(O)-(CH2CH2O)r-(CH2)2-或-(CH2CH2O)r-(CH2)2-。
在一些实施方案中，R7为-O-、-NH、-N(CH3)、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)5-、-O-C(O)-(CH2CH2O)6-(CH2)2-、-(CH2CH2O)-(CH2)2-、-(CH2CH2O)2-(CH2)2-、-(CH2CH2O)4-(CH2)2-或-(CH2CH2O)6-(CH2)2-。
在一些实施方案中，每个A1独立地为：
Figure BDA0003975405560000211
Figure BDA0003975405560000212
其中R8为H、羟基或C1-4烷基；r为约4-约6范围内的整数；和*表示附着于PBRM，而当LC存在时**表示附着于LC，或当LC不存在时**表示附着于D。
应当理解，每个A1在与PBRM连接之前独立地对应于一价部分A1’。
在一些实施方案中，每个A1’独立地为：
Figure BDA0003975405560000213
Figure BDA0003975405560000214
其中R7、R8和r如本文所述；而当LC存在时，**表示附着于LC，或当LC不存在时，**表示附着于D。
在一些实施方案中，每个A1’独立地为：
Figure BDA0003975405560000215
Figure BDA0003975405560000216
其中：
r为约4-约6范围内的整数；和
当LC存在时，**表示附着于LC，或当LC不存在时，**表示附着于D。
变量LC
在一些实施方案中，当存在时，每个LC独立地为：
Figure BDA0003975405560000221
其中：
#表示附着于A1而##表示附着于D；
当存在时，MA为包含至少两个氨基酸的肽部分；
当存在时，T1为亲水基团；和
当MA存在时，LD为使D与MA连接的二价接头部分，或当MA不存在时，LD为使D与A1连接的二价接头部分。
在一些实施方案中，每个LD包含至少一个可裂解键，使得当键断裂时，D以用于其预期治疗作用的活性形式释放。
在一些实施方案中，当存在时，每个LC独立地为
Figure BDA0003975405560000222
在一些实施方案中，当存在时，每个LC独立地为
Figure BDA0003975405560000223
变量LD
在一些实施方案中，每个LD独立地为使D与MA(当MA存在时)或A1(当MA不存在时)连接的二价接头部分。
在一些实施方案中，每个LD包含至少一个可裂解键，使得当键裂解时，D以用于其预期治疗作用的活性形式释放。
在一些实施方案中，LD包含一个可裂解键。在一些实施方案中，LD包含多个裂解位点或键。
应当理解，每个LD在与D连接之前独立地对应于一价部分LD’。
在一些实施方案中，LD’包含能够形成可裂解键的官能团。能够形成可裂解键的官能团可包括例如形成二硫键的巯基、形成腙键的醛、酮或肼基、形成肟键的羟胺基、形成肽键的羧基或氨基、形成酯键的羧酸或羟基以及形成糖苷键的糖。
在一些实施方案中，每个LD包含一个可通过二硫键交换裂解的二硫键、一个可在酸性pH下裂解的酸不稳定键和/或可通过水解酶裂解的键。在一些实施方案中，LD包含氨基甲酸酯键(即-O-C(O)-NR-，其中R为氢或烷基等)。
在一些实施方案中，LD中可裂解键的结构和序列可使得该键通过靶位点处存在的酶的作用而裂解。在一些实施方案中，可裂解键可通过其他机制裂解。
在一些实施方案中，LD中可裂解键的结构和序列可使得这些键通过靶位点处存在的酶的作用而裂解。在一些实施方案中，可裂解键可通过其他机制裂解。
在一些实施方案中，(多个)可裂解键可由一种或多种酶(包括肿瘤相关蛋白酶)酶促裂解以释放药物单元或D，其中本公开的缀合物或中间体或其支架在释放后在体内质子化以提供药物单元或D。
在一些实施方案中，每个LD独立地为
Figure BDA0003975405560000231
其中：
当存在时，LE为-NH-[(CH2CH2O)p-(CH2)0-2]q-C(O)-、-NH-(C1-C6烷基)-O-C(O)-或-NH-[(CH2CH2O)p-(CH2)0-2]q-C(O)-NH-(C1-C6烷基)-O-C(O)-，其中p为约1-约20范围内的整数，和q为约1-约10范围内的整数；
每个W独立地为天然或非天然氨基酸单元；
w为约0-约12范围内的整数；
当MA存在时，***表示附着于MA，或当MA不存在时，**表示附着于A1；和
****表示附着于D。
在一些实施方案中，每个LD独立地为
Figure BDA0003975405560000232
在一些实施方案中，每个LD独立地为
Figure BDA0003975405560000241
在一些实施方案中，每个LD独立地为
Figure BDA0003975405560000242
在一些实施方案中，LE包含至少一个PEG单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少1个亚单元、至少2个亚单元、至少3个亚单元、至少4个亚单元、至少5个亚单元或至少6个亚单元。在一些实施方案中，PEG单元包含至少4个亚单元、至少3个亚单元、至少2个亚单元或至少1个亚单元。在一些实施方案中，PEG单元包含至少1个亚单元。在一些实施方案中，PEG单元包含至少2个亚单元。
在一些实施方案中，p为约1-约15、约1-约10、约1-约9、约1-约8、约1-约7、约1-约6或约1-约5范围内的整数。
在一些实施方案中，p为约1-约6范围内的整数。在一些实施方案中，p为约1-约4范围内的整数。在一些实施方案中，p为约1-约2范围内的整数。
在一些实施方案中，p为2。
在一些实施方案中，q为约1-约15、约1-约10、约1-约9、约1-约8、约1-约7、约1-约6或约1-约5范围内的整数。
在一些实施方案中，q为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，q为2。
在一些实施方案中，当存在时，LE为-NH-(CH2CH2O)1-4-(CH2)2-C(O)-。在一些实施方案中，当存在时，LE为-NH-(CH2CH2O)2-(CH2)2-C(O)-。在一些实施方案中，当存在时，LE为-NH-(CH2CH2O)3-(CH2)0-2-C(O)-。在一些实施方案中，当存在时，LE为-NH-(CH2CH2O)3-(CH2)1-C(O)-。在一些实施方案中，当存在时，LE为-NH-(CH2CH2O)3-(CH2)2-C(O)-。在一些实施方案中，当存在时，LE为-NH-CH2CH2O-(CH2)0-2-C(O)-。在一些实施方案中，当存在时，LE为-NH-CH2CH2O-C(O)-。在一些实施方案中，当存在时，LE为-NH-(C1-C6烷基)-O-C(O)-。在一些实施方案中，当存在时，LE为-NH-CH2-CH(CH3)-O-C(O)-。在一些实施方案中，当存在时，LE为-NH-[(CH2CH2O)1-4-(CH2)2-C(O)-NH-(C1-C6烷基)-O-C(O)-。在一些实施方案中，当存在时，LE为-NH-CH2CH2O-(CH2)2-C(O)-NH-(CH2)2-O-C(O)-。
在一些实施方案中，w为约1-约12范围内的整数(例如1-6、或1-4、或1-3、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。
在一些实施方案中，w为0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，w为1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，w为1。在一些实施方案中，w为2。在一些实施方案中，w为3。
在一些实施方案中，每个W独立地为天然或非天然氨基酸和/或D或L为异构体。
在一些实施方案中，每个W独立地为天然或非天然的α、β或γ氨基酸。
在一些实施方案中，至少一个W为天然氨基酸。在一些实施方案中，至少一个W为非天然氨基酸。
在一些实施方案中，Ww不包含天然氨基酸。在一些实施方案中，Ww不包含非天然氨基酸。
在一些实施方案中，Ww包含连接于非天然氨基酸的天然氨基酸。在一些实施方案中，Ww包含连接于天然氨基酸的D-异构体的天然氨基酸。
在一些实施方案中，Ww为二肽，例如-Val-Cit-、-Phe-Lys-、-Val-Ala-或Glu-Ala。
在一些实施方案中，Ww为单肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。
在一些实施方案中，Ww为肽(例如1-12个氨基酸的肽)，其与D直接缀合。在一些实施方案中，肽为单个氨基酸。在一些实施方案中，肽为二肽。在一些实施方案中，肽为三肽。
在一些实施方案中，Ww中的每个氨基酸独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、鸟氨酸、青霉胺、氨基烷酸、氨基炔酸、氨基烷二酸、氨基苯甲酸、氨基-杂环-烷酸，杂环羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基烷酸及其衍生物。
在一些实施方案中，Ww中的每个氨基酸独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、瓜氨酸及其衍生物。
在一些实施方案中，Ww中的每个氨基酸独立地选自蛋白和非蛋白氨基酸。
在一些实施方案中，Ww中的每个氨基酸独立地选自以下氨基酸的L或D异构体：丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、青霉胺、氨基炔酸、氨基烷二酸、杂环羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基烷酸、缬氨酸、瓜氨酸及其衍生物。
在一些实施方案中，Ww中的每个氨基酸独立地为半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、硒代半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、瓜氨酸或丙氨酸。
在一些实施方案中，Ww中的每个氨基酸独立地选自以下氨基酸的L-异构体：丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。
在一些实施方案中，Ww中的每个氨基酸独立地选自以下氨基酸的D-异构体：丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。
在一些实施方案中，Ww中的每个氨基酸为丙氨酸、β-丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、异谷氨酸、异天冬氨酸、缬氨酸、瓜氨酸或天冬氨酸。
在一些实施方案中，Ww包含β-丙氨酸。在一些实施方案中，W包含(β-丙氨酸)-(丙氨酸)。在一些实施方案中，Ww包含(β-丙氨酸)和任选地谷氨酸、异谷氨酸、天冬氨酸、异天冬氨酸、缬氨酸、(缬氨酸)-(丙氨酸)、(丙氨酸)-(丙氨酸)或(缬氨酸)-(瓜氨酸)。
在一些实施方案中，Ww包含(谷氨酸)-(丙氨酸)。
在一些实施方案中，Ww包含谷氨酸和任选地丙氨酸、甘氨酸、异谷氨酸、天冬氨酸、异天冬氨酸、缬氨酸、(缬氨酸)-(丙氨酸)、(丙氨酸)-(丙氨酸)或(缬氨酸)-(瓜氨酸)。
在一些实施方案中，Ww包含2,3-二氨基丙酸。在一些实施方案中，Ww包含(R)-2,3-二氨基丙酸。在一些实施方案中，Ww包含谷氨酸。在一些实施方案中，Ww包含(谷氨酸)-(丙氨酸)。在一些实施方案中，Ww包含(谷氨酸)-(甘氨酸)-(丙氨酸)。
在一些实施方案中，Ww包含L-谷氨酸、D-谷氨酸、(L-谷氨酸)-(L-丙氨酸)、(L-谷氨酸)-(D-丙氨酸)、(D-谷氨酸)-(L-丙氨酸)、(D-谷氨酸)-(D-丙氨酸)、(L-谷氨酸)-(甘氨酸)-(L-丙氨酸)、(D-谷氨酸)-(甘氨酸)-(D-丙氨酸)、(L-谷氨酸)-(甘氨酸)-(D-丙氨酸)或(D-谷氨酸)-(甘氨酸)-(L-丙氨酸)。
在一些实施方案中，除一个或多个氨基酸之外，Ww还包含氨基甲酸酯键。
在一些实施方案中，LD(例如Ww)对于酶促裂解具有选择性(例如通过特定的酶)。在一些实施方案中，特定的酶为肿瘤相关蛋白酶。
在一些实施方案中，LD(例如Ww)包含一个其裂解通过组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D或纤溶酶蛋白酶催化的键。
在一些实施方案中，LD包含糖裂解位点。
在一些实施方案中，LD包含经氧糖苷键连接于自降解基团的糖部分(Su)。
在一些实施方案中，“自降解基团”可为三官能化学部分，其能够将3个间隔的化学部分(即糖部分(经糖苷键)、药物单元(直接或间接地)和MA(当MA存在时)(直接或间接地)或A1(当MA不存在时)共价连接在一起。
在一些实施方案中，糖苷键可在靶位点处裂解以启动自降解反应序列，从而导致药物释放。
在一些实施方案中，当存在时，每个LD独立地为：
Figure BDA0003975405560000281
Figure BDA0003975405560000291
Figure BDA0003975405560000301
其中：当MA存在时，***表示附着于MA，或当MA不存在时，***表示附着于A1；和****表示附着于D。
在一些实施方案中，当存在时，每个LD独立地为：
Figure BDA0003975405560000302
Figure BDA0003975405560000311
其中：当MA存在时，***表示附着于MA，或当MA不存在时，***表示附着于A1；和****表示附着于D。
在一些实施方案中，当存在时，每个LD独立地为：
Figure BDA0003975405560000312
其中：***表示附着于MA和****表示附着于D。
变量MA
在一些实施方案中，MA包含至少两个氨基酸的肽部分。
在一些实施方案中，氨基酸在本文中称为“AA”而氨基酸类称为“AA’s”。
在一些实施方案中，MA为能够与-LD-D单元形成共价键并使得附着多种药物的部分。
在一些实施方案中，MA包含单个AA单元或者具有两个或更多个AA单元(例如2-10个、2-6个或者2、3、4、5或6个)，其中AA单元各自独立地为天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛、二胺、多胺或其组合。
在一些实施方案中，为具有必需数量的附着，至少一个AA单元将具有官能化侧链，以提供-LD-D单元的附着。在一些实施方案中，示例性的官能化AA单元(例如氨基酸、氨基醇或氨基醛)包括例如叠氮基或炔烃官能化AA单元(例如氨基酸、氨基醇或氨基醛修饰以具有叠氮基或炔烃基)。
在一些实施方案中，MA包含2-12个AA单元。在一些实施方案中，MA包含2-10个AA单元。在一些实施方案中，MA包含2-6个AA单元。在一些实施方案中，MA包含2、3、4、5或6个AA单元。
在一些实施方案中，MA具有2个AA单元。在一些实施方案中，肽部分具有3个AA单元。在一些实施方案中，肽部分具有4个AA单元。在一些实施方案中，肽部分具有5个AA单元。在一些实施方案中，肽部分具有6个AA单元。
在一些实施方案中，MA内或与缀合物、其中间体或支架的其他组分的附着可例如经氨基、羧基或其他官能团。
在一些实施方案中，MA中的每个氨基酸可独立地为含有硫醇的氨基酸的D或L异构体。在一些实施方案中，MA中的每个氨基酸可独立地为含有硫醇的氨基酸的D异构体。在一些实施方案中，MA中的每个氨基酸可独立地为含有硫醇的氨基酸的L异构体。在一些实施方案中，含有硫醇的氨基酸可为例如半胱氨酸、高半胱氨酸或青霉胺。
在一些实施方案中，MA中的每个氨基酸可独立地为以下氨基酸的L或D异构体：丙氨酸(包括β-丙氨酸)、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、青霉胺、氨基炔酸、氨基烷二酸、杂环羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基烷酸、其立体异构体或其衍生物。
在一些实施方案中，MA中的每个氨基酸独立地为半胱氨酸、高胱氨酸、青霉胺、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、硒代半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸或其立体异构体。
在一些实施方案中，MA包含单肽、二肽、三肽、四肽或五肽。在一些实施方案中，MA包含五肽。
在一些实施方案中，MA包含单肽、二肽、三肽、四肽或五肽。在一些实施方案中，MA包含五肽。
在一些实施方案中，MA包含至少约5个氨基酸(例如5、6、7、8、9或10个氨基酸)。在一些实施方案中，MA包含至多约10个氨基酸。
在一些实施方案中，MA中的每个氨基酸独立地为甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸。
在一些实施方案中，MA包含至少4个甘氨酸和至少1个谷氨酸，例如(甘氨酸)4和谷氨酸，其中谷氨酸位于沿肽链的任何位置处，比如(谷氨酸)-(甘氨酸)4、(甘氨酸)-(谷氨酸)-(甘氨酸)3、(甘氨酸)2-(谷氨酸)-(甘氨酸)2、(甘氨酸)3-(谷氨酸)-(甘氨酸)或(甘氨酸)4-(谷氨酸)。
在一些实施方案中，MA包含(甘氨酸)4-(谷氨酸)。在一些实施方案中，肽部分包含(谷氨酸)-(甘氨酸)4。
在一些实施方案中，MA包含至少4个甘氨酸和至少1个丝氨酸，例如(甘氨酸)4和丝氨酸，其中丝氨酸位于沿肽链的任何位置处，比如(丝氨酸)-(甘氨酸)4、(甘氨酸)-(丝氨酸)-(甘氨酸)3、(甘氨酸)2-(丝氨酸)-(甘氨酸)2、(甘氨酸)3-(丝氨酸)-(甘氨酸)或(甘氨酸)4-(丝氨酸)。
在一些实施方案中，MA包含(甘氨酸)4-(丝氨酸)。在一些实施方案中，肽部分包含(丝氨酸)-(甘氨酸)4。
在一些实施方案中，MA包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)4-(丝氨酸)，其中丝氨酸位于沿肽链的任何位置处，比如(β-丙氨酸)-(丝氨酸)-(甘氨酸)4、(β-丙氨酸)-(甘氨酸)-(丝氨酸)-(甘氨酸)3、(β-丙氨酸)-(甘氨酸)2-(丝氨酸)-(甘氨酸)2、(β-丙氨酸)-(甘氨酸)3-(丝氨酸)-(甘氨酸)或(β-丙氨酸)-(甘氨酸)4-(丝氨酸)。
在一些实施方案中，MA包含(甘氨酸)4-(丝氨酸)-(谷氨酸)，其中丝氨酸位于沿肽链的任何位置处，比如(丝氨酸)-(甘氨酸)4-(谷氨酸)、(甘氨酸)-(丝氨酸)-(甘氨酸)3-(谷氨酸)、(甘氨酸)2-(丝氨酸)-(甘氨酸)2-(谷氨酸)、(甘氨酸)3-(丝氨酸)-(甘氨酸)-(谷氨酸)或(甘氨酸)4-(丝氨酸)-(谷氨酸)。在一些实施方案中，肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)4-(丝氨酸)-(谷氨酸)，其中丝氨酸位于沿肽链的任何位置处，比如(β-丙氨酸)-(丝氨酸)-(甘氨酸)4-(谷氨酸)、(β-丙氨酸)-(甘氨酸)-(丝氨酸)-(甘氨酸)3-(谷氨酸)、(β-丙氨酸)-(甘氨酸)2-(丝氨酸)-(甘氨酸)2-(谷氨酸)、(β-丙氨酸)-(甘氨酸)3-(丝氨酸)-(甘氨酸)-(谷氨酸)或(β-丙氨酸)-(甘氨酸)4-(丝氨酸)-(谷氨酸)。
在一些实施方案中，MA包含(甘氨酸)4-(丝氨酸)。在一些实施方案中，肽部分包含(丝氨酸)-(甘氨酸)4。
在一些实施方案中，MA包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)4-(丝氨酸)，其中丝氨酸位于沿肽链的任何位置处。
在一些实施方案中，MA包含(甘氨酸)4-(丝氨酸)-(谷氨酸)，其中丝氨酸位于沿肽链的任何位置处。
在一些实施方案中，MA包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)4-(丝氨酸)-(谷氨酸)，其中丝氨酸位于沿肽链的任何位置处。
在一些实施方案中，MA包含(谷氨酸)-(甘氨酸)1-4，其中：MA经一个谷氨酸附着于A1；MA经甘氨酸附着于T1；和MA经谷氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000341
在一些实施方案中，MA包含(谷氨酸)-(甘氨酸)4，其中：MA经谷氨酸附着于A1；MA经一个甘氨酸附着于T1；和MA经谷氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000342
在一些实施方案中，MA包含(谷氨酸)-(甘氨酸)，其中：MA经谷氨酸附着于A1；MA经甘氨酸附着于T1；和MA经谷氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure BDA0003975405560000343
在一些实施方案中，MA包含(甘氨酸)1-4-(谷氨酸)，其中MA经一个甘氨酸附着于A1；MA经谷氨酸附着于T1；和MA经谷氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000351
在一些实施方案中，MA包含(甘氨酸)4-(谷氨酸)，其中：MA经谷氨酸附着于A1；MA经甘氨酸附着于T1；和MA经谷氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000352
在一些实施方案中，MA包含(甘氨酸)-(谷氨酸)，其中：MA经甘氨酸附着于A1；MA经谷氨酸附着于T1；和MA经谷氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000353
在一些实施方案中，MA包含(甘氨酸)1-4-(丝氨酸)，其中：MA经一个甘氨酸附着于A1；MA经丝氨酸附着于T1；和MA经丝氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000354
在一些实施方案中，MA包含(甘氨酸)-(丝氨酸)，其中：MA经甘氨酸附着于A1；MA经丝氨酸附着于T1；和MA经丝氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000355
在一些实施方案中，MA包含(甘氨酸)4-(丝氨酸)，其中：MA经一个甘氨酸附着于A1；MA经丝氨酸附着于T1；和MA经丝氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000361
在一些实施方案中，MA包含(丝氨酸)-(甘氨酸)1-4，其中：MA经丝氨酸附着于A1；MA经一个甘氨酸附着于T1；和MA经丝氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000362
在一些实施方案中，MA包含(丝氨酸)-(甘氨酸)4，其中：MA经丝氨酸附着于A1；MA经一个甘氨酸附着于T1；和MA经丝氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000363
在一些实施方案中，MA包含(丝氨酸)-(甘氨酸)，其中：MA经丝氨酸附着于A1；MA经一个甘氨酸附着于T1；和MA经丝氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000364
在一些实施方案中，MA包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)1-4-(丝氨酸)，其中：MA经β-丙氨酸附着于A1；MA经丝氨酸附着于T1；和MA经丝氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000365
在一些实施方案中，MA包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)4-(丝氨酸)，其中：MA经β-丙氨酸附着于A1；MA经丝氨酸附着于T1；和MA经丝氨酸附着于LD。
在一些实施方案中，MA包含
Figure BDA0003975405560000371
在一些实施方案中，肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)-(谷氨酸)，其中：肽部分附着于L3(当存在时)或经β-丙氨酸附着于LM(当L3不存在时)；肽部分经谷氨酸附着于T1(当存在时)；和肽部分经谷氨酸附着于LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure BDA0003975405560000372
应当理解，对于MA的实施方案，*表示附着于A1，**表示附着于T1，和***表示附着于LD。
亲水基团(变量T1)
在一些实施方案中，在本公开的缀合物或支架中包含的亲水基团为水溶性且基本上非抗原性聚合物。亲水基团的实例包括但不限于多元醇、聚醚、聚阴离子、聚阳离子、聚磷酸、多胺、多糖、多羟基化合物、聚赖氨酸及其衍生物。在一些实施方案中，亲水基团的一端可官能化，使得其可通过不可裂解键或经可裂解键共价附着于MA接头(例如附着于MA接头中的氨基酸)。在一些实施方案中，官能化可为例如经胺、硫醇、NHS酯、马来酰亚胺、炔烃、叠氮化物、羰基或其他官能团。在一些实施方案中，亲水基团的另一个末端(或多个末端)将为游离的和未束缚的。在一些实施方案中，“未束缚的”意指亲水基团不会附着于另一部分，比如D或药物单元，或者本公开缀合物或支架的其他组分。在一些实施方案中，亲水基团的游离和未束缚端可包括甲氧基、羧酸、醇或其他合适的官能团。在一些实施方案中，甲氧基、羧酸、醇或其他合适的官能团充当亲水基团一个或多个末端的帽。
在一些实施方案中，可裂解键是指在血浆中循环时对裂解基本上不敏感，但在细胞内或瘤内环境中对裂解敏感的键。在一些实施方案中，不可裂解键为在任何生物环境中均对裂解基本上不敏感的键。在一些实施方案中，腙的化学水解、二硫化物的还原和肽键或糖苷键的酶促裂解均为可裂解键的实例。在一些实施方案中，亲水基团的示例性附着为经酰胺键、醚键、酯键、腙键、肟键、二硫键、肽键或三唑键。在一些实施方案中，亲水基团与MA接头(例如与MA接头中的氨基酸)的附着为经酰胺键。
在一些实施方案中，其中本公开的缀合物或支架包含多于一个亲水基团，多个亲水基团可为相同或不同的化学部分(例如不同分子量、亚单元数量或化学结构的亲水基团)。在一些实施方案中，多个亲水基团可在单个附着位点或不同位点处附着于MA接头。
在一些实施方案中，亲水基团的添加可能对所得缀合物的药代动力学具有两个潜在影响。在一些实施方案中，期望的影响为由药物或药物-接头暴露的疏水元素诱导的非特异性相互作用减少而产生的清除率的减少(以及随之而来的暴露增加)。在一些实施方案中，不期望的影响为可能由缀合物分子量的增加而产生的分布体积和速率减少。在一些实施方案中，增加亲水基团的分子量会增加缀合物的流体动力学半径，导致扩散率降低，这可能降低缀合物穿透到肿瘤中的能力。由于这两种相互竞争的药代动力学效应，可能合乎期望的是使用足够大的亲水基团以降低缀合物清除率，从而增加血浆暴露，但不要太大以免大大降低其扩散率，这可能会降低缀合物到达预期靶细胞群的能力。
在一些实施方案中，亲水基团包括但不限于糖醇(sugar alcohol)(也称为多元醇(polyalcohol)、多元醇(polyhydric alcohol)、醛醇或糖醇(glycitol)，比如肌醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿糖醇、木糖醇、核糖醇、半乳糖醇、甘露醇、山梨醇等)或其衍生物(例如氨基多元醇)、碳水化合物(例如糖)、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物(例如右旋糖酐)、羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚环氧烷和/或其共聚物。
在一些实施方案中，T1包含多个羟基(“-OH”)基团，比如包含单糖、低聚糖、多糖等的部分。
在一些实施方案中，T1包含多个-(CR58OH)-基团，其中R58为-H或C1-8烷基。
在一些实施方案中，T1为-OH或
Figure BDA0003975405560000391
其中：
n1为0-约6的整数；
每个R58独立地为-H或C1-8烷基；
R60为键、C1-6烷基接头或-CHR59-，其中R59为-H、C1-8烷基、环烷基或芳基烷基；
R61为CH2OR62、COOR62、-(CH2)n2COOR62或者由一个或多个羟基取代的杂环烷基；
R62为-H或C1-8烷基；和
n2为1-约5的整数。
在一些实施方案中，T1为-OH。在一些实施方案中，T1为
Figure BDA0003975405560000392
在一些实施方案中，R58为-H；R60为键或C1-6烷基接头；n1为1-约6的整数；和R61为CH2OH或COOH)。
在一些实施方案中，R58为-H；R60为-CHR59-；n1为0；和R61为由一个或多个羟基取代的杂环烷基，例如单糖。
在一些实施方案中，T1包含葡萄糖基胺、二胺或三胺。
在一些实施方案中，T1包含一种或多种以下片段或其立体异构体：
Figure BDA0003975405560000393
Figure BDA0003975405560000401
其中R59为-H、C1-8烷基、环烷基或芳基烷基；n1为1-约6的整数；n2为1-约5的整数；和n3为约1-约3的整数。
应当理解，本文考虑亲水基团的所有立体化学形式。例如，在以上式中，亲水基团可衍生于核糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或其他糖，并保留这些分子上存在的侧基羟基和烷基的立体化学排列。
应当理解，在上述式中，还考虑各种脱氧化合物。说明性地，适用时，对于亲水基团考虑一个或多个以下特征。
在一些实施方案中，n3为2或3。
在一些实施方案中，n1为1、2或3。
在一些实施方案中，n2为1。
在一些实施方案中，R59为氢。
在一些实施方案中，T1为
Figure BDA0003975405560000402
在一些实施方案中，T1为
Figure BDA0003975405560000411
在一些实施方案中，T1为
Figure BDA0003975405560000412
在一些实施方案中，T1为
Figure BDA0003975405560000413
其中
n4为1-约25的整数；
每个R63独立地为-H或C1-8烷基；
R64为键或C1-8烷基接头；
R65为-H、C1-8烷基、-(CH2)n2COOR62或-(CH2)n2COR66；
R62为H或C1-8烷基；
R66为H、
Figure BDA0003975405560000414
Figure BDA0003975405560000415
n2为1-约5的整数。
在一些实施方案中，T1为
Figure BDA0003975405560000416
其中R67为：(1)-OH；
Figure BDA0003975405560000421
其中n4为约2-约20、约4-约16、约6-约12、约8-约12的整数。
在一些实施方案中，T1为
Figure BDA0003975405560000422
在一些实施方案中，n4为约2-约20、约4-约16、约6-约12、约8-约12的整数。
在一些实施方案中，n4为6、7、8、9、10、11或12。
在一些实施方案中，n4为8或12。
在一些实施方案中，T1为
Figure BDA0003975405560000423
Figure BDA0003975405560000424
其中n4为约2-约24、约4-约16、约6-约12、约8-约12的整数。
在一些实施方案中，n4为6、7、8、9、10、11或12。
在一些实施方案中，n4为8或12。在一些实施方案中，n4为8。
在一些实施方案中，T1为
Figure BDA0003975405560000425
其中n4为8。
在一些实施方案中，T1包含聚醚，例如聚亚烷基二醇(PAO)。PAO包括但不限于低级环氧烷的聚合物，特别是环氧乙烷的聚合物，比如环氧丙烷、聚丙二醇、聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物。
在一些实施方案中，聚亚烷基二醇为聚乙二醇(PEG)，包括但不限于多分散PEG、单分散PEG和离散PEG。多分散PEG为大小和分子量的非均匀混合物，而单分散PEG一般地为从非均匀混合物中纯化，并因此提供单一链长和分子量。在一些实施方案中，PEG单元为离散PEG，提供具有确定和指定链长的单一分子。在一些实施方案中，聚乙二醇为mPEG。
在一些实施方案中，T1包含含有一个或多个PEG链的PEG单元。PEG链可例如以线性、分支或星形构型连接在一起。除包含重复性PEG亚单元之外，PEG单元还可包含非PEG材料(例如以促进多个PEG链彼此偶联或促进与氨基酸偶联)。非PEG材料是指PEG链中不为重复性-CH2CHO-亚单元的部分的原子。在一些实施方案中，PEG链可包含经非PEG元件彼此连接的两个单体PEG链。在一些实施方案中，PEG单元可包含与附着于氨基酸的中心核附着两条线性PEG链(即PEG单元本身为分支的)。
PEG单元可经反应性基团与MA接头(例如与MA接头中的氨基酸)共价结合。反应性基团为活化的PEG分子可结合的那些(例如游离氨基或羧基)。在一些实施方案中，N-末端氨基酸和赖氨酸(K)具有游离氨基；和C-末端氨基酸残基具有游离羧基。巯基(例如半胱氨酸残基上存在的)也可用作用于附着PEG的反应性基团。
在一些实施方案中，PEG单元可通过使用具有包括但不限于以下的不同反应性部分的甲氧基化PEG(“mPEG”)附着于MA接头(例如MA接头中的氨基酸)：琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺碳酸酯(SC)、mPEG-亚氨酸酯、对硝基苯碳酸酯(NPC)、琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)和三聚氯氰。mPEG的实例包括但不限于mPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)、mPEG2-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG2-SS)、mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)、mPEG2-琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG2-SC)、mPEG-亚氨酸酯、mPEG-对硝基苯碳酸酯(mPEG-NPC)、mPEG-亚氨酸酯、mPEG2-对硝基苯碳酸酯(mPEG2-NPC)、mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG2-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG2-SPA)、mPEG-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG-NHS)、mPEG2-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG2-NHS)、mPEG-三聚氯氰、mPEG2-三聚氯氰、mPEG2-赖氨醇-NPC和mPEG2-Lys-NHS。可使用广泛种类的PEG物质，并且可使用基本上任何合适的反应性PEG试剂。在一些实施方案中，反应性PEG试剂将导致在附着于多官能接头或MA接头(例如MA接头中的氨基酸)后形成氨基甲酸酯或酰胺键。反应性PEG试剂包括但不限于mPEG2-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG2-NHS)、双官能PEG丙醛(mPEG2-ALD)、多臂PEG、含有马来酰亚胺的PEG(mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL))、mPEG-NH2、mPEG-琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG的琥珀酰亚胺丁酸酯(mPEG-SBA)、mPEG-硫酯、mPEG-双酯、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG-乙醛二乙基乙缩醛(mPEG-ACET)、杂官能PEG(例如NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-乙烯基砜(NHS-PEG-VS)或NHS-PEG-MAL)、PEG丙烯酸酯(ACRL-PEG-NHS)、PEG-磷脂(例如mPEG-DSPE)、SUNBRITETM系列的多臂PEG(包括通过由本领域技术人员选择的化学物质活化的甘油基PEG)、任何SUNBRITE活化的PEG(包括但不限于羧基-PEG、p-NP-PEG、三氟乙磺酰氯-PEG、醛PEG、乙缩醛-PEG、氨基-PEG、硫醇-PEG、马来酰亚胺基-PEG、羟基-PEG-胺、氨基-PEG-COOK羟基-PEG-醛、羧酸酐型-PEG、官能化PEG-磷脂及其他类似和/或合适的反应性PEG。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少6个亚单元、至少7个亚单元、至少8个亚单元、至少9个亚单元、至少10个亚单元、至少11个亚单元、至少12个亚单元、至少13个亚单元、至少14个亚单元、至少15个亚单元、至少16个亚单元、至少17个亚单元、至少18个亚单元、至少19个亚单元、至少20个亚单元、至少21个亚单元、至少22个亚单元、至少23个亚单元或至少24个亚单元。在一些这种实施方案中，PEG单元包含不多于约72个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少6个亚单元、至少7个亚单元、至少8个亚单元、至少9个亚单元、至少10个亚单元、至少11个亚单元、至少12个亚单元、至少13个亚单元、至少14个亚单元、至少15个亚单元、至少16个亚单元、至少17个亚单元、至少18个亚单元、至少19个亚单元或至少20个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少6个亚单元、至少7个亚单元、至少8个亚单元、至少9个亚单元、至少10个亚单元、至少11个亚单元、至少12个亚单元、至少13个亚单元、至少14个亚单元、至少15个亚单元、至少16个亚单元、至少17个亚单元或至少18个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少6个亚单元、至少7个亚单元、至少8个亚单元、至少9个亚单元、至少10个亚单元、至少11个亚单元或至少12个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少8个亚单元、至少9个亚单元、至少10个亚单元、至少11个亚单元或至少12个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少6个亚单元、至少7个亚单元或至少8个亚单元。
在一些实施方案中，线性PEG单元为：
(i)
Figure BDA0003975405560000451
(ii)
Figure BDA0003975405560000452
(iii)
Figure BDA0003975405560000453
其中：
Figure BDA0003975405560000461
表示与MA接头(例如与MA接头中的氨基酸)的附着位点；
Y71为PEG附着单元；
Y72为PEG加帽单元；
Y73为PEG偶联单元(即用于使多个PEG亚单元链偶联在一起)；
d9为2-72的整数；
每个d10独立地为1-72的整数；和
d11为2-5的整数。
在一些实施方案中，d9为2-24的整数。在一些实施方案中，d9为4-24的整数。在一些实施方案中，d9为6-24、8-24、10-24或12-24的整数。
在一些实施方案中，在PEG单元中存在至少6个PEG亚单元。在一些实施方案中，在PEG单元中存在至少8个PEG亚单元。在一些实施方案中，在PEG单元中存在至少10个PEG亚单元。在一些实施方案中，在PEG单元中存在至少12个PEG亚单元。
在一些实施方案中，d9为8或约8、12或约12、24或约24。
在一些实施方案中，每个Y72独立地为-C1-10烷基、-C2-10烷基-CO2H、-C2-10烷基-OH、-C2-10烷基-NH2、-C2-10烷基-NH(C1-3烷基)或C2-10烷基-N(C1-3烷基)2。
在一些实施方案中，Y72为-C1-10烷基、-C2-10烷基-CO2H、-C2-10烷基-OH或-C2-10烷基-NH2。
在一些实施方案中，PEG偶联单元为PEG单元的部分，并且为用于连接两个或更多个重复性CH2CHO-亚单元链的非PEG材料。在一些实施方案中，PEG偶联单元Y73为-C2-10烷基-C(O)-NH-、-C2-10烷基-NH-C(O)-、-C2-10烷基-NH-、-C2-10烷基-C(O)-、-C2-10烷基-O-或-C2-10烷基-S-。
在一些实施方案中，每个Y73独立地为-C1-10烷基-C(O)-NH-、-C1-10烷基-NH-C(O)-、-C2-10烷基-NH-、-C2-10烷基-O-、-C1-10烷基-S-或-C1-10烷基-NH-。
在一些实施方案中，PEG附着单元为PEG单元的部分并且用于将PEG单元连接于MA接头(例如MA接头中的氨基酸)。在一些实施方案中，氨基酸具有与PEG单元形成键的官能团。在一些实施方案中，用于将PEG单元附着于氨基酸的官能团包括形成二硫键或硫醚键的巯基、形成腙键的醛、酮或肼基、形成肟键的羟胺、形成肽键的羧基或氨基、形成酯键的羧基或羟基、形成磺酰胺键的磺酸、形成氨基甲酸酯键的醇和形成磺酰胺键或氨基甲酸酯键或酰胺键的胺。在一些实施方案中，PEG单元可例如经二硫化物、硫醚、腙、肟、肽、酯、磺酰胺、氨基甲酸酯或酰胺键附着于氨基酸。在一些实施方案中，用于附着PEG单元的反应可为环加成、加成、加成/消除或取代反应或其组合(适用时)。
线性PEG单元的实例包括：
(i)
Figure BDA0003975405560000471
(ii)
Figure BDA0003975405560000472
(iii)
Figure BDA0003975405560000473
(iv)
Figure BDA0003975405560000474
(v)
Figure BDA0003975405560000475
其中
Figure BDA0003975405560000476
表示与多官能接头或MA接头(例如与MA接头中的氨基酸)的附着位点，和每个d9独立地为4-24、6-24、8-24、10-24、12-24、14-24或16-24的整数。
在一些实施方案中，d9为约8、约12或约24。在一些实施方案中，d9为约8。
在一些实施方案中，PEG单元为约300Da-约5kDa、约300Da-约4kDa、约300Da-约3kDa、约300Da-约2kDa或约300Da-约1kDa。在一些实施方案中，PEG单元具有至少6个亚单元或至少8、10或12个亚单元。在一些实施方案中，PEG单元具有至少6个亚单元或至少8、10或12个亚单元但不多于24个亚单元。
在一些实施方案中，合适的聚乙二醇可在聚合物分子的每一端具有游离羟基，或者可具有一个用低级烷基例如甲基醚化的羟基。在一些实施方案中，合适的聚乙二醇为具有可酯化羧基的聚乙二醇衍生物。在一些实施方案中，聚乙二醇以商品名PEG可市售获得，通常作为以平均分子量为特征的聚合物混合物。在一些实施方案中，聚乙二醇的平均分子量为约300-约5000。在一些实施方案中，聚乙二醇的平均分子量为约600-约1000。
在一些实施方案中，适合于本文公开的缀合物、支架和方法的亲水基团的实例可见于例如US 8367065第13栏、US 8524696第6栏、WO2015/057699和WO 2014/062697，其每一个的内容通过参考以其全部并入本文。
STING激动剂药物部分(变量D)
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分(D)为以下式(A)化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000481
其中：
Y1、Y2、Z1和Z2各自独立地为O、S、C或N；
X1、X2、W1和W2各自独立地为C或N；
X3和X4各自独立地为S或NRf；
X5为N或CRA2；
X6为N或CRA1；
R3和R5各自独立地为-CON(Rd)(Rf)、-CH2N(Rd)(Rf)、-N(Rd)(Rf)、-N(Rd)CO(Rf)、-CH2N(Rd)CO(Rf)或者R3和R5中的一个为-CON(Rd)(Rf)、-CH2N(Rd)(Rf)、-N(Rd)(Rf)、-N(Rd)CO(Rf)或-CH2N(Rd)CO(Rf)和R3和R5中的另一个为H、-COOH或-CO2(RC)；
Rc为C1-4烷基；
RA2和RA1各自独立地为H、卤素、羟基、氨基、氨基(C1-4烷基)-、任选取代的(C1-6烷基)或任选取代的(C1-6烷基)氧基-，其中所述任选取代的(C1-6烷基)或任选取代的(C1-6烷基)氧基-的C1-6烷基由1-4个各自选自羟基、C1-4烷氧基、-N(Re)(Rf)、-CO2(Rf)、-CON(Re)(Rf)和-COOH的取代基任选取代；
每个Rd独立地为H、羟基或C1-4烷基；
Re选自H、(C1-4烷基)、-CO(C1-4烷基)、-OCO(C1-4烷基)和-CO2(C1-4烷基)；
每个Rf独立地为H、羟基或(C1-4烷基)；
R14和RC2各自独立地为不存在或C1-4烷基，其中C1-4烷基由选自卤素、-ORc、-NRcRd、-CO2Rc、-CONRcRd、-SO2NRcRd和-OCONRcRd的取代基任选取代；
R16和RC1各自独立地为不存在、H或C1-4烷基；和
R15、R17、R18或R19各自独立地为不存在、H或C1-4烷基，其中C1-4烷基由选自卤素、-ORc、-NRcRd、-CO2Rc、-CONRcRd、-SO2NRcRd和-OCONRcRd的取代基任选取代；
其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，和其中RA2和RA1中的至少一个经RA2和/或RA1的至少一个官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-a)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000501
其中：
Y1、Y2、Z1、Z2、X1、X2、W1、W2、X3、X4、R3、R5、Rc、Rd、Re、Rf、R14、RC2、R16、RC1、R15、R17、R18和R19如在式(A)中定义；
X5为CRA2；和
RA2为卤素、羟基、任选取代的(C1-6烷基)、取代的(C1-6烷基)氧基-、任选取代的(C1-6烷基)氨基-或任选取代的(C1-6烷基)(C1-4烷基)氨基-，其中所述任选取代的(C1-6烷基)或取代的(C1-6烷基)氧基-的C1-6烷基由1-4个各自独立地选自羟基、C1-4烷氧基、-N(Re)(Rf)、-CO2(Rf)、-CON(Re)(Rf)和-COOH的取代基任选取代；
其中：(i)RA2经RA2的官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-b)化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000511
其中：
Y1、Y2、Z1、Z2、X1、X2、W1、W2、X4、X5、X6、R3、R5、Rc、RA2、RA1、Rd、Re、Rf、R14、RC2、R16、RC1、R15、R17、R18和R19如在式(A)中定义；
其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，和其中RA2和RA1中的至少一个经RA2和/或RA1的至少一个官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-c)化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000512
Figure BDA0003975405560000521
其中：
Y2、Z2、X2、W2、X3、X4、X5、X6、R3、R5、Rc、RA2、RA1、Rd、Re、Rf、R14、RC2、R16、RC1、R15、R17、R18和R19如在式(A)中定义；
其中W1、X1、Y1和Z1中的一个为N和另外的W1、X1、Y1和Z1为O、S或C；
其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，和其中RA2和RA1中的至少一个经RA2和/或RA1的至少一个官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-d)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000522
其中：
Y1、Y2、Z1、Z2、X1、X2、W1、W2、X3、R3、R5、Rc、Rd、Re、Rf、R14、RA2、RC2、R16、RC1、R15、R17、R18和R19如在式(A)中定义；
X5为CRA2；和
其中：(i)RA2经RA2的官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-e)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000531
其中：
Y1、Y2、Z1、Z2、X1、X2、X3、W1、W2、RA1、R3、R5、Rc、Rd、Re、Rf、R14、RC2、R16、RC1、R15、R17、R18和R19如在式(A)中定义；
X6为CRA1；和
其中：(i)RA1经RA1的官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-f)化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000541
其中：
X2、X3、X4、X5、X6、W2、Y2、Z2、R3、R5、Rc、RA2、RA1、Rd、Re、Rf、R16、R17、R18、R19、RC2和RC1如在式(A)中定义；和
其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，和其中RA2和RA1中的至少一个经RA2和/或RA1的至少一个官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-f1)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000542
其中：
X2、X3、X4、W2、Y2、Z2、R3、R5、Rc、Rd、Re、Rf、R16、RA2、R17、R18、R19、RC2和RC1如在式(A)中定义；
X5为CRA2；和
其中：(i)RA2经RA2的官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-f2)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000551
其中：
X2、X4、X5、X6、W2、Y2、Z2、R3、R5、Rc、RA2、RA1、Rd、Re、RC1、RC2、R16、R17、R18、R19和Rf如在式(A)中定义；
其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，和其中RA2和RA1中的至少一个经RA2和/或RA1的至少一个官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-f3)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000561
其中：
X2、X4、W2、Y2、Z2、R3、R5、Rc、Rd、Re、Rf、R16、RA2、RC2、R16、R17、R18、R19和RC1如在式(A)中定义；
X5为CRA2；和
其中：(i)RA2经RA2的官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-f4)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000562
其中：
X2、X4、W2、Y2、Z2、R3、R5、Rc、Rd、Re、Rf、R16、RA2、RC2、R16、R17、R18、R19和RC1如在式(A)中定义；
X5为CRA2；和
其中：(i)RA2经RA2的官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-f5)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000571
其中：
X2、W2、Y2、Z2、R3、R5、Rc、Rd、Re、Rf、R16、RA2、RC2、R16、R17、R18、R19和RC1如在式(A)中定义；
X5为CRA2；和
其中：(i)RA2经RA2的官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-g)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000581
其中：
X3、X4、X5、X6、R3、R5、Rc、RA2、RA1、RC2、R17、R18、R19、Rd、Re、Rf、R16和RC1如在式(A)中定义；
Y2和Z2各自独立地为O、S、C或N；
X2和W2各自独立地为C或N；
其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，和其中RA2和RA1中的至少一个经RA2和/或RA1的至少一个官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-g1)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000582
Figure BDA0003975405560000591
其中：
X2、W2、Y2、Z2、X3、X4、X5、R3、R5、Rc、Rd、Re、Rf、RA2、RC2、R17、R18、R19、R16和RC1如在式(A)中定义；其中：(i)RA2经RA2的官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-g2)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000592
其中：
X2、X4、X5、X6、W2、Y2、Z2、R3、R5、Rc、RA2、RA1、RC2、R17、R18、R19、Rd、Re、Rf、R16和RC1如在式(A)中定义；
其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，和其中RA2和RA1中的至少一个经RA2和/或RA1的至少一个官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-g3)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000601
其中：
X2、X4、W2、Y2、Z2、R3、R5、Rc、RA2、RC2、R17、R18、R19、R16和RC1如在式(A)中定义；
X5为CRA2；和
其中：(i)RA2经RA2的官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD；和
任选地，其中RA2经RA2的官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-g4)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000602
其中：
X2、X4、W2、Y2、Z2、R3、R5、Rc、Rd、Re、Rf、RA2、RC2、R17、R18、R19、R16和RC1如在式(A)中定义；
X5为CRA2；和
其中：(i)RA2经RA2的官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-g5)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000611
其中：
X2、W2、Y2、Z2、R3、R5、Rc、Rd、Re、Rf、RA2、RC2、R17、R18、R19、R16和RC1如在式(A)中定义；
X5为CRA2；和
其中：(i)RA2经RA2的官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-h)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000621
其中：
X1、W1、Y1、Z1、X4、X5、X6、R3、R5、Rc、RA2、RA1、Rd、Re、Rf、R14、R15、R18、R19、R16和RC1如在式(A)中定义；其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，和其中RA2和RA1中的至少一个经RA2和/或RA1的至少一个官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-h1)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000622
Figure BDA0003975405560000631
其中：
X1、X3、W1、Y1、Z1、X5、X6、R3、R5、Rc、RA2、RA1、Rd、Re、Rf、R14、R15、R18、R19、R16和RC1如在式(A)中定义；
其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，和其中RA2和RA1中的至少一个经RA2和/或RA1的至少一个官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分为以下式(A-h2)的化合物或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000632
其中：
X1、X3、W1、Y1、Z1、R3、R5、Rc、Rd、Re、Rf、RA2、R14、R15、R18、R19、R16和RC1如在式(A)中定义；
X5为CRA2；和
其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，和其中RA2和RA1中的至少一个经RA2和/或RA1的至少一个官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，STING激动剂药物部分(D)为式(A)的化合物，其中化合物具有以下式(A-i)或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure BDA0003975405560000641
其中：
Y1、Y2、Z1、Z2、X1、X2、X3、X6、W1、W2、RA1、RA2、Rc、Rd、Re、Rf、R14、RC2、R16、RC1、R15、R17、R18和R19如在式(A)中定义；和
其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，和其中RA2和RA1中的至少一个经RA2和/或RA1的至少一个官能团连接于LD；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，和其中RC2和RC1中的至少一个经RC2和/或RC1的至少一个官能团连接于LD。
在一些实施方案中，每种STING激动剂药物部分(D)独立地为：
Figure BDA0003975405560000642
Figure BDA0003975405560000651
Figure BDA0003975405560000661
Figure BDA0003975405560000671
Figure BDA0003975405560000681
Figure BDA0003975405560000691
Figure BDA0003975405560000701
Figure BDA0003975405560000711
Figure BDA0003975405560000721
Figure BDA0003975405560000731
Figure BDA0003975405560000741
Figure BDA0003975405560000751
其中：
R2为不存在、-O-或-NR4-；R4为H或C1-3烷基；和
Figure BDA0003975405560000753
表示附着于LD。
在一些实施方案中，每种STING激动剂药物部分(D)独立地为：
Figure BDA0003975405560000752
Figure BDA0003975405560000761
Figure BDA0003975405560000771
其中：
R2为不存在、-O-或-NR4-；R4为H或C1-3烷基；和
Figure BDA0003975405560000772
表示附着于LD。
在一些实施方案中，每种STING激动剂药物部分(D)独立地为：
Figure BDA0003975405560000781
其中：
R2为不存在、-O-或-NR4-；R4为H或C1-3烷基；和
Figure BDA0003975405560000782
表示附着于LD。
在一些实施方案中，每种STING激动剂药物部分(D)独立地为：
Figure BDA0003975405560000791
其中：
R2为不存在、-O-或-NR4-；R4为H或C1-3烷基；和
Figure BDA0003975405560000792
表示附着于LD。
在一些实施方案中，每种STING激动剂药物部分(D)独立地为：
Figure BDA0003975405560000801
其中：
R2为不存在、-O-或-NR4-；R4为H或C1-3烷基；和
Figure BDA0003975405560000802
表示附着于LD。
基于蛋白的识别分子(PBRM)
在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子将缀合物引导至特定组织、细胞或细胞中的位置。在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子可在培养物或在整个生物体中，或在两者中引导缀合物。在每种情况下，基于蛋白的识别分子可能具有存在于靶向细胞的细胞表面的配体，配体以有效特异性、亲和性和亲合力与所述靶向细胞结合。在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子使缀合物靶向除肝脏以外的组织。在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子使缀合物靶向特定组织，比如肝脏、肾脏、肺部或胰腺。基于蛋白的识别分子可使缀合物靶向靶细胞比如癌细胞，比如细胞比如癌细胞上表达的受体、基质组织或与癌症相关的蛋白比如肿瘤抗原。或者，包含肿瘤脉管系统的细胞可被靶向。基于蛋白的识别分子可将缀合物引导至特定类型的细胞，比如对肝脏中的肝细胞而不是Kupffer细胞的特定靶向。在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子可将缀合物引导至网状内皮或淋巴系统的细胞或专职吞噬细胞，比如巨噬细胞或嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，缀合物本身也可为有效的递送系统而不需要特定靶向。
在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子可使缀合物靶向细胞内的位置，比如细胞核、细胞质或核内体。在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子可增强细胞与受体的结合或细胞质向细胞核的转运以及核从核内体或其他细胞内小泡进入或释放。
在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子为抗体、抗体片段、蛋白、肽或肽模拟物。
在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子为抗体。在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子为抗体片段。在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子为蛋白。在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子为肽。在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子为肽模拟物。
在一些实施方案中，抗体或抗体片段可为其中相应的亲本抗体或抗体片段(例如相应的野生型抗体或抗体片段)的一个或多个氨基酸由半胱氨酸(例如工程化半胱氨酸)取代的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，亲本抗体或抗体片段可为野生型或突变的。
在一些实施方案中，抗体或抗体片段可为突变的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，本领域已知的单克隆抗体被工程化以形成抗体。在一些实施方案中，本领域已知的抗体片段(例如Fab抗体片段)被工程化以形成抗体片段(例如半胱氨酸工程化Fab抗体片段)。在一些实施方案中，由于IgG抗体的二聚性所致，Fab的单一位点突变产生Fab中的单一残基，而抗体中的单一位点突变产生所得抗体中的两个氨基酸。
在一些实施方案中，抗体或抗体片段保留其相应的野生型抗体或抗体片段的抗原结合能力。在一些实施方案中，抗体或抗体片段能够与其相应的野生型抗体或抗体片段的一个或多个抗原结合。
在一些实施方案中，示例性的抗体或衍生于对细胞表面标志物具有特异性的Fab、Fab2、scFv或骆驼抗体重链片段的抗体包括但不限于5T4、AOC3、ALK、AXL、B7-H4、C242、C4.4a、CA-125、CCL11、CCR 5、CD2、CD3、CD4、CD5、CD15、CA15-3、CD18、CD19、CA19-9、CDH6、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD31、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD44 v6、CD51、CD52、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD74、CD79-B、CD80、CD125、CD103、CD138、CD141、CD147、CD152、CD 154、CD326、CEA、CEACAM-5、聚集因子、Clec9A、CSFR1、CTLA-4、CXCR2、DEC205、EGFR(HER1)、ErbB1、ErbB2、ErbB3、EpCAM、EPHA2,EPHB2、EPHB4、FAP、FGFR(即FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)、FLT3、纤连蛋白-EDB、叶酸受体、GD2、GD3、GPNMB、GCC(GUCY2C)、HGF、HER2、HER3、HMI.24、ICAM、ICOS-L、IGF-1受体、VEGFR1、EphA2、TRPV1、CFTR、gpNMB、CA9、Cripto、c-KIT、c-MET、ACE、APP、肾上腺素能受体-β2、Claudine 3、LIV1、LY6E、间皮素、MUC1、MUC13、NaPi2b、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、RON、ROR1、PD-L1、PD-L2、PTK7、B7-H3、B7-B4、IL-2受体、IL-4受体、IL-13受体、TROP-2、卷曲蛋白-7、整合素(包括α4、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α4β7、α5β1、α6β4、αIIbβ3整合素)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE、IGF-1受体、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-22、IL-4、IL-5、IL-6、干扰素受体、ITGB2(CD18)、LFA-1(CD11a)、CD11b、L-选择素(CD62L)、黏蛋白、肌肉生长抑制素、NCA-90、NGF、PDGFRα、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、狂犬病、RANKL、呼吸道合胞病毒、恒河猴因子、SLAMF7、鞘氨醇-1-磷酸、TAG-72、T-细胞受体、腱生蛋白C、TGF-1,TGF-β2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR2、波形纤维蛋白等。
在一些实施方案中，衍生于对细胞表面标志物具有特异性的Fab、Fab2、scFv或骆驼抗体重链片段的多种或一种抗体包括CA-125、C242、CD3、CD11b、CD19、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD103、CD138、CD141、CD326、CEA、Clec9A、CSFR1、CTLA-4、DEC205、EGFR(HER1)、ErbB2、ErbB3、FAP、纤连蛋白-EDB、叶酸受体、IGF-1受体、GD3、GPNMB、HGF、HER2、VEGF-A、VEGFR2、VEGFR1、EphA2、EpCAM、5T4、PTK7,TAG-72、腱生蛋白C、TRPV1、CFTR、gpNMB、CA9、Cripto、ACE、APP、PDGFRα、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、肾上腺素能受体-β2、Claudine 3、黏蛋白、MUC1、NaPi2b、B7H3、B7H4、C4.4a、CEACAM-5、MUC13、TROP-2、卷曲蛋白-7、间皮素、IL-2受体、IL-4受体、IL-13受体和整合素(包括αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α5β1、α6β4整合素)、腱生蛋白C、TRAIL-R2和波形纤维蛋白。
在一些实施方案中，抗体针对以下的细胞表面标志物：5T4、CA-125、CEA、CDH6、CD3、CD11b、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD51、CD-103、CTLA-4、CEACAM5、Clec9A、CSFR1、DEC205、EpCAM、HER2、EGFR(HER1)、FAP、纤连蛋白-EDB、叶酸受体、GCC(GUCY2C)、HGF、整合素αvβ3、整合素α5β1、IGF-1受体、GD3、GPNMB、黏蛋白、LIV1、LY6E、间皮素、MUC1、MUC13、NaPi2b、PTK7、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、PDGFRα、TAG-72、腱生蛋白C、TRAIL-R2、VEGF-A和VEGFR2。在这种实施方案中，抗体包括但不限于阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿拉赛珠单抗(alacizumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、安那莫单抗(anatumomab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)
Figure BDA0003975405560000831
比伐珠单抗(bivatuzumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、坎妥珠单抗(cantuzumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、卡罗单抗(capromab)、西妥昔单抗(cetuximab)、西他组单抗(citatuzumab)、克利妥珠单抗(clivatuzumab)、可那木单抗(conatumumab)、达西组单抗(dacetuzumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、埃达组单抗(etaracizumab)、法妥组单抗(farletuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、格巴妥木单抗(glembatumumab)、伊贝莫单抗(ibritumomab)、伊戈伏单抗(igovomab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊组单抗(inotuzumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、卢卡木单抗(lucatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米妥莫单抗(mitumomab)、他那莫单抗(naptumomab estafenatox)、奈妥木单抗(necitumumab)、莫妥组单抗(oportuzumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕木单抗(panitumumab)、帕特姆单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、普林木单抗(pritumumab)、利妥昔单抗(rituximab)
Figure BDA0003975405560000841
利妥木单抗(rilotumumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、沙妥莫单抗(satumomab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、他利妥莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替西木单抗(ticilimumab)(曲美木单抗(tremelimumab))、替加组单抗(tigatuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)
Figure BDA0003975405560000842
托西莫单抗(tositumomab)、曲美木单抗(tremelimumab)、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、伏洛昔单抗(volociximab)和扎芦木单抗(zalutumumab)。
在一些实施方案中，针对HER2的细胞表面标志物的抗体为帕妥珠单抗或曲妥珠单抗，和对于EGFR(HER1)的抗体为西妥昔单抗或帕木单抗；和对于CD20的抗体为利妥昔单抗和对于VEGF-A为贝伐珠单抗和对于CD-22的抗体为依帕珠单抗或维妥组单抗(veltuzumab)和对于CEA的抗体为拉贝珠单抗。
示例性的肽或肽模拟物包括整合素靶向肽(RGD肽)、LHRH受体靶向肽、ErbB2(HER2)受体靶向肽、前列腺特异性膜结合抗原(PSMA)靶向肽、脂蛋白受体LRP1靶向、ApoE蛋白衍生肽、ApoA蛋白肽、生长抑素受体靶向肽、氯毒素衍生肽和铃蟾肽。
在一些实施方案中，肽或肽模拟物为LHRH受体靶向肽和ErbB2(HER2)受体靶向肽。
示例性的蛋白包括胰岛素、转铁蛋白、纤维蛋白原γ片段、血小板反应蛋白、闭合蛋白、载脂蛋白E、亲和体分子比如ABY-025、锚蛋白重复蛋白、锚蛋白样重复蛋白和合成肽。
在一些实施方案中，蛋白-药物缀合物包含广谱细胞毒素与细胞表面标志物的组合，对于HER2，比如帕妥珠单抗或曲妥珠单抗；对于EGFR，比如西妥昔单抗和帕木单抗；对于CEA，比如拉贝珠单抗；对于CD20，比如利妥昔单抗；对于VEGF-A，比如贝伐珠单抗；或对于CD-22，比如依帕珠单抗或维妥组单抗。
在一些实施方案中，本公开中使用的蛋白-药物缀合物或蛋白缀合物包含两种或更多种基于蛋白的识别分子的组合，比如针对肿瘤细胞上EGF受体(EGFR)和T细胞上CD3和CD28的双特异性抗体的组合；衍生于Fab、Fab2、scFv或骆驼抗体重链片段和肽或肽模拟物的多种或一种抗体的组合；衍生于Fab、Fab2、scFv或骆驼抗体重链片段和蛋白的多种或一种抗体的组合；两种双特异性抗体的组合，比如CD3-CD19加CD28-CD22双特异性抗体。
在一些实施方案中，本公开中使用的蛋白-药物缀合物或蛋白缀合物包含的基于蛋白的识别分子为针对抗原的抗体，比如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗、依帕珠单抗、维妥组单抗、拉贝珠单抗、B7-H4、B7-H3、CD11b、CD103、CA125、CDH6、CD33、CXCR2、CEACAM5、Clec9A、CSFR1、DEC205、EGFR、FAP、纤连蛋白-EDB、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、GCC(GUCY2C)、HER2、LIV1、LY6E、NaPi2b、c-Met、间皮素、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PD-L1、PTK7、c-Kit、MUC1、MUC13和5T4。
在一些实施方案中，本公开的蛋白-药物缀合物或蛋白缀合物包含基于蛋白的识别分子，其为CSRF1、CD11b、DEC205、clec9A、CD103、B7H4、间皮素、PTK7、Ly6E、FAP、纤连蛋白-EDB、Her-2或NaPi2b抗体。
NaPi2b抗体
在一些实施方案中，适合于缀合的NaPi2b抗体与SLC34A2的胞外区结合。在一些实施方案中，本公开提供特异性地识别NaPi2b(也称为钠依赖性磷酸盐转运蛋白2B)的NaPi2b靶向单克隆抗体。在一些实施方案中，本文公开的缀合物中使用的NaPi2b抗体能够并且可用于调节，例如阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰NaPi2b的至少一种生物活性。在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括结合可溶性NaPi2b的抗体。在一些实施方案中，NaPi2b抗体特异性地结合于人类NaPi2b的胞外结构域(ECD)上的表位。这些抗体在本文统称为“NaPi2b”抗体。
在一些实施方案中，本文提供的NaPi2b抗体-药物缀合物包括以≤1μM(例如≤100nM、≤10nM和≤1nM)的平衡解离常数(Kd或KD)与NaPi2 b表位结合的抗体。在一些实施方案中，本文公开的抗体-药物缀合物中使用的NaPi2b抗体呈现≤约1nM-约1pM之间范围内的Kd。
在一些实施方案中，本文提供的NaPi2b抗体-药物缀合物可包括用于调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰NaPi2b的功能活性的抗体。在一些实施方案中，NaPi2b的功能活性包括例如参与跨细胞无机磷酸盐(Pi)吸收，从而助于维持体内的磷酸盐稳态。在一些实施方案中，NaPi2b抗体通过部分或完全地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰跨细胞无机磷酸盐吸收而完全或部分地抑制NaPi2b功能活性。
在一些实施方案中，与不存在与本文所述的NaPi2b抗体结合的情况下NaPi2b的功能活性水平相比较，当在存在NaPi2b抗体的情况下NaPi2b的功能活性水平降低至少95％，例如96％、97％、98％、99％或100％时，认为NaPi2b抗体完全地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰NaPi2p功能活性。在一些实施方案中，与不存在与本文所述的NaPi2b抗体结合的情况下NaPi2b的活性水平相比较，当在存在NaPi2b抗体的情况下NaPi2b的活性水平降低少于95％，例如10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％时，认为NaPi2b抗体部分地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰NaPi2b功能活性。
在一些实施方案中，本文公开的示例性抗体包括XMT-1535抗体。这些抗体对人类NaPi2b显示特异性，并且其已经显示抑制NaPi2b活性。
NaPi2b人源或人源化单克隆抗体XMT-1535包括重链(HC)、重链可变区(VH)、轻链(LC)和轻链可变区(VL)，如以下表I所示的氨基酸和相应核酸序列所示。每种抗体的可变重链区和可变轻链区在以下氨基酸序列中涂有阴影。重链和轻链的互补决定区(CDR)在以下所示的氨基酸序列中突出显示。包含XMT-1535抗体的互补决定区(CDR)的氨基酸公开于美国专利8,603,474中。
表I：NaPi2b人源或人源化单克隆抗体XMT-1535序列
SEQ ID NO: 序列描述
1 XMT-1535重链氨基酸序列
2 XMT-1535轻链氨基酸序列
3 XMT-1535重链可变区
4 XMT-1535轻链可变区
5 XMT-1535 CDRH1
6 XMT-1535 CDRH2
7 XMT-1535 CDRH3
8 XMT-1535 CDRL1
9 XMT-1535 CDRL2
10 XMT-1535 CDRL3
11 XMT-1535 IgG1重链恒定区
12 XMT-1535轻链恒定区
13 XMT-1535重链可变区核酸序列
14 XMT-1535轻链可变区核酸序列
15 全长人类NaPi2b序列
本文公开的抗体特异性地结合于人类NaPi2b的胞外结构域(ECD)上的表位。
在一些实施方案中，本领域的技术人员应当认识到，通过确定单克隆抗体是否阻止本文公开的单克隆抗体与天然结合配偶体或已知与NaPi2b缔合的其他分子结合，可在没有过度实验的情况下确定前者与后者(例如XMT-1535，10H1.11.4B)是否具有相同特异性。如果待测单克隆抗体与本文公开的单克隆抗体竞争，如本文公开的单克隆抗体的结合减少所示，则两种单克隆抗体结合于相同或密切相关的表位。
用于确定单克隆抗体是否具有本文公开的单克隆抗体的特异性的一种备选方法为使本文公开的单克隆抗体与可溶性NaPi2b(与其通常具有反应性)一起预温育，并然后加入待测单克隆抗体，以确定待测单克隆抗体其结合NaPi2b的能力是否受到抑制。如果待测单克隆抗体被抑制，则很有可能其与本文公开的单克隆抗体具有相同或功能等效的表位特异性。
例如通过测量NaPi2b介导的活性，并确定测试单克隆抗体是否能够调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰NaPi2b活性，也可进行本文公开的单克隆抗体的筛选。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含具有与选自SEQ ID NO:3的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的重链可变区和具有与选自SEQ ID NO:4的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:3的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:4的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:1的重链氨基酸序列和SEQID NO:2的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:5的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO:6的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO:7的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO:8的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:9的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO:10的CDRL3氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列、包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的CDRH2、包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的CDRH3、包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的CDRL1、包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的CDRL2和包含与SEQID NO:10的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的CDRL3。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包括可变结构域序列中的一个或多个保守氨基酸取代，比如可变结构域序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个保守取代。在一些实施方案中，这些保守氨基酸取代处于CDR区，例如在所有CDR中累积进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个保守取代，并且在一些特定实施方案中，多达1、2、3或4个保守氨基酸取代可存在于每个CDR序列，例如SEQ ID NO:5-10中。
在一些实施方案中，本领域的技术人员应当认识到，通过确定单克隆抗体是否阻止单克隆抗体XMT-1535与天然结合配偶体或已知与NaPi2b缔合的其他分子结合，可在没有过度实验的情况下确定前者与后者是否具有相同特异性。如果待测单克隆抗体与本文公开的单克隆抗体竞争，如本文公开的单克隆抗体的结合减少所示，则两种单克隆抗体结合于相同或密切相关的表位。
在一些实施方案中，用于确定单克隆抗体是否具有本文公开的单克隆抗体的特异性的一种备选方法为使本文公开的单克隆抗体与可溶性NaPi2b(与其通常具有反应性)一起预温育，并然后加入待测单克隆抗体，以确定待测单克隆抗体其结合NaPi2b的能力是否受到抑制。在一些实施方案中，如果待测单克隆抗体被抑制，则其与本文公开的单克隆抗体具有相同或功能等效的表位特异性。
例如通过测量NaPi2b介导的活性，并确定测试单克隆抗体是否能够调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰NaPi2b活性，也可进行本文公开的单克隆抗体的筛选。
在一些实施方案中，适合于缀合的NaPi2b抗体可通过众所周知的技术产生和纯化，例如WO 2009/097128、WO 2017/160754和US 16/136,706，其每一个通过参考以其全部并入本文。
HER2抗体
在一些实施方案中，适合于缀合的HER2抗体结合可溶性形式或膜结合(即当在细胞表面表达时)的人类HER2。在一些实施方案中，本公开提供结合HER2并且为人源化或完全人源的的单克隆抗体。在一些实施方案中，本公开提供特异性地结合HER2的单克隆抗体。这些抗体在本文统称为“HER2”抗体。
在一些实施方案中，适合于缀合的HER2抗体以≤1μM(例如≤100nM、≤10nM、≤1nM)的平衡解离常数(Kd或KD)与HER2表位结合。在一些实施方案中，本公开提供结合HER2并且为人源化或完全人源的的单克隆抗体。例如，本文提供的HER2抗体呈现≤约1nM-约1pM之间范围内的Kd。
在一些实施方案中，本文公开的HER2抗体用于调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰HER2的功能活性。在一些实施方案中，HER2的功能活性包括例如PI3K-Akt通路活性的调节。在一些实施方案中，HER2抗体通过部分或完全地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰PI3K-Akt通路活性而完全或部分地抑制HER2功能活性。PI3K-Akt通路活性使用任何领域公认的用于检测PI3K-Akt通路活性的方法进行评价，包括但不限于在存在和不存在本文公开的抗体或抗原结合片段的情况下检测磷酸化Akt的水平。
在一些实施方案中，与不存在与本文所述的HER2抗体结合的情况下HER2的功能活性水平相比较，当在存在HER2抗体的情况下HER2的功能活性水平降低至少80％，例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％时，认为HER2抗体完全地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰HER2功能活性。在一些实施方案中，与不存在与本文所述的HER2抗体结合的情况下HER2的活性水平相比较，当在存在HER2抗体的情况下HER2的活性水平降低少于95％，例如10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％时，认为HER2抗体部分地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰HER2功能活性。
在一些实施方案中，本文公开的示例性抗体包括XMT-1519抗体。该抗体对人类HER2显示特异性，并且其已经显示体外抑制HER2的功能活性。
HER2单克隆抗体XMT-1519包括重链(HC)、重链可变区(VH)、轻链(LC)和轻链可变区(VL)，如以下表II所示的氨基酸和相应核酸序列所示。每种抗体的可变重链区和可变轻链区在以下氨基酸序列中涂有阴影。重链和轻链的互补决定区(CDR)在以下所示的氨基酸序列中突出显示。
表II：HER2人源或人源化单克隆抗体XMT-1519序列
SEQ ID NO: 序列描述
16 全长人类HER2受体
17 XMT-1519重链可变区
18 XMT-1519 IgG1重链恒定区
19 XMT-1519重链氨基酸序列
20 XMT-1519 CDRH1
21 XMT-1519 CDRH2
22 XMT-1519 CDRH3
23 XMT-1519重链可变区核酸序列
24 XMT-1519轻链可变区
25 XMT-1519轻链恒定区
26 XMT-1519轻链氨基酸序列
27 XMT-1519 CDRL1
28 XMT-1519 CDRL2
29 XMT-1519 CDRL3
30 XMT-1519轻链可变区核酸序列
31 人类HER2受体的胞外结构域(ECD)
本文公开的抗体及其抗原结合片段特异性地结合于包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的全长人类HER2受体上的表位。
本文公开的抗体及其抗原结合片段特异性地结合于包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的人类HER2受体的胞外结构域(ECD)上的表位。
在一些实施方案中，本公开的抗体呈现出不同于本领域所述抗体的HER2结合特性。在一些实施方案中，本文公开的抗体与HER2的不同表位结合，因为它们彼此交叉阻断，但不阻断曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、Fab37或chA21与HER2结合。进一步地，与已知抗体相反，本文公开的抗体可有效地内化到HER2表达细胞中而不会促进细胞增殖。
在一些实施方案中，本文公开的抗体为与新表位结合和/或具有用于治疗用途的其他有利特性的全人类单克隆抗体。在一些实施方案中，示例性的特性包括但不限于对以高或低水平表达人类HER2的癌细胞的有利结合特性、对重组人类和食蟹猴HER2的特异性结合、与HER2结合后的有效内化、作为抗体药物缀合物(ADC)给予时高效杀伤表达高或低水平HER2的癌细胞、对HER2表达癌细胞的增殖没有显著激动作用和/或提供有效的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的HER2表达细胞的杀伤以及上述特性的任何组合。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性地结合于人类HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括人类HER2受体胞外结构域的残基452-531、SEQ IDNO:16的残基474-553或SEQ ID NO:31的残基452-531。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包括结合人类HER2受体结构区IV的N-末端的至少一部分，但不与结合于人类HER2受体表位4D5的抗体交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段不与曲妥珠单抗交叉竞争与人类HER2受体的结合，因为曲妥珠单抗已知结合人类HER2受体的表位4D5。如本文使用的术语人类HER2受体的表位4D5是指人类HER2受体胞外结构域的氨基酸残基529-627、SEQ ID NO:16的残基551-649或SEQ ID NO:31的残基529-627。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段还结合食蟹猴HER2受体上的至少一个表位。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性地结合于人类HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括人类HER2受体胞外结构域的残基452-500、SEQ IDNO:16的残基474-522或SEQ ID NO:31的残基452-500。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性地结合于人类HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括选自人类HER2受体胞外结构域的氨基酸残基E521、L525和R530中的至少一个氨基酸残基，例如SEQ ID NO:16的残基543、547和552，和SEQ ID NO:31的残基521、525、530。在一些实施方案中，本文公开的抗体包括特异性地结合于人类HER2受体胞外结构域的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括选自人类HER2受体胞外结构域的氨基酸残基E521、L525和R530的至少两个氨基酸残基。在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性地结合于人类HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位至少包括人类HER2受体胞外结构域的氨基酸残基E521、L525和R530。在一些实施方案中，任何或所有这些抗体或其抗原结合片段还结合食蟹猴HER2受体上的至少一个表位。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括结合于人类HER2受体结构区III的至少一部分和结构区IV的N-末端的至少一部分，但不与Fab37单克隆抗体或结合于人类HER2受体表位4D5的抗体交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段不与Fab37单克隆抗体和/或曲妥珠单抗交叉竞争与人类HER2受体的结合。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段还结合食蟹猴HER2受体上的至少一个表位。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性地结合于人类HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括人类HER2受体胞外结构域的残基520-531、SEQ IDNO:16的残基542-553或SEQ ID NO:31的残基520-531。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性地结合于人类HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括选自人类HER2受体胞外结构域的残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497和W499中的至少一个氨基酸残基，例如SEQ ID NO:16的残基475、478、495、498、517、518、519和521或SEQ ID NO:31的残基453、456、473、476、495、496、497和499。在一些实施方案中，本文公开的抗体包括特异性地结合于人类HER2受体胞外结构域的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括选自人类HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497和W499的至少两个氨基酸残基、至少三个氨基酸残基、至少四个氨基酸残基、至少五个氨基酸残基或至少六个氨基酸残基。在一些实施方案中，本文公开的抗体包括特异性地结合于人类HER2受体胞外结构域的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位至少包括人类HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497和W499。在一些实施方案中，任何或所有这些抗体或其抗原结合片段还结合食蟹猴HER2受体上的至少一个表位。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性地结合于人类HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括选自人类HER2受体胞外结构域的残基C453、H473、N476、R495、H497和W499的至少一个氨基酸残基，例如SEQ ID NO:16的残基475、495、498、517、519和521或SEQ ID NO:31的残基453、473、476、495、497和499。在一些实施方案中，本文公开的抗体包括特异性地结合于人类HER2受体胞外结构域的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括选自人类HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H473、N476、R495、H497和W499的至少两个氨基酸残基、至少三个氨基酸残基、至少四个氨基酸残基、至少五个氨基酸残基或至少六个氨基酸残基。在一些实施方案中，本文公开的抗体包括特异性地结合于人类HER2受体胞外结构域的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位至少包括人类HER2受体胞外结构域的氨基酸残基C453、H473、N476、R495、H497和W499。在一些实施方案中，任何或所有这些抗体或其抗原结合片段还结合食蟹猴HER2受体上的至少一个表位。
在一些实施方案中，这些抗体对人类HER2显示特异性，并且其已经显示调节，例如阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰PI3K-Akt通路，其通过降低磷酸化Akt水平来促进细胞存活。在一些实施方案中，这些抗体从HER2表达细胞的细胞表面，以与曲妥珠单抗或其生物类似物内化的速率相同或基本上相似的速率内化。在一些实施方案中，这些抗体和抗原结合片段的内化速率为时间0(内化4小时)时总表面结合的约50％。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含具有与选自SEQ ID NO:17的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的重链可变区和具有与选自SEQID NO:24的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:17的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:24的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:19的重链氨基酸序列和SEQID NO:26的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:20的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO:21的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO:22的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO:27的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:28的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO:29的CDRL3氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包括可变结构域序列中的一个或多个保守氨基酸取代，比如可变结构域序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个保守取代。在一些实施方案中，这些保守氨基酸取代处于CDR区，例如在所有CDR中累积进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个保守取代。在一些实施方案中，多达1、2、3或4个保守氨基酸取代可存在于每个CDR序列，例如SEQ ID NO:20-22和27-29中。
本领域的技术人员应当认识到，通过确定单克隆抗体是否阻止单克隆抗体XMT-1519与天然结合配偶体或已知与HER2缔合的其他分子结合，可在没有过度实验的情况下确定前者与后者是否具有相同特异性。在一些实施方案中，如果待测单克隆抗体与本文公开的单克隆抗体竞争，如本文公开的单克隆抗体的结合减少所示，则两种单克隆抗体结合于相同或密切相关的表位。
在一些实施方案中，用于确定单克隆抗体是否具有本文公开的单克隆抗体的特异性的一种备选方法为使本文公开的单克隆抗体与可溶性HER2(与其通常具有反应性)一起预温育，并然后加入待测单克隆抗体，以确定待测单克隆抗体其结合HER2的能力是否受到抑制。如果待测单克隆抗体被抑制，则很有可能其与本文公开的单克隆抗体具有相同或功能等效的表位特异性。
在一些实施方案中，例如通过测量HER2介导的PI3K-Akt通路活性，并确定测试单克隆抗体是否能够调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰PI3K-Akt通路活性，也可进行本文公开的单克隆抗体的筛选。在一些实施方案中，适合于缀合的HER2抗体可通过众所周知的技术产生和纯化，例如WO 2015/195917和PCT/US2018/019873，其每一个通过参考以其全部并入本文中。
缀合物
在一些实施方案中，本公开的缀合物包含D的一次或多次出现，其中D为STING激动剂，其中D的一次或多次出现可为相同或不同的。
在一些实施方案中，PBRM的一次或多次出现附着于接头-药物部分，其中PBRM的一次或多次出现可为相同或不同的。在一些实施方案中，包含D的一次或多次出现的一个或多个接头-药物部分连接于一个PBRM(例如抗体)。
在一些实施方案中，本公开的缀合物包含具有约40kDa或更大(例如约60kDa或更大、约80kDa或更大、约100kDa或更大、约120kDa或更大、约140kDa或更大、约160kDa或更大、约180kDa或更大、或约200kDa或更大、或约40-200kDa、约40-180kDa、约40-140kDa、约60-200kDa、约60-180kDa、约60-140kDa、约80-200kDa、约80-180kDa、约80-140kDa、约100-200kDa、约100-180kDa、或约100-140kDa)的分子量和具有巯基(即-SH或硫醇)基团的PBRM。
在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间形成的硫化物键总数(或附着点的总数)为10或更少(例如8、6、4或2)。
在一些实施方案中，对于与一个或多个接头-药物部分的缀合，PBRM具有约40kDa或更大(例如约60kDa或更大、约80kDa或更大、约100kDa或更大、约120kDa或更大、约140kDa或更大、约160kDa或更大、或约180kDa或更大、或约40-200kDa、约40-180kDa、约40-140kDa、约60-200kDa、约60-180kDa、约60-140kDa、约80-200kDa、约80-180kDa、约80-140kDa、约100-200kDa、约100-180kDa、或约100-140kDa)的分子量。
在一些实施方案中，对于与一个或多个接头-药物部分的缀合，PBRM具有约40kDa-约200kDa的分子量。在一些实施方案中，对于与一个或多个接头-药物部分的缀合，PBRM具有约40kDa-约80kDa的分子量。
在一些实施方案中，对于与一个或多个接头-药物部分的缀合，PBRM具有40kDa-200kDa的分子量。在一些实施方案中，对于与一个或多个接头-药物部分的缀合，PBRM具有40kDa-80kDa的分子量。
在一些实施方案中，在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如抗体片段，比如Fab。
在一些实施方案中，对于与一个或多个接头-药物部分的缀合，PBRM具有约60kDa-约120kDa的分子量。
在一些实施方案中，对于与一个或多个接头-药物部分的缀合，PBRM具有60kDa-120kDa的分子量。
在一些实施方案中，该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如骆驼科、Fab2、scFcFv等。
在一些实施方案中，对于与一个或多个接头-药物部分的缀合，PBRM具有约140kDa-约180kDa的分子量。
在一些实施方案中，对于与一个或多个接头-药物部分的缀合，PBRM具有140kDa-180kDa的分子量。
在一些实施方案中，在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如全长抗体，比如IgG、IgM。
在一些实施方案中，例如根据所公开的技术和方法，本文描述的靶向配体、接头和药物或前药片段可组装成本公开的缀合物或支架。以下通过非限制性实例描述本公开的治疗性和靶向缀合物以及用于产生它们的方法。
在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间形成的硫化物键总数(或附着点的总数)为8或更少。
在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间形成的硫化物键总数(或附着点的总数)为8。在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间形成的硫化物键总数(或连接点的总数)为6。在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间形成的硫化物键总数(或附着点的总数)为5。在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间形成的硫化物键总数(或附着点的总数)为4。在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间形成的硫化物键总数(或附着点的总数)为3。在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间形成的硫化物键总数(或附着点的总数)为2。
在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间的比率为约1:1-约1:8之间。在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间的比率为约1:1-约6:1之间。在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间的比率为约1:1-约4:1之间。在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间的比率为约2:1-约2:1之间。
在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间的比率为约6:1-约8:1之间。
在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间的比率为约8:1。
在一些实施方案中，接头-药物部分和PBRM之间的比率为约6:1。
在一些实施方案中，本公开还涉及包含至少两个部分的接头-药物部分，其中每个部分能够与PBRM中的硫醇基缀合以形成蛋白-接头-药物缀合物。
在一些实施方案中，PBRM的一个或多个硫醇基通过还原蛋白产生。然后，PBRM的一个或多个硫醇基可与一个或多个接头-药物部分反应，所述接头-药物部分能够缀合于具有接头-药物部分的PBRM的硫醇基。在一些实施方案中，连接于PBRM的至少两个部分为马来酰亚胺基团。
在一些实施方案中，通过用还原剂比如DTT(Cleland试剂，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)处理，抗体可被活化用于与接头-药物部分缀合。在一些实施方案中，全长单克隆抗体可用过量的TCEP还原以还原二硫键(例如在相应的亲本抗体中存在的半胱氨酸之间)以产生还原形式的抗体。新引入和未配对的半胱氨酸可保持可与接头-药物部分反应以形成本公开的抗体缀合物。在一些实施方案中，添加过量的接头-药物部分以影响缀合并形成抗体-药物缀合物，并且纯化缀合混合物以去除过量的接头-药物中间体和其他杂质。
在一些实施方案中，对于接头-药物部分的缀合，PBRM具有40kDa或更大(例如60kDa或更大、80kDa或更大、或100kDa或更大、120kDa或更大、140kDa或更大、160kDa或更大或180kDa或更大)的分子量。在一些实施方案中，每个接头-药物部分的PBRM的比率为约1:1-约1:8之间、约1:1-约1:6之间、约1:1-约1:5之间、约1:1-约1:4之间、约1:1-约1:3之间或约1:1-约1:2之间。
该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如全长抗体，比如IgG、IgM。
在一些实施方案中，对于与一个或多个接头-药物部分的缀合，PBRM具有60kDa-120kDa的分子量。在一些实施方案中，每个接头-药物部分的PBRM的比率为约1:1-约1:8之间、约1:1-约1:6之间、约1:1-约1:5之间、约1:1-约1:4之间、约1:1-约1:3或约1:1-约1:2之间。
该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如抗体片段，比如Fab2、scFcFv和骆驼科。
在一些实施方案中，对于与一个或多个接头-药物部分的缀合，PBRM具有40kDa-80kDa的分子量。在一些实施方案中，每个接头-药物部分的PBRM的比率为约1:1-约1:8、约1:1-约1:6之间、约1:1-约1:5之间、1:1-约1:4之间、约1:1-约1:3之间或约1:1-约1:2之间。
在一些实施方案中，在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如抗体片段，比如Fab。
在一些实施方案中，本公开的特征为可用于与基于蛋白的识别分子(PBRM)和STING激动剂部分(D)的任一种或两者缀合的支架。
在一些实施方案中，本文所述的载药支架(即没有连接于PBRM)各自一般地具有1的多分散指数(PDI)。
本文公开的缀合物和支架可通过广泛渗滤进行纯化(即去除任何起始材料)。如果必要，可通过尺寸排阻色谱法进行另外的纯化以去除任何聚集的缀合物。通常，所纯化的缀合物一般地含有如经SEC测定的少于5％(例如<2％w/w)的聚集的缀合物、如经RP-HPLC测定的少于0.5％(例如<0.1％w/w)的游离(未缀合)药物、如经SEC测定的少于1％的含有载药肽的支架和如经HIC-HPLC测定的少于2％(例如<1％w/w)的未缀合的PBRM。
在一些实施方案中，支架选自表A1中描述的支架。
在一些实施方案中，支架选自表A2中描述的支架。
在一些实施方案中，缀合物选自表B1中描述的缀合物。
在一些实施方案中，缀合物选自表B2中描述的缀合物。
表A1
Figure BDA0003975405560001021
Figure BDA0003975405560001031
Figure BDA0003975405560001041
Figure BDA0003975405560001051
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Figure BDA0003975405560001081
其中R14、R15、R16、R17、R18、R19、RC1、RC2、X3、X4、X6、X1、W1、Y1、Z1、X2、W2、Y2、Z2如本文定义。
表A2
Figure BDA0003975405560001082
Figure BDA0003975405560001091
Figure BDA0003975405560001101
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表B1
Figure BDA0003975405560001332
Figure BDA0003975405560001341
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Figure BDA0003975405560001621
Figure BDA0003975405560001631
其中d15、R14、R15、R16、R17、R18、R19、RC1、RC2、X3、X4、X6、X1、W1、Y1、Z1、X2、W2、Y2、Z2如本文定义。
表B2
Figure BDA0003975405560001632
Figure BDA0003975405560001641
Figure BDA0003975405560001651
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Figure BDA0003975405560001701
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Figure BDA0003975405560001731
Figure BDA0003975405560001741
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Figure BDA0003975405560001801
Figure BDA0003975405560001811
Figure BDA0003975405560001821
在一些实施方案中，缀合物为：
Figure BDA0003975405560001822
Figure BDA0003975405560001831
Figure BDA0003975405560001841
其中R14、R15、R16、R17、R18、R19、RC1、RC2、X3、X4、X6、X1、W1、Y1、Z1、X2、W2、Y2、Z2如本文定义。
在一些实施方案中，缀合物为：
Figure BDA0003975405560001842
Figure BDA0003975405560001851
其中d15、R14、R15、R16、R17、R18、R19、RC1、RC2、X3、X4、X6、X1、W1、Y1、Z1、X2、W2、Y2、Z2如本文定义。
在一些实施方案中，缀合物为：
Figure BDA0003975405560001852
Figure BDA0003975405560001861
Figure BDA0003975405560001871
Figure BDA0003975405560001881
其中d15如本文定义。
药物组合物
在一方面，本公开提供包含本文描述的缀合物和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
含有本公开缀合物的药物组合物可以通常已知的方式制造，例如通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制备、磨细、乳化、胶囊化、包封或冻干工艺。药物组合物可使用一种或多种药学上可接受的包含助于将缀合物加工成药学上可使用的制剂的赋形剂和/或助剂的载体以常规方式配制。当然，适当的配方取决于选择的给予途径。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液剂(当可溶于水时)或分散体和用于无菌可注射溶液剂或分散体的临时制备的无菌粉剂。对于静脉内给予，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须为无菌的，并且应当在存在易于可注射性的程度上为流体。其必须在制造和储存条件下为稳定的，并且必须保存防止微生物比如细菌和真菌的污染作用。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。例如，可通过使用包衣比如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持需要的粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫汞撒等。在许多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(比如甘露醇和山梨醇)以及氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来实现，例如单硬脂酸铝和明胶。
无菌可注射溶液剂可通过将所需量的缀合物与上述一种成分或成分的组合(根据需要)并入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备。通常，分散体为通过将缀合物并入到含有基本分散介质和来自上述那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉剂的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，从而从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外期望的成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的药学上可接受的载体。其可封装于明胶胶囊中或压制成片剂。出于口服治疗性给予的目的，缀合物可与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物还可使用用作漱口剂的流体载体制备，其中流体载体中的缀合物经口施用并漱口和咳出或吞咽。药学上相容的粘附剂和/或助剂材料可作为组合物的部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或类似性质的化合物：粘合剂比如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂比如淀粉或乳糖，崩解剂比如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂比如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂比如胶体二氧化硅；甜味剂比如蔗糖或糖精；或矫味剂比如薄荷、水杨酸甲酯或橙味矫味剂。
对于通过吸入给予，缀合物以气溶胶喷雾的形式从压力容器或分配器(其含有合适的喷射剂，例如气体比如二氧化碳)或雾化器中递送。
全身给予也可通过经粘膜或经皮方式给予。对于经粘膜或经皮给予，配方中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂为本领域通常已知的，并且包括例如用于经粘膜给予的洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给予可通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮给予，将缀合物配制成如本领域通常已知的软膏剂、药膏剂、凝胶剂或霜剂。
缀合物可用保护缀合物免受从体内快速清除的药学上可接受的载体制备，比如缓释剂，包括植入剂和微囊化递送系统。可使用可生物降解的、生物相容性聚合物，比如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种配方的方法为本领域技术人员显而易见的。
可为尤其有利的是以剂量单位形式配制口服或非肠道组合物，以便于给予和剂量均匀。如本文使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理离散单位；可计算含有预定量的缀合物的每个单位，以与需要的药物载体联合产生期望的治疗效果。本公开剂量单位形式的规格由缀合物的独特特性和待实现的特定治疗效果决定并直接取决于此。
在治疗应用中，根据本公开使用的药物组合物的剂量取决于药剂、接受患者的年龄、体重和临床状况，以及给予疗法的临床医师或执业医生的经验和判断，以及影响所选剂量的其他因素而变化。通常，剂量应足以导致疾病症状的减缓，和优选地消退，以及优选地导致疾病完全消退。
应当理解，药物组合物可与给予说明一起包含在容器、包装或分配器中。
使用方法
在一些实施方案中，本公开提供在需要它的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，包括给予受试者治疗有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开提供在需要它的受试者中治疗疾病或病症的方法，包括给予受试者治疗有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开提供在受试者中激活或增强STING活性的方法，包括给予受试者本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开涉及在需要它的受试者中治疗癌症的方法，包括给予受试者有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开提供用于在需要它的受试者中治疗或预防疾病或病症的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开提供用于在需要它的受试者中治疗疾病或病症的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开提供用于在受试者中治疗STING介导的疾病或病症的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的缀合物用于在需要它的受试者中治疗癌症的用途。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的缀合物在制造用于在需要它的受试者中治疗疾病或病症的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的缀合物在制造用于在需要它的受试者中治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的缀合物在制造用于在受试者中治疗STING介导的疾病或病症的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的缀合物在制造用于在需要它的受试者中治疗癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的缀合物用于在需要它的受试者中治疗或预防疾病或病症的用途。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的缀合物用于在需要它的受试者中治疗疾病或病症的用途。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的缀合物用于在受试者中治疗STING介导的疾病或病症的用途。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的缀合物用于在需要它的受试者中治疗癌症的用途。
在一些实施方案中，本文公开的缀合物给予受试者。
在一些实施方案中，本公开提供在需要它的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，包括给予受试者有效量的至少一种本公开缀合物；其中所述缀合物在生物降解后释放一种或多种治疗剂。
在一些实施方案中，本公开提供在需要它的受试者中治疗疾病或病症的方法，包括给予受试者有效量的至少一种本公开缀合物；其中所述缀合物在生物降解后释放一种或多种治疗剂。
在一些实施方案中，本公开缀合物为抗体-STING激动剂缀合物。在一些实施方案中，疾病或病症为癌症。
在一些实施方案中，本公开提供治疗或预防STING介导的疾病和病症的方法。示例性的疾病/病症包括但不限于癌症、感染性疾病(例如HIV、HBV、HCV、HPV和流感)和疫苗佐剂。
在一些实施方案中，STING通路可通过响应于激动性胞质核酸上调肿瘤内许多细胞类型中的IFNβ和干扰素(IFN)刺激基因(ISG)而诱导抗肿瘤免疫。
在一些实施方案中，本公开提供用作疫苗佐剂的本文公开的缀合物。因此，还提供包含本文公开的缀合物的免疫原性组合物或疫苗佐剂。
在一些实施方案中，提供包含本文公开的缀合物和一种或多种免疫刺激剂的组合物。
在一些实施方案中，本公开提供本文公开的缀合物在制造疫苗中的用途。在一些实施方案中，本公开提供本文公开的缀合物用于制造用于治疗或预防疾病的免疫原性组合物或疫苗组合物(包含抗原或抗原组合物)的用途。
在一些实施方案中，本公开涉及治疗或预防疾病的方法，包括给予患有或易感疾病的人类受试者免疫原性组合物或疫苗组合物，其包含抗原或抗原组合物和本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，疾病或病症为炎症、自身免疫性疾病、过敏性疾病、感染性疾病、HIV感染、AIDS感染、HCV感染、流感或人类乳头瘤病毒(HPV)感染。疾病的范围易于被本领域技术人员识别。在一些实施方案中，这些疾病如PCT申请第PCT/US2020/044538号中所述，其内容通过参考以其全部并入本文。
如本文使用的术语“癌症”、“瘤”和“肿瘤”可互换使用，并且以单数或复数形式，其是指已经历使其对宿主生物体为病理性的恶性转化的细胞。通过确立的技术，特别是组织学检查，可易于区分原发性癌细胞与非癌细胞。如本文使用的癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，而且包括源于癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞以及源于癌细胞的体外培养物和细胞系。当指涉一种通常表现为实体瘤的癌症类型时，“临床可检测的”肿瘤为基于肿瘤块可检测的肿瘤；例如通过程序比如计算机断层(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、X-射线、超声或身体检查触诊，和/或其由于可从患者获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达而可检测的肿瘤。肿瘤可为造血(或血液(hematologic)或血液学(hematological)或血液相关)癌症，例如源于血细胞或免疫细胞的癌症，其可称为“液体瘤”。基于血液肿瘤的临床病况的具体实例包括白血病，比如慢性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病；浆细胞恶性肿瘤，比如多发性骨髓瘤、MGUS和华氏巨球蛋白血症；淋巴瘤，比如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤；等等。
在一些实施方案中，疾病或病症为癌前综合征。
本公开的缀合物可用于治疗身体任何组织和器官的炎症，包括肌肉骨骼炎症、血管炎症、神经炎症、消化系统炎症、眼部炎症、生殖系统炎症和其他炎症。疾病的范围易于被本领域技术人员识别。在一些实施方案中，这些疾病如PCT申请第PCT/US2020/044538号中描述，其内容通过参考以其全部并入本文。
其中本公开的缀合物可能具有潜在有益抗肿瘤作用的癌症疾病和病况的实例包括但不限于肺部、骨骼、胰腺、皮肤、头部、颈部、子宫癌、卵巢、胃部、结肠、乳腺、食管、胆道、小肠、肠道、内分泌系统、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、尿道、前列腺、阴茎、睾丸、输尿管或尿路上皮、膀胱、肾脏或肝脏的癌症；直肠癌；肛门区癌；输卵管、子宫内膜、子宫颈、阴道、外阴、肾盂、肾细胞的癌；软组织肉瘤；粘液瘤；横纹肌瘤；纤维瘤；脂肪瘤；畸胎瘤；胆管癌；肝母细胞瘤；血管肉瘤；血管瘤；肝癌；纤维肉瘤；软骨肉瘤；骨髓瘤；慢性或急性白血病；淋巴细胞性淋巴瘤；原发性CNS淋巴瘤；CNS瘤；脊髓轴肿瘤；鳞状细胞癌；滑膜肉瘤；恶性胸膜间皮瘤；脑干胶质瘤；垂体腺瘤；支气管腺瘤；软骨瘤性错构瘤；间皮瘤；霍奇金病或者一种或多种上述癌症的组合。
在一些实施方案中，疾病或病症为实体瘤。一方面，肿瘤选自头颈癌、胃癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、食管癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、结直肠癌(CRC)、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、尿路上皮癌、子宫颈癌、膀胱癌、乳头状甲状腺癌、乳头状肾细胞癌、胆管癌、涎腺导管癌、肾癌、子宫颈癌和胰腺癌。在一些实施方案中，人类患有液体瘤，比如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、多发性骨髓瘤、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、急性髓细胞性白血病和慢性髓性白血病。在一些实施方案中，疾病或病症为皮肤癌(例如非黑色素瘤皮肤癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌)或光化性角化病。除用于清除浅表皮肤癌的场效应之外，本公开的缀合物还可防止治疗对象继发性皮肤癌和恶变前光化性角化病的发展。
在一些实施方案中，疾病或病症为膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、食管癌、胆道癌、尿路上皮癌、头颈部鳞癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌或胰腺癌。在一些实施方案中，疾病或病症为乳腺癌、胃癌、结直肠癌、结肠癌、食管癌、胆道癌、子宫内膜癌、尿路上皮癌或非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，乳腺癌为HER2扩增/过度表达的乳腺癌或HER2低表达乳腺癌。
在一些实施方案中，子宫内膜癌为浆液性子宫内膜癌。
本公开的缀合物还可用于治疗一种或多种困扰哺乳动物的疾病，其特征为与新血管形成和/或血管通透性、纤维化病症和代谢病症相关的病症区域中的细胞增殖。疾病的范围易于被本领域技术人员识别。在一些实施方案中，这些疾病如PCT申请第PCT/US2020/044538号中所述，其内容通过参考以其全部并入本文。
在一些实施方案中，疾病或病症为神经退行性疾病。示例性的神经退行性疾病包括但不限于多发性硬化、亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)。疾病的范围易于被本领域技术人员识别。在一些实施方案中，这些疾病如美国临时申请第62/882,081、62/944,643和62/982,935号中所述，其内容通过参考以其全部并入本文。
在一些实施方案中，疾病或病症为感染性疾病，疾病为由源于细菌、源于DNA病毒家族或RNA病毒家族的病原体感染引发或同时发生的任何疾病。疾病的范围易于被本领域技术人员识别。在一些实施方案中，这些疾病如PCT申请第PCT/US2020/044538号中所述，其内容通过参考以其全部并入本文。
本公开的缀合物可单独或与其他治疗剂组合使用。作为免疫反应的调节剂，本公开的缀合物还可以单一疗法或与另一种治疗剂组合用于治疗其中调节STING为有益的疾病和病况。因此，本公开的组合疗法包括给予本公开的缀合物或其药学上可接受的盐和至少一种其他治疗活性剂。在一些实施方案中，本公开的组合疗法包括给予至少一种本公开的缀合物或其药学上可接受的盐和至少一种其他治疗剂。本公开的(多种)缀合物及其药学上可接受的盐和(多种)其他治疗剂可以单一药物组合物一起或分开给予，并且当分开给予时，这可同时或以任何顺序依序发生。本公开的(多种)缀合物及其药学上可接受的盐和(多种)其他治疗剂的量以及给予的相对时机将被选择以实现期望的组合治疗效果。因此，另一方面，提供包含本公开的缀合物或其药学上可接受的盐与一种或多种其他治疗剂一起的组合。
本公开的缀合物及其药学上可接受的盐可与一种或多种可用于预防或治疗过敏性疾病、炎症性疾病或自身免疫性疾病的其他治疗剂组合使用，例如抗原免疫疗法、抗组胺药、类固醇类、NSAID、支气管扩张剂、甲氨蝶呤、白三烯调节剂、单克隆抗体疗法、受体疗法或抗原非特异性免疫疗法。
本公开的缀合物及其药学上可接受的盐可与放射疗法和/或手术和/或至少一种可用于治疗癌症和癌前综合征的其他治疗剂组合使用。任何抗瘤剂、抗微管、抗有丝分裂剂、激素、激素类似物信号转导通路抑制剂、蛋白酪氨酸激酶或抗血管生成治疗剂均可用于组合中。其他治疗剂的范围易于被本领域技术人员识别。在一些实施方案中，其他治疗剂如PCT申请第PCT/US2020/044538号中所述，其内容通过参考以其全部并入本文。
用于免疫治疗方案的药剂、用于促凋亡方案的治疗剂或细胞周期信号传导抑制剂也可与本公开的缀合物组合使用。
在一些实施方案中，本公开的组合包含本公开的缀合物或其盐，特别是药学上可接受的盐，和至少一种抗瘤剂、抗微管、抗有丝分裂剂、激素、激素类似物信号转导通路抑制剂、蛋白酪氨酸激酶或抗血管生成治疗剂或其组合。
用于与本公开的缀合物或其药学上可接受的盐组合或共给予的其他治疗剂(例如抗瘤剂)的另外实例为免疫调节剂。
在一些实施方案中，本公开的组合包含本公开的缀合物或其盐，特别是药学上可接受的盐，和至少一种免疫调节剂或至少一种免疫刺激剂。
如本文使用的“免疫调节剂”是指包括影响免疫系统的单克隆抗体的任何物质。免疫调节剂可用作用于治疗癌症的抗瘤剂。例如，免疫调节剂包括但不限于抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体。其他免疫调节剂包括但不限于ICOS抗体、OX-40抗体、PD-L1抗体、LAG3抗体、TIM-3抗体、41BB抗体和GITR抗体。
用于与本公开的缀合物组合或共给予的其他治疗剂(抗瘤剂)的另外实例为抗PD-Ll剂(即抗PD-Ll抗体)或PD-1拮抗剂。
因此，在一些实施方案中，提供治疗需要它的人的方法，包括给予本公开的缀合物或其盐和至少一种免疫调节剂。在一些实施方案中，免疫调节剂选自ICOS激动剂抗体、OX-40抗体和PD-1抗体。在一些实施方案中，人患有癌症。本文还提供本公开的缀合物或其盐与至少一种免疫调节剂的组合用于治疗需要它的人的用途。
如本文使用的“免疫刺激剂”是指可刺激免疫系统的任何药剂。如本文使用的免疫刺激剂包括但不限于疫苗佐剂(比如Toll样受体激动剂)、T细胞检查点阻断剂(比如针对PD-1和CTL4的mAb)和T细胞检查点激动剂(比如针对OX-40和ICOS的激动剂mAb)。如本文使用的“免疫刺激剂”是指可刺激免疫系统的任何药剂。如本文使用的免疫刺激剂包括但不限于疫苗佐剂。
如本文使用的术语“Toll样受体”(或“TLR”)是指感知微生物产物和/或启动适应性免疫反应的蛋白Toll样受体家族的成员或其片段。在一些实施方案中，TLR激活树突状细胞(DC)。Toll样受体(TLR)为模式识别受体家族，最初鉴定为识别微生物病原体的先天免疫系统的感应器。TLR识别微生物中的不同结构，通常称为“PAMP”(病原体相关分子模式)。与TLR结合的配体引发细胞内信号传导通路级联，诱导参与炎症和免疫的因子的产生。
在一些实施方案中，用于与本公开缀合物组合的免疫刺激剂为TLR4激动剂。
因此，在一些实施方案中，提供治疗需要它的人的方法，包括给予本公开的缀合物或其盐和至少一种免疫刺激剂。在一些实施方案中，免疫刺激剂为TLR4激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激剂为AGP。在一些实施方案中，人患有癌症。本文还提供本公开的缀合物或其盐与至少一种免疫刺激剂的组合用于治疗需要它的人的用途。
除以上描述的免疫刺激剂之外，本公开的组合物可进一步包含其他治疗剂，后者由于其佐剂性质，可用于刺激免疫系统以对灭活肿瘤细胞上存在的癌症抗原作出反应。这种佐剂包括但不限于脂质、脂质体、诱导先天免疫的灭活细菌(例如灭活或减毒的单核细胞增生李斯特菌)、经(NOD)样受体(NLR)介导先天免疫激活的组合物、基于维甲酸诱导基因(RIG)的I样受体(RLR)和/或C型凝集素受体(CLR)。
由于其佐剂品质，TLR激动剂可与其他疫苗、佐剂和/或免疫调节剂组合使用，并且可以各种组合使用。在一些实施方案中，本公开的缀合物与STING结合并诱导STING依赖性TBKI激活并且如本文所述表达和分泌一种或多种刺激DC诱导、募集和/或成熟的细胞因子的灭活肿瘤细胞可与一种或多种TLR激动剂一起给予以用于治疗目的。
用于与本公开的缀合物组合或共给予的其他活性成分(抗瘤剂)为IDO抑制剂。
在一些实施方案中，本公开的缀合物可与至少一种其他治疗剂组合用于预防或治疗感染性疾病细菌感染、病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、TB感染、衣原体、疟原虫感染、葡萄球菌感染、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化、系统性红斑狼疮和相关狼疮病症、银屑病或干燥综合征。
本公开的缀合物可通过任何合适的给予途径给予，包括全身给予和局部给予两者。全身给予包括口服给予、非肠道给予、经皮给予、直肠给予和通过吸入给予。非肠道给予是指除肠内、经皮或通过吸入以外的给予途径，并且一般地为通过注射或输注。非肠道给予包括静脉内、肌内和皮下注射或输注。吸入是指无论是通过口腔还是通过鼻部通道吸入而给予到患者的肺部中。局部给予包括施用于皮肤。
除以上描述的适合于治疗肿瘤的给予途径之外，药物组合物还可适于通过瘤内或瘤周注射给予。预计将本公开的缀合物直接瘤内或瘤周注射到单个实体瘤中或邻近单个实体瘤以引发免疫反应，从而可攻击和破坏遍及全身的癌细胞，显著减少并且在一些情况下永久消除患病受试者的肿瘤。以这种方式激活免疫系统以杀伤远端部位的肿瘤通常称为远隔效应，并已用多种治疗方式在动物中得到证实。局部或瘤内或瘤周给予的另一优势为能够以低得多的剂量实现等效效力，从而最小化或消除在高得多的全身剂量下可能观察到的不良事件。
本公开的缀合物可给予一次或根据给药方案给予，其中在给定时间段内以不同时间间隔给予多个剂量。例如，剂量可每天给予1、2、3或4次。可给予剂量直至实现期望的治疗效果或无限期地给予以保持期望的治疗效果。本公开缀合物的合适给药方案取决于该缀合物的药代动力学特性，比如吸收、分布和半衰期，这可由技术人员确定。另外，对于本公开的缀合物，合适的给药方案，包括给予这种方案的持续时间，取决于所治疗的疾病或病症、所治疗疾病或病症的严重性、所治疗患者的年龄和身体状况、待治疗患者的病史、同时疗法的性质、期望的治疗效果以及处于技术人员的知识和专长范围内的类似因素。这样的技术人员应当进一步理解，合适的给药方案可能需要鉴于个体患者对给药方案的反应或随着个体患者需求的变化随着时间的推移而调整。总每日剂量在1mg-2000mg的范围内，优选地，总每日剂量在1mg-250mg的范围内。
为用于疗法，本公开的缀合物在给予患者之前通常(但不一定必须)配制成药物组合物。因此，本公开还涉及包含本公开的缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本公开的药物组合物可以散装形式或以单位剂型制备和包装。对于口服施用，例如可给予一个或多个片剂或胶囊剂。一剂药物组合物至少含有治疗有效量的本公开缀合物(即本公开的缀合物或其盐，特别是药学上可接受的盐)。当以单位剂型制备时，药物组合物可含有1mg-1000mg本公开的缀合物。
如本文提供的，包含1mg-1000mg本公开缀合物的单位剂型(药物组合物)可每天给予1、2、3或4次，优选地每天1、2或3次，并且更优选地，每天1或2次，以实现对STING介导的疾病或病症的治疗。
本公开的药物组合物一般地含有一种本公开的缀合物。然而，在某些实施方案中，本公开的药物组合物含有多于一种本公开的缀合物。另外，本公开的药物组合物可任选地进一步包含一种或多种另外的治疗剂(例如药学上有活性的缀合物)。
如本文使用的“药学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的参与赋予药物组合物的形式或稠度的材料、组成或媒介物。每种赋形剂当混合时必须与药物组合物的其他成分相容，使得当给予患者时避免会显著降低本公开缀合物效力的相互作用和会导致药学上不可接受的药物组合物的相互作用。另外，每种赋形剂当然必须具有足够高的纯度以使其药学上可接受。
本公开的缀合物和药学上可接受的一种或多种赋形剂一般地配制成适于通过期望的给予途径给予患者的剂型。常规剂型包括适于以下的那些：(1)口服给予，比如片剂、胶囊剂、囊片、丸剂、锭剂、粉剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、香囊和扁囊剂；(2)非肠道给予，比如无菌溶液剂、混悬剂和用于重构的粉剂；(3)经皮给予，比如经皮贴剂；(4)直肠给予，比如栓剂；(5)吸入，比如气溶胶和溶液剂；和(6)局部给予，比如霜剂、软膏剂、洗剂、溶液剂、糊剂、喷雾剂、泡沫剂和凝胶剂。
合适的药学上可接受的赋形剂将根据选择的特定剂型而变化。另外，可选择合适的药学上可接受的赋形剂以用于其可用于组合物的特定功能。例如，可选择某些药学上可接受的赋形剂以便其能够促进均匀剂型的产生。可选择某些药学上可接受的赋形剂以便其能够促进稳定剂型的产生。可选择某些药学上可接受的赋形剂以便其能够促进一旦给予患者将本公开的一种或多种缀合物从身体的一个器官或部分运载或转运到身体的另一器官或部分。可选择某些药学上可接受的赋形剂以便其能够增强患者依从性。
合适的药学上可接受的赋形剂包括以下类型的赋形剂：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、制粒剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、助溶剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、矫味剂、掩味剂、着色剂、抗结块剂、保湿剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。技术人员将意识到，某些药学上可接受的赋形剂可用于多于一种功能并且可用于备选功能，这取决于配方中存在多少赋形剂以及配方中存在哪些其他成分。
技术人员拥有本领域的知识和技能以使其能够选择用于本公开的适当量的合适的药学上可接受的赋形剂。另外，有许多资源可供技术人员使用，这些资源描述药学上可接受的赋形剂并可用于选择合适的药学上可接受的赋形剂。实例包括Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company)、The Handbook ofPharmaceutical Additives(Gower Publishing Limited)以及The Handbook ofPharmaceutical Excipients(the American Pharmaceutical Association and thePharmaceutical Press)。
一方面，本公开涉及固体口服剂型，比如包含有效量的本公开缀合物和稀释剂或填充剂的片剂或胶囊剂。口服固体剂型可进一步包含崩解剂或润滑剂。
应当理解，本公开的缀合物还可与疫苗一起配制为佐剂以调节其活性。这种组合物可含有任选地与一种或多种具有佐剂活性的其他组分一起的抗体(多种抗体)或抗体片段或抗原组分。
本公开的某些化合物和/或缀合物可为强有效的免疫调节剂，并且因此在其处理时应谨慎行事。已经描述了本公开，以下实施例通过说明而非限制的方式提供。
在一些实施方案中，缀合物为以下式BB
Figure BDA0003975405560002011
其中缀合物包含XMT-1519抗体，XMT-1519抗体包含含有氨基酸序列FTFSSYSMN(SEQ ID NO:20)的可变重链互补决定区1(CDRH1)、含有氨基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:21)的可变重链互补决定区2(CDRH2)、含有氨基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO:22)的可变重链互补决定区3(CDRH3)和含有氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO:27)的可变轻链互补决定区1(CDRL1)、含有氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO:28)的可变轻链互补决定区2(CDRL2)和含有氨基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO:29)的可变轻链互补决定区3(CDRL3)，并且d15为约8。
在一些实施方案中，缀合物为以下式CC
Figure BDA0003975405560002021
其中缀合物包含XMT-1535抗体，XMT-1535抗体包含含有氨基酸序列GYTFTGYNIH(SEQ ID NO:5)的CDRH1、含有氨基酸序列AIYPGNGDTSYKQKFRG(SEQ ID NO:6)的CDRH2、含有氨基酸序列GETARATFAY(SEQ ID NO:7)的CDRH3、含有氨基酸序列SASQDIGNFLN(SEQ ID NO:8)的CDRL1、含有氨基酸序列YTSSLYS(SEQ ID NO:9)的CDRL2、含有氨基酸序列QQYSKLPLT(SEQ ID NO:10)的CDRL3，并且d15为约8。
在一些实施方案中，式BB或式CC的缀合物用于在需要它的受试者中治疗疾病或病症，包括给予受试者治疗有效量的式BB或式CC的缀合物。在一些实施方案中，疾病或病症为癌症。
在一些实施方案中，对于式BB的缀合物，癌症为乳腺癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、胆道癌、子宫内膜癌、尿路上皮癌或非小细胞肺癌。在一些实施方案中，乳腺癌为HER2扩增/过度表达的乳腺癌或HER2低表达乳腺癌。在一些实施方案中，子宫内膜癌为浆液性子宫内膜癌。
在一些实施方案中，对于式CC的缀合物，用于在需要它的受试者中治疗NaPi2b表达肿瘤。在一些实施方案中，NaPi2b表达肿瘤为卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳头状甲状腺癌、子宫内膜癌、胆管癌、乳头状肾细胞癌、透明细胞肾癌、乳腺癌、肾癌、子宫颈癌或涎腺导管癌。
在一些实施方案中，受试者患有上皮性卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、铂抗性卵巢癌、非鳞状NSCLC癌、进行性、放射性碘难治性、局部区域复发性或转移性疾病乳头状甲状腺癌或上皮性子宫内膜癌。
在一些实施方案中，式BB的缀合物可用于在需要它的受试者中治疗疾病或病症，包括给予受试者治疗有效量的与一种或多种治疗剂组合的式BB缀合物。在一些实施方案中，治疗剂为免疫调节剂或免疫刺激剂。在一些实施方案中，免疫调节剂为抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、ICOS抗体、OX-40抗体、PD-L1抗体、LAG3抗体、TIM-3抗体、41BB抗体或GITR抗体。
在一些实施方案中，式BB的缀合物可用于在需要它的受试者中治疗疾病或病症，包括给予受试者治疗有效量的与一种或多种与不同于HER2抗体XMT-1519的HER2表位结合的HER2抗体组合的式BB缀合物。在一些实施方案中，与不同于HER2抗体XMT-1519的HER2结合的HER2抗体为曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、Fab37或chA21。
实施例
以下实施例说明本公开。这些实施例并非旨在限制本公开的范围，而是为技术人员提供指导以制备和使用本公开的化合物、组合物和方法。尽管描述了本公开的特定实施方案，但技术人员应当意识到，可进行各种变化和修改而不背离本公开的精神和范围。
应当理解，本公开的某些化合物可为强有效的免疫调节剂，并且因此在其处理时应谨慎行事。
本文描述的反应适用于产生如本文定义的具有各种不同取代基(例如R1、R2等)的本公开化合物。技术人员应当意识到，如果特定取代基与本文描述的合成方法不相容，则可用对反应条件稳定的合适的保护基来保护取代基。合适的保护基以及使用这种合适的保护基保护和去保护不同取代基的方法为本领域技术人员众所周知的；其实例可见于T.W.Greene‘Protective Groups in Organic Synthesis’(第4版,J.Wiley and Sons,2006)中。除非另外说明，否则所有起始材料均获自商业供应商且无需进一步纯化即可使用。
缩写
以下缩写用于以下反应方案和合成实施例。该列表并不意指为本申请中使用的缩写的包括一切的列表，因为有机合成领域的技术人员易于理解的另外标准缩写也可用于合成方案和实施例中。
ACN 乙腈
CDI 1,1’-羰基二咪唑
DCC N,N’-二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMA 二甲基乙酰胺
DMF 二甲基甲酰胺
DMPA 二羟甲基丙酸
ESI 电喷雾电离
HATU 2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐
HIC 疏水相互作用色谱
HOBt 羟基苯并三唑
HPLC 高压液相色谱
MeOH 甲醇
SEC 尺寸排阻色谱
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
PyBOP (苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
一般信息
除非另外说明，否则所有试剂均从相关供应商处购买。
diABZI STING激动剂如Ramanjulu等人(Nature,564(7736):439-443(2018))所述制备。
XMT-1535(抗NaPi2b抗体)在2017年3月13日递交的共同未决申请US 15/457,574中公开，其全部内容通过参考结合至本文中。XMT-1519(抗Her2抗体)在2017年1月31日发布的US 9,555,112和2017年8月22日发布的US 9,738,720中公开，其全部内容通过参考结合至本文中。
XMT-1535 AF-HPA ADC,DAR 5.9和利妥昔单抗AF-HPA ADC,DAR 5.5如2020年1月9日递交的共同未决申请US 62/958,916和2020年6月18日提交的US 63/040,735所述制备，其全部内容通过参考结合至本文中。
HPLC纯化在Phenomenex Gemini 5μm C18
Figure BDA0003975405560002051
250x10mm半制备型柱上进行。
适用时，缀合物的药物含量用分光光度法测定，否则用RP-HPLC或LC/MS进行药物含量的定量测定。
抗体-药物缀合物的蛋白含量用分光光度法或通过ELISA测定。
根据需要，抗体-药物缀合物、载药支架或抗体支架通过广泛渗滤、CHT色谱或HIC纯化(即去除残余未反应的药物、未缀合的抗体、酶或起始材料)。如果必要，通过SEC或HIC进行另外的纯化以去除聚集的抗体-药物缀合物。通常，经纯化的抗体-药物缀合物含有如通过SEC测定的<5％(w/w)(例如<2％(w/w))聚集的抗体-药物缀合物、如通过RP-HPLC和/或LC-MS/MS测定的0.5％(w/w)(例如<0.1％(w/w))游离(未缀合)的药物、如通过SEC和/或RP-HPLC测定的1％(w/w)游离的药物缀合物和如通过HIC-HPLC和/或RP-HPLC测定的<10％(w/w)(例如<1％(w/w))未缀合的抗体或抗体片段。使用文献中描述的程序制备还原或部分还原的抗体，参见例如Francisco等人,Blood 102(4):1458-1465(2003)。总药物(缀合和未缀合的)浓度通过UV-Vis分光光度法或RP-HPLC测定。
为测定生物样品中游离药物的浓度，用乙腈处理酸化样品。提取游离药物，并分析乙腈上清液。为测定非临床样品中缀合的STING激动剂的浓度，样品使用抗人Fc抗体磁珠进行免疫捕获，然后进行彻底碱性水解。含有释放药物的乙腈上清液通过LC-MS/MS进行分析。使用MSD ECL免疫测定测量非临床样品中的总抗体。
使用C-4柱和乙腈梯度通过RP-HPLC进行游离药物的分析。积分串联质谱上的MRM峰面积并与奥瑞他汀F(AF)和奥瑞他汀F羟丙基酰胺(AF-HPA)标准进行比较。该方法对血浆和组织匀浆中的AF-HPA和AF进行定量，并且在0.1-150ng/mL的浓度范围内呈线性。在相同条件下测量用NaOH水解之后释放的总药物的动态范围为1ng/mL-5000ng/mL。总抗体标准范围为0.009μg/mL-20μg/mL。
药物-抗体比率(DAR)为通过测量缀合物的吸收来确定。使用抗体的适当摩尔消光系数和STING激动剂有效负载计算DAR值。
使用数字卡尺每周两次测量肿瘤，并且肿瘤体积使用以下公式计算：肿瘤体积(mm3)＝(宽度2x长度)/2。第一周每天并且之后每周两次记录体重。动物保持在研究中，直至单个肿瘤体积达到≥1000mm3、≥1500mm3或如所显示的那样。体重变化的百分比使用以下公式计算：体重变化(％)＝((体重研究第X天-体重研究第1天)/体重研究第1天)*100。肿瘤体积报告为平均值±平均值的标准误差(SEM)。肿瘤生长抑制(％TGI)定义为治疗和对照组之间平均肿瘤体积(MTV)的百分比差异。肿瘤大小贯穿每次效力研究测量，以确定肿瘤生长抑制(TGI)。肿瘤消退百分比使用以下公式计算：消退％＝(1-(平均肿瘤体积最终)/(平均肿瘤体积第1天))*100。部分缓解(PR)定义为连续3次测量的肿瘤体积为第1天体积的50％或以下，并且这3次测量中至少一次等于或大于13.5mm3。完全缓解(CR)定义为连续3次测量的肿瘤体积小于13.5mm3。在研究结束时，无瘤存活者(TFS)分类为具有CR。
实施例1：XMT-1519缀合物8的合成
Figure BDA0003975405560002071
部分A：向化合物1(如WO2017175147A1所述制备,0.5g,0.64mmol)、Boc-L-丙氨酸(0.242g,1.28mmol)、DMAP(7.8mg,0.064mmol)和DCC(0.264g,1.28mmol)的混合物中加入DMF(2mL)。将混悬液在室温下搅拌过夜，然后浓缩溶液，并将残余物在硅胶上纯化(0-40％MeOH在DCM中)，得到为浅黄色固体的化合物2(0.52g,85％产率)。C46H58N13O10[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：952.4；实测值952.4。
部分B：向化合物2(0.52g,0.55mmol)在二噁烷(10mL)中的混悬液中加入4N HCl(2mL,8.19mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h，然后浓缩混悬液，并且无需进一步纯化即可用于下一步。得到为白色固体的化合物3。C41H50N13O8[M+H]的ESI-MS m/z计算值：852.4；实测值852.3。
部分C：向化合物3(0.586g,0.661mmol)在DMF(5mL)中的溶液中先后加入2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十四烷-14-酸(0.202g,0.727mmol)和DIPEA(0.230mL,1.322mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5min，然后加入HATU(0.376g,0.992mmol)和HOBt(0.153g,0.992mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h。加入另一等分的DIPEA(0.460mL,2.6mmol)。又一1小时之后，将反应混合物浓缩为油状物。残余物经硅胶(0-40％ MeOH在DCM中)纯化，得到为白色固体的化合物4(0.9g,>95％产率)。C53H71N14O13[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1111.5；实测值1111.5。
部分D：向化合物4(0.9g,0.810mmol)在二噁烷(10mL)中的混悬液中加入4N HCl(3.04mL,12.15mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1.5h，浓缩混悬液，得到为无色固体的化合物5(0.56g,66.0％产率)。C48H63N14O11[M+H]+的ESI-MS计算值：1011.5；实测值1011.4。
部分E：向支架6(100mg,0.072mmol,如PCT/US2018/06719所述制备)和化合物5(72.7mg,0.072mmol)在DMF(2mL)中的溶液中加入PyBOP(37.5mg,0.072mmol)和DIPEA(0.075mL,0.431mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h，然后浓缩溶液，并通过制备型HPLC(0-80％ CAN在水中)纯化残余物，得到化合物7(109mg,64％产率)。C103H156N24O41[M+2H]2+的ESI-MS m/z计算值：1192.5；实测值1192.5。
部分F：向XMT-1519(10mg,0.069μmol)在50mM HEPES、1mM EDTA、pH 7缓冲液中的溶液中加入TCEP(0.059mg,0.207μmol)，并将混合物在37℃下振摇90分钟。向还原的抗体中加入化合物7(0.987mg,0.414μmol在200μL DMA中)。将所得混合物在37℃下振摇60分钟。反应用半胱氨酸(15当量,0.125mg,1.035μmol，在125μL的50mM HEPES、1mM EDTA,pH 7中)淬灭并在室温下旋转1h。所得缀合物8通过超滤或CHT色谱纯化。抗体-药物缀合物8-1和8-2的详细信息如下所示。如所描述的那样制备缀合物8-1和8-2，除8-2的合成中使用TCEP:mAb的比率高于8-1(4:1相对于3:1)以及化合物7与mAb的比率更高(8:1 vs 6:1)之外。
缀合物 DAR
8-1 6.1
8-2 6.8
实施例1a：曲妥珠单抗缀合物8a的合成
Figure BDA0003975405560002091
缀合物8a如实施例1所述制备和表征，除使用曲妥珠单抗替代XMT-1519之外。抗体-药物缀合物8a-1、8a-2和8a-3的详细信息如下所示。
缀合物 DAR
8a-1 6.0
8a-2 7.0
8a-3 8.4
实施例1b：XMT-1535缀合物8b,DAR 5.7的合成
Figure BDA0003975405560002101
缀合物8b如实施例1所述制备和表征，除使用XMT-1535替代XMT-1519之外。抗体-药物缀合物8b-1、8b-2和8b-3的详细信息如下所示。
缀合物 DAR
8b-1 5.7
8b-2 6.6
8b-3 6.4
实施例1c：帕利珠单抗缀合物8c的合成
Figure BDA0003975405560002111
缀合物8c如实施例1所述制备和表征，除使用帕利珠单抗替代XMT-1519之外。抗体-药物缀合物8c-1和8c-2的详细信息如下所示。
缀合物 DAR
8b-1 7.5
8b-2 5.8
实施例1d：帕利珠单抗mIgG2a缀合物8d的合成
Figure BDA0003975405560002112
缀合物8d如实施例1所述制备和表征，除使用帕利珠单抗mIgG2a替代XMT-1519之外。抗体-药物缀合物8d-1、8d-2和8d-3的详细信息如下所示。
Figure BDA0003975405560002113
Figure BDA0003975405560002121
实施例1e：XMT-1535 hIgG1-mIgG2a缀合物8e,DAR 7.0的合成
Figure BDA0003975405560002122
缀合物8e如实施例1所述制备和表征，除使用XMT-1535mIgG2a替代XMT-1519之外。纯化的缀合物8e具有7.0的STING激动剂与XMT-1535 hIgG1-mIgG2a的比率。
实施例1f：XMT-1535 AAG缀合物8f,DAR 7.4的合成
Figure BDA0003975405560002123
缀合物8f如实施例1所述制备和表征，除使用XMT-1535 AAG替代XMT-1519之外。纯化的缀合物8f具有7.4的STING激动剂与XMT-1535 AAG的比率。
实施例1g：靶标D mIgG2a缀合物8g,DAR 7.4的合成
Figure BDA0003975405560002131
缀合物8g如实施例1所述制备和表征，除使用靶标D mIgG2a替代XMT-1519之外。纯化的缀合物8g具有7.4的STING激动剂与靶标D mIgG2a的比率。
实施例1h：靶标C hIgG1a缀合物8h,DAR 6.9的合成
Figure BDA0003975405560002132
缀合物8h如实施例1所述制备和表征，除使用靶标C hIgG1a替代XMT-1519之外。纯化的缀合物8g具有6.9的STING激动剂与靶标C hIgG1a的比率。
实施例1i：靶标E mIgG2a缀合物8i,DAR 10.0的合成
Figure BDA0003975405560002141
缀合物8i如实施例1所述制备和表征，除使用靶标E mIgG2a替代XMT-1519之外。纯化的缀合物8i具有10.0的STING激动剂与靶标E mIgG2a的比率。
实施例1j：曲妥珠单抗AAG缀合物8j,DAR 7.0的合成
Figure BDA0003975405560002142
缀合物8j如实施例1所述制备和表征，除使用曲妥珠单抗AAG替代XMT-1519之外。
缀合物8j和8j-1的详细信息如下所示。
缀合物 DAR
8j 7.0
8j-1 4.2
实施例1k：曲妥珠单抗mIgG2a缀合物8k,DAR 8.1的合成
Figure BDA0003975405560002151
缀合物8k如实施例1所述制备和表征，除使用曲妥珠单抗mIgG2a替代XMT-1519之外。纯化的缀合物8k具有8.1的STING激动剂与曲妥珠单抗mIgG2a的比率。
实施例11：XMT-1535缀合物8l,DAR 4.7的合成
Figure BDA0003975405560002152
缀合物8l如实施例1所述制备和表征，除使用XMT-1535替代XMT-1519和将2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸结合到化合物结构中替代(3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-丙氨酸之外。纯化的缀合物8l具有4.7的STING激动剂与XMT-1535的比率。
实施例1m：帕利珠单抗缀合物8m,DAR 4.5的合成
Figure BDA0003975405560002161
缀合物8m如实施例1所述制备和表征，除使用帕利珠单抗替代XMT-1519和将2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸结合到化合物结构中替代(3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-丙氨酸之外。纯化的缀合物8m具有4.5的STING激动剂与帕利珠单抗的比率。
实施例2：XMT-1519缀合物16,DAR 5.3的合成
Figure BDA0003975405560002171
部分A：向化合物9(0.100g,0.429mmol)在THF(5mL)中的溶液中加入HATU(0.196g,0.514mmol)和HOBt(0.079g,0.514mmol)，将反应混合物在0℃下搅拌10min，然后加入2-(苄氧基)乙-1-胺(0.0648mg,0.429mmol)和DIPEA(0.112mL,0.643mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，浓缩溶液，并在硅胶上纯化残余物(0-10％ MeOH在DCM中)，得到化合物10(0.2g,100％产率)。C19H30N2O5Na[(M+Na]+的ESI-MS m/z计算值：389.2；实测值389.2。
部分B：将化合物10(150mg,0.409mmol)在EtOH(10mL)中的溶液用N2脱气，之后加入Pd-C(43.6mg,0.409mmol)。混合物然后用H2脱气。将反应混合物在室温和H2(1atm)下搅拌过夜。通过硅藻土垫滤除固体并浓缩滤液，得到化合物11。粗品化合物11无需进一步纯化即可用于下一步。C12H24N2O5Na[(M+Na]+)的ESI-MS m/z计算值：299.2；实测值299.2。
部分C：用氩气冲洗含有化合物11残余物(128mg,0.463mmol)和N,N-二甲基吡啶-4-胺(11.32mg,0.093mmol)的100mL烧瓶，然后加入三乙胺(129μl,0.926mmol)、乙腈(1.544mL)和DMF(0.772mL)。使反应混合物冷却至0℃并搅拌5min，然后加入4-硝基苯基氯甲酸酯(140mg,0.695mmol)，并将所得混合物在20℃下搅拌2h，然后浓缩为油。经硅胶(0-100％乙酸乙酯在己烷中)纯化残余物，得到为白色固体的化合物12(50mg,24％产率)。C14H19N3O7[(M-Boc+H]+)的ESI-MS m/z计算值：342.2；实测值342.1。
部分D：向化合物12(50mg,0.113mmol)和化合物1(36.9mg,0.047mmol)的溶液中加入在DMF(500μL)中的DMAP(1.153mg,9.44μmol)。将反应混合物在80℃下加热3h，然后加入化合物12(50mg,0.113mmol)。将反应混合物搅拌另外3h并然后冷却至室温。浓缩混合物，并经硅胶(0-30％ MeOH在DCM中)纯化残余物，得到为白色固体的化合物13(20mg,39％产率)。C51H67N14O13[(M+H)]+的ESI-MS m/z计算值：1083.4；实测值1083.5。
部分E：向化合物13(20mg,0.047mmol)在DCM(0.5mL)中的溶液中加入TFA(0.1mL)。将反应混合物在室温下搅拌4h然后浓缩，得到为固体的化合物14(10mg,55％产率)。C46H59N14O11[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：983.4；实测值983.5。
部分F：向支架6(14.15mg,10.17μmol)和化合物14(10mg,10.17μmol)在DMF(1mL)中的溶液中加入HATU(4.64mg,0.012mmol)、HOAt(1.881mg,0.012mmol)和DIPEA(0.018mL,0.102mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h然后浓缩，并在制备型RP HPLC(0-80％CAN在水中)上纯化残余物，得到支架15(20mg,83％产率)。C101H152N24O41[(M+2H]2+)的ESI-MS m/z计算值：1178.7；实测值1178.59.0。
部分G：如实施例1所述使XMT-1519(10mg,0.069μmol)与支架15(0.823mg,0.347μmol在200μL DMA中)缀合。纯化的缀合物16具有5.3的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例3：曲妥珠单抗缀合物20的合成
Figure BDA0003975405560002191
部分A：将Boc-ala-ala-OH(67mg,256μmol)、CDI(70mg,435μmol)和DMF(2mL)的溶液在室温下搅拌23h。然后加入化合物1a(如WO2017175147A1所述制备,100mg,128μmol)和DIPEA(67μL,384μmol)并将反应在室温下搅拌23h。浓缩反应混合物并将残余物通过硅胶(0-20％ MeOH-DCM洗脱剂)层析化。分离为黄色泡沫的产物化合物17(109mg,83％产率)。C49H64N15O10[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1022.5；实测值1022.4。
部分B：将化合物17(108mg,106μmol)和2M HCl-二噁烷(6mL)的混合物在室温下搅拌2h。浓缩反应混合物并在高真空下干燥残余物，得到为米白色泡沫的化合物18(103mg,定量)。C44H56N15O8[M+H]的ESI-MS m/z计算值：922.4；实测值922.4。
部分C：将化合物18(80mg,84μmol)、支架6(117mg,84μmol)、HOAt(12mg,84μmol)、DiPEA(59μL,336μmol)和DMF(3mL)的混合物在室温下搅拌5min，然后加入HATU(42mg,109μmol)并将反应混合物在室温下搅拌20h。然后浓缩反应混合物并通过反相(10-100％ ACN-水w/0.1％ HCOOH洗脱剂)层析化。分离为白色、蓬松固体的支架19(35mg,18％产率)。C99H149N25O38[M+2H]2+的ESI-MS m/z计算值：1148.0；实测值1148.4。
部分D：如实施例1所述使曲妥珠单抗(10mg,0.067μmol)与支架19(1.237mg,0.539μmol在200μL DMA中)缀合，然后使用CHT II型色谱纯化，得到缀合物20。抗体-药物缀合物20-1和20-2的详细信息如下所示。
缀合物 DAR
20-1 6.0
20-2 6.1
实施例3a：帕利珠单抗缀合物20a,DAR 5.5的合成
Figure BDA0003975405560002201
缀合物20a如实施例1所述制备和表征，除使用帕利珠单抗替代XMT-1519之外。纯化的缀合物20a具有5.5的STING激动剂与帕利珠单抗的比率。
实施例4：曲妥珠单抗缀合物25,DAR 6.6的合成
Figure BDA0003975405560002211
部分A：向化合物21(如US 62/982,935所述制备,38mg,0.047mmol)和叔丁基(S)-(2-羟丙基)氨基甲酸酯(9.85mg,0.056mmol)在DMF(2mL)中的混合物中加入3-((乙基亚氨基)亚甲基)氨基)-N,N-二甲基丙-1-胺盐酸盐(13.48mg,0.070mmol)、HOBt(10.77mg,0.070mmol)、DIPEA(0.016mL,0.094mmol)和DMAP(5.73mg,0.047mmol)。然后将混悬液在室温下搅拌2天。浓缩混合物，得到残余物，然后将其在硅胶上纯化(0-30％ MeOH在DCM中)，得到为浅黄色固体的化合物22(20mg,44％产率)。C47H58N11O12[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：968.4；实测值968.3。
部分B：向化合物22(20mg,0.021mmol)在二噁烷(4mL)中的混悬液中加入4N HCl(0.52mL,8.19mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5h，浓缩并且无需纯化即可用于下一步。产物化合物23(17mg,95％产率)为白色固体。C42H50N11O10[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：868.3；实测值868.4。
部分C：向化合物23(17mg,0.020mmol)和支架6(32.1mg,0.023mmol)在DMF(2mL)中的溶液中加入PyBOP(15.3mg,0.03mmol)和DIPEA(0.034mL,0.196mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h，浓缩，得到残余物，然后将其在制备型RP HPLC(0-80％ ACN在水中)上纯化，得到支架24(26mg,59％产率)。C97H143N21O40[M+2H]2+的ESI-MS m/z计算值：1120.98；实测值1121.06。
部分D：如实施例1所述使XMT-1519抗体(5mg,0.0347μmol)与支架24(0.622mg,0.278μmol)缀合。粗品反应混合物通过CHT II柱色谱纯化，得到缀合物25(3.19mg,64％产率)。纯化的缀合物25具有6.6的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例5：XMT-1519缀合物28,DAR 6.0的合成
Figure BDA0003975405560002231
部分A：如实施例1所述制备化合物26，除使用26(如US 62/982,935中所述制备)替代化合物1之外。得到为无色固体的化合物27(71.0mg,40％产率)。C103H154N22O43[M+2H]2+的ESI-MS m/z计算值：1193.52；实测值1193.48)。
部分B：如实施例1所述制备缀合物28，得到缀合物28。纯化的缀合物28具有6.0的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例6：XMT-1519缀合物29,DAR 5.5的合成
Figure BDA0003975405560002241
使用30kDa MWCO超滤装置将缀合物28(6.5mg)配制到PBS(pH 8)中，进行3次浓缩和稀释循环。然后将重新配制的缀合物在37℃下温育24h，并然后重新配制为海藻糖缓冲液(pH 5.5)。抗体还原后，通过重链和轻链的LCMS分析证实开环。在各种轻链种类之间观察到良好的分辨率：未缀合的、与完整琥珀酰亚胺缀合的和与开环琥珀酰亚胺缀合的。在相应的重链种类也可观察到开环，但各种种类之间的分辨率较差。因此，通过关注轻链种类来估计开环程度。使用这种方法，缀合物29中开环产物相对于完整琥珀酰亚胺的百分比估计为94％。缀合物29具有5.5的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例7：XMT-1519缀合物32-1,DAR 6.5的合成
Figure BDA0003975405560002251
部分A：如实施例1所述制备支架31，除使用化合物30(如US 62/982,935所述制备)替代化合物1之外。得到为无色固体的支架31(9mg,8％产率)。C101H151N23O42[M+2H]2+的ESI-MS m/z计算值：1179.02；实测值1179.21。
部分B：如实施例1所述制备缀合物32-1、32-2、32-3和32-4，得到标题缀合物。纯化的缀合物32-1、32-2、32-3、32-4和32-5具有的STING激动剂与XMT-1519的比率如下表所述。缀合物32-5具有>10mg/mL的mAb浓度，含有<1％未缀合的mAb，和<1％高分子量种类。
Figure BDA0003975405560002252
Figure BDA0003975405560002261
实施例7a：XMT-1535缀合物32a,DAR 6.2的合成
Figure BDA0003975405560002262
如实施例1所述制备和表征缀合物32a、32a-1、32a-2、32a-3和32a-4，除使用XMT-1535替代XMT-1519之外。纯化的缀合物32a、32a-1、32a-2、32a-3和32a-4具有的STING激动剂与XMT-1535的比率如下表所述。
缀合物 DAR
32a 6.2
32a-1 7.4
32a-2 8.0
32a-3 7.5
32a-4 8.0
实施例7b：帕利珠单抗缀合物32b,DAR 6.8的合成
Figure BDA0003975405560002271
如实施例1所述制备和表征缀合物32b、32b-1和32b-2，除使用帕利珠单抗替代XMT-1519之外。纯化的缀合物32b、32b-1和32b-2具有的STING激动剂与帕利珠单抗的比率如下表所述。
缀合物 DAR
32b 6.8
32b-1 5.7
32b-2 7.2
实施例7c：帕利珠单抗mIgG2a缀合物32c,DAR 9.1的合成
Figure BDA0003975405560002272
如以上实施例1所述制备和表征缀合物32c，除使用帕利珠单抗mIgG2a替代XMT-1519之外。纯化的缀合物32c具有9.1的STING激动剂与帕利珠单抗的比率。
实施例7d：XMT-1535 mIgG2a缀合物32d,DAR 8.8的合成
Figure BDA0003975405560002281
如以上实施例1所述制备和表征缀合物32d，除使用XMT-1535 mIgG2a替代XMT-1519之外。纯化的缀合物32d具有8.8的STING激动剂与XMT-1535 mIgG2a的比率。
实施例7e：XMT-1519 AAG缀合物32e,DAR 7.4的合成
Figure BDA0003975405560002282
如实施例1所述制备和表征缀合物32e，除使用XMT-1519 AAG替代XMT-1519之外。纯化的缀合物32e具有7.4的STING激动剂与XMT-1519 AAG的比率。
实施例7-1：化合物31的备选合成
Figure BDA0003975405560002291
部分A：将化合物30(如US 62/982,935所述制备)(500mg,0.663mmol,1当量)、Boc-PEG2-Ala-OH(0.693g,1.99mmol,3当量)、EDC-HCl(381mg,1.99mmol,3当量)和DMAP(243mg,1.99mmol)在空气下于小瓶中在DMF(26.5mL)中混合。反应在3小时内完成。混合物用AcOH(0.76mL,10当量)淬灭，浓缩，并经硅胶(DCM:MeOH)纯化，得到为白色固体的化合物30a。C51H66N13O14[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1084.5；实测值1084.4。
部分B：将化合物30a(0.663mmol)在空气下于烧瓶中悬浮于二噁烷(10mL)中。加入HCl(4M在二噁烷中,6mL)，并将混合物在室温下搅拌1小时。浓缩混合物，得到白色固体。使固体溶解于纯水中并通过反相色谱(0-25％ ACN在水中)纯化，得到为白色固体的化合物30b(444mg,77％)。C46H58N13O12[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：984.4；实测值984.2。
部分C：向支架6(450mg,0.32mmol,如PCT/US2018/06719所述制备)和化合物30b(350mg,0.072mmol)在DMF(6.5mL)中的溶液中加入PyBOP(185mg,0.36mmol)和三乙胺(0.23mL,1.62mmol)。将混合物在室温下搅拌15分钟并然后用AcOH(0.23mL,3.99mmol)淬灭，且通过反相纯化(0-40％ ACN在水中w/0.1％乙酸)进行纯化，得到化合物31(408mg,55％产率)。C101H151N23O42[M+2H]2+的ESI-MS m/z计算值：1179.52；实测值1179.27。
实施例8：曲妥珠单抗缀合物34,DAR 6.9的合成
Figure BDA0003975405560002301
部分A：向化合物1a(如WO2017175147A1所述制备,0.030g,0.038mmol)在DMF(1.5mL)中的溶液中加入N-乙基-N-异丙基丙-2-胺(0.067mL,0.385mmol)。将溶液在室温下搅拌5分钟，之后加入在DMF(0.5mL)中的2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸酯(0.027g,0.050mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌15分钟。然后加入乙酸(0.1mL)，随后在制备型HPLC柱(C18,21.2mm x 100mm)上纯化，梯度为10-100％ MeCN(0.1％ HOAc)在H2O(0.1％ HOAc)中20min，得到支架33(0.006g,13.05％产率)。C57H75N14O15[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1195.55；实测值1195.47。
部分B：如实施例1所述使曲妥珠单抗(10mg,0.069μmol)与支架33(0.658mg,0.550μmol在DMA中)缀合。粗品缀合物34通过CHT II型色谱纯化。纯化的缀合物34具有6.9的STING激动剂与曲妥珠单抗的比率。
实施例8a：帕利珠单抗缀合物34a,DAR 7.0的合成
Figure BDA0003975405560002311
如实施例8所述制备和表征缀合物34a，除使用帕利珠单抗替代曲妥珠单抗之外。纯化的缀合物34a具有7.0的STING激动剂与帕利珠单抗的比率。
实施例9：XMT-1519缀合物45,DAR 6.5的合成
Figure BDA0003975405560002312
部分A：向化合物35(400mg,1688μmol)和叔丁基乙酸酯(8mL)的混合物中加入70％HClO4(302mg,2.11mmol)。然后将所得溶液在室温下搅拌21h，然后用饱和NaHCO3溶液中和。水相用EtOAc(2x)洗涤并然后用盐水洗涤合并的有机相，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩，得到为不透明油的化合物36(530mg,定量)。C16H24N1O4[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：294.2；实测值294.2。
部分B：将化合物36(279mg,782μmol)、化合物37(370mg,938μmol)、HOAt(128mg,938μmol)、DIPEA(409μL,2.35mmol)和DMF(4mL)的混合物在室温下搅拌5min，然后加入HATU(416mg,1095μmol)并将反应在室温下搅拌2.5h。然后浓缩反应混合物，并将残余物通过硅胶(20-100％ EtOAc/己烷洗脱剂)层析化。分离为白色蓬松固体的化合物38(254mg,362μmol,46％产率)。C39H48N2O9[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：702.3；实测值702.4。
部分C：将化合物38(254mg,362μmol)、MeOH(6mL)和10％Pd-C催化剂的混合物在室温下于H2(1atm)下搅拌2h。然后过滤反应混合物，并浓缩滤液，得到为澄明油的化合物39(214mg,97％产率)。C32H42N3O9[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：612.3；实测值612.3。
部分D：将化合物39(58mg,64μmol)、化合物40(如US62/982,935所述制备,47mg,77μmol、HOAt(10mg,77μmol)、DiPEA(56μL,320μL)和DMF(2mL)的混合物在室温下搅拌5min。然后加入HATU(36mg,96μmol)并将反应混合物在室温下搅拌16h，然后浓缩，得到为黄色油的化合物41(90mg,定量)。C70H83N14O16[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1375.6；实测值1375.4。
部分E：将化合物41(90mg,64μmol)在DMF(2mL)中的20％哌啶中的溶液在室温下搅拌1h。然后浓缩反应混合物并通过硅胶(0-40％MeOH-DCM洗脱剂)层析化，得到为黄色油的化合物42(30mg,41％产率)。C55H73N14O14[M+H]的ESI-MS m/z计算值：1153.5；实测值1153.4。
部分F：将化合物42(30mg,37μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸酯(8mg,44μmol)、TEA(7μL,74μmol)和DMF(1mL)的溶液在室温下搅拌17h。然后浓缩反应混合物，得到为黄色油的支架43(40mg,定量)。C61H76N15O17[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1290.6；实测值1290.3。
部分G：将支架43(30mg,26μmol)在10％ TFA-DCM(2mL)中的溶液在室温下搅拌1h。然后浓缩反应混合物，并将残余物通过HPLC(10-100％ ACN-水w/0.1％ HCOOH洗脱剂)层析化。分离为米白色蓬松固体的支架44(6mg,20％产率)。C52H60N15O15[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1134.4；实测值1134.2。
部分H：如实施例1所述制备缀合物45，除使用4当量TCEP之外。纯化的缀合物45具有6.5的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例10：XMT-1519缀合物50,DAR 8.2的合成
Figure BDA0003975405560002331
部分A：将化合物26(如US 62/982,935所述制备,50mg,64μmol)、Fmoc-D-谷氨酸-O-叔丁基(54mg,128μmol)、DCC(26mg,128μmol)、DMAP(1mg,6μmol)和DMF(2mL)的混合物在室温下搅拌17h。浓缩反应混合物并且无需纯化即可用于下一步。得到为黄色油的化合物46(135mg)。C62H68N11O14[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1190.5；实测值：1190.3。
部分B：将化合物46(135mg,64μmol)和33％ TEA在DMF中(2.4mL)的混合物在室温下搅拌4.5h。浓缩反应混合物，并将残余物通过经反相HPLC(10-100％ ACN-水w/0.1％HCOOH洗脱剂)的层析法纯化。分离为黄色粉末的化合物47(27mg,44％产率)。C47H58N11O12[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：968.4；实测值968.2。
部分C：将化合物47(25mg,26μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸酯(8mg,31μmol)、TEA(11μL,78μmol)和DMF(1mL)的溶液在室温下搅拌1h。浓缩反应混合物并且无需纯化即可用于下一步。支架48为黄色油(40mg,定量)。C53H61N12O15[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1105.4；实测值1105.2。
部分D：将支架48(40mg,24μmol)和15％ TFA在DCM中(1mL)的溶液在室温下搅拌2h。然后浓缩反应混合物并通过HPLC(含0.1％HCOOH的10-100％ ACN-水洗脱剂)层析化。分离为白色蓬松固体的支架49(5mg,20％产率)。C49H53N12O15[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1049.4；实测值1049.2。
部分E：如实施例1所述使XMT-1519(10mg,0.069μmol)与支架49缀合。缀合物50通过CHT II型色谱纯化。纯化的缀合物50具有8.2的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例11：XMT-1519缀合物52,DAR 7.7的合成
Figure BDA0003975405560002341
如实施例10所述从支架51制备缀合物52，除使用Fmoc-L-Glu(O-tBu)替代Fmoc-D-Glu(O-tBu)之外。纯化的缀合物52具有7.7的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例12：XMT-1519缀合物58,DAR 6.5的合成
Figure BDA0003975405560002351
部分A：向化合物26(如US 62/982,935所述制备,0.105g,0.134mmol)、Boc-L-丙氨酸(50.8mg,0.268mmol)、DMAP(50.8mg,0.067mmol)和DCC(0.111g,0.537mmol)的混合物中加入DMF(2mL)。然后将混悬液在室温下搅拌2天。浓缩混合物并在硅胶(0-40％ MeOH在DCM中)上纯化，得到为浅黄色固体的化合物53(0.102g,80％产率)。C46H56N11O12[M+H]+的ESI-MSm/z计算值：954.4；实测值954.4。
部分B：向化合物53(0.102g,0.107mmol)在二噁烷(10mL)中的混悬液中加入4NHCl(0.508mL,2.031mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h。然后浓缩混悬液并且无需纯化即可用于下一步。得到为浅黄色固体的化合物54。C41H48N11O10[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：854.3；实测值854.3。
部分C：向化合物54(0.015g,0.017mmol)在DMF(1mL)中的溶液中先后加入Boc-D-Glu(Otu)-OH(7.67mg,0.025mmol)和DIPEA(0.026mL,0.152mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5min。然后加入PyBOP(13.15mg,0.025mmol)，并将混合物在室温下搅拌1h，浓缩并经硅胶(0-30％ MeOH在DCM中)纯化残余物，得到为白色固体的化合物55(11mg,57.3％产率)。C55H71N12O15[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1139.5；实测值1139.5。
部分D：向化合物55(11mg,0.00966mmol)在二噁烷(3mL)中的混悬液中加入4N HCl(0.241mL,0.966mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h。浓缩混悬液并且无需纯化即可用于下一步。化合物56为白色固体。C46H55N12O13[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：983.4；实测值983.4。
部分E：向化合物56(9.5mg,0.00966mmol)在DMF(3mL)中的溶液中加入DIEA(8.44μL,0.048mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸酯(3.17mg,0.013mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，用HOAc中和至pH 6-7，然后经制备型RP HPLC(0-75％ ACN在水中)纯化，得到为白色固体的支架57(3.3mg,31％产率)。C52H58N13O16[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1120.4；实测值1120.4。
部分F：如实施例1所述使XMT-1519(10mg,0.069μmol)与支架57(0.700mg,0.625μmol在200μL DMA中)缀合。缀合物58通过CHT II型色谱纯化。纯化的缀合物58具有6.5的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例13：XMT-1519缀合物60的合成
Figure BDA0003975405560002361
如实施例12所述从支架59制备缀合物60，除使用Boc-L-Glu(Otu)-OH替代Boc-D-Glu-O-tBu以外。抗体-药物缀合物60-1和60-2的详细信息如下所示。
缀合物 DAR
60-1 7.7
60-2 5.5
实施例14：XMT-1519缀合物62,DAR 6.5的合成
Figure BDA0003975405560002371
如实施例12所述从支架61制备缀合物62，除使用Boc-L-Glu(Otu)-OH替代Boc-D-Glu-O-tBu和使用Boc-D-Ala替代Boc-L-Ala之外。纯化的缀合物62具有6.5的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例15：XMT-1519缀合物64,DAR 6.4的合成
Figure BDA0003975405560002372
如实施例12所述从支架63制备缀合物64，除使用Boc-D-Ala替代Boc-L-Ala之外。纯化的缀合物64具有6.4的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例16：XMT-1519缀合物66的合成
Figure BDA0003975405560002381
如实施例12所述从支架65制备缀合物66，除使用Boc-2-氨基-2-甲基丙酸替代Boc-L-Ala之外。抗体-药物缀合物66-1和66-2的详细信息如下所示。
缀合物 DAR
66-1 7.5
66-2 5.3
实施例17：XMT-1519缀合物74,DAR 6.9的合成
Figure BDA0003975405560002382
部分A：将化合物26(如US 62/982,935所述制备,75mg,0.096mmol)、N-Boc-(D)-Ala-OH(91mg,0.48mmol)、DCC(99mg,0.48mmol)和DMAP(1.2mg,9.58μmol)在DMF(3mL)中的混合物在室温下搅拌1h，并然后真空浓缩。经硅胶(DCM:MeOH 60:40v/v)纯化，得到为浅黄色固体的化合物67(82mg,90％产率)。C46H56N11O12[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：954.40；实测值：954.43。
部分B：向化合物67(80mg,0.084mmol)在二噁烷(5mL)中的混悬液中加入HCl(4M在二噁烷中,0.42mL,1.68mmol)，并将混合物在室温下搅拌4h。真空浓缩混合物，得到为浅黄色固体的化合物68(72mg,100％产率)。C41H48N11O10[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：854.35；实测值：854.38。
部分C：向化合物68(48mg,0.056mmol)、N-Boc-甘氨酸(15mg,0.084mmol)和PyBOP(44mg,0.084mmol)在DMF(3mL)中的搅拌着的溶液中加入DIPEA(0.088mL,0.51mmol)，并将混合物在室温下搅拌2h。浓缩混合物，并将残余物经硅胶(DCM:MeOH 60:40v/v)纯化，得到为白色固体的化合物69(53mg,93％产率)。C48H59N12O13[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1011.42；实测值：1011.45。
部分D：向化合物69(50mg,0.049mmol)在二噁烷(5mL)中的混悬液中加入HCl(4M在二噁烷中,1mL,20％v/v)，并将混合物在室温下搅拌2h然后浓缩，得到为白色固体的化合物70(45mg,100％产率)。C43H51N12O11[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：911.37；实测值：911.39。
部分E：向化合物70(20mg,0.022mmol)、N-Boc-(D)-Glu(OtBu)-OH(10mg,0.033mmol)和PyBOP(17mg,0.033mmol)在DMF(2mL)中的搅拌着的溶液中加入DIPEA(0.03mL,0.22mmol)，并将混合物在室温下搅拌2h。浓缩混合物，并经硅胶(DCM:MeOH 60:40v/v)纯化残余物，得到为白色固体的化合物71(24mg,90％产率)。C57H74N13O16[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1196.53；实测值：1196.55。
部分F：向化合物71(24mg,0.02mmol)在DCM(5mL)中的混悬液中加入TFA(1mL,20％v/v)，并将混合物在室温下搅拌12h。浓缩混合物，得到为浅黄色固体的化合物72(21mg,100％产率)。C48H58N13O14[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1040.41；实测值：1040.23。
部分G：向化合物72(21mg,0.02mmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸酯(7.6mg,0.03mmol)在DMF(2mL)中的搅拌着的溶液中加入DIPEA(0.035mL,0.20mmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。浓缩混合物，并经RP HPLC残余物纯化，得到为白色固体的支架73(4.5mg,19％产率)。C54H61N14O17[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1177.43；实测值：1177.40。
部分H：如实施例12所述从支架73制备缀合物74。纯化的缀合物74具有6.9的STING激动剂与XMT-1519比率。
实施例18：XMT-1519缀合物76,DAR 7.5的合成
Figure BDA0003975405560002401
如实施例17所述从支架75制备缀合物76，除使用N-Boc-(L)-Ala-OH替代N-Boc-(D)-Ala-OH和使用N-Boc-(L)-Glu(OtBu)-OH替代N-Boc-(D)-Glu(OtBu)-OH之外。纯化的缀合物76具有7.5的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例19：XMT-1519缀合物78,DAR 7.4的合成
Figure BDA0003975405560002402
如实施例17所述从支架70制备缀合物78，除使用N-Boc-(L)-Glu(OtBu)-OH替代N-Boc-(D)-Glu(OtBu)-OH之外。纯化的缀合物78具有7.4的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例20：XMT-1519缀合物80,DAR 7.5的合成
Figure BDA0003975405560002411
如实施例17所述从支架79制备缀合物80，除使用N-Boc-(L)-Ala-OH替代N-Boc-(D)-Ala-OH之外。纯化的缀合物80具有7.5的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例21：XMT-1519缀合物82,DAR 5.7的合成
Figure BDA0003975405560002412
如实施例12所述从支架81制备缀合物82，除使用Boc-甘氨酸替代Boc-(L)-Ala-OH之外。纯化的缀合物81具有5.7的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例22：XMT-1519缀合物85,DAR 6.5的合成
Figure BDA0003975405560002421
部分A：如实施例1所述制备支架84，除使用化合物83(如US62/982,935所述制备)替代化合物1之外。得到为白色蓬松固体的支架84(3.3mg,0.5％产率，经5步)。C101H148N22O42S[M+2H]2+的ESI-MS m/z计算值：1187.49；实测值1187.78。
部分B：如实施例1所述制备缀合物85，得到标题缀合物。纯化的缀合物85具有6.5的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例22a：帕利珠单抗缀合物85a,DAR 7.4的合成
Figure BDA0003975405560002431
如实施例1所述制备和表征缀合物85a，除使用帕利珠单抗替代XMT-1519之外。纯化的缀合物85a具有7.4的STING激动剂与帕利珠单抗的比率。
实施例23：XMT-1519缀合物88,DAR 6.6的合成
Figure BDA0003975405560002432
部分A：如实施例12所述制备支架87，除使用化合物86(如US 62/982,935所述制备)替代化合物26之外。C50H55N14O15[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1091.4；实测值1091.2。
部分B：如实施例12所述制备缀合物88，除使用支架87替代支架57之外。纯化的缀合物具有6.6的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例23a：帕利珠单抗缀合物89,DAR 5.9的合成
Figure BDA0003975405560002441
如实施例12所述制备和表征缀合物89，除使用帕利珠单抗替代XMT-1519之外。纯化的缀合物89具有5.9的STING激动剂与帕利珠单抗的比率为。
实施例23b：CTL-48132_mIgG2a缀合物89a,DAR 8.8的合成
Figure BDA0003975405560002442
如实施例12所述制备和表征缀合物89a，除使用CTL-48132_mIgG2a替代XMT-1519之外。纯化的缀合物89a具有8.8的STING激动剂与CTL-48132_mIgG2a的比率。
实施例23c：MFP5_mIgG2a缀合物89b,DAR 9.0的合成
Figure BDA0003975405560002451
如实施例12所述制备和表征缀合物89b，除使用CTL-48132_mIgG2a替代XMT-1519之外。纯化的缀合物89b具有9.0的STING激动剂与MFP5_mIgG2a的比率。
实施例24：XMT-1519缀合物92,DAR 7.6的合成
Figure BDA0003975405560002452
部分A：如实施例12所述制备支架91，除使用化合物90(如US 62/982,935所述制备)替代化合物26。C52H58N13O15S[M+H]+的ESI-MS m/z计算值：1136.4；实测值1136.2。
部分B：如实施例12所述制备缀合物88，除使用支架87替代支架57之外。纯化的缀合物具有7.6的STING激动剂与与XMT-1519的比率。
实施例24a：帕利珠单抗缀合物93,DAR 6.7的合成
Figure BDA0003975405560002461
如实施例12所述制备和表征缀合物93，除使用帕利珠单抗替代XMT-1519之外，纯化的缀合物93具有6.7的STING激动剂与与帕利珠单抗的比率。
实施例25：XMT-1519缀合物100,DAR 7.8的合成
Figure BDA0003975405560002471
部分A：向化合物94(如US 62/982,935所述制备,45mg,0.054mmol)在DMF(3mL)中的搅拌着的溶液中加入(S)-1-(Boc-氨基)丙-2-醇(19mg,0.11mmol)、EDC(17mg,0.109mmol)和DMAP(3.3mg,0.027mmol)，并将混合物在室温下搅拌12小时。真空浓缩反应，并经硅胶(DCM:MeOH 60:40v/v)纯化残余物，得到为白色固体的95(49mg,92％产率)。C47H57N10O12S(M+H)的ESI-MS计算值：985.38；实测值：985.21。
部分B：向化合物95(49mg,0.05mmol)在DCM(5mL)中的搅拌着的混悬液中加入TFA(1mL,20％v/v DCM)，并将混合物在室温下搅拌12小时。浓缩所得混合物，得到为浅黄色固体的化合物96(44mg,100％产率)。C42H49N10O10S(M+H)的ESI-MS计算值：885.33，实测值：885.18。
部分C：向化合物96(50mg,0.05mmol)在DMF(2mL)中的搅拌着的溶液中加入Boc-Glu-OtBu(86mg,0.28mmol)、PyBOP(118mg,0.23mmol)和DIPEA(0.12mL,0.68mmol)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。真空浓缩混合物，并经硅胶(DCM:MeOH 60:40v/v)纯化残余物，得到为白色固体的化合物97(45mg,77％产率)。C56H72N11O15S(M+H)的ESI-MS计算值：1170.49；实测值：1170.29。
部分D：向化合物97(45mg,0.038mmol)在DCM(5mL)中的搅拌着的混悬液中加入TFA(1mL,20％v/v DCM)，并将混合物在室温下搅拌12小时。真空浓缩混合物，得到为浅黄色固体的化合物98(38mg,100％产率)。C47H56N11O13S(M+H)的ESI-MS计算值：1014.37，实测值：1014.20。
部分E：向化合物98(20mg,0.02mmol)在DMF(2mL)中的搅拌着的溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸酯(5mg,0.02mmol)和DIPEA(0.034mL,0.20mmol)，并将混合物在室温下搅拌15分钟。反应用乙酸(0.034mL,1:1v/v DIPEA)淬灭，并直接经使用C18固定相(水:ACN)的HPLC纯化，得到为白色固体的支架99(4.7mg,20％产率)。C53H59N12O16S(M+H)的ESI-MS计算值：1151.38，实测值：1151.18。
部分F：如实施例12所述制备缀合物100，除使用支架99替代支架57之外，纯化的缀合物具有7.8的STING激动剂与XMT-1519的比率。
实施例25a：帕利珠单抗缀合物101,DAR 6.5的合成
Figure BDA0003975405560002491
如实施例25所述制备缀合物101，除使用帕利珠单抗替代XMT-1519之外。纯化的缀合物具有6.5的STING激动剂与帕利珠单抗的比率。
实施例26A：靶向癌细胞的野生型或Fc突变型STING-ADC在癌细胞/THP1荧光素酶报告细胞共培养中的活性
NaPi2b Fc沉默抗体的产生：将设计改造以消除Fc效应子功能的NaPi2b mAb及其Fc区(抗NaPi2b-(AAG))设计为具有重链恒定区中的3个突变L234A、L235A和P329G(AAG；Kabat Eu编号)，并通过标准分子生物学程序产生。表达并纯化抗体。简言之，将编码具有携带L234A、L235A和P329G突变的人类IgG1的恒定区的NaPi2b抗体的重链可变区和具有人类κ轻链的抗NaPi2b抗体的轻链可变区的DNA克隆到哺乳动物表达载体中。NaPi2b-(AAG)的重链和轻链在HEK293细胞中共表达，并通过标准蛋白A亲和层析从细胞上清液中纯化抗体。
免疫细胞中STING通路的诱导：通过癌细胞/THP1-IRF3-荧光素酶报告细胞共培养测定评估靶向NaPi2b的STING ADC对免疫细胞中STING通路的诱导。将OVCAR3人类卵巢癌细胞接种于96孔CellBind表面组织培养板(15000/孔)中，并使得在含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中附着6小时。将供试品缀合物8b-1、缀合物8f、缀合物8d-1和化合物1的一系列稀释液(基于有效负载0.4nM-100nM；生长培养基中的3倍连续稀释液)加入到每孔中，并将板在37℃下温育20min。然后将THP1-双报告细胞(30,000)加入到每孔中，并在37℃和5％ CO2的增湿气氛下继续温育20小时。将来自每个温育样品的细胞培养上清液(20μl)加入到重悬浮的QUANTI-Luc(50μl)中，并立即使用SpectraMax M5平板读取器(Molecular Devices)测量发光信号。根据剂量反应曲线确定EC50值。表1A提供与OVCAR3癌细胞共培养的THP1-Dual细胞的EC50值。
表1A
供试品 缀合物8b-1 缀合物8f 缀合物8d-1 化合物1
EC<sub>50</sub>(nM) <0.05 43.3 41.8 6.8
如表1A所示，具有野生型Fc效应子功能的缀合物8b-1表现出与游离激动剂化合物1相比较活性增加多于100倍，和与缀合物8f和缀合物8d-1相比较活性增加约1000倍，证实Fc受体对于活性的作用。显示的结果为代表性实验的EC50值。
实施例26B：靶向癌细胞的野生型或Fc突变型STING-ADC在癌细胞/THP1荧光素酶报告细胞共培养中的活性
HER-2 Fc沉默抗体的产生：将设计改造以消除Fc效应子功能的曲妥珠单抗mAb及其Fc区(抗Her2-(AAG))设计为具有重链恒定区中的3个突变L234A、L235A和P329G(AAG；Kabat Eu编号)并如实施例26A所述产生。
免疫细胞中STING通路的诱导：通过癌细胞/THP1-IRF3-荧光素酶报告细胞共培养测定，使用如实施例26A所述的SKBR3人类乳腺癌细胞与供试品缀合物8a-2、缀合物8j、缀合物8c-2和化合物1评估靶向Her2的STING ADC对免疫细胞中STING通路的诱导。表1A提供与SKBR3癌细胞共培养的THP1-Dual细胞的EC50值。
表1B
供试品 缀合物8a-2 缀合物8j 缀合物8c-2 化合物1
EC<sub>50</sub>(nM) 0.35 >200 >200 7.4
如表1B所示，具有野生型Fc效应子功能的缀合物8a-2表现出与游离激动剂化合物1相比较活性增加约50倍，和与缀合物8j和缀合物8c-2相比较活性增加约1000倍，证实Fc受体对于活性的作用。显示的结果为代表性实验的EC50值。
实施例27A：靶向癌细胞的野生型或Fc突变体STING ADC在涂覆肿瘤细胞抗原的板上培养的THP1荧光素酶报告细胞中的活性
通过与肽(1μg/mL在PBS中)一起在4℃下温育过夜，将人类NaPi2b衍生肽(QINVTVPSTANCTSPSLCWTDGIQNWTMKN)涂覆到96孔板每孔的表面。然后孔用PBS-T洗涤1x，并通过在室温下与BSA(3％在PBS-T中)温育1小时来封闭。用PBS-T(2x)、PBS(1x)和生长培养基(RPMI 1640,10％ FBS,1％青霉素/链霉素,1x)洗涤之后，将供试品(缀合物8b-1、缀合物8f、缀合物8c-1和化合物1)的一系列稀释液(基于有效负载0.4nM-100nM；生长培养基中的3倍连续稀释液)加入到每孔中，并将板在37℃下温育20min。将THP1-双报告细胞(50,000)加入到每孔中，并在37℃和5％ CO2的增湿气氛下温育20小时。将来自每个温育样品的细胞培养上清液(20μl)加入到重悬浮的QUANTI-Luc(50μl)中，并立即使用SpectraMax M5平板读取器(Molecular Devices)测量发光信号。根据剂量反应曲线确定EC50值。表2A提供涂覆NaPi2b重组肽的板上培养的THP1双细胞中的EC50值。
表2A
供试品 缀合物8b-1 缀合物8f 缀合物8c-1 化合物1
EC<sub>50</sub>(nM) <0.022 >100 18.99 5.18
如表2所示，具有野生型Fc的缀合物8b-1表现出与化合物1相比较活性增加约100倍。缀合物8f无活性而缀合物8c-1与缀合物8b-1相比较活性低约1000倍，证实Fc受体对于活性的作用。显示的结果为代表性实验的EC50值。
实施例27B：靶向癌细胞的野生型或Fc突变体STING ADC在涂覆肿瘤细胞抗原的板上培养的THP1荧光素酶报告细胞中的活性
通过与肽(1μg/mL在PBS中)一起在4℃下温育过夜，将人类HER2/ErbB2蛋白(His-标记的,ECD,结构域IV,17.1kDa)衍生肽涂覆到96孔板每孔的表面，并如实施例27A所述进行测定，除使用供试品缀合物8a-3、缀合物8j、缀合物8c-2和化合物1的3倍连续稀释液(基于有效负载0.09nM-200nM)之外。表2B提供在涂覆Her2重组蛋白的板上培养的THP1双细胞中的EC50值。
表2B
供试品 缀合物8a-3 缀合物8j 缀合物8c-2 化合物1
EC<sub>50</sub>(nM) 0.36 >200 >200 8.8
如表2B所示，具有野生型Fc的缀合物8a-3表现出与化合物1相比较活性增加约100倍。缀合物8j和缀合物8c-2无活性，证实Fc受体对于活性的作用。显示的结果为代表性实验的EC50值。
实施例28A：靶向肿瘤细胞的NaPi2b ADC在癌细胞/PBMC共培养中的活性
通过用
Figure BDA0003975405560002521
NucLight red Lentivirus试剂转导产生稳定表达核限制性mKate荧光红色蛋白的OVCAR3人类卵巢癌细胞。将在含有嘌呤霉素的培养基(2μg/mL)中持续2天选择的稳定转导的细胞(命名为OVCAR3-NucRed细胞)接种于96孔组织培养板(8,000/孔)中，并使得在含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中附着过夜。培养基用新鲜培养基(50μL)替换。然后将供试品(3x浓缩，缀合物8b-1(100、10和1nM)、缀合物8f(100、10和1nM)、缀合物8c-1(100和10nM)和化合物1(100和10nM)；缀合物浓度为基于有效负载)加入到每孔的培养基中(50μL)，并将板在37℃下温育20分钟。根据供应商的说明解冻冷冻的人类外周血单核细胞(PBMC)，并将其加入到每孔(50μL培养基中40,000个PBMC)中，且将板置于温育箱(37℃，5％ O2)中的
Figure BDA0003975405560002522
活细胞成像仪中，并经2天每4小时扫描一次。使用
Figure BDA0003975405560002523
Zoom软件量化红色物体(癌细胞)的数量。将每孔中的红色物体融合度归一化为其自己T＝0时间点的红色物体融合度。
图1A绘制红色物体融合度随时间变化的图表，并显示与化合物1相比较，PBMC响应于100x较低有效负载浓度下的缀合物8b-1的对癌细胞杀伤的强烈诱导。缀合物8f也表现出活性，尽管与缀合物8b相比较水平降低。缀合物8c-1的活性明显低于缀合物8b-1。
实施例28B：靶向肿瘤细胞的NaPi2b ADC在癌细胞/PBMC共培养中的活性
将OVCAR3-NucRed细胞接种于96孔组织培养板(20,000/孔)中，并使得在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中附着6小时。培养基用新鲜培养基(50μL)替换。然后将供试品(3x浓缩，缀合物8l和化合物1(每一种在100、10和1nM下)和缀合物8m(100nM)；缀合物浓度基于有效负载)加入到每孔的培养基(50μL)中。如实施例28A所述进行测定，除使用30,000PBMC之外。使用
Figure BDA0003975405560002531
Zoom软件量化红色物体(癌细胞)的数量。将每孔中的红色物体数量归一化为其自己T＝0时间点的红色物体数量。
图1B绘制红色物体数量随时间变化的图表，并显示与化合物1相比较，PBMC响应于100x较低有效负载浓度下的缀合物8l的对癌细胞杀伤的强烈诱导。缀合物8m无显著活性，并且红色物体数量(细胞生长)随着时间推移的增加与未处理的对照相似。插图显示供试品(100nM)均未抑制单一培养中OVCAR3-NucRed细胞的生长。
实施例29：PBMC和分离的单核细胞亚群中CD14、Fcγ受体和CD3表达的流式细胞术分析
将冷冻的人类PBMC(1x108)解冻并等分到3个管中：一个等分式样进行人类单核细胞富集[StemCell Technologies](“CD16耗尽的单核细胞”)，一个等分式样进行没有CD16耗尽的人类单核细胞富集[StemCell Technologies](“富集的单核细胞”)和一个等分式样未进行富集(“PBMC”)。对于流式细胞术，将来自每组的细胞(50,000)转移至U形底96孔板，重复4次，用PBS洗涤并用活/死可固定Aqua死细胞染色染料(分子探针)染色，然后用荧光团缀合靶向特异性(一式三份)或同种型对照抗体(Pacific Blue抗人CD14、FITC抗人CD3、APC/Cy7 CD16、PE抗人CD32、PE/Cy7抗人CD64)染色。固定细胞并通过MACSQuant流式细胞仪上的流式细胞术分析测定目的蛋白的表面表达。通过FlowJo软件进行数据分析。表3提供PBMC、富集的单核细胞和CD16耗尽的单核细胞群中CD14-/CD16+、CD14+/CD16+、CD14-/CD32+、CD14+/CD32+、CD14-/CD64+、CD14+/CD64+和CD14-/CD3+细胞的频率(单个/活细胞的％)。
表3
Figure BDA0003975405560002541
*单个/活细胞上的门控
表3显示CD3+细胞的有效耗尽和单核细胞的富集以及分离后CD16耗尽的单核细胞中CD16阳性细胞的水平降低。CD64染色结果表明，所有CD14阳性细胞在PBMC以及在富集的单核细胞亚群中表达CD64(FcγRI)。
图2显示CD3+细胞的有效耗尽和单核细胞的富集以及分离后CD16耗尽的单核细胞中CD14阳性细胞的水平降低。
实施例30：靶向Fc突变体肿瘤细胞的Her2 ADC在PBMC和STING野生型或敲除型SKBR3细胞体外共培养中的癌细胞杀伤活性
表达核限制性mKate荧光蛋白的STING敲除型单细胞克隆的产生：将SKBR3细胞接种于24孔板(50,000/孔)，并根据制造商的方案使用来自Thermo Fisher的TrueGuideTMSynthetic gRNA、TrueCutTM Cas9蛋白v2和LipofectamineTM CRISPRMAXTM转染试剂用非靶向sgRNA和3种靶向人类STING基因的不同sgRNA进行转染。sgRNA序列为：sgNT(非靶向)：AAAUGUGAGAUCAGAGUAAU；sg#3：TACTCCCTCCCAAATGCGGT；sg#4：CTCGCAGGCACTGAACATCC；和sg#5:GTTAAACGGGGTCTGCAGCC。转染后7天，将单细胞在含有100μL的DMEM(含有20％ FBS和1％青霉素/链霉素)的96孔板中进行筛选，并在2-3周内形成克隆(培养基每周更新1-2次)。使用兔单克隆抗STING(Cell Signaling Technologies)和抗β-肌动蛋白(Licor)抗体，通过Western印迹使多个克隆胰蛋白酶化和扩增以分析STING表达。如实施例28所述选择无STING蛋白表达(如通过Western印迹测定)的克隆稳定表达核限制性mKate荧光蛋白。
杀伤测定：将STING野生型(sgNT-2：非靶向sgRNA，克隆2)和表达NucRed的敲除型(sg#3-2：sgRNA#3克隆2)SKBR3细胞在96孔板中接种于含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI中(15,000/孔)，并如实施例29所述各自以100、25、5和1nM(缀合物浓度基于有效负载)使用缀合物8a-3、缀合物8j、缀合物8c-2和化合物1进行PBMC杀伤测定。
图3A和图3B绘制红色物体融合度随时间变化的图表，并分别显示STING野生型(sgNT-2)SKBR3细胞/PBMC共培养和敲除型(sg#3-2)SKBR3细胞/PBMC共培养的杀伤。在测试的所有剂量下，缀合物8a-3诱导STING野生型和敲除型SKBR3细胞/PBMC共培养两者的强烈杀伤。在STING野生型(sgNT-2)SKBR3细胞/PBMC共培养中，缀合物8j在100、25和5nM下具有高活性，而在STING敲除型(sg#3-2)SKBR3细胞/PBMC共培养中活性低。化合物1仅在STING野生型(sgNT-2)SKBR3细胞/PBMC共培养中于100nM下显示出活性，而在STING敲除型(sg#3-2)SKBR3细胞/PBMC共培养中于所有剂量下均无活性。缀合物8c-2在STING野生型(sgNT-2)SKBR3细胞/PBMC共培养或STING敲除型(sg#3-2)SKBR3细胞/PBMC共培养中均没有任何活性。
实施例30A：靶向肿瘤细胞的Her2 ADC和Her2抗体在STING野生型或STING敲除型SKBR3癌细胞/PBMC共培养中的活性
将STING野生型(sgNT-2：非靶向sgRNA，克隆2)和表达NucRed的敲除型(sgRNA#3-2：sgRNA#3克隆2)SKBR3细胞与PBMC共培养，并如实施例30所述使用缀合物8a-3、缀合物8-j(基于有效负载200nM,4x稀释)的剂量范围进行杀伤测定。未缀合的野生型Fc曲妥珠单抗和AAG Fc突变体曲妥珠单抗基于对应于缀合物8a-3抗体浓度的抗体浓度给药。如图4A和图4B所示，缀合物8a-3对STING野生型和敲除型SKBR3癌细胞两者均表现出强烈杀伤，而靶向Fc突变体Her2的ADC缀合物8-j仅在STING野生型SKBR3共培养中显示出杀伤活性，在STING敲除型SKBR3共培养中几乎消失。Fc野生型和AAG突变体未缀合的曲妥珠单抗抗体两者在STING野生型和敲除型癌细胞共培养两者中均显示出低活性。这些数据表明，靶向Fc突变体癌细胞的STING-ADC活性在免疫细胞共培养中的癌细胞杀伤活性由肿瘤细胞固有的STING激活所贡献。
实施例31：在不存在T细胞的情况下靶向肿瘤细胞的NaPi2b ADC在癌细胞/人类单核细胞共培养中的活性
将OVCAR3-NucRed细胞(如实施例28所述产生)接种于96孔CellBind表面组织培养板(Corning)(15000/孔)中，并使得在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中附着6小时。培养基用新鲜培养基(50μL)替换。然后将供试品(缀合物8b-1和化合物1，每种在20和4nM下，缀合物浓度基于有效负载浓度)加入到每孔的培养基中(50μL)，并将板在37℃下温育20分钟。如实施例29所述制备PBMC、富集的单核细胞和CD16耗尽的单核细胞。然后将活PBMC(30,000/孔)、富集的单核细胞(20,000/孔)和CD16耗尽的单核细胞(20,000/孔)加入到孔中的培养基(50μL)中，并将板置于温育箱(37℃，5％O2)中的
Figure BDA0003975405560002561
活细胞成像仪中，并经2天每4小时扫描一次。使用
Figure BDA0003975405560002562
Zoom软件量化红色物体(癌细胞)的数量。将每孔中的红色物体融合度归一化为其自己T＝0时间点的红色物体融合度。红色物体融合度随时间的变化绘制于图5A-5C中，并且显示CD3+ T细胞耗尽单核细胞群响应于靶向肿瘤细胞的ADC活性具有相当的癌细胞杀伤活性。缀合物8b-1在4nM和20nM有效负载浓度下诱导PBMC(图5A)、富集的单核细胞(图5B)和CD16耗尽的单核细胞(图5C)对OVCAR3-NucRed癌细胞的强烈杀伤。化合物1在20nM下仅在富集的单核细胞和CD16耗尽的单核细胞共培养中诱导癌细胞杀伤。
实施例32：人类CXCL10和靶向HER2的抗体-药物缀合物与HCC1954人类乳腺癌细胞系的细胞结合的体外测量
使HCC1954乳腺癌细胞在补充有FBS(10％)和青霉素/链霉素(1％)的RPMI 1640培养基中生长至约80-95％的融合度。收获细胞并加入到96孔平底板的孔中(40,000/孔)，且在37℃和5％ CO2下温育过夜。如表4所示以1pM-10μM之间范围内的浓度用测试HER2抗体-药物缀合物(20μL)处理细胞，并在37℃和5％ CO2下温育24小时。将板离心(300g,5分钟)，收集上清液(100mL)并对人类CXCL10(人类CXCL10/IP-10)进行ELISA分析。在SpectraMaxM5平板读取器上于OD450下读取显影版。绘制每种处理的值，并用GraphPad Prism软件使用四参数曲线拟合计算EC50值。
为测定HER2抗体-药物缀合物与HCC1954细胞的细胞结合，使HCC1954细胞在补充有FBS(10％)和青霉素/链霉素(1％)的RPMI 1640培养基中生长至约80-95％的融合度。收获细胞并加入到96孔V形底板的孔中(50,000/孔)。将细胞沉淀(300x g,5分钟)并如表4所示以0.01nM-100nM之间范围内的浓度重悬浮于测试HER2抗体-药物缀合物的溶液中，且在冰上温育3小时。然后将细胞在冰冷的PBS(3x)中洗涤，沉淀(300g,5分钟)，并与检测抗体(山羊抗人IgG-Alexa-647(H+L链)一起在4℃下温育1小时。将细胞悬液沉淀(300g,5分钟)，在冰冷的PBS中洗涤3次，并通过重悬浮于多聚甲醛溶液(2％)中固定。重悬浮的细胞然后在MACS Quant流式细胞仪上进行流式细胞术分析。收集单个事件(10,000)进行分析。用FlowJo软件进行群门控(population gating)和平均荧光强度(MFI)分析。
表4概述HCC1954中细胞结合和CXCL10诱导的平均EC50值。
表4
供试品 DAR CXCL10 ELISA EC<sub>50</sub>(nM) 细胞结合EC<sub>50</sub>(nM)
缀合物25 6.6 0.13 ND
缀合物45 6.5 0.17 ND
缀合物8-2 6.8 0.51 ND
缀合物28 6 0.16 1.0
缀合物29 5.5 0.18 ND
缀合物62 6.5 0.20 ND
缀合物64 6.4 0.22 ND
缀合物58 6.5 2.3 ND
缀合物74 6.9 3.4 ND
缀合物78 7.4 2.7 ND
缀合物28 6 0.16 1.0
缀合物82 5.7 0.17 ND
缀合物52 7.7 0.12 2.3
缀合物50-1 7.7 0.13 ND
缀合物66-2 5.3 1.38 ND
缀合物32-1 6.5 1.23 2.4
ND＝未测定
如表4所示，用靶向Her2的抗体-药物缀合物处理HCC1954细胞导致CXCL10诱导的次纳摩尔至低纳摩尔EC50值。在确定的情况下，靶向Her2的ADC与HCC2954细胞结合的EC50值也处于低纳摩尔范围内。
实施例33：靶向肿瘤细胞的HER2抗体-药物缀合物在癌细胞/PBMC共培养中的活性
癌细胞杀伤活性：如实施例28A所述产生稳定表达核限制性mKate荧光蛋白的SKBR3人类乳腺癌细胞，并将其命名为SKBR3 NucRed细胞。将20,000个(每个孔)SKBR3NucRed细胞接种于96孔组织培养板中，并使得在50μL含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中附着6小时。将50μL供试品(缀合物8a-2、缀合物8-j、缀合物8c-2和化合物1)的一系列稀释液(基于有效负载0.0.1nM-200nM；生长培养基中的4倍连续稀释液)加入到每个孔中，并将板在37℃下温育20min。然后将PBMC或原代人类单核细胞(如实施例29所述从PBMC中分离)(50,000)加入到每个孔中，并如实施例28所述进行测定。表5显示供试品在癌细胞/PBMC和分离的原代人类单核细胞共培养中的IC50值(杀伤活性)(杀伤癌细胞活性)。
表5
供试品 缀合物8a-2 缀合物8-j 缀合物8c-2 化合物1
IC<sub>50</sub>(nM)-PBMC 0.03 0.91 NA 9.51
IC<sub>50</sub>(nM)-单核细胞 0.05 1.6 NA 8.32
如表5所示，缀合物8a-2在PBMC和单核细胞共培养中分别表现出与化合物1相比较高约300x和约150x的效力。缀合物8-j在PBMC和单核细胞共培养中的效力分别相对于缀合物8a-2低约30x和80x。缀合物8c-2在PBMC和单核细胞共培养两者中活性最低。
CXCL10诱导：表6显示供试品在癌细胞/PBMC和分离的原代人类单核细胞共培养中CXCL10诱导的EC50值。
表6
供试品 缀合物8a-2 缀合物8-j 缀合物8c-2 化合物1
EC<sub>50</sub>(nM)-PBMC 0.06 2.35 NA 26.13
EC<sub>50</sub>(nM)-单核细胞 0.04 2.05 NA 31.10
如表6所示，缀合物8a-2在PBMC和单核细胞共培养中分别表现出与化合物1相比较高约400x和约700x的CXCL10诱导效力。缀合物8-j在PBMC和单核细胞共培养两者中的效力相对于缀合物8a-2低约50x。缀合物8c-2在PBMC和单核细胞共培养两者中活性最低。
III型IFN诱导：如上所述建立SKBR3细胞和PBMC的共培养，以使用人类IL29/IL28bELISA试剂盒分析处理后24小时上清液中III型干扰素的诱导。表7显示供试品在癌细胞/PBMC共培养中IL29/IL28b诱导(IFNλ1/λ3)的EC50值。
表7
供试品 缀合物8a-2 缀合物8-j 缀合物8c-2 化合物1
EC<sub>50</sub>(nM)-PBMC 0.08 0.54 NA 28.30
如表7所示，缀合物8a-2在PBMC共培养中表现出与化合物1相比较高约400x的IL29/IL28b诱导效力。缀合物8-j在PBMC共培养中的效力相对于缀合物8a-2低约6x。缀合物8c-2在PBMC共培养中活性最低。
表7-9中的数据表明，清除FcγR的相互作用的ADC的Fc区中的突变降低但不消除靶向ADC的癌细胞杀伤活性，从而表明ADC的Fc独立性贡献。
实施例34：免疫细胞中STING通路的诱导
通过癌细胞/THP1-IRF3-荧光素酶报告细胞共培养测定，评估靶向Her2的STINGADC对免疫细胞中STING通路的诱导。将SKOV3人类卵巢腺癌细胞接种于96孔CellBind表面组织培养板(20,000/孔)中，并使得在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的McCoy’s 5a培养基中附着6小时。将供试品缀合物32-5、缀合物32e和化合物30的一系列稀释液(基于有效负载0.01nM-300nM；生长培养基中的4倍连续稀释液)加入到每个孔中，并将板在37℃下温育20min。然后将50,000个THP1-双报告细胞加入到每个孔中，并在37℃和5％ CO2的增湿气氛下继续温育20小时。将来自每个温育样品的细胞培养上清液(20μL)加入到重悬浮的QUANTI-Luc(50μl)中，并立即使用SpectraMax M5平板读取器(Molecular Devices)测量IRF3的发光信号。根据剂量反应曲线确定EC50值。表8提供与SKOV3癌细胞共培养的THP1双细胞的EC50值。
表8
供试品 缀合物32-5 缀合物32e 化合物30
EC<sub>50</sub>(nM) 0.78 NA 38.51
如表8所示，SKOV3和THP-1与靶向Her2的ADC共培养的处理导致THP-1免疫细胞中STING通路诱导的次纳摩尔至低纳摩尔EC50值。
实施例35：靶向肿瘤细胞的HER2抗体-药物缀合物在癌细胞/PBMC共培养中的活性
CXCL10诱导：将Calu3人类肺腺癌细胞接种于96孔组织培养板中，并使得在37℃和5％ CO2下，于100μL含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的EMEM培养基中附着过夜。培养基用新鲜培养基(100μL)替换。将50μL供试品(缀合物32-4、化合物30和缀合物32b-1)的一系列稀释液(基于有效负载0.0.1nM-200nM；生长培养基中的4倍连续稀释液)加入到每个孔中，并如实施例33-CXCL10诱导中所述进行测定。表9显示供试品在癌细胞/PBMC和癌细胞单一培养中CXCL10诱导的EC50值。
表9
供试品 缀合物32-4 化合物30 缀合物32b-1
EC<sub>50</sub>(nM)-PBMC 0.06 160.20 NA
如表9所示，缀合物32-4在癌细胞/PBMC共培养和单一培养中与化合物30相比较分别表现出次纳摩尔效力。缀合物32b-1在癌细胞/PBMC共培养和单一培养两者中活性最低。
实施例36：在存在来自未处理的免疫细胞培养的条件培养基的情况下癌细胞单一培养中STING通路的激活。
条件培养基通过在含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中，于37℃和5％ O2下，在温育箱中培养1.5x106/mL PBMC(两种不同供体)、1x106/mL原代单核细胞(从来自两种不同供体的PBMC中分离，如实施例29所述)或1x106/mL THP1细胞24小时来制备。收集上清液，并以2000rpm下旋10分钟以去除细胞。将SKOV3细胞接种于96孔板中(30,000/孔)，并使得在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中附着过夜。培养基用100μL/孔新鲜培养基(对照)或来自未处理免疫细胞的条件培养基替换，然后将化合物1(50μL/孔，100nM终浓度)或对照培养基(无处理)加入到每个孔中。在37℃和5％ O2下温育24小时之后，使用人类CXCL10 ELISA试剂盒分析来自96孔板的上清液中的CXCL10产生。表10显示通过SKOV3癌细胞单一培养产生的CXCL10的O.D.450值。
表10
Figure BDA0003975405560002621
如表10所示，单一培养中的SKOV3细胞仅在存在来自PBMC和原代人类单核细胞的条件培养基的情况下对STING激动剂处理作出反应，而对来自THP1细胞则没有，从而表明PBMC或原代人类单核细胞分泌可使癌细胞对STING激动剂处理敏感的因子。
实施例37：响应于SKOV3中给予HER2抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种SKOV3人类卵巢癌细胞(每只小鼠10x106个细胞)。当肿瘤体积在63-75mm3之间(平均值＝65.4mm3/组)(n＝10只/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天作为单剂量静脉内给药媒介物、曲妥珠单抗(3/0mg/kg)、diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)、缀合物8c-1(1/0.04mg/kg或3/0.12mg/kg)或缀合物8a-1(1/0.03mg/kg或3/0.09mg/kg)(所有剂量通过抗体/有效负载给出)。对diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)和缀合物8c-1(3/0.12mg/kg)在治疗后2-3天观察到可接受的限度范围内的短暂体重减轻且没有另外的临床观察。在后来时间点的体重减轻与肿瘤进展相关，表明肿瘤模型诱发的恶病质。
图6提供用曲妥珠单抗、diABZI STING激动剂、缀合物8c-1、缀合物8a-1或媒介物治疗的SKOV3荷瘤小鼠的肿瘤体积结果。用曲妥珠单抗(3/0mg/kg)、diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)或缀合物8c-1(1/0.04mg/kg或3/0.12mg/kg)治疗导致TGI分别为47.5、36.9、13.5或25.5％。缀合物8a-1(1/0.03mg/kg或3/0.09mg/kg)治疗导致肿瘤消退分别为86.5和100％。
实施例38：SKOV3中给予HER2抗体-药物缀合物后的血清细胞因子
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种SKOV3人类卵巢癌细胞(每只小鼠10x106个细胞)。当肿瘤体积在108-172mm3之间(平均值＝128-131.6mm3)时，将动物随机分到治疗组。第1天静脉内给予媒介物、diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)、缀合物8c-1(3/0.12mg/kg)或缀合物8a-1(3/0.09mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝10)。在给药后6、12、24和72小时收集血清(每组n＝5)并在干冰上速冻用于血清细胞因子分析。在给药后12和72小时收集肿瘤(每个时间点n＝5)并加工成福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)块。
在FlexMap3D Luminex仪器上使用小鼠细胞因子/趋化因子磁珠面板分析血清细胞因子(Eotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFNγ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70),IL-13,IL-15,IL-17,CXCL10(IP-10)、CXCL1(KC)、LIF、LIX、MCP-1、M-CSF、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、RANTES、TNFα和VEGF)。Belysa免疫测定曲线拟合软件用于数据分析。
图7A-7H提供随时间变化的测量细胞因子。仅显示相对于媒介物对照有明显增加的细胞因子(CXCL-10(IP-10)、IL-6、TNFα、IFNγ、CXCL1(KC)、MIG、MIP-1α和RANTES)。每幅图中的插图显示相对于媒介物由缀合物8a-1和缀合物8c-1诱导的细胞因子水平。静脉内给予的diABZI STING激动剂诱导的血清细胞因子水平显著高于缀合物8a-1或缀合物8c-1，IL6的倍数差异高达100倍，而CXCL10的差异低至6倍。对于大多数细胞因子，在对照和靶向ADC之间无显著差异，而在媒介物对照和ADC之间很少有细胞因子显示出差异。主图和插图中的Y轴标度强调diABZI STING激动剂与本研究中其余治疗之间的差异。
实施例39A：SKOV3中给予HER2抗体-药物缀合物后的PD反应
将6周龄雌性CB.17 SCID皮下接种SKOV3人类卵巢癌细胞(每只小鼠10x106个细胞)。当肿瘤体积在75-126mm3之间(平均值＝94.5-96.7mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天静脉内给予媒介物、缀合物8c-1(3/0.12mg/kg)或缀合物8a-1(3/0.09mg/kg)、缀合物8c-1(3/0.12mg/kg)或缀合物8a-1(3/0.09mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝12)。在给药后6、12、24和72小时收集血清(每组n＝6)并在干冰上速冻用于血清细胞因子分析(数据未显示)。在12和72小时收集肿瘤(每组n＝6)并固定于FFPE块中用于进一步处理。
对于实时qPCR分析，使用Qiagen Rneasy FFPE试剂盒从FFPE块中提取RNA。基于纳米微滴读数和使用Thermofisher SuperScript IV VILO Master Mix产生的cDNA对样品进行平衡，小鼠CXCL10、干扰素-β和IL-6的exDNase Enzyme基因表达测定用TaqMan FastAdvanced Master Mix建立。小鼠干扰素-β(IFNβ)、IL-6和CXCL10的ABI测定与作为管家基因的GAPDH和RPL30一起使用。使用2-ΔΔCT方法计算相对于GAPDH的mRNA水平。
图8A-8C提供在12和72小时测量的SKOV3肿瘤中小鼠CXCL10、干扰素-β和IL-6mRNA的水平。用缀合物8a-1治疗导致相对于媒介物或缀合物8c-1在12小时CXCL10、干扰素-β和IL-6mRNA的水平最高。对于缀合物8a-1，CXCL10、干扰素-β和IL-6mRNA水平在72小时全部降低。
图9提供对缀合物8a-1、缀合物8c-1或媒介物在12和72小时用兔抗CD45单克隆抗体进行FFPE肿瘤组织切片的CD45免疫组织化学(IHC)染色。如所显示的那样，在用缀合物8a-1治疗后72小时，CD45阳性小鼠免疫细胞向SCID小鼠中SKOV3肿瘤中的浸润增加。
实施例39B：SCID小鼠中的SKOV3人类肿瘤异种移植物响应于HER2抗体-药物缀合物的STING通路基因表达。
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种SKOV3人类卵巢癌细胞，并如实施例38所述用缀合物8a-1(3/0.09mg/kg)进行治疗。如实施例31所述收获肿瘤并加工成FFPE。根据试剂盒说明，使用Qiagen Rneasy FFPE试剂盒提取RNA。将每个样品150ng RNA在NanoStringnCounter Max系统上使用nCounter泛癌人类或小鼠免疫分析面板和nCounter StandardMaster试剂盒进行分析。表11显示所选STING通路基因在12小时的log2倍数变化。
表11
Figure BDA0003975405560002651
如表11所示，单次给予缀合物8a-1导致小鼠和人类STING通路基因两者的显著诱导，表明靶向肿瘤的STING激动剂ADC可在体内肿瘤中诱导肿瘤固有的STING通路激活。
实施例40：靶向Her-2的ADC在CB17 SCID小鼠中的药代动力学分析
将10周龄雌性CB.17 SCID小鼠第1天作为单剂量静脉内给药媒介物或缀合物8a-1(3/0.1mg/kg)(剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝3)。在治疗后1、24、48、72、96、168、240和336小时从所有动物连续采集血液(每组n＝3)。将全血立即用酸性缓冲液(0.6％ BSA(w/v)，5mM EDTA在100mL PBS+15.34ml 10mg/mL柠檬酸中)1:10稀释，总体积为0.1mL。将稀释的全血在干冰上速冻并储存于-80℃下，直至分析总抗体和缀合药物。
图10提供总抗体和缀合药物的循环血浆浓度的结果。总抗体和缀合药物分别达到血浆浓度为约25.1μg/mL和约0.46μg/mL，并且总抗体的相应清除率为约6.71mL/天/kg和缀合药物为约20.2mL/天/kg。
类似地，给予缀合物32-3(1.14/0.04mg/kg)，并在0.25、24、72、168、240和336小时评价总抗体和缀合药物。数据如表12所示。
表12
Cmax(ng/mL) 半衰期(天) AUC∞(天*ng/mL) Cl_obs(mL/天/Kg)
缀合药物 562±16 6.43±1.15 2880±468 14.2±2.51
总抗体 12200±1160 8.69±1.20 96300±7190 11.9±0.88
实施例41：SKBR3癌细胞/PBMC共培养中的STING通路基因响应于Her2靶向STING激动剂ADC治疗的表达。
Nanostring分析：将癌细胞(250,000个细胞/孔)一式两份接种于12孔板中的0.75mL培养基(含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基)中，并使得在37℃下于5％ CO2温育箱中附着过夜。移除培养基并将缀合物8a-3或媒介物加入到孔中的0.5mL培养基中，最终浓度为50nM(基于有效负载)。将每孔500,000PBMC加入到每个孔中的0.5mL培养基中。在37℃下温育5小时之后，将悬浮细胞收集在Eppendorf管中并短暂下旋。移除上清液并将管置于冰上。用RNA裂解缓冲液裂解附着的细胞，并将其转移到悬浮细胞沉淀上。根据试剂盒说明，使用Qiagen Rneasy mini试剂盒提取RNA。将每个样品150ng RNA在NanoString nCounter Max系统上使用nCounter泛癌人类免疫分析面板和nCounterStandard Master试剂盒进行分析。
表13显示通过缀合物8a-3相对于媒介物处理(5小时)所选STING通路基因在体外SKBR3癌细胞和PBMC共培养中的log2倍数变化。50nM缀合物8a-3处理导致STING通路基因和III型干扰素(IFNλ1和IFNλ2)的显著诱导，证实靶向肿瘤的STING激动剂ADC处理也在体外癌症/免疫细胞共培养中诱导STING通路基因以及II型干扰素。
表13
Figure BDA0003975405560002661
Figure BDA0003975405560002671
III型干扰素基因的qPCR分析：如上所述建立SKBR3/PBMC共培养，并用50nM和1nM(基于有效负载)的缀合物8a-3或缀合物8c-2处理5小时。如上所述收获细胞并提取RNA。如实施例39A所述进行qPCR分析。人类IFNλ1(IL29)、IFNλ2(IL28a)和IFNλ3(IL28b)的ABI测定与作为管家基因的GAPDH和ACTB一起使用。使用2-ΔΔCT方法计算相对于GAPDH的mRNA水平，如表14所示。
表14
Figure BDA0003975405560002672
表14显示响应于癌细胞/PBMC共培养的靶向ADC和对照ADC处理相对于管家基因的III型干扰素的mRNA表达。以50nM和1nM有效负载剂量两者的缀合物8a-3处理均诱导III型干扰素基因显著上调。在本实验中使用的剂量下，缀合物8c-2处理并未显著诱导III型干扰素。
实施例42：STING野生型或敲除型SKBR3癌细胞和PBMC共培养中III型干扰素的诱导
STING野生型或敲除型癌细胞(如实施例30所述)和PBMC共培养物用缀合物8a-3、缀合物8j-1、缀合物8c-2和化合物1(基于有效负载0.0.1nM-200nM；4倍连续稀释液)处理，并且如实施例33-III型干扰素诱导中所述测量III型干扰素IFNλ1/IFNλ3(IL29/IL28b)细胞因子。
表15显示STING野生型或STING敲除型SKBR3和PBMC共培养中响应于缀合物8a-3、缀合物8j-1、缀合物8c-2和化合物1的III型干扰素IFNλ1/IFNλ3(IL29/IL28b)细胞因子产生。
表15
Figure BDA0003975405560002681
缀合物8a-3和缀合物8j-1两者均在STING野生型SKBR3细胞共培养中诱导强烈的III型干扰素IFNλ1/IFNλ3(IL29/IL28b)细胞因子产生。化合物1在该共培养环境下还诱导III型干扰素IFNλ1/IFNλ3(IL29/IL28b)产生，但EC50浓度低约400x，而缀合物8c-2无显著活性。STING敲除型SKBR3细胞共培养中IFNλ1/IFNλ3(IL29/28b)产生的量响应于所有处理而显著减少，这从极低Bmax(OD450)水平可以明显看出。
实施例43A：IFNλ1(IL29)或IFNλ2(IL28A)中和抗体对癌细胞和PBMC共培养中靶向Her2的STING ADC杀伤活性的影响
癌细胞杀伤活性：如实施例33-III型干扰素诱导中所述进行SKBR3和PBMC共培养，以评价缀合物8a-3(基于有效负载1nM或0.1nM)在存在IFNλ1(IL29)或IFNλ2(IL28b)中和抗体(10、2、0.4、0.08μg/mL)的情况下的杀伤活性。如图11所示，IFNλ1中和抗体在10、2和0.4μg/mL下抑制PBMC共培养中缀合物8a-3在0.1nM(基于有效负载)下的杀伤活性。当缀合物8a-3在1nM(基于有效负载)下使用时，对IFNλ1抗体观察到无抑制，甚至当缀合物8a-3以0.1nM给药时，IFNλ2中和抗体不抑制癌细胞杀伤活性。
实施例43B：IFNλ1/IFNλ3(L29/28b)细胞因子诱导
使用实施例43A中描述的测定的姐妹板，以使用如实施例33-III型干扰素诱导中所述的人类IL29/28b ELISA试剂盒在处理后24小时分析上清液中的IFNλ1/IFNλ3(IL29/28b)。表16显示获自每种条件的OD450值。
表16
Figure BDA0003975405560002691
实施例43C：CXCL10、IFNβ、IL6和TNFα细胞因子诱导.使用来自实施例43B的上清液，以在FlexMap3D Luminex仪器上使用人类细胞因子/趋化因子磁珠面板分析CXCL10、IFNβ、IL6和TNFα细胞因子产生。Belysa免疫测定曲线拟合软件用于数据分析。表17显示上清液中检测到的CXCL10、FNβ、IL6和TNFα细胞因子。
表17
Figure BDA0003975405560002692
Figure BDA0003975405560002701
这些数据一起表明III型干扰素产生对靶向肿瘤细胞的STING-ADC活性为重要的，尤其是在低浓度下。
实施例44：响应于OVCAR-3中给予NaPi2b抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将5周龄雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种OVCAR-3细胞(每只小鼠5x106个细胞)。当肿瘤体积在52-180mm3之间(平均值：93-94mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天作为单剂量静脉内给药媒介物、diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)、缀合物8c-1(3/0.12mg/kg)、缀合物8b-1(3/0.09mg/kg)或缀合物8f(3/0.12mg/kg)(所有剂量通过抗体/有效负载给出，每组n＝8)。对diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)、缀合物8c-1、缀合物8b-1和缀合物8f在治疗后3-13天观察到短暂体重减轻且没有另外的临床观察。
图12提供用媒介物、diABZI STING激动剂、缀合物8c-1、缀合物8b-1或缀合物8f治疗的OVCAR-3荷瘤小鼠的结果。当与媒介物对照相比较，用缀合物8c-1(3/0.12mg/kg)治疗导致肿瘤生长平均增加70.6％。用diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)治疗导致TGI为42.7％。用缀合物8b-1(3/0.09mg/kg)治疗导致TGI为98.4％。用缀合物8f治疗导致TGI为83.1％。
实施例45：响应于OVCAR-3中给予嵌合(hIgG1-mIgG2a)NaPi2b抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种OVCAR-3人类卵巢癌细胞(每只小鼠5x106个细胞)。当肿瘤体积在53-223mm3之间(平均值＝112-122mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天静脉内给予媒介物、缀合物8d-2(3/0.1mg/kg)或缀合物8e(3/0.1mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝8)。对缀合物8d-2(3/0.1mg/kg)和缀合物8e(3/0.1mg/kg)在治疗后3-15天观察到可接受的限度范围内的短暂体重减轻且没有另外的临床观察。
图13提供用媒介物、缀合物8d-2或缀合物8e治疗的OVCAR-3荷瘤小鼠肿瘤体积的结果。用缀合物8d-2(3/0.1mg/kg)治疗导致TGI为37.3％。用缀合物8e(3/0.1mg/kg)治疗导致TGI为95.8％。
实施例46：响应于三阴性乳腺癌异种移植模型中给予靶标C抗体-药物缀合物的肿瘤生长
向8周龄雌性NCr nu/nu小鼠(Charles River Laboratories)植入表达靶标C的人类三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤片段(1mm3)。当肿瘤体积在63-108mm3之间(平均值＝80.7-82mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天作为单剂量静脉内给药媒介物、diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)、缀合物8c-1(1/0.04mg/kg)或缀合物8h(1/0.04mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝9)。对diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)在治疗后2天观察到可接受的限度范围内的短暂体重减轻且没有另外的临床观察。
图14提供用媒介物、diABZI STING激动剂、缀合物8c-1或缀合物8h治疗的人类TNBC荷瘤小鼠肿瘤体积的结果。用diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)治疗导致TGI为52.4％。用缀合物8c-1治疗导致TGI为35.1％。用缀合物8h(1.1/00.4mg/kg)治疗导致TGI为51.8％。
实施例47：响应于结肠癌中给予靶标D抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将7-8周龄雌性C57Bl/6小鼠右侧皮下接种小鼠结肠癌细胞(每只小鼠5x105个细胞)。接种后10天，当肿瘤体积在63-108mm3之间(平均值＝78mm3/组)之间时，将动物随机分到治疗组。第1天作为单剂量静脉内给药媒介物、缀合物8d-3(1/0.04mg/kg)或缀合物8g(0.09/0.04mg/kg)(所有剂量表示为抗体/有效负载，每组n＝10)。对缀合物8g(0.9/0.04mg/kg)在治疗后2天观察到可接受的限度范围内的短暂体重减轻且没有另外的临床观察。
图15A提供用媒介物、缀合物8d-3或缀合物8g治疗的鼠结肠癌荷瘤小鼠肿瘤体积的结果。用缀合物8d-3治疗导致TGI为42％。而用缀合物8g治疗导致TGI为92.5％。
图15B显示用媒介物、缀合物8d-3或缀合物8g治疗的鼠结肠癌荷瘤小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。用缀合物8d-3治疗。用缀合物8g治疗的小鼠存活最长。
实施例48：响应于给予靶标D抗体-药物缀合物的肿瘤生长的再激发研究
将先前用图16A所示的来自实施例36的缀合物8g(0.9/0.04mg/kg)治疗的无瘤小鼠(9只中的6只)和来自实施例38的年龄匹配未治疗动物左侧皮下接种鼠结肠癌细胞(每只小鼠5x105个细胞)和右侧皮下接种鼠肺癌细胞(每只小鼠1x106个细胞)(分别为n＝6和12)。先前用缀合物8g(0.9/0.04mg/kg)治疗的小鼠当用鼠结肠癌细胞或鼠肺癌细胞再激发时的肿瘤生长分别如图16B和图16C所示。当与相应未治疗的对照相比较时，先前用缀合物8g治疗导致鼠肺癌模型的TGI为25.5％和鼠结肠癌模型的TGI为99.8％。
实施例49：响应于胚胎癌中给予靶标E抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将雌性Balb/C小鼠皮下接种鼠胚胎癌细胞(每只小鼠5x105个细胞)。当肿瘤体积在56-108mm3之间(平均值＝75.3-76.5mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天作为单剂量静脉内给药媒介物、diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)、缀合物8d-3(5.5/0.18mg/kg)或缀合物8i(3.2/0.18mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝10)。对diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)和缀合物8i(3.2/0.18mg/kg)在治疗后2天观察到可接受的限度范围内的短暂体重减轻且没有另外的临床观察。
图17提供用媒介物、diABZI STING激动剂、缀合物8d-3或缀合物8i治疗的鼠胚胎癌荷瘤小鼠肿瘤体积的结果。用缀合物8d-3(5.5/0.18mg/kg)治疗导致TGI分别为27.5和66.5％。用diABZI STING激动剂(0/5mg/kg)治疗导致TGI为93.8％。用缀合物8i(3.2/0.18mg/kg)治疗导致TGI分别为20.5和100％。
实施例50：响应于SKOV3卵巢癌中给予HER2抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种SKOV3人类卵巢癌细胞(每只小鼠10x106个细胞)。当肿瘤体积在63-75mm3之间(平均值＝65.4mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天作为单剂量静脉内给药媒介物、缀合物34a(3/0.11mg/kg)、缀合物34(3/0.11mg/kg)、缀合物20a(3/0.09mg/kg)或缀合物20-1(3/0.10mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝10)。对缀合物34a、缀合物20a、缀合物34和缀合物20-1在治疗后2-3天观察到可接受的限度范围内的短暂体重减轻且没有另外的临床观察。在后来时间点的体重减轻与肿瘤进展相关，表明肿瘤模型诱发的恶病质。
图18提供用媒介物、缀合物34a、缀合物34、缀合物20a或缀合物20-1(3/0.09mg/kg)治疗的SKOV3荷瘤小鼠肿瘤体积的结果。用缀合物20a(3/0.09mg/kg)或缀合物34a(3/0.11mg/kg)治疗导致TGI分别为21和65.9％。用缀合物34(3/0.11mg/kg)或缀合物20-1(3/0.10mg/kg)治疗各自导致平均肿瘤消退为100％。
实施例51：响应于SKOV3卵巢癌中给予HER2抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种SKOV3人类卵巢癌细胞(每只小鼠10x106个细胞)。当肿瘤体积在88-126mm3之间(平均值＝112.8-113.2mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天作为单剂量静脉内给药媒介物、缀合物28(0.3/0.01mg/kg或1/0.03mg/kg)、缀合物29(0.2/0.01mg/kg或0.8/0.02mg/kg)、缀合物8-2(0.3/0.01mg/kg或1/0.04mg/kg)、缀合物25(0.3/0.01mg/kg或1/0.04mg/kg)或缀合物45(0.3/0.01mg/kg或1/0.04mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝10)。对缀合物25(1/0.04mg/kg)在治疗后3天观察到可接受的限度范围内的短暂体重减轻且没有另外的临床观察。在后来时间点的体重减轻与肿瘤进展相关，表明肿瘤模型诱发的恶病质。
图19提供用媒介物、缀合物28、缀合物29、缀合物8-2、缀合物25和缀合物45治疗的SKOV3荷瘤小鼠的肿瘤体积。用缀合物28(0.3/0.01mg/kg或1/0.03mg/kg)、缀合物29(0.2/0.01mg/kg或0.8/0.02mg/kg)、缀合物8-2(0.3/0.01mg/kg或1/0.04mg/kg)、缀合物25(0.3/0.01mg/kg)、缀合物45(0.3/0.01mg/kg或1/0.04mg/kg)治疗导致TGI分别为17.6、97.6、12.1、86.9、10.9、70.3、81.9、15.8和27.2％。用缀合物25(1/0.04mg/kg)治疗导致平均肿瘤消退为74.5％。
实施例52：响应于SKOV3卵巢癌中给予HER2抗体-药物缀合物的反肿瘤生长
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种SKOV3人类卵巢癌细胞(10x106个细胞/小鼠+50％ Matrigel)。当肿瘤体积在63-75mm3之间(平均值＝67.8mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。媒介物(盐水，每三天一次x3或每五天一次x5)、diABZI STING激动剂(1.5mg/kg每三天一次x3或0.128mg/kg每天一次x1)、化合物30(1.5mg/kg每三天一次x3或0.128mg/kg每天一次x1)、缀合物32b-2(3.42/0.128mg/kg每天一次x1)、XMT-1519(3.00mg/kg每天一次x1)、缀合物32-5(0.100/0.004、0.300/0.013、1.00/0.042或3.00/0.117mg/kg每天一次x1)、缀合物32e(1.00/0.039或3.00/0.117mg/kg每天一次x1)均在第1天开始静脉内给药(所有剂量作为抗体有效负载给出，每组n＝10)。
图20提供用媒介物、diABZI STING激动剂、化合物30、缀合物32b-2、XMT-1519、缀合物32-5或缀合物32e治疗的SKOV3荷瘤小鼠的肿瘤体积。用缀合物32-5以1.00/0.042或3.00/0.117mg/kg治疗导致10/10完全缓解。
实施例53：响应于设计改造以表达人类HER2的4T1中给予HER2抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将雌性Balb/C小鼠皮下接种设计改造以表达人类HER2(4T1-hHER2)的4T1鼠乳腺癌细胞(每只小鼠2x106个细胞)。当肿瘤体积在75-88mm3之间(平均值＝71.5-80.3mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天作为单剂量静脉内给药媒介物、缀合物8d-3(1/0.04mg/kg)或缀合物8k(0.9/0.04mg/kg)(所有剂量作为抗体有效负载给出，每组n＝10)。对缀合物8k(0.9/0.04mg/kg)在治疗后2天观察到可接受的限度范围内的短暂体重减轻且没有另外的临床观察。
图21A提供用媒介物、缀合物8d-3(1/0.04mg/kg)或缀合物8k(0.9/0.04mg/kg)治疗的4T1-hHER2荷瘤小鼠的肿瘤体积。用缀合物8d-3(1/0.04mg/kg)治疗导致TGI为85.4％(图21B)。用缀合物8k(0.9/0.04mg/kg)治疗导致平均肿瘤消退为93.2％，在研究结束时10只动物中的8只无瘤(图21C)。
实施例54：响应于SKOV3卵巢癌中给予Fc突变型HER2抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种SKOV3人类卵巢癌细胞(10x106个细胞/小鼠)。当肿瘤体积在63-75mm3之间(平均值＝72.6mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天静脉内给药媒介物、缀合物8c-2(3.17/0.10mg/kg)、缀合物8a-2(2.7/0.10mg/kg或0.81/0.03mg/kg)、缀合物8j(2.71/0.10mg/kg或0.81/0.03mg/kg)或diABZI IV STING激动剂(0/5mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝10)。
图22提供用缀合物8c-2、缀合物8a-2、缀合物8j或diABZI IV STING激动剂治疗的SKOV3荷瘤小鼠的肿瘤体积。用缀合物8a-2(2.70/0.10mg/kg)治疗导致10只CR和10只TFS。用缀合物8a-2(0.81/0.030mg/kg)治疗导致2只PR、8只CR和3只TFS。用缀合物8j(2.71/0.10mg/kg)治疗导致2只PR和6只CR。用缀合物8j(0.81/0.03mg/kg)治疗导致3只PR和1只CR。用diABZI IV STING激动剂(0/5mg/kg)治疗导致7只PR。
实施例55：NaPi2b抗体-药物缀合物与人类卵巢癌细胞的体外结合
使OVCAR3细胞在补充有FBS(20％)和青霉素/链霉素(1％)的RPMI 1640培养基中生长至约80-95％的融合度。收获细胞并加入到96孔U形底板的孔中(50,000/孔)。将细胞沉淀(300x g,5分钟)并如表18所示以0.01nM-300nM之间范围内的浓度重悬浮于供试品的溶液中，且在冰上温育1小时。然后将细胞在冰冷的PBS(3x)中洗涤，沉淀(300g,5分钟)，并与检测抗体(山羊抗人IgG-Alexa-647(H+L链)一起在4℃下温育1小时。将细胞悬液沉淀(300g，5分钟)，在冰冷的PBS中洗涤3次，并通过重悬浮于多聚甲醛溶液(1％)中固定。重悬浮的细胞然后在MACS Quant流式细胞仪上进行流式细胞术分析。收集单个事件(10,000)进行分析。用MACS Quant软件进行群门控和平均荧光强度(MFI)分析。表18概述细胞结合的平均EC50值。
表18
供试品 DAR 细胞结合EC<sub>50</sub>(nM)
缀合物60-1 6.2 3.33
缀合物32d 8.8 2.99
缀合物32b-1 5.7 ND
缀合物8b-3 6.4 8.13
XMT-1535 NA 4.29
XMT-1535 NA 3.74
XMT-1535 mIgG2a NA 4.13
人类IgG对照 NA ND
ND＝未测定；NA＝不适用
如表18所示，NaPi2b ADC与OVCAR3细胞结合的EC50值在低纳摩尔范围内，而同种型对照未与OVCAR3细胞结合。
实施例56：OVCAR3人类卵巢癌和THP1报告细胞共培养测定中NaPi2b生物缀合物的功能活性
以癌细胞/THP1-IRF3-荧光素酶报告细胞共培养测定评估靶向NaPi2b的STINGADC对免疫细胞中STING通路的诱导。将OVCAR3人类卵巢癌细胞接种于96孔CellBind表面组织培养板(20,000/孔)中，并使得在含有20％ FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中附着6小时。将供试品的一系列稀释液(基于有效负载0.01nM-300nM；生长培养基中的3倍连续稀释液)加入到每个孔中，并将板在37℃下温育20min。然后将50,000THP1-双报告细胞加入到每个孔中，并在37℃和5％ CO2下继续温育20小时。将来自每个温育样品的细胞培养上清液(20μl)加入到重悬浮的QUANTI-Luc(50μl)中，并立即使用SpectraMax M5平板读取器(Molecular Devices)测量发光信号。根据剂量反应曲线确定EC50值。表19提供与OVCAR3癌细胞共培养的THP1双细胞的EC50值。
表19
供试品 缀合物32a 缀合物32d 缀合物32c 缀合物32b-1 缀合物8b-3
EC<sub>50</sub>(nM) 0.29 0.47 NA NA 0.21
如表19所示，OVCAR3和THP-1与NaPi2b-ADC共培养的治疗导致THP-1免疫细胞中STING通路诱导的EC50值为次纳摩尔级，而同种型对照则无活性。
实施例57：响应于OVCAR-3中给予NaPi2b抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种OVCAR-3人类卵巢癌细胞(5x106个细胞/小鼠)。当肿瘤体积在56-122mm3之间(平均值＝83.9-84.7mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天静脉内给药媒介物、缀合物32b-1(3.39/0.10mg/kg)、缀合物32a(0.93/0.03或3.12/0.10mg/kg)、缀合物32c(2.12/0.10mg/kg)、缀合物32d(2.20/0.10mg/kg)或diABZI IVSTING激动剂(0/5mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝10)。
图23提供用缀合物32b-1、缀合物32a、缀合物32c、缀合物32d或diABZI IV STING激动剂治疗的OVCAR-3荷瘤小鼠肿瘤体积的结果。
实施例58：响应于OVCAR-3中给予NaPi2b STING抗体-药物缀合物与NaPi2b AF-HPA抗体-药物缀合物的组合的肿瘤生长
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种OVCAR-3人类卵巢癌细胞(5x106个细胞/小鼠)。当肿瘤体积在68-247mm3之间(平均值＝148-148.2mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天静脉内给药媒介物、利妥昔单抗AF-HPA ADC(0.75/0.023mg/kg)和缀合物8c-2(4.0/0.126mg/kg)的组合、XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)、缀合物8b-2(2.0/0.071或4.0/0.142mg/kg)、XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和缀合物8c-2(4.0/0.126mg/kg)的组合、利妥昔单抗AF-HPA ADC(0.75/0.023mg/kg)和缀合物8b-2(4.0/0.142mg/kg)的组合、利妥昔单抗AF-HPA ADC(0.75/0.023mg/kg)和缀合物8b-2(2.0/0.071mg/kg)的组合、XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和缀合物8b-2(4.0/0.142mg/kg)的组合、XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和缀合物8b-2(2.0/0.071mg/kg)的组合、XMT-1535AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和XMT-1535(4.0/0mg/kg)的组合或XMT-1535(4.75/0mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝10)。
图24提供用以下治疗的OVCAR-3荷瘤小鼠肿瘤体积的结果：媒介物、利妥昔单抗AF-HPA ADC和缀合物8c-2的组合、XMT-1535 AF-HPA ADC、缀合物8b-2、XMT-1535 AF-HPAADC和缀合物8c-2的组合、利妥昔单抗AF-HPA ADC和缀合物8b-2的组合、利妥昔单抗AF-HPAADC和缀合物8b-2的组合、XMT-1535 AF-HPA ADC和缀合物8b-2的组合、XMT-1535 AF-HPAADC和缀合物8b-2的组合、XMT-1535 AF-HPA ADC和XMT-1535的组合或XMT-1535。所有计算均基于第22天的值。用利妥昔单抗AF-HPA ADC(0.75/0.023mg/kg)和缀合物8c-2(4.0/0.126mg/kg)的组合治疗导致TGI为25.1％(n＝10)。用XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)治疗导致TGI为71.6％(n＝9)和平均肿瘤收缩为71.2％(n＝1)。用缀合物8b-2(4.0/0.142mg/kg)治疗导致TGI为72.9％(n＝9)和平均肿瘤收缩为48％(n＝1)。用缀合物8b-2(2.0/0.071mg/kg)治疗导致TGI为59.8％(n＝10)。用XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和缀合物8c-2(4.0/0.126mg/kg)的组合治疗导致TGI为85.1％(n＝9)和平均肿瘤收缩为24.6％(n＝1)。用利妥昔单抗AF-HPA ADC(0.75/0.023mg/kg)和缀合物8b-2(4.0/0.142mg/kg)的组合治疗导致TGI为61.7％(n＝10)。用利妥昔单抗AF-HPA ADC(0.74/0.023mg/kg)和缀合物8b-2(2.0/0.071mg/kg)的组合治疗导致TGI为55.7％(n＝10)。用XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和缀合物8b-2(4.0/0.142mg/kg)的组合治疗导致TGI为95.2％(n＝4)和平均肿瘤收缩为60.5％(n＝6)。用XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和缀合物8b-2(2.0/0.071mg/kg)的组合治疗导致TGI为98.2％(n＝8)和平均肿瘤收缩为17.8％(n＝2)。用XMT-1535 AF-HPA ADC(0.75/0.024mg/kg)和XMT-1535(4.00/0mg/kg)的组合治疗导致TGI为68.2％(n＝9)和平均肿瘤收缩为23.7％(n＝1)。用XMT-1535(4.75/0mg/kg)治疗导致TGI为0.6％(n＝10)。
实施例59：响应于SKOV3卵巢癌中给予HER2抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种SKOV3人类卵巢癌细胞(10x106个细胞/小鼠)。当肿瘤体积在75-100mm3之间(平均值＝84-85mm3/组)时，将动物随机分到治疗组。第1天静脉内给药媒介物、缀合物32b(0.85/0.03mg/kg)、缀合物32-2(0.90/0.03mg/kg)、缀合物88(0.87/0.03mg/kg)、缀合物85(2.87/0.10mg/kg)、缀合物92(2.36/0.10mg/kg)、缀合物100(2.23/0.10mg/kg)、缀合物89(0.99/0.030mg/kg)、缀合物85a(2.59/0.10mg/kg)、缀合物93(2.85/0.10mg/kg)或缀合物101(2.70/0.10mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝10)。
图25提供用缀合物32b、缀合物32-2、缀合物88、缀合物85、缀合物92、缀合物100、缀合物89、缀合物85a、缀合物93和缀合物101治疗的SKOV3荷瘤小鼠肿瘤体积的结果。用缀合物32-2(0.90/0.03mg/kg)治疗导致1只PR、9只CR和5只TFS。用缀合物88(0.87/0.03mg/kg)治疗导致6只CR和4只TFS。用缀合物85(2.87/0.10mg/kg)治疗导致9CR和8TFS。用缀合物100(2.23/0.10mg/kg)治疗导致1只PR。
实施例60：响应于SKOV3中给予HER2抗体-药物缀合物的肿瘤生长
将雌性CB.17 SCID小鼠皮下接种SKOV3人类卵巢癌细胞(10x106个细胞/小鼠)。当肿瘤体积在75-144mm3之间(平均值＝112-114mm3/组)时，将动物随机分到治疗组(n＝10/组)。第1天静脉内给药媒介物、缀合物28(0.99/0.0325mg/kg)或缀合物62(0.9/0.0325mg/kg)(所有剂量作为抗体/有效负载给出，每组n＝10)。
图26提供用媒介物、缀合物28或缀合物62(HER2靶向)治疗的SKOV3荷瘤小鼠肿瘤体积的结果。用缀合物28(0.99/0.0325mg/kg)治疗导致为1只PR、8只CR和5只TFS。用缀合物62(0.92/0.0325mg/kg)治疗导致2只PR、7只CR和4只TFS。
实施例61：SKOV3中HER2抗体-药物缀合物的药代动力学
将雌性CB.17 SCID小鼠用单次静脉内注射媒介物、缀合物28(3.0/0.10mg/kg)或缀合物62(2.84/0.10mg/kg)进行治疗(所有剂量作为抗体/有效负载给予，每组n＝4)。治疗后15分钟、1、6、24、48、72、96、168和336小时收集血浆。血浆以1.33mg/ml柠檬酸酸1:10稀释，总体积为0.1ml。将稀释的血浆在干冰上速冻并储存于-80℃下，直至PK分析。
图27提供缀合药物的循环血浆浓度的结果。缀合物28和缀合物62分别达到血浆浓度为约2.5μg/mL和约1.8μg/mL，并且相应的清除率分别为约9.05mL/天/kg和约14.6mL/天/kg。
等效物
本发明一个或多个实施方案的细节在以上所附描述中阐述。尽管在本公开的实践或测试中可使用与本文描述的方法和材料类似或等效的那些，但现描述这些方法和材料。本公开的其他特征、目的和优势将从描述和权利要求中显而易见。在说明书和所附权利要求中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式包括复数指涉。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本说明书中引用的所有专利和出版物均通过参考并入。
上述描述仅出于说明的目的而呈现，并且不旨在将本发明限于所公开的精确形式，而是由在此所附的权利要求限定。
<110> 梅尔莎纳医疗公司
<120> 包含STING激动剂的抗体药物缀合物
<130> MRSN-033/001WO
<150> US 63/004,108
<151> 2020-04-02
<150> US 63/040,755
<151> 2020-06-18
<150> US 63/111,820
<151> 2020-11-10
<160> 31
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
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agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacaaca tccactgggt caagcaggcc 120
cctggacagg gactcgaatg gatcggagcc atctatcccg gcaacggcga caccagctac 180
aagcagaagt tccggggcag agccacactg accgccgata caagcaccag caccgtgtac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggac agcgccgtgt actattgcgc cagaggcgaa 300
acagccagag ccacctttgc ctattggggc cagggaaccc tggtcaccgt tagctct 357
<210> 14
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
gatattcaga tgacacagag ccccagcagc ctgtctgcct ctgtgggaga cagagtgacc 60
atcacctgta gcgccagcca ggatatcggc aacttcctga actggtatca gcagaaaccc 120
ggcaagaccg tgaaggtgct gatctactac acctccagcc tgtacagcgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc tggcaccgac tacaccctga ccatatctag cctgcagcct 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcaagc tgcccctgac atttggccag 300
ggcaccaagc tggaactgaa g 321
<210> 15
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Met Ala Pro Trp Pro Glu Leu Gly Asp Ala Gln Pro Asn Pro Asp Lys
1 5 10 15
Tyr Leu Glu Gly Ala Ala Gly Gln Gln Pro Thr Ala Pro Asp Lys Ser
20 25 30
Lys Glu Thr Asn Lys Thr Asp Asn Thr Glu Ala Pro Val Thr Lys Ile
35 40 45
Glu Leu Leu Pro Ser Tyr Ser Thr Ala Thr Leu Ile Asp Glu Pro Thr
50 55 60
Glu Val Asp Asp Pro Trp Asn Leu Pro Thr Leu Gln Asp Ser Gly Ile
65 70 75 80
Lys Trp Ser Glu Arg Asp Thr Lys Gly Lys Ile Leu Cys Phe Phe Gln
85 90 95
Gly Ile Gly Arg Leu Ile Leu Leu Leu Gly Phe Leu Tyr Phe Phe Val
100 105 110
Cys Ser Leu Asp Ile Leu Ser Ser Ala Phe Gln Leu Val Gly Gly Lys
115 120 125
Met Ala Gly Gln Phe Phe Ser Asn Ser Ser Ile Met Ser Asn Pro Leu
130 135 140
Leu Gly Leu Val Ile Gly Val Leu Val Thr Val Leu Val Gln Ser Ser
145 150 155 160
Ser Thr Ser Thr Ser Ile Val Val Ser Met Val Ser Ser Ser Leu Leu
165 170 175
Thr Val Arg Ala Ala Ile Pro Ile Ile Met Gly Ala Asn Ile Gly Thr
180 185 190
Ser Ile Thr Asn Thr Ile Val Ala Leu Met Gln Val Gly Asp Arg Ser
195 200 205
Glu Phe Arg Arg Ala Phe Ala Gly Ala Thr Val His Asp Phe Phe Asn
210 215 220
Trp Leu Ser Val Leu Val Leu Leu Pro Val Glu Val Ala Thr His Tyr
225 230 235 240
Leu Glu Ile Ile Thr Gln Leu Ile Val Glu Ser Phe His Phe Lys Asn
245 250 255
Gly Glu Asp Ala Pro Asp Leu Leu Lys Val Ile Thr Lys Pro Phe Thr
260 265 270
Lys Leu Ile Val Gln Leu Asp Lys Lys Val Ile Ser Gln Ile Ala Met
275 280 285
Asn Asp Glu Lys Ala Lys Asn Lys Ser Leu Val Lys Ile Trp Cys Lys
290 295 300
Thr Phe Thr Asn Lys Thr Gln Ile Asn Val Thr Val Pro Ser Thr Ala
305 310 315 320
Asn Cys Thr Ser Pro Ser Leu Cys Trp Thr Asp Gly Ile Gln Asn Trp
325 330 335
Thr Met Lys Asn Val Thr Tyr Lys Glu Asn Ile Ala Lys Cys Gln His
340 345 350
Ile Phe Val Asn Phe His Leu Pro Asp Leu Ala Val Gly Thr Ile Leu
355 360 365
Leu Ile Leu Ser Leu Leu Val Leu Cys Gly Cys Leu Ile Met Ile Val
370 375 380
Lys Ile Leu Gly Ser Val Leu Lys Gly Gln Val Ala Thr Val Ile Lys
385 390 395 400
Lys Thr Ile Asn Thr Asp Phe Pro Phe Pro Phe Ala Trp Leu Thr Gly
405 410 415
Tyr Leu Ala Ile Leu Val Gly Ala Gly Met Thr Phe Ile Val Gln Ser
420 425 430
Ser Ser Val Phe Thr Ser Ala Leu Thr Pro Leu Ile Gly Ile Gly Val
435 440 445
Ile Thr Ile Glu Arg Ala Tyr Pro Leu Thr Leu Gly Ser Asn Ile Gly
450 455 460
Thr Thr Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ala Leu Ala Ser Pro Gly Asn Ala
465 470 475 480
Leu Arg Ser Ser Leu Gln Ile Ala Leu Cys His Phe Phe Phe Asn Ile
485 490 495
Ser Gly Ile Leu Leu Trp Tyr Pro Ile Pro Phe Thr Arg Leu Pro Ile
500 505 510
Arg Met Ala Lys Gly Leu Gly Asn Ile Ser Ala Lys Tyr Arg Trp Phe
515 520 525
Ala Val Phe Tyr Leu Ile Ile Phe Phe Phe Leu Ile Pro Leu Thr Val
530 535 540
Phe Gly Leu Ser Leu Ala Gly Trp Arg Val Leu Val Gly Val Gly Val
545 550 555 560
Pro Val Val Phe Ile Ile Ile Leu Val Leu Cys Leu Arg Leu Leu Gln
565 570 575
Ser Arg Cys Pro Arg Val Leu Pro Lys Lys Leu Gln Asn Trp Asn Phe
580 585 590
Leu Pro Leu Trp Met Arg Ser Leu Lys Pro Trp Asp Ala Val Val Ser
595 600 605
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610 615 620
Cys Cys Arg Ala Cys Cys Leu Leu Cys Asp Cys Pro Lys Cys Cys Arg
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Cys Ser Lys Cys Cys Glu Asp Leu Glu Glu Ala Gln Glu Gly Gln Asp
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Glu Ala Gln Gly Glu Val Pro Ala Ser Asp Ser Lys Thr Glu Cys Thr
675 680 685
Ala Leu
690
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
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Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
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Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
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50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
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Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
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Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu
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1100 1105 1110
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Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly His Gly Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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<213> 智人
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
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<212> PRT
<213> 智人
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Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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<212> PRT
<213> 智人
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Gly Gly His Gly Tyr Phe Asp Leu
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<212> DNA
<213> 智人
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cacggatatt tcgacctatg ggggagaggt accttggtca ccgtctcctc a 351
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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<213> 智人
<400> 25
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<213> 智人
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
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Gln Gln Tyr His His Ser Pro Leu Thr
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<213> 智人
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ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtaccacc acagtcctct cacttttggc 300
ggagggacca aggttgagat caaa 324
<210> 31
<211> 630
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln
20 25 30
Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
50 55 60
Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
85 90 95
Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
130 135 140
Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
145 150 155 160
Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175
Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
180 185 190
Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro
195 200 205
Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
210 215 220
Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
225 230 235 240
Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
245 250 255
Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
260 265 270
Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
275 280 285
Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
290 295 300
Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
305 310 315 320
Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
325 330 335
Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
340 345 350
Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
355 360 365
Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
370 375 380
Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
385 390 395 400
Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
405 410 415
Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
435 440 445
Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
450 455 460
Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
465 470 475 480
Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
485 490 495
His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe
500 505 510
Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
515 520 525
Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu
530 535 540
Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp
545 550 555 560
Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala
565 570 575
Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp
580 585 590
Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
595 600 605
Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln
610 615 620
Arg Ala Ser Pro Leu Thr
625 630

Claims (46)

1.以下式(I)的抗体-药物缀合物(ADC)或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
PBRM-[A1-(LC)0或1-D]d15(I)
其中：
PBRM表示基于蛋白的识别分子；
当存在时，LC为接头单元；
当LC存在时，A1为使PBRM与LC连接的二价接头部分，或当LC不存在时，A1为使PBRM与D连接的二价接头部分；
D为STING激动剂药物部分；和
d15为约1-约20的整数。
2.用于与PBRM缀合的支架，其中所述支架具有以下式(II)或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
A1’-(LC)0或1-D(II)
其中：
当存在时，LC为接头单元；
A1’为包含能够与PBRM的官能团形成共价键的官能团的一价接头部分；和
D为STING激动剂药物部分。
3.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中当存在时，每个LC独立地为：
Figure FDA0004048600300000011
其中：
#表示附着于A1而##表示附着于D；
当存在时，MA为包含至少两个氨基酸的肽部分；
当存在时，T1为亲水基团；
当MA存在时，LD为使D与MA连接的二价接头部分，或当MA不存在时，LD为使D与A1连接的二价接头部分。
4.前述权利要求中任何一项的缀合物，其具有以下式(I-B’)或其药学上可接受的盐或溶剂合物：
Figure FDA0004048600300000021
5.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中每个A1独立地为
Figure FDA0004048600300000022
其中：
R7为-O-、-NR8、-(C1-C10烷基)-、-(C1-C10烯基)-、-(C1-C10炔基)-、-(C3-C8环烷基)-、-芳基-、-O-(C1-C8烷基)-、-O-(C1-C10烯基)-、-O-(C1-C10炔基)-、-(C1-C10烷基)-(C3-C8环烷基)-、-(C1-C10烷基)-芳基-、-(C2-C10烯基)-(C3-C8环烷基)-、-(C2-C10烯基)-芳基-、-(C2-C10炔基)-(C3-C8环烷基)-、-(C2-C10炔基)-芳基-、-(C3-C8环烷基)-(C1-C10烷基)-、-芳基-(C1-C10烷基)-、-(C3-C8环烷基)-(C2-C10烯基)-、-芳基-(C2-C10烯基)-、-(C3-C8环烷基)-(C2-C10炔基)-、-芳基-(C2-C10炔基)-、-(3至8元杂环烷基)-、-(5至8元杂芳基)-、-(C1-C10烷基)-(3至8元杂环烷基)-、-(C1-C10烷基)-(5至8元杂芳基)-、-(C2-C10烯基)-(3至8元杂环烷基)-、-(C2-C10烯基)-(5至8元杂芳基)-、-(C2-C10炔基)-(3至8元杂环烷基)-、-(C2-C10炔基)-(5至8元杂芳基)-、-(3至8元杂环烷基)-(C1-C10烷基)-、-(5至8元杂芳基)-(C1-C10烷基)-、-(3至8元杂环烷基)-(C2-C10烯基)-、-(5至8元杂芳基)-(C2-C10烯基)-、-(5至8元杂芳基)-(C2-C10炔基)-、-(5至8元杂芳基)-(C2-C10炔基)-、-O-C(O)-(CH2CH2O)r-(CH2)2-、-(CH2CH2O)r-或-(CH2CH2O)r-(CH2)2-，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环烷基或杂芳基被任选取代；
R8为H、羟基或C1-4烷基；
r为约1-约12范围内的整数；和
*表示附着于PBRM，而当LC存在时，**表示附着于LC或当LC不存在时，**表示附着于D。
6.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中每个A1’独立地为：
Figure FDA0004048600300000031
其中：
r为约4-约6范围内的整数；和
当LC存在时，**表示附着于LC或当LC不存在时，**表示附着于D。
7.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中每个LD独立地为
Figure FDA0004048600300000032
其中：
当存在时，LE为-NH-[(CH2CH2O)p-(CH2)0-2]q-C(O)-、-NH-(C1-C6烷基)-O-C(O)-或-NH-[(CH2CH2O)p-(CH2)0-2]q-C(O)-NH-(C1-C6烷基)-O-C(O)-，其中p为约1-约20范围内的整数，而q为约1-约10范围内的整数；
每个W独立地为天然或非天然氨基酸单元；
w为约0-约12范围内的整数；
当MA存在时，***表示附着于MA或当MA不存在时，***表示附着于A1；和
****表示附着于D。
8.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中w为0、1、2、3、4或5。
9.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中当存在时，LE为-NH-(CH2CH2O)2-(CH2)2-C(O)-、-NH-CH2-CH(CH3)-O-C(O)-或-NH-[(CH2CH2O)1-4-(CH2)2-C(O)-NH-(CH2)2-O-C(O)-。
10.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中当存在时，每个LD独立地为：
Figure FDA0004048600300000041
Figure FDA0004048600300000051
Figure FDA0004048600300000061
其中：当MA存在时，***表示附着于MA或当MA不存在时，***表示附着于A1；而****表示附着于D。
11.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中LD为：
Figure FDA0004048600300000062
Figure FDA0004048600300000071
其中：当MA存在时，***表示附着于MA或当MA不存在时，***表示附着于A1；而****表示附着于D。
12.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中LD为
Figure FDA0004048600300000072
其中：
当MA存在时，***表示附着于MA或当MA不存在时，***表示附着于A1；而
****表示附着于D。
13.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中MA为
Figure FDA0004048600300000073
其中：*表示附着于A1；**表示附着于T1；而***表示附着于LD。
14.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中T1为-OH或
Figure FDA0004048600300000074
其中：
n1为0-约6的整数；
每个R58独立地为-H或C1-8烷基；
R60为键、C1-6烷基接头或-CHR59-，其中R59为-H、C1-8烷基、环烷基或芳基烷基；
R61为CH2OR62、COOR62、-(CH2)n2COOR62或者由一个或多个羟基取代的杂环烷基；
R62为-H或C1-8烷基；和
n2为1-约5的整数。
15.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中T1为
Figure FDA0004048600300000081
16.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中T1为
Figure FDA0004048600300000082
其中
n4为1-约25的整数；
每个R63独立地为氢或C1-8烷基；
R64为键或C1-8烷基接头；
R65为H、C1-8烷基、-(CH2)n2COOR62或-(CH2)n2COR66；
R62为-H或C1-8烷基；
R66为H、
Figure FDA0004048600300000083
Figure FDA0004048600300000084
Figure FDA0004048600300000085
和
n2为1-约5的整数。
17.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中T1为：
Figure FDA0004048600300000086
其中R67为：(1)-OH；
Figure FDA0004048600300000091
其中n4为约2-约20、约4-约16、约6-约12、约8-约12的整数。
18.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中n4为6、7、8、9、10、11或12。
19.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中d13为约2-约8的整数。
20.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中d13为6或8。
21.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中每个D独立地具有以下式(A)或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure FDA0004048600300000092
其中：
Y1、Y2、Z1和Z2各自独立地为O、S、C或N；
X1、X2、W1和W2各自独立地为C或N；
X3和X4各自独立地为S或NRf；
X5为N或CRA2；
X6为N或CRA1；
R3和R5各自独立地为-CON(Rd)(Rf)、-CH2N(Rd)(Rf)、-N(Rd)(Rf)、-N(Rd)CO(Rf)、-CH2N(Rd)CO(Rf)或者R3和R5中的一个为-CON(Rd)(Rf)、-CH2N(Rd)(Rf)、-N(Rd)(Rf)、-N(Rd)CO(Rf)或-CH2N(Rd)CO(Rf)而R3和R5中的另一个为H、-COOH或-CO2(RC)；
Rc为C1-4烷基；
RA2和RA1各自独立地为H、卤素、羟基、氨基、氨基(C1-4烷基)-、任选取代的(C1-6烷基)或任选取代的(C1-6烷基)氧基-，其中所述任选取代的(C1-6烷基)或任选取代的(C1-6烷基)氧基-的C1-6烷基由1-4个各自选自羟基、C1-4烷氧基、-N(Re)(Rf)、-CO2(Rf)、-CON(Re)(Rf)和-COOH的取代基任选取代；
每个Rd独立地为H、羟基或C1-4烷基；
Re选自H、(C1-4烷基)、-CO(C1-4烷基)、-OCO(C1-4烷基)和-CO2(C1-4烷基)；
每个Rf独立地为H、羟基或(C1-4烷基)；
R14和RC2各自独立地为不存在或C1-4烷基，其中C1-4烷基由选自卤素、-ORc、-NRcRd、-CO2Rc、-CONRcRd、-SO2NRcRd和-OCONRcRd的取代基任选取代；
R16和RC1各自独立地为不存在、H或C1-4烷基；和
R15、R17、R18或R19各自独立地为不存在、H或C1-4烷基，其中C1-4烷基由选自卤素、-ORc、-NRcRd、-CO2Rc、-CONRcRd、-SO2NRcRd和-OCONRcRd的取代基任选取代；
其中：(i)RA2和RA1中的至少一个存在，且其中RA2和RA1中的至少一个直接或经RA2和/或RA1的至少一个官能团当LC存在时间接连接于LC或当LC不存在时间接连接于A1；或(ii)RC2和RC1中的至少一个存在，且其中RC2和RC1中的至少一个直接或经RC2和/或RC1的至少一个官能团当LC存在时间接连接于LC或当LC不存在时间接连接于A1。
22.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中每个D独立地具有以下式(A-a)、(A-b)、(A-c)、(A-d)、(A-e)、(A-f)、(A-f1)、(A-f2)、(A-f)3、(A-f4)、(A-f5)、(A-g)、(A-g1)、(A-g2)、(A-g3)、(A-g4)、(A-g5)、(A-h)、(A-h1)、(A-h2)或(A-i)或其前药、溶剂合物、药学上可接受的盐或互变异构体：
Figure FDA0004048600300000111
Figure FDA0004048600300000121
Figure FDA0004048600300000131
Figure FDA0004048600300000141
23.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中每个D独立地为：
Figure FDA0004048600300000151
Figure FDA0004048600300000161
Figure FDA0004048600300000171
Figure FDA0004048600300000181
Figure FDA0004048600300000191
Figure FDA0004048600300000201
Figure FDA0004048600300000211
Figure FDA0004048600300000221
Figure FDA0004048600300000231
Figure FDA0004048600300000241
Figure FDA0004048600300000251
其中：
R2为不存在、-O-或-NR4-；
R4为H或C1-3烷基；和
当LC存在时，
Figure FDA0004048600300000253
表示附着于LC或当LC不存在时，
Figure FDA0004048600300000254
表示附着于A1。
24.前述权利要求中任何一项的缀合物或支架，其中每个D独立地为：
Figure FDA0004048600300000252
Figure FDA0004048600300000261
其中：
R2为不存在、-O-或-NR4-；
R4为H或C1-4烷基；和
当LC存在时，
Figure FDA0004048600300000262
表示附着于LC或当LC不存在时，
Figure FDA0004048600300000263
表示附着于A1。
25.前述权利要求中任何一项的支架，其选自表A1中描述的支架。
26.前述权利要求中任何一项的支架，其选自表A2中描述的支架。
27.前述权利要求中任何一项的缀合物，其选自表B1中描述的缀合物。
28.前述权利要求中任何一项的缀合物，其选自表B2中描述的缀合物。
29.前述权利要求中任何一项的缀合物，其为
Figure FDA0004048600300000271
Figure FDA0004048600300000281
Figure FDA0004048600300000291
30.前述权利要求中任何一项的缀合物，其为
Figure FDA0004048600300000292
31.前述权利要求中任何一项的缀合物，其为
Figure FDA0004048600300000301
Figure FDA0004048600300000311
Figure FDA0004048600300000321
32.包含前述权利要求中任何一项的缀合物和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
33.包含前述权利要求中任何一项的缀合物的药物组合物，其进一步包含至少一种免疫调节剂或至少一种免疫刺激剂。
34.激活或增强受试者干扰素基因刺激因子(STING)的活性的方法，包括给予所述受试者前述权利要求中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐。
35.预防或治疗受试者疾病或病症的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的前述权利要求中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐。
36.前述权利要求中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，用于激活或增强受试者干扰素基因刺激因子(STING)的活性。
37.前述权利要求中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐，用于预防或治疗受试者的疾病或病症。
38.前述权利要求中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐在制造用于激活或增强受试者干扰素基因刺激因子(STING)的活性的药物中的用途。
39.前述权利要求中任何一项的缀合物或其药学上可接受的盐在制造用于预防或治疗受试者疾病或病症的药物中的用途。
40.前述权利要求中任何一项的方法、用于用途的缀合物或用途，其中所述疾病或病症与所述STING的激动相关。
41.前述权利要求中任何一项的方法、用于用途的缀合物或用途，其中所述疾病或病症为癌症。
42.前述权利要求中任何一项的方法、用于用途的缀合物或用途，其中所述疾病或病症为膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈部鳞癌、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、食管癌、胆道癌、尿路上皮癌、子宫颈癌、乳头状甲状腺癌、乳头状肾细胞癌、胆管癌、涎腺导管癌、肾癌或胰腺癌。
43.以下式BB的缀合物或其药学上可接受的盐
Figure FDA0004048600300000331
其中所述缀合物包含XMT-1519抗体，XMT-1519抗体包含含有氨基酸序列FTFSSYSMN(SEQ ID NO:20)的可变重链互补决定区1(CDRH1)、含有氨基酸序列YISSSSSTIYYADSVKG(SEQ ID NO:21)的可变重链互补决定区2(CDRH2)、含有氨基酸序列GGHGYFDL(SEQ ID NO:22)的可变重链互补决定区3(CDRH3)和含有氨基酸序列RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO:27)的可变轻链互补决定区1(CDRL1)、含有氨基酸序列GASSRAT(SEQ ID NO:28)的可变轻链互补决定区2(CDRL2)和含有氨基酸序列QQYHHSPLT(SEQ ID NO:29)的可变轻链互补决定区3(CDRL3)，并且d15为约8。
44.预防或治疗受试者疾病或病症的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的权利要求43的缀合物或其药学上可接受的盐。
45.权利要求44的方法，其中所述疾病或病症为癌症。
46.权利要求45的方法，其中所述癌症为乳腺癌、胃癌、结直肠癌、结肠癌、食管癌、胆道癌、子宫内膜癌、尿路上皮癌或非小细胞肺癌。
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