CN115317656B

CN115317656B - 一种含有胶原蛋白的医用敷料及制备方法

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Publication number: CN115317656B
Application number: CN202211250239.5A
Authority: CN
Inventors: 路宝
Original assignee: Jiangsu Hengrui Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-10-13
Filing date: 2022-10-13
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2042-10-13
Also published as: CN115317656A

Abstract

本发明公开了一种含有胶原蛋白的医用敷料及制备方法，所述敷料包括以下组分：磺胺两性离子改性硅油、Ⅲ型重组人源胶原蛋白，磷钨酸，甘油，三乙醇胺和水。本发明以改性聚硅氧烷弹性体作为敷料基底，其采用物理方法进行交联，具有良好的力学性能的同时具有自愈合性，裂纹通过吸水、干燥后进行修复。利用磷钨酸与重组人源III型胶原蛋白的相互作用，达到缓释蛋白的作用，作用于伤口的时间长达48h，可持续稳定的释放胶原蛋白。

Description

一种含有胶原蛋白的医用敷料及制备方法

技术领域

本发明属于合成生物医学材料技术领域，具体涉及一种含有胶原蛋白的医用敷料及制备方法。

背景技术

皮肤因手术、感染、烧烫伤等各种原因形成的瘢痕影响人体美观，可对患者的日常生活和社会活动造成严重影响。随着时代的发展和生活水平的提高，人们对瘢痕美化要求的越来越高，故各种成分的祛疤制剂如硅酮类凝胶、动物胶原蛋白凝胶和类人胶原蛋白凝胶等相继出现。重组人源Ⅲ型胶原蛋白功能凝胶是一种新型胶原蛋白，可以外源性地给予皮肤补充胶原蛋白，连接皮肤因创伤和感染造成的皮肤纤维断裂，抑制黑色素生成，抑制瘢痕，加速皮肤愈合。但以凝胶作为重组人源Ⅲ型胶原蛋白具有以下缺点：（1）凝胶成膜后力学强度低，在外力摩擦或水冲刷的作用下易流失，作用于伤口的时间较短、若未及时补充容易造成伤口干燥、感染、二次伤害；（2）保湿性较差，根据“湿性伤口愈合理论”，伤口在湿性无菌的环境下愈合情况更好；（3）不具有缓释性，持续稳定的释放重组人源Ⅲ型胶原蛋白能够避免I型胶原蛋白过度沉积或排列紊乱，从而避免病理性于瘢痕的产生。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种含有胶原蛋白的医用敷料，该敷料系由改性聚硅氧烷弹性体制成，具有良好的力学性能、抗菌性能和透气性，并且具有自愈合性，作用于伤口的时长可达48h，同时能够持续稳定的释放Ⅲ型胶原蛋白。

本发明的技术方案如下：

一种含有胶原蛋白的医用敷料，按质量百分比计算，包括以下组分：磺胺两性离子改性硅油、Ⅲ型重组人源胶原蛋白，磷钨酸，甘油，三乙醇胺和水。

本发明还提供上述含有胶原蛋白的医用敷料的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备磺胺两性离子改性硅油

以无水乙醚为溶剂，N,N -二乙基胺丙基甲基二甲氧基硅烷在碱性条件下水解制备全接枝叔胺基硅油；进一步的，N,N -二乙基胺丙基甲基二甲氧基硅烷按计量比与八甲基环四硅氧烷D₄和六甲基二硅氧烷MM混合，在氢氧化四甲铵硅醇盐的催化下，加热反应，制备得到叔胺基硅油；

以四氢呋喃为溶剂，叔胺基硅油与1,3-丙烷磺内酯(PS)在60℃下加热反应12h，然后进一步酸化后制备得到磺胺两性离子改性硅油。

（2）制备改性聚硅氧烷弹性体

分别用溶剂溶解磺胺两性离子改性硅油和磷钨酸，在加热条件下将两者混合，搅拌均匀后将获得的溶液浇铸到聚四氟乙烯模具中，室温下溶剂蒸发后，80℃真空干燥48h，得到改性聚硅氧烷弹性体。

（3）制备含有胶原蛋白的医用敷料

将步骤（2）得到的改性聚硅氧烷弹性体浸泡于含有胶原蛋白的药液中，时间为24h，随后捞出在20~30℃环境下吹风干燥，得到含有胶原蛋白的医用敷料。

进一步的，步骤（1）中叔胺基硅油的接枝率为20~50%。

进一步的，步骤（1）中叔胺基硅油的叔胺基摩尔量和1,3-丙烷磺内酯的摩尔量比例为1：1~2。

进一步的，步骤（2）中磺胺两性离子改性硅油与磷钨酸的质量比例为1:10~30%。

进一步的，步骤（2）中所述溶剂选自：水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种或组合。

进一步的，步骤（3）中所述含有胶原蛋白的药液，具体组分如下：0.5~1%Ⅲ型重组人源胶原蛋白，3~4%甘油，三乙醇胺4~7%、余量为水。

有益效果：

（1）本发明以改性聚硅氧烷弹性体作为敷料基底，其采用物理方法进行交联，具有良好的力学性能的同时具有自愈合性，裂纹通过吸水、干燥后进行修复。另一方面，该敷料基底具有良好的吸水性和透明性，施加于伤口能够吸收渗出液、保持伤口湿润状态，同时可对伤口进行观察。

（2）本发明利用磺胺两性离子改性硅油上的季铵盐与磷钨酸通过静电作用力结合，同时发挥了季铵盐与磷钨酸的协同抗菌作用，防止伤口细菌、真菌感染。

（3）利用磷钨酸与重组人源III型胶原蛋白的相互作用，达到缓释蛋白的作用，作用于伤口的时间长达48h，可持续稳定的释放胶原蛋白。

（4）生物安全性实验表明，本发明的敷料皮肤刺激性和细胞毒性较小。

附图说明

图1为磺胺两性离子改性硅油的¹H-NMR。

图2为测试例4胶原蛋白释放度随时间的变化关系。

图3为测试例4圆二色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

制备磺胺两性离子改性硅油。

（1）制备全接枝叔胺基硅油

以400mL无水乙醚溶解200g N,N -二乙基胺丙基甲基二甲氧基硅烷，搅拌升温至40℃缓慢滴加20wt% NaOH水溶液40 g，回流反应4 h后，将反应液倒入分液漏斗，水洗至pH≤8，取有机层用无水MgSO₄干燥，过滤后挥发溶剂，得全接枝叔胺基硅油。

（2）制备部分接枝叔胺基硅油

往反应釜中加入全接枝叔胺基硅油，D₄，MM和前述原料总质量1wt%的四甲基氢氧化铵，升温至90℃反应9h，然后升温至150℃继续搅拌30 min，得到粗产物在120℃下旋蒸5h除去小分子低沸物，得到部分接枝叔胺基硅油。

不同投料量下叔胺基硅油的接枝率和分子量如下表所示。

表1

样品	全接枝叔胺基硅油，g	D<sub>4</sub>，g	MM，g	Mn，g/mol	接枝率1，%
						PAMS-1	58.34	55.22	2.62	6216	22.34%
PAMS-2	74.26	23.17	2.37	5428	48.23%

数均分子量（Mn）采用Waters 515-2414型凝胶渗透色谱仪测定，流动相为THF。

接枝率利用¹H-NMR计算，计算方法如下：

叔胺基硅油的化学表达式为：

Si(CH₃)₃O[Si(CH₃)₂O]_x[Si(CH₃)(CH₂CH₂CH₂N(C₂H₅)₂]_ySi(CH₃)₃

接枝率1=

×100%

x和y分别对应重复单元数量，S_Me对应Si-CH₃在0~0.22ppm的出峰，S_CH2对应Si-CH₂在0.54ppm的出峰。

（3）制备磺胺两性离子改性硅油

将部分接枝叔胺基硅油和1,3-丙烷磺内酯用四氢呋喃溶解后装入圆底烧瓶中，于60℃水浴中加热反应12h，反应结束后反应液用过量的石油醚沉淀，重复三次后挥发溶剂，重新以去离子水或乙醇溶解，进行透析3d，干燥后的产物重新以乙醇溶解，加入35wt%盐酸调节pH=4进行加热回流酸化（40℃，6h），最后挥干溶剂得到磺胺两性离子改性硅油。

不同投料量下磺胺两性离子改性硅油的接枝率如下表所示。

表2

接枝率利用¹H-NMR计算，计算方法如下：

磺胺两性离子改性硅油的分子结构表达式为：

接枝率2=

S_SCH2对应S-CH₂在2.52ppm的出峰，S_SiCH2对应Si-CH₂在0.54ppm的出峰。

实施例2

制备改性聚硅氧烷弹性体。

以乙醇为溶剂分别溶解磺胺两性离子改性硅油和磷钨酸，浓度分别为0.5g/mL和0.2g/mL，在50℃下将两者混合，搅拌均匀后将获得的溶液浇铸到聚四氟乙烯模具中，室温下溶剂挥发后，80℃真空干燥48h，得到改性聚硅氧烷弹性体。

改性聚硅氧烷弹性体的投料量如下：

表3

测试例1

对改性聚硅氧烷弹性体进行吸水率（WU）测试，测试条件为常温、去离子水、浸泡时间为8h。

式中，m_w和m_d分别为待测样品的湿重和干重。

测试例2

对改性聚硅氧烷弹性体进行力学性能测试。

采用热压的方式将弹性体制成条状，具体为100℃热压10min再冷压5min。样条尺寸：5cm×1cm×0.1~0.2cm。拉伸速率：500mm/min。

测试例3

对改性聚硅氧烷弹性体进行自愈合性能测试。

自愈合性能测试：以恒定作用力1N和恒定距离-0.1μm在样品表面划痕，然后在划痕表面滴加200μL的乙醇，使其铺开，放于常温鼓风箱中吹干，随后进行拉伸测试，以修复后的拉伸强度与原始拉伸强度的比值评价自修复率。

测试例1~3的结果如表4所示。

表4

样品	WU，%	拉伸强度，MPa	断裂伸长率，%	自修复率，%
					R1	31.2	5.48	128.5	84.3
R2	30.1	5.12	142.3	89.5
					R3	47.5	7.21	89.7	77.1
R4	48.2	5.88	136.5	93.3

实施例3

制备改性聚硅氧烷弹性体并浸泡药液得到敷料，同时计算蛋白负载量。

S1:制备改性聚硅氧烷弹性，配方如下表5所示。

表5

S2:采用BCA法建立胶原蛋白含量标准曲线（pH7.4 PBS），测得A=0.45C+0.0071，r=0.9921。

S3:采用容量瓶精确配置以下配方药液5mL：0.5%Ⅲ型重组人源胶原蛋白，3%甘油，三乙醇胺4%、余量为水，取1mL放入石英比色皿中，测的吸光度OD1，及其对应的浓度c₁(mg/mL)。

S4:称量已干燥至恒重的弹性体（规格0.5×0.5×0.12~0.15cm）为m_d，浸入S2中含有药液的比色皿，24h后用镊子取出，并加入去离子水将比色皿的溶液补充至1mL，测得吸光度OD2，及其对应的浓度c₂(mg/mL)。

S5:计算敷料的蛋白负载量（mg/g）=

表6：蛋白负载量

从表6数据中可以看出，随着弹性体中磷钨酸的比例增加，敷料的蛋白负载量先减少后增大，这是由于随着磷钨酸投料量增大，弹性体的交联密度增大，从而导致吸水量减少，分子链联系得越紧密，蛋白难以扩散至敷料内部，但随着磷钨酸量进一步增大，由于磷钨酸表面有大量的氢键位点，与蛋白的羟基等发生相互作用，从而有利于蛋白的扩散。

测试例4

对实施例3制备得到的敷料（取出后放入30℃鼓风箱中吹干）进行体外释放度及蛋白活性测定。

将实施例3得到的敷料放入pH=7.4的 PBS溶液中，37℃下以100rpm的速度搅拌，一定的时间间隔取溶液使用BCA法测定其吸光度，同时补充等量PBS溶液，并计算体外释放度。

胶原蛋白释放度随时间的变化关系，参阅附图2。

对浸出液采用圆二色谱对比色皿中的蛋白溶液进行活性鉴定，具体方法如下：不同样品采用相近浓度（通过吸光度进行判断）的浸出液进行测试，同时配置相近浓度的重组胶原蛋白PBS溶液作为对照（本测试蛋白浓度为0.22±0.17mg/mL）；对浸出液或对照组进行远紫外CD扫描,应用dicroprot软件对色谱图进行分析得到二级结构的信息。

圆二色谱图参阅附图3，浸出液蛋白二级结构含量如表7所示。

表7

样品	-螺旋	-折叠	-转角+无规则卷曲
				重组胶原蛋白	0.74	0.02	0.24
R4	0.62	0.11	0.27
				R5	0.68	0.09	0.23
R6	0.54	0.29	0.17

在192nm、208对应的是

-螺旋片段的构像，在195、216对应

-折叠片段的构像。在200nm有较弱负吸收峰为无规则卷曲片段；205nm 为β-转角片段的构像。胶原蛋白在变性过程中会伴随着各个构像的含量变化，未变性胶原蛋白多肽链中

-螺旋结构含量在50%以上。

从表中数据可以看出，浸出液中的胶原蛋白各构像变化较少,且

-螺旋结构含量在50%以上，仍具有较高活性。

测试例5

对敷料进行抑菌活性测试：将弹性体消毒后裁剪成直径15mm的圆片，放置在装有固体培养基的培养皿中央。用移液枪吸取20μL菌液（分别为：大肠杆菌、白色葡萄球菌和白色念珠菌，浓度均为1×10⁹CFU/mL）涂布于圆片上。将培养基置于37℃培养箱中培养24h后取出，在无菌条件下移除圆片后利用打孔器取出圆片正下方直径为10mm的固体培养基，置于离心管中，并加入2000μL PBS缓冲液，超声4min后得到原菌液。将原菌液分别稀释10⁴倍得到稀释液，分别取150μL各浓度稀释液涂布在装有固体培养基的培养皿中。将其置于37℃培养箱中培养24h后取出，观察并计数菌落数n，得出相应稀释液中细菌或真菌的个数，并按稀释倍数D推算出原菌液（2000μL）中细菌或真菌的个数N，计算公式如下：

测试例6

对敷料进行生物相容性测试：包括溶血实验和细胞毒性实验。

溶血实验：取新鲜含有枸橼酸钠抗凝剂的人血，按人血/生理盐水=5/4（w/w）的比例稀释，得到新鲜稀释抗凝人血。弹性体裁剪为约0.5×2×0.13cm样条，消毒后并放入试管中，并向其中加入2 mL生理盐水。取一支试管为阴性对照，向其中加入2 mL生理盐水，另取一支试管为阳性对照，向其中加入2mL蒸馏水。然后将所有试管放入37℃恒温水浴中保温30min，再向试管中加入2 mL混匀的新鲜稀释抗凝人血，轻轻混匀，置于37℃水浴中继续保温60 min。将试管中液体移入离心管中，在3000rpm速率下离心5 min，吸取上层清液，利用SMA5000型微量紫外光度计测试其在545 nm处吸光度，按以下公式计算溶血率：

×100%

式中，D_S为测试样品的吸光度值，D_pc为阳性对照的吸光度，D_nc为阴性对照的吸光度。

细胞毒性测试：将消毒后的弹性体（1g）浸入10mLRPMI 1640培养基中24 h，并用RPMI 1640培养基稀释至原始浓度的50%。将L929细胞（鼠非整倍体纤维肉瘤细胞）在96孔培养板上以1.0×10⁵细胞/mL的密度用上述RPMI 1640培养基进行培养。将细胞在37℃、CO₂浓度为5 %的培养箱中培养过夜。细胞培养24h后，向孔中加入5.0 mg/mL浓度的MTT（PBS溶液），再在37℃下培养4 h。随后去除培养基，加入150μLDMSO，然后剧烈震动以溶解形成的紫色甲瓒晶体。用Wellscan Mk 3酶标仪在570 nm的波长下测量吸光度。

表8：测试例5~6结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种含有胶原蛋白的医用敷料，其特征在于，包括以下组分：磺胺两性离子改性硅油、Ⅲ型重组人源胶原蛋白，磷钨酸，甘油，三乙醇胺和水；

所述的含有胶原蛋白的医用敷料的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备磺胺两性离子改性硅油

以无水乙醚为溶剂，N,N -二乙基胺丙基甲基二甲氧基硅烷在碱性条件下水解制备全接枝叔胺基硅油；然后N,N -二乙基胺丙基甲基二甲氧基硅烷按计量比与八甲基环四硅氧烷D₄和六甲基二硅氧烷MM混合，在氢氧化四甲铵硅醇盐的催化下，加热反应，制备得到部分接枝叔胺基硅油；

以四氢呋喃为溶剂，部分接枝叔胺基硅油与1,3-丙烷磺内酯在60℃下加热反应12h，然后酸化后制备得到磺胺两性离子改性硅油；

（2）制备改性聚硅氧烷弹性体

分别用溶剂溶解磺胺两性离子改性硅油和磷钨酸，在加热条件下将两者混合，搅拌均匀后将获得的溶液浇铸到聚四氟乙烯模具中，室温下溶剂蒸发后，80℃真空干燥48h，得到改性聚硅氧烷弹性体；

（3）制备含有胶原蛋白的医用敷料

将步骤（2）得到的改性聚硅氧烷弹性体浸泡于含有胶原蛋白的药液中，时间为24h，随后捞出在20~30℃环境下吹风干燥，得到含有胶原蛋白的医用敷料；

所述步骤（1）中部分接枝叔胺基硅油的接枝率为20~50%；

所述步骤（1）中部分接枝叔胺基硅油的叔胺基摩尔量和1,3-丙烷磺内酯的摩尔量比例为1：1~2；

所述步骤（2）中磺胺两性离子改性硅油与磷钨酸的质量比例为1:10~30%；

所述步骤（3）中含有胶原蛋白的药液，具体组分如下：0.5~1%Ⅲ型重组人源胶原蛋白，3~4%甘油，三乙醇胺4~7%、余量为水。

2.根据权利要求1所述的一种含有胶原蛋白的医用敷料的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述溶剂选自：水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种或组合。