CN115057929B - 一种牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，包括箱体A、箱体B、试管以及驱动组件，所述箱体B通过主轴与箱体A转动连接，还包括：提取机构，与箱体A连接，用于对血清进行提取，所述提取机构包括顶板、放置组件、缓压组件以及降速组件；所述缓压组件包括套筒A、连接柱A、弹性件A以及连接柱B；所述降速组件包括推杆以及滑柱，所述滑柱与推杆连接，所述滑柱与开设在套筒A上的槽位滑动配合，所述推杆与连接柱B连接，所述推杆与放置组件连接，本发明属于细胞工程技术领域；本发明能够利用提取机构对分离后的含有血清的放置组件进行自动分离且设置的限位机构能够对试管进行快速定位固定。

Description

一种牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，尤其涉及一种牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置。

背景技术

对牛精准及时的怀孕检测在当今的牧场繁殖管理程序中是一项十分重要的内容，现有技术中采用含有抗牛早孕因子的单克隆抗体对牛进行怀孕检测，在该抗体制备过程中需要使用离心设备获得相应血清来完成抗体的制备工作。

公告号为CN110152895B的中国专利提出了一种血清提取离心分离装置，包括固定座、固定壳、连通管和转动座，固定座上固设有固定壳，固定壳的内部设置有转动座，转动座上固定连接有从动轮，从动轮上固定连接有电机，电机的输出轴固定连接有主动轮，主动轮与从动轮通过皮带连接，转动座的内部均匀开设有采血管放置槽和血清管放置槽，转动座上设置有内盖，内盖上开设有穿孔，该装置设置多个采血管放置槽并通过连通管连通，且定位套的设置便于连通管的固定，同时刻度线的设置便于定量控制连通管的插入量，避免分离不彻底，提高了分离质量。

虽然上述装置进一步解决了现有血清提取装置需要单个分离采血管的问题，但仍存在不能实现自动将离心后获得的血清批量高质量的从血样试管中提出。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，解决了上述问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，包括箱体A、箱体B、试管以及驱动组件，所述试管与嵌入设置在箱体B内的海绵塞滑动配合，所述箱体B通过主轴与箱体A转动连接，还包括：

提取机构，与箱体A连接，用于对血清进行提取，所述提取机构包括顶板、放置组件、缓压组件以及降速组件，所述顶板通过推动组件A与箱体B连接；

所述缓压组件包括套筒A、连接柱A、弹性件A以及连接柱B，所述套筒A与顶板转动连接，所述连接柱A与连接柱B转动连接，所述弹性件A位于套筒A内且一端与套筒A连接，所述弹性件A另一端与连接柱A连接；

所述降速组件包括推杆以及滑柱，所述滑柱与推杆连接，所述滑柱与开设在套筒A上的槽位滑动配合，所述推杆与连接柱B连接，所述推杆与放置组件连接；

所述推动组件A通过拉动顶板进行线性往复运动促使放置组件插入或远离试管，驱动组件通过主轴带动箱体B进行转动促使试管进行离心运动，同时连接柱A以及连接柱B进行同步旋转并在自身惯性下拉动弹性件A，促使自身沿着套筒A进行线性运动，连接柱B推动推杆进行线性运动，滑柱在推杆的推动下沿着开设在套筒A上的槽位进行滑动并促使推杆推动放置组件沿着试管内壁进行缓慢线性运动对血清进行膜过滤的方式，实现对血清进行快速自动提取。

在上述技术方案的基础上，本发明还提供以下可选技术方案：

进一步的技术方案：所述箱体A上设置有用于对试管进行固定的限位机构。

进一步的技术方案：所述放置组件包括筒体、安装板以及渗透膜，所述渗透膜与安装板连接，所述安装板与筒体螺纹连接，所述筒体与试管滑动配合，所述筒体上螺纹连接有密封盖，所述密封盖与推杆通过吸附组件B连接。

进一步的技术方案：所述推动组件A包括套筒B、连接杆C以及弹性件B，所述连接杆C与套筒B滑动配合，所述弹性件B位于套筒B内，所述套筒B以及连接杆C通过吸附组件A连接。

进一步的技术方案：所述驱动组件包括电机以及齿轮副，所述电机与箱体A连接，所述电机的输出轴通过齿轮副与主轴传动连接。

进一步的技术方案：所述限位机构包括限位件、套筒C以及安装盘，所述套筒C与箱体A连接，还包括：

推动组件B，与限位件以及安装盘连接，用于推动限位件挤压试管；以及

线性运动组件，与套筒C以及安装盘连接，用于推动安装盘进行竖直方向上的线性运动。

进一步的技术方案：所述吸附组件A包括电磁铁A以及电磁铁B，所述电磁铁A嵌入设置在连接杆C上且与连接杆C连接，所述电磁铁B与套筒B连接。

进一步的技术方案：所述线性运动组件包括旋转块以及丝杆，所述旋转块与丝杆连接，所述丝杆与套筒C螺纹连接，所述丝杆与安装盘转动连接。

进一步的技术方案：所述推动组件B包括连杆A以及连杆B，所述连杆A与连杆B转动连接，所述连杆B与限位件转动连接，所述连杆B与海绵塞滑动配合，所述连杆A与安装盘转动连接。

进一步的技术方案：所述箱体A上嵌入设置有滚轮，所述滚轮与箱体A转动连接，所述滚轮与箱体B抵触。

有益效果

本发明提供了一种牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置。与现有技术相比具备以下有益效果：

1、推动组件A能够通过拉动顶板进行竖直方向线性往复运动的方式促使放置组件插入或远离放置在海绵塞内的试管，驱动组件通过主轴带动箱体B进行竖直方向上的旋转运动促使试管进行离心运动，同时连接柱A以及连接柱B进行同步旋转并在自身惯性下拉动弹性件A促使自身沿着套筒A进行线性运动，连接柱B推动推杆进行线性运动，推杆通过推动滑柱沿着开设在套筒A上的槽位进行滑动促使推杆推动放置组件沿着试管内壁进行缓慢线性运动的方式，实现对血清进行快速自动提取的技术效果；

2、通过拧动旋转块进行旋转促使丝杆能够沿着与之螺纹连接的套筒C进行竖直方向上的线性运动，实现推动安装盘进行竖直方向线性运动，同时安装盘通过带动推动组件推动限位件对若干个试管进行挤压试管方式，实现对试管进行限位固定的技术效果；

3、放置组件中的渗透膜能够对血清进行精准过滤，确保过滤的血清内部不会蕴含多余杂质，能够有效提高单克隆抗体制备的成功率以及准确率。

附图说明

图1为本发明各组件分布示意图。

图2为本发明整体结构示意图。

图3为本发明A部结构放大图。

图4为本发明B部结构放大图。

图5为本发明C部结构放大图。

图6为本发明D部结构放大图。

图7为本发明限位机构结构示意图。

附图标记注释：1、箱体A；2、箱体B；3、海绵塞；4、试管；5、放置组件；6、顶板；7、推动组件A；8、限位机构；9、主轴；10、驱动组件；11、齿轮副；12、滚轮；13、筒体；14、套筒A；15、安装板；16、渗透膜；17、密封盖；18、推杆；19、连接柱A；20、弹性件A；21、滑柱；22、连接柱B；23、连杆A；24、连杆B；25、限位件；26、套筒B；27、电磁铁A；28、连接杆C；29、弹性件B；30、电磁铁B；31、旋转块；32、套筒C；33、丝杆；34、安装盘；35、电机。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

请参阅图1～5，为本发明一种实施例提供的，一种牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，包括箱体A1、箱体B2、试管4以及驱动组件，试管4与嵌入设置在箱体B2内的海绵塞3滑动配合，箱体B2通过主轴9与箱体A1转动连接，还包括：

提取机构，与箱体A1连接，用于对血清进行提取，提取机构包括顶板6、放置组件5、缓压组件以及降速组件，顶板6通过推动组件A7与箱体B2连接；

缓压组件包括套筒A14、连接柱A19、弹性件A20以及连接柱B22，套筒A14与顶板6转动连接，连接柱A19与连接柱B22转动连接，弹性件A20位于套筒A14内且一端与套筒A14固定连接，弹性件A20另一端与连接柱A19固定连接；

降速组件包括推杆18以及滑柱21，滑柱21与推杆18固定连接，滑柱21与开设在套筒A14上的槽位滑动配合，推杆18与连接柱B22固定连接，推杆18与放置组件5连接；

推动组件A7通过拉动顶板6进行竖直方向线性往复运动的方式促使放置组件5插入或远离放置在海绵塞3内的试管4，驱动组件通过主轴9带动箱体B2进行竖直方向上的旋转运动促使试管4进行离心运动，同时连接柱A19以及连接柱B22进行同步旋转并在自身惯性下拉动弹性件A20促使自身沿着套筒A14进行线性运动，连接柱B22推动推杆18进行线性运动，推杆18通过推动滑柱21沿着开设在套筒A14上的槽位进行滑动促使推杆18推动放置组件5沿着试管4内壁进行缓慢线性运动对血清进行膜过滤的方式，实现对血清进行快速自动提取。

优选的，槽位为螺旋槽。

优选的，弹性件A20为弹簧、压簧以及弹性钢板中的任一种。

优选的，放置组件5包括筒体13、安装板15以及渗透膜16，渗透膜16与安装板15固定连接，安装板15与筒体13螺纹连接，筒体13与试管4滑动配合，筒体13上螺纹连接有密封盖17，密封盖17与推杆18通过吸附组件B连接。此种设置的目的在于，利用设置在安装板15上的渗透膜对血液中的血清进行提取并将其放置在筒体13内。

优选的，箱体A1上嵌入设置有滚轮12，滚轮12与箱体A1转动连接，滚轮12与箱体B2抵触。此种设置的目的在于，减少箱体A1与箱体B2之间的摩擦力，同时对箱体B2进行支撑。

优选的，筒体13内设置有单向阀(图中未标出)，单向阀与筒体13固定连接。此种设置的目的在于，防止位于筒体13内的血清发生回流。

优选的，吸附组件为电磁铁。

优选的，推动组件A7包括套筒B26、连接杆C28以及弹性件B29，连接杆C28与套筒B26滑动配合，弹性件B29位于套筒B26内，套筒B26以及连接杆C28通过吸附组件A连接。吸附组件A带动套筒B26进行竖直方向上的线性往复运动，套筒B26通过拉动顶板6进行竖直方向上的线性往复运动的方式，实现推动放置组件5靠近或远离试管4的技术效果。

优选的，吸附组件A包括电磁铁A27以及电磁铁B30，电磁铁A27嵌入设置在连接杆C28上且与连接杆C28固定连接，电磁铁B30与套筒B26固定连接。此种设置的目的在于，利用电磁铁A27以及连接杆C28同行相斥异性相吸的性质，促使连接杆C28沿着套筒B26进行线性往复滑动的技术效果。

优选的，弹性件B29为弹簧、压簧以及弹性钢板中的任一种。

优选的，驱动组件10包括电机35以及齿轮副11，电机35与箱体A1固定连接，电机35的输出轴通过齿轮副11与主轴9传动连接。此种设置的目的在于，利用齿轮副11将电机35的旋转运动传递给主轴9，促使主轴9进行竖直方向上的旋转运动，以实现驱动箱体B2进行竖直方向转动的技术效果。

在本发明实施例中，推动组件A7通过拉动顶板6进行竖直方向线性往复运动的方式促使放置组件5插入或远离放置在海绵塞3内的试管4，驱动组件通过主轴9带动箱体B2进行竖直方向上的旋转运动促使试管4进行离心运动，同时连接柱A19以及连接柱B22进行同步旋转并在自身惯性下拉动弹性件A20促使自身沿着套筒A14进行线性运动，连接柱B22推动推杆18进行线性运动，推杆18通过推动滑柱21沿着开设在套筒A14上的槽位进行滑动并促使推杆18推动放置组件5沿着试管4内壁进行缓慢线性运动对血清进行膜过滤的方式，实现对血清进行快速自动提取。

请参阅图1、图2以及图7，作为本发明的一种实施例，箱体A1上设置有用于对试管4进行固定的限位机构8。

优选的，限位机构8包括限位件25、套筒C32以及安装盘34，套筒C32与箱体A1固定连接，还包括：

推动组件B，与限位件25以及安装盘34连接，用于推动限位件25挤压试管4；以及

线性运动组件，与套筒C32以及安装盘34连接，用于推动安装盘34进行竖直方向上的线性运动。线性运动组件推动安装盘34在箱体A1内进行竖直方向上的线性运动，安装盘34通过带动推动组件推动限位件25对若干个试管4进行挤压试管4方式，实现对试管4进行限位固定的技术效果。

优选的，线性运动组件包括旋转块31以及丝杆33，旋转块31与丝杆33固定连接，丝杆33与套筒C32螺纹连接，丝杆33与安装盘34转动连接。此种设置的目的在于，通过拧动旋转块31进行旋转促使丝杆33能够沿着与之螺纹连接的套筒C32进行竖直方向上的线性运动，实现推动安装盘34进行竖直方向线性运动的技术效果。

优选的，推动组件B包括连杆A23以及连杆B24，连杆A23与连杆B24转动连接，连杆B24与限位件25转动连接，连杆B24与海绵塞3滑动配合，连杆A23与安装盘34转动连接。连杆A23在安装盘34的带动下推动连杆B24沿着开设在海绵塞3上的槽位进行滑动的方式，实现推动限位件25对试管4进行抵压的技术效果。

优选的，限位件25为弧形板、C形板以及V形板中的任一种。此种设置的目的在于，增加限位件25与试管4之间接触面积，对试管4进行稳固抵触。

在本发明实施例中，此种设置的目的在于，对若干个试管4进行限位固定。

采用本装置进行血液离心提取一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

采用本装置进行血液离心提取一种抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：建立抗扭早孕因子单克隆抗体细胞株，通过表位预测获得抗原表位免疫多肽，与载体KLH交联，免疫小鼠获得抗血清并测定效价，SP2/0细胞与小鼠脾细胞融合，细胞克隆获得能稳定传代并分泌抗牛早孕单克隆抗体的杂交瘤细胞，筛选阳性克隆；

步骤2：制备单克隆抗体，收集S1建立的抗牛早孕因子单克隆抗体细胞株阳性克隆，对小鼠进行腹腔注射，收集腹水，去细胞、除杂，澄清处理，应用Protein G层析柱对单克隆抗体进行亲和纯化；

具体步骤为：

S1：抗原合成

S1.1表位预测

以牛早孕因子氨基酸残基蛋白序列为模板，经软件分析预测抗原表位，获得5段抗原表位序列，每段序列在N-端或C-端添加一个半胱氨酸，以便与载体交联；

牛早孕因子蛋白序列：

IVKIPLRRLK TMRNVVSGKN MLNNFLKEHA YSLASQISFR

GSNLTTHPLR NIKDLVYMGN ITIGTPPQEF QVVFDTASSD

LWVPSDFCTS PACSTHVRFR HLQSSTFRLT NKTFRITYGS

GRMKGVVVHD TVRIGNLVST DQPFGLSIEE YGFEGRIYDG

VLGLNYPNIS FSGAIPIFDK LKNQRAISEP VFAFYLSKDE

REGSVVMFGG VDHRYYEGEL NWVPLIQAGD WSVEMDRISI

ERKIIACSDG CKALVDTGTS DIVGPRRLVN NIHRLIGAIP

RGSEHYVPCS EVNTLPSIVF TINGINYPVP GRAYILKDDR

GRCYTTFQEN RVSSSTETWY LGDVFLRLYF SVFDRGNDRI

GLARAV(SEQ NO.1)

经软件分析得出抗原表位：

CFDRGNDRIGLARAV(SEQ NO.2)

VDHRYYEGELNWC(SEQ NO.3)

CLKNQRAISEP(SEQ NO.4)

CSKDEREGSVVM(SEQ NO.5)

CKDDRGRCYTT(SEQ NO.6)

S1.2免疫多肽与载体KLH交联

采用碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)两步法：称取多肽10-20毫克，EDC·HCl50-150毫克，NHS5-20毫克，于单口瓶中，加入1-4毫升DMF使其充分溶解，放入一颗磁力搅拌子，密封避光，室温反应10-20小时，得到多肽反应液，为A液；另称取KLH10-50毫克充分溶解于1-8毫升磷酸盐缓冲液(PBS)中，为B液；将A液逐滴加入B液中，密封避光，2-8摄氏度条件下搅拌过夜，将上述反应液转移至采用PBS预处理10-32小时的透析袋中，在2-8摄氏度条件下，置磁力搅拌器上搅拌并用PBS透析12-72小时，透析过程中多次换液，对透析后产生多肽-KLH的交联产物进行冰冻干燥。

S2：建立单克隆抗体细胞株

S2.1免疫小鼠

将5段多肽-KLH交联物等量混合，作为免疫抗原，免疫Balb/c纯系小鼠。

a、初次免疫：以每只小鼠取抗原30-150微克，与等量弗氏完全佐剂混合并充分乳化，小鼠颈背部皮下多点注射；

b、第二次免疫：于初次免疫3周后进行，取与第一次相同剂量抗原，与等量弗氏不完全佐剂乳化，小鼠颈背部皮下多点注射；

c、第三次免疫：于第二次免疫3周后进行，用相同剂量的抗原溶于生理盐水，腹腔注射；

d、免疫结束后5-15天，小鼠断尾采血，采用本发明中的分离装置分离抗血清，具体为，推动组件A7通过拉动顶板6进行竖直方向线性往复运动的方式促使放置组件5插入或远离放置在海绵塞3内的试管4，驱动组件通过主轴9带动箱体B2进行竖直方向上的旋转运动促使试管4进行离心运动，同时连接柱A19以及连接柱B22进行同步旋转并在自身惯性下拉动弹性件A20促使自身沿着套筒A14进行线性运动，连接柱B22推动推杆18进行线性运动，推杆18通过推动滑柱21沿着开设在套筒A14上的槽位进行滑动并促使推杆18推动放置组件5沿着试管4内壁进行缓慢线性运动对血清进行膜过滤的方式，实现对血清进行快速自动提取。

S2.2抗血清效价检测

采用间接ELISA法测定抗体对牛早孕因子蛋白的效价。

a、抗原处理：用PBS将牛早孕因子蛋白稀释至1-5微克每毫升，100微升每孔加入酶标板，2-8摄氏度过夜，洗板3次，取1-5％BSA封闭液，100-300微升每孔加入酶标板，室温孵育1-3小时，洗板。

b、样品处理：取抗血清，从1比500开始做倍比稀释，取100微升依次加入酶标板各孔，37摄氏度孵育1小时，洗板3次，每孔加入100微升HRP标记的羊抗鼠Ig(H+L)，37摄氏度孵育30分钟，洗板3次，加100微升TMB底物，室温避光显色5-15分钟，加50微升终止液。

c、测定：用酶标仪测定OD值(检测波长：450纳米，参考波长：630纳米)。检测结果见表1。

表1小鼠抗血清效价ELISA检测结果

抗血清稀释度	1#	2#	3#	4#	5#
						1∶500	1.936	0.785	1.147	0.746	1.297
1∶1000	0.947	0.43	0.671	0.584	0.867
						1∶2000	0.682	0.305	0.387	0.39	0.541
1∶4000	0.409	0.167	0.179	0.188	0.292
						1∶8000	0.247	0.117	0.142	0.154	0.191
1∶16000	0.158	0.096	0.105	0.122	0.126
						1∶32000	0.124	0.087	0.087	0.088	0.093
PBS	0.082	0.082	0.08	0.084	0.077

结果表明：小鼠抗血清倍比稀释1比32000，测得抗体效价均高于对照PBS，抗体水平满足细胞融合要求。

S2.3建立杂交瘤细胞

a、骨髓瘤细胞培养：融合前5-10天复苏SP2/0细胞，于5-10％FBS的RPMI-1640培养基中传代培养，收集处于对数生长期的SP2/0于50毫升离心管中，计数，取1-5×107个骨髓瘤细胞，1000-1500转每分离心5-10分钟，弃上清，加入20-50微升无血清RPMI-1640，洗涤2次；

b、冲击免疫：于融合前3-5天，取多肽-KLH交联免疫抗原，对经3次免疫的小鼠进行冲击免疫，每只小鼠腹腔注射30-150微克抗原；

c、制备滋养细胞板：于融合前一天，断颈处死小鼠，将小鼠浸泡于75％酒精中消毒3-5分钟后移入超净工作台剪开腹部皮肤，钝性剥离，剪开腹膜，吸取1-5毫升无血清培养基注入腹腔冲洗2-3遍吸入离心管中，1000-1500转每分离心5-10分钟，弃上清，将小鼠腹腔巨噬细胞移入适量完全培养基混匀，制备5块滋养细胞板，将滋养细胞悬液加入96孔板，37摄氏度孵育10-24小时，将0.5-1.5毫升PEG和5-20毫升无血清RPMI-1640置于37摄氏度孵箱预热；

d、制备小鼠免疫脾细胞：将经冲击免疫的小鼠摘眼球放血，断髓处死，浸泡于75％的酒精中消毒3-5分钟，无菌操作，剪开腹腔，取出脾脏，将脾脏置于200目钢网，加少量RPMI-1640研磨，制成脾单细胞悬液，移入50毫升离心管中，加RPMI-1640至20-40毫升，1000-1500转每分离心5-10分钟，洗涤2次。

e、细胞融合：骨髓瘤细胞和脾细胞充分混合，加RPMI1-1640，1000-1500转每分离心5-10分钟，弃上清。30-60秒内缓缓加入37摄氏度预热的PEG0.5-1.5毫升，反应30-60秒后，加无血清培养基5-20毫升以终止PEG的作用，此操作先慢后快，每1-3分钟加入1毫升，加2毫升后，余量培养基在3-5分钟内加完，1000-1500转每分离心5-10分钟，弃上清，加入10-30毫升含有5-20％FBS的RPMI-1640，轻轻吹打混匀，将细胞加入5块已铺有滋养细胞的96孔板，一天后加入HAT选择性培养基，每天观察细胞形态，加HAT3-5天后，融合的细胞会有单克隆形成，此时用负压吸引器吸出1/3-1/2培养基，加入新的HAT培养基。细胞培养过程中，换液1-3次为杂交瘤细胞筛选做准备，筛选前一天必须换液，一般融合后8-15天，未融合的骨髓瘤细胞和其他细胞全部死亡，融合细胞克隆生长，在细胞铺满孔低1/2或2/3时可进行进行细胞筛选。

f、阳性筛选细胞亚克隆：间接ELISA筛选方法鉴定细胞培养液中的融合细胞，以确定是否产生特异性抗体，筛选方法同抗血清效价的检测，区别在于，样品为单克隆细胞培养上清液，同时以骨髓瘤细胞培养液做对照对阳性孔进行细胞亚克隆，亚克隆前一天制备小鼠腹腔巨噬细胞滋养板，取需要亚克隆的细胞轻轻吹打，制成单细胞悬液，加入计数板，计算细胞密度，按每板100个细胞，取所需体积，加入适量完全培养基中，充分混匀后加入96孔板。

S2.4杂交瘤细胞亚型检测

阳性筛选细胞亚克隆：间接ELISA筛选方法鉴定细胞培养液中的融合细胞，以确定是否产生特异性抗体，筛选方法同抗血清效价的检测，区别在于，样品为单克隆细胞培养上清液，同时，以骨髓瘤细胞培养液做对照，对阳性孔进行细胞亚克隆，亚克隆前一天制备小鼠腹腔巨噬细胞滋养板，取需要亚克隆的细胞轻轻捶打，制成单细胞悬液，加入计数板，计算细胞密度，按每板100个细胞，取所需体积，加入适量完全培养基中，充分混匀后加入96孔板。

表2杂交瘤细胞ELISA检测结果

	2A1	2D8	3H7	5A3	6E4
						A	1.505	1.188	1.467	0.727	1.362
B	1.495	1.108	1.153	0.676	0.605
						C	1.308	1.099	0.527	0.537	0.178
D	0.96	0.736	0.171	0.32	0.072
						E	0.427	0.328	0.09	0.156	0.058
F	0.165	0.136	0.06	0.077	0.05
						G	0.088	0.069	0.057	0.085	0.071
H	0.06	0.063	0.063	0.056	0.059

5株杂交瘤细胞上清(2A1、2D8、3H7、5A3、6E4)与牛早孕因子全部反应。

表3杂交瘤细胞亚型

Code of mab cl0nes	Isotype
		2A1	IgG1/K
2D8	IgG1/κ
		3H7	IgG1/κ
5A3	IgG2a/κ
		6E4	IgGl/κ

五株单克隆抗体轻链均为Kappa，其中四株单抗(2M，2D8，3H7和6E4)亚型为IgG1，5A3亚型为IgG2a。

关于S1中腹水制备

选取亚克隆筛选后，可稳定分泌特异性抗体的细胞株进行培养，至细胞达到一定数量后，离心，收集细胞，按照2×105-1×106细胞每小鼠腹腔注射，对小鼠注射杂交瘤细胞株前一周，富强注射0.5毫升液体石蜡，使致小鼠敏，观察小鼠状态，注射杂交瘤细胞1-2周后，待小鼠腹部膨隆，进行腹腔穿刺收集腹水。

关于S2中腹水预处理

取新鲜(或冻存)的腹水，1000-4000转每分，2-8摄氏度离心10-20分钟，取上清，量取腹水上清液体积，每毫升腹水上清液中，加2-5mgCaCl2，立即混匀，再加5-15毫克二氧化硅粉末，混匀，混悬液置室温下旋转孵育15-30分钟，4000-10000转每分，2-8摄氏度离心10-20分钟，收集上清液一次性0.22微米滤器过滤，即可得澄清腹水。

S3：Protein G亲和纯化

取Protein G层析柱，使用前解冻至室温，并用3-5倍柱床体积平衡缓冲液预平衡，开启蠕动泵、记录仪和UV监测器，调整记录仪和UV监测器的基线，将预处理的腹水用等体积的平衡缓冲液稀释，经蠕动泵上样至Protein G层析柱中，收集流出液，继续用平衡缓冲液洗柱以彻底去除杂蛋白，至基线处，更换洗脱缓冲液，用含适量中和缓冲液的收集管收集洗脱峰，纯化抗体用过量0.01MPBS，pH7.4条件下透析，期间更换3次缓冲液，最后一次透析过夜，透析抗体可超滤浓缩，浓度＞1毫克每毫升，浓缩后抗体经5000-10000转每分，2-8摄氏度离心5-15分钟。取上清，用一次性0.22微米滤器过滤除菌，测定纯化后抗体效价，并加入防腐剂分装冻存。结果见表4。

表4纯化抗体效价

纯化抗体浓度	2A1	2D8	3H7	5A3	6E4
						10000	2.113	1.147	1.116	1.282	0.834
2000	2.136	1.02	1.064	1.002	0.732
						400	1.868	0.698	0.497	0.385	0.381
80	1.204	0.246	0.161	0.121	0.127
						39	0.54	0.115	0.081	0.062	0.075
16	0.186	0.061	0.056	0.049	0.055
						3.2	0.119	0.068	0.065	0.067	0.066
0	0.085	0.07	0.066	0.067	0.086

S4：单克隆抗体与HRP交联

称取HRP25毫克溶于1.25％戊二醛，室温静置过夜，溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱，控制流速1毫升每分钟，收集棕色流出液，棕色流出液体积多于5毫升，则以PEG浓缩至5毫升，置25毫升小烧杯中，缓慢搅拌，即HRP酶溶液，取待标记的抗体12.5毫克，用生理盐水稀释至5毫升，边搅拌边逐滴加入HRP酶溶液中，加1MPH9.5碳酸缓冲0.25毫升，继续搅拌3小时，加0.2M赖氨酸0.25毫升，混匀，置室温放置2时，边搅拌边逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4摄氏度放置1小时，3000转每分离心半小时，弃上清，用半饱和硫酸铵洗沉淀物二次，溶于少量PH7.4，0.15MPBS中，将上述溶液装入透析袋，透析去除铵离子(用萘氏试剂检测)，10000转每分离心30分钟去除沉淀，收集上清液，即为抗体与酶结合物，分装冻存。

对于双抗体夹心检测牛早孕因子蛋白采用棋盘法将不同多肽免疫的单抗做捕获抗体或检测抗体，评价它们检测牛早孕因子蛋白的可能性。

捕获抗体5-20微克每毫升包被，100微升每孔，4摄氏度过夜，加入1微克每毫升及0微克每毫升牛早孕因子蛋白，每孔100微升，37摄氏度孵育30-60分钟，洗板3次，每孔加入1-5微克每毫升HRP标记的检测抗体，37摄氏度孵育30分钟，洗板3次，加TMB底物100微升，室温避光显色5-15分钟，加终止液50微升，酶标仪测定OD值(检测波长：450纳米，参考波长：630纳米)。筛选结果见表5。

表5抗不同多肽单抗棋盘筛选结果

选择背景OD值＜0.1，阳性孔OD值＞1.0的抗体对，进行捕获抗体、检测抗体浓度的优化，并将牛早孕因子做系列稀释，检测标准曲线。检测结果见表6。

表6 2D8-6E4配对检测牛早孕因子检测结果

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，包括箱体A(1)、箱体B(2)、试管(4)以及驱动组件(10)，所述试管(4)与嵌入设置在箱体B(2)内的海绵塞(3)滑动配合，所述箱体B(2)通过主轴(9)与箱体A(1)转动连接，其特征在于，还包括：

提取机构，与箱体A(1)连接，用于对血清进行提取，所述提取机构包括顶板(6)、放置组件(5)、缓压组件以及降速组件，所述顶板(6)通过推动组件A(7)与箱体B(2)连接；

所述缓压组件包括套筒A(14)、连接柱A(19)、弹性件A(20)以及连接柱B(22)，所述套筒A(14)与顶板(6)转动连接，所述连接柱A(19)与连接柱B(22)转动连接，所述弹性件A(20)位于套筒A(14)内且一端与套筒A(14)连接，所述弹性件A(20)另一端与连接柱A(19)连接；

所述降速组件包括推杆(18)以及滑柱(21)，所述滑柱(21)与推杆(18)连接，所述滑柱(21)与开设在套筒A(14)上的槽位滑动配合，所述推杆(18)与连接柱B(22)连接，所述推杆(18)与放置组件(5)连接；

所述推动组件A(7)通过拉动顶板(6)进行线性往复运动促使放置组件(5)插入或远离试管(4)，驱动组件通过主轴(9)带动箱体B(2)进行转动促使试管(4)进行离心运动，同时连接柱A(19)以及连接柱B(22)进行同步旋转并在自身惯性下拉动弹性件A(20)，促使自身沿着套筒A(14)进行线性运动，连接柱B(22)推动推杆(18)进行线性运动，滑柱(21)在推杆(18)的推动下沿着开设在套筒A(14)上的槽位进行滑动并促使推杆(18)推动放置组件(5)沿着试管(4)内壁进行缓慢线性运动对血清进行膜过滤的方式，实现对血清进行快速自动提取。

2.根据权利要求1所述的牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，其特征在于，所述箱体A(1)上设置有用于对试管(4)进行固定的限位机构(8)。

3.根据权利要求1所述的牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，其特征在于，所述放置组件(5)包括筒体(13)、安装板(15)以及渗透膜(16)，所述渗透膜(16)与安装板(15)连接，所述安装板(15)与筒体(13)螺纹连接，所述筒体(13)与试管(4)滑动配合，所述筒体(13)上螺纹连接有密封盖(17)，所述密封盖(17)与推杆(18)通过吸附组件B连接。

4.根据权利要求1所述的牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，其特征在于，所述推动组件A(7)包括套筒B(26)、连接杆C(28)以及弹性件B(29)，所述连接杆C(28)与套筒B(26)滑动配合，所述弹性件B(29)位于套筒B(26)内，所述套筒B(26)以及连接杆C(28)通过吸附组件A连接。

5.根据权利要求1所述的牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，其特征在于，所述驱动组件(10)包括电机(35)以及齿轮副(11)，所述电机(35)与箱体A(1)连接，所述电机(35)的输出轴通过齿轮副(11)与主轴(9)传动连接。

6.根据权利要求2所述的牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，其特征在于，所述限位机构(8)包括限位件(25)、套筒C(32)以及安装盘(34)，所述套筒C(32)与箱体A(1)连接，还包括：

推动组件B，与限位件(25)以及安装盘(34)连接，用于推动限位件(25)挤压试管(4)；以及

线性运动组件，与套筒C(32)以及安装盘(34)连接，用于推动安装盘(34)进行竖直方向上的线性运动。

7.根据权利要求4所述的牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，其特征在于，所述吸附组件A包括电磁铁A(27)以及电磁铁B(30)，所述电磁铁A(27)嵌入设置在连接杆C(28)上且与连接杆C(28)连接，所述电磁铁B(30)与套筒B(26)连接。

8.根据权利要求6所述的牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，其特征在于，所述线性运动组件包括旋转块(31)以及丝杆(33)，所述旋转块(31)与丝杆(33)连接，所述丝杆(33)与套筒C(32)螺纹连接，所述丝杆(33)与安装盘(34)转动连接。

9.根据权利要求6所述的牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，其特征在于，所述推动组件B包括连杆A(23)以及连杆B(24)，所述连杆A(23)与连杆B(24)转动连接，所述连杆B(24)与限位件(25)转动连接，所述连杆B(24)与海绵塞(3)滑动配合，所述连杆A(23)与安装盘(34)转动连接。

10.根据权利要求1所述的牛早孕快速检测单克隆杂交瘤细胞株装置，其特征在于，所述箱体A(1)上嵌入设置有滚轮(12)，所述滚轮(12)与箱体A(1)转动连接，所述滚轮(12)与箱体B(2)抵触。