JP2005241520A - 糞便ろ過装置及び糞便ろ過方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 多検体の自然排泄便から大腸がんの診断をするために、糞便から細胞を回収する際に用いる糞便ろ過装置及び糞便ろ過方法を提供する。
【解決手段】 自然排出便及び前記バッファ液の混合物７をろ過する円錐状又は筒状フィルタ１と、フィルタ１を装着させる多孔質又は網目構造の支持機構２を有し、フィルタ１及び支持機構２を回転させる機構５、６を有し、支持機構２の外周部に、遠心力によりろ過されたろ液を採取する容器３を有する糞便ろ過装置。
【選択図】 図１

Description

本発明は、採取された自然排出便に、バッファ液が添加された試料をろ過し、ろ液よりがん細胞を採取するための糞便ろ過装置、及び糞便ろ過方法に関するものである。

欧米では、大腸がんが癌死亡率の上位を占めている。日本でも大腸がんの患者数は近年急激に増加している。これは日本人の食生活が欧米型の肉食が中心となったことに原因があると考えられている。国内では毎年約６万人程度が大腸がんに羅患しており、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さであり、今後のさらなる増加も予想されている。しかしながら、大腸がんは他のがんと異なり、早期がんであれば手術により、１００％近く治せることが知られている。従って、大腸がんは早期がん検診の対象となり、数多くの検査法が考案されてきた。

大腸がんの早期発見のための検査法として注腸検査や内視鏡検査などが行なわれている。注腸検査とはバリウムを大腸内に注入し、大腸の粘膜面に付着させ、その表面の凹凸をＸ線により調べる方法である。内視鏡検査は大腸の中を直接内視鏡で調べる方法である。これらの検査法は大腸がんの発見に対して、高い感度と特異性を有している。加えて、内視鏡検査では早期がんや前がん状態のポリープを切除できる利点も有している。しかし、これらの検査法は被験者への負担が大きく、コストも高い、特に内視鏡検査では操作に熟練を要し、合併症のリスクを伴っている。そのため、無症状の一般人を対象にした大腸がん検査には向いていない。

そこで、一般人の大腸がん一次スクリーニング法として、便潜血検査が広く利用されている。便潜血検査とは糞便に含まれるヘモグロビンの存在を調べることにより、腸内の出血の有無を診断し、間接的に大腸がんの発生を予測する方法である。

便潜血検査法には大きく分けて化学的検査法と免疫検査法の２種類が存在する。化学的便潜血検査法とは、ヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を利用した方法であり、基質として加えられた過酸化水素が分解される際に生じた活性酸素により、濾紙に含まれたグアヤックが、青緑色の酸化グアヤックに変わる反応を利用している。ヘモカルトＩＩ濾紙（藤沢薬品）や、シオノギＢ濾紙（塩野義製薬）などが市販品として検査に使用されている。

免疫的便潜血検査とは主に、抗ヒトヘモグロビン抗体の特異的なヒトヘモグロビンへの結合を利用しており、その特異性の高さから、現在では便潜血検査法の主流になりつつある。逆受身無血球凝集法（イムディアＨｅｍ−Ｓｐ、富士レオビ）、磁性粒子凝集傾斜法（マグストリーム Ｈｅｍ−Ｓｐ、 富士レオビ）、ラテックス凝集法（イムノカルト、中外製薬）などが知られている。

このように広く大腸がん検査に利用されている便潜血検査だが、検査の有用性に対しては疑問の声も上がっている。ヘモカルトＩＩを使用した化学的便潜血反応で陽性判定になるには大腸内で１日当たり２０ｍｇの出血が必要だが、実際の大腸がん患者の出血は１０ｍｇ以下であると考えられている。そのため、便潜血反応の感度は２６％程度であり、実際の大腸がん患者のおよそ１／４しか発見できず、３／４を見逃しているとの報告もある（下記非特許文献１）。更に、陽性判定被験者の中で実際に大腸がんであったのは８．３％に過ぎず、多くの擬陽性を含んでいる。

そこで、より精度の高い新しい一次スクリーニング用検査法の開発が切望されている。その候補として、糞便中に剥離したがん細胞を利用した検査法に注目が集まっている。大腸がんに伴い、間接的におこる腸内の出血を調べる便潜血検査法に比べて、本方法は直接がん細胞を調べるため、より信頼性の高い検査法になりうると考えられる。

糞便中のがん細胞を調べる検査法では、糞便から直接抽出した核酸を利用して遺伝子診断を行なう方法が下記特許文献１等に報告されている。具体的な遺伝子変異検出法としては、シークエンス法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ(polymerase chain reaction-restriction enzyme fragment length polymorphism) 法、ＳＳＣＰ(single-stranded conformational polymorphism) 法、ＰＴＴ(protein truncation test) 法などが開発されている。遺伝子変異の検出以外にもマイクロサテライトの不安定性 (MSI, microsatellite instability) やｌｏｎｇＤＮＡ (Ｌ−ＤＮＡ) の出現などを指標に診断を行なう方法が知られている。

遺伝子変異の診断の対象となる遺伝子として、Ｋ−ｒａｓ，ＡＰＣ，Ｐ５３，ＤＣＣ等が広く知られている。遺伝子の発現量の違いに目を付けた、新たな診断の対象となりうる遺伝子の探索はマイクロアレイ等を利用して現在でも活発に行なわれている。ＣＤ４４遺伝子のスプライシングバリアントの発現パターンをマーカーとする方法なども提言されている。

これらの検査法で問題になるのは、糞便中には様々な細菌や正常細胞由来の核酸が存在しており、糞便から回収されるがん細胞由来の遺伝子の割合が非常に微量（約０．０５％）であるという事である。これはがん細胞由来遺伝子の変異や微妙な発現パターンの変化を調べる際に大きな妨げとなり、これらの方法の実用化を困難にしている。

そこで、より確実な大腸がん診断に向けて、糞便から直接がん細胞を回収し、診断する方法が考えられている。糞便からがん細胞を回収するためには、２つのステップが重要である。ひとつは糞便中に存在する細胞を糞便から解離するステップであり、もう一つは解離した細胞を回収するステップである。

下記特許文献２には、糞便から細胞を解離するステップで糞便を冷却し、糞便の表面下に存在する細胞を解離させる前処理法が報告されている。具体的には、特許請求の範囲第１項に、『便をそのゲル氷点未満の温度に冷却する工程』を必須とするとの記載があり、この方法では冷却して氷結した糞便の表面を削り取り、糞便表面下に存在するがん細胞を解離させるものである。また、ストマッカーと呼ばれる固形物をマイルドに粉砕できる装置を使い、糞便全体を懸濁し、細胞を解離させる方法も報告されている。

解離した細胞を回収するステップでは、パーコールを利用した遠心分離法（下記非特許文献２）や、抗ヒト抗体を結合させた磁気ビーズを利用した回収法（下記非特許文献３）が報告されている。中でも上皮系細胞特異的に結合するＢｅｒ−ＥＰ４抗体を結合させた磁気ビーズは市販されており（Dynabeads Epithelial Enrich、ダイナル社）、大腸がん細胞株に結合することが知られている。下記特許文献２でもＢｅｒ−ＥＰ４結合磁気ビーズが糞便からのがん細胞の回収に利用されている。

特表２００２−５１５９７３号公報（ＷＯ９７／２８４５０） 特表平１１−５１１９８２号公報（ＷＯ９７／０９６００） Jama, Vol.269,1262-7, 1993 Int J Cancer, Vol.52, 347-50, 1992 Lancet, Vol.359, 1917-9, 2002, Apmis, Vol.110, 239-46, 2002

一般人を対象にした大規模な大腸がん検査では、自動化システムによる多検体の大量処理が必要である。糞便から直接細胞を回収し大腸がんの検査を行なう方法は、その信頼性において非常に優れた方法である。しかし、上記特許文献２に開示されたように、冷却によって氷結させた糞便の表面から細胞を回収する既存の方法（以下、「冷却法」という）では操作が煩雑であり、大規模検査を行なうことができない。

自動化に向けた多検体の大量処理には操作時間の短縮と簡略化が必要である。冷却法では遠心分離のステップが存在する。遠心分離は時間がかかる上に、自動化を行なうことができず、多検体処理を困難にする。更に検体の冷却操作は自動化において、装置を大掛かりなものにし、糞便処理操作を煩雑にする。

糞便から回収した細胞を用いた大腸がんの判定では細胞学的分析を行い、大腸がんを同定する方法が非常に有効である。ところが従来の冷却法では冷却操作により細胞にダメージを与え、細胞学的分析を困難にする。

更に、冷却法では糞便表面下の細胞を剥離させ回収している。小腸に近い上行結腸部位では糞便は泥水状であり、大腸壁から剥離したがん細胞はその後の有形便の形成過程で糞便中に取込まれると考えられる。そのため、冷却法では上行結腸由来のがん細胞を回収できない可能性が高い。

上記の課題を解決するために、本発明では、室温でも容易に操作できる糞便ろ過装置及び糞便ろ過方法とした。

即ち、本発明の糞便ろ過装置は、自然排出便及びバッファ液の混合物をろ過するフィルタが、円錐状又は筒状フィルタであり、フィルタを装着させる多孔質又は網目構造の支持機構を有し、これらフィルタ及び支持機構を回転させる機構を有し、支持機構の外周部に、遠心力によりろ過されたろ液を採取する容器を有することを特徴とする。同様に、本発明の糞便ろ過方法は、自然排出便及びバッファ液の混合物を、円錐状又は筒状フィルタを用いてろ過するステップと、フィルタを回転させ、フィルタの外周部に配置された容器内に、遠心力によりろ過されたろ液を採取するステップを有することを特徴とする。

これにより、本発明の糞便ろ過装置及び糞便ろ過方法は、細胞回収操作を簡便にするとともに、糞便中のがん細胞を安定した状態で高効率に回収でき、高い判定精度が得られるものである。しかも、温度管理手段を有さない糞便ろ過が可能である。

本発明では、糞便全体の懸濁液が利用できる新たなフィルターシステムの開発を行なった。回転型のフィルタは糞便懸濁液のろ過を効率化し、操作時間の短縮をもたらす。更に糞便の中心部を含んだ全体から細胞を回収するため、全大腸を対象にしたがん診断を可能にするものである。がん診断の自動化を可能にするものである。

更に糞便懸濁液中に血清を加えるなどプロトコールの条件検討を行い、全工程を室温で操作できる簡便化プロトコールの開発を行なった。

従来の上記特許文献２に開示された、冷却して氷結した糞便の表面を削り取り、糞便表面下に存在するがん細胞を解離させる方法（冷却法）と相違し、本発明の糞便ろ過装置及び糞便ろ過方法により、室温で糞便から良好な生きたがん細胞を効率的に回収することが出来るようになり、回収細胞の細胞学的、免疫学的、生化学的分析を高い精度で行なうことが可能になった。又、本発明の糞便ろ過装置及び糞便ろ過方法により、早期大腸がん由来の細胞や、全部の便を検体とすることにより、内視鏡検査で発見が困難な上行結腸由来のがん細胞を回収することができるため、非常に信頼性の高い検査法を提供することが可能になった。更に、冷却操作を本装置及び方法から排除し、大幅な操作の簡便化と時間の短縮をもたらし、本装置及び方法を利用した大腸がん検査の自動化トータルシステムの構築を可能にした。

図１に、本発明の糞便ろ過装置の一例を示す。フィルタ１が容器３に装着される。多孔質又は網目構造の支持機構２を用いておいてもよい。フィルタ１は、円錐状又は筒状であり、支持機構２と接触面積を増やすために、フィルタ１の底部は内部に折り込まれていても良い。フィルタ１がポリアミドメッシュやポリプロピレンのように、それ自体が自立できる場合は、支持機構２は不要である。フィルタ１が不織布のような柔らかな材質の場合には、支持機構２が必要となる。支持機構２としては、メッシュサイズの大きなステンレスメッシュやポリアミドメッシュが適する。支持機構２の外周部に、遠心力によりろ過されたろ液を採取する容器３が配置される。図１においては、容器３の底部はろ液を導くための開口部４となっているが、開口部をなくし、容器３自体がリザーバを兼ねてもよい。フィルタ１及び支持機構２は、モータ５及び回転運動伝達機構６によって軸６−１を中心として回転させることができる。図１においては、フィルタ１及び支持機構２は、容器３とともに回転するが、フィルタ１及び支持機構２のみが回転する機構としても良い。又、図１では、容器３がモータ５及び回転運動伝達機構６によって直接的に回転させられているが、その他の機構を介在させ間接的に回転させても良い。

上記のように構成される糞便ろ過装置に、採取された自然排出便にバッファ液が添加された試料７が、フィルタ１の内部に置かれる。図２のように、フィルタ１及び支持機構２が回転すると、試料７は遠心力により、フィルタ１の内部に広がりつつ、ろ液は多孔質又は網目構造の支持機構２を通過して、ろ液７−２が容器３に集められる。その後、回転を停止すると、ろ液７−２は容器３の開口部４より本装置の外に導かれ、以後の免疫学的、細胞学的、又は生化学的検査に付される。

ろ液を採取する容器３自体が、採取したろ液を保管するリザーバを兼ねる場合には、図３のように、容器３の内部側壁又は底部に、ろ液中のがん細胞と抗原−抗体反応を生ずる抗体が結合されたプレート７−３を設けることができる。抗体が結合されたプレートは、例えば、画像スキャナ７−４によってがん細胞との抗原−抗体反応の有無を判定する。これにより、がん細胞診断をより自動化することが可能となる。

図１〜３には図示されないが、本装置には、試料７を攪拌させるための攪拌手段が設けられても良い。

又、本糞便ろ過装置は、温度管理手段を有さないで、室温、例えば１５℃以上３５℃以下で操作することが好ましい。図４に、糞便中の細胞安定度及び抗原−抗体結合反応速度の温度依存性を示す。図４に示されるように、温度が低いと糞便中の細胞安定度は低下し、特に、４℃以下の氷結した状態では、がん細胞が死滅する恐れがあり、以後の細胞学的分析を困難にする。一方、抗原−抗体結合反応速度は、高温になるに連れて抗体が失活し、やはり以後の免疫学的操作を困難にする。そこで、本発明の糞便ろ過では、両者を両立させるために、室温付近、具体的には５℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３５℃の温度範囲を採用することが可能である。

＜糞便からの細胞回収＞
本発明である糞便からの細胞回収法の標準化プロトコールを図５に示す。以下、標準化プロトコールの手順に沿って説明する。
（ステップ１：検体回収）
本発明に用いる糞便はヒト自然排泄便を使用する。糞便は固体状の形を保ったものを使用し、下痢便は使用しない。また被験者が下剤等の強制排出薬や腸検査用のバリウム等を使用した後に排泄した糞便は使用しない。事前に被験者が特別な食事制限をする必要性はない。

検体用糞便は皿状またはシート状の使い捨て可能な容器上に回収し、適量をストマッカーバッグに入れたものを使用する。他にも糞便の回収は、ステック式糞便回収装置やスタンプ式回収装置など、適量の糞便が回収可能な方法であれば適用可能である。ストマッカーバッグは市販のフィルタ無しバッグを使用する。フィルタ付きストマッカーバッグも使用出来る。ここで言うストマッカーとは袋状の容器に入った検体を破砕するミキサーの一般名称であり、ストマッカー用の袋とはストマッカー用に市販された専用の袋を指すが、ストマッカーに使用可能な袋であれば他の代用品であっても適用可能である。

被験者から回収した糞便は３時間以内に使用することが望ましいが、およそ１０時間まで使用出来る。この間検体糞便は室温で保存することが可能であり、検体糞便を冷蔵もしくは冷凍する必要はない。

使用する糞便の量は５ｇから８０ｇ程度が望ましいが、およそ０．５ｇから２００ｇまで使用出来る。

糞便を回収したストマッカーバッグには懸濁用のバッファ液（メディウム）を加える。バッファ液にはＨａｎｋｓ液を使用する。しかし、一般的に細胞を扱う実験で使用するバッファ液であれば使用出来る。具体的な例として、ＰＢＳ、ＰＢＳ（−）、各種細胞培養用メディウム（ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，ＲＰＭＩ）などを挙げることができる。

加えるメディウムの量は糞便の量や状態により変える事が可能である。しかしながら、糞便１ｇ当たり２．５ｍｌ以上が望ましい。ストマッカーバッグ１袋当たり、２００ｍｌのバッファ液を加えれば上記のすべての便量に対応できる。

バッファ液には細胞安定化のため血清を加える。血清濃度は１０％が望ましいが０．５〜２０％程度でも可能である。血清の種類はＦＢＳ(fetal bovine serum)が望ましいがＣＳ(calf serum)でも使用できる。

バッファ液が加えられた糞便入りストマッカーバッグはシーラーを用いて密閉する。この時ストマッカーバッグを２重にして用いれば、懸濁液の漏れをより完璧に防ぐことが可能である。密閉したストマッカーバッグはストマッカーを用いて処理し、糞便懸濁液を作製する。この検体回収のステップは、室温で行った。但し、検体の回収からろ過までに時間を要する場合には、クーラーボックス等で冷却保管しておいても良い。

（ステップ２：ろ過）
懸濁液はドラフト内で、図１に示されるフィルタ付きろ過装置を使用してろ過し、残渣物を取り除く。
フィルタ装置のフィルタは単独もしくは様々な口径をもつフィルタを並べた多段式で使用する。単独で使用する際のフィルタの口径は５００μｍ程度が望ましいが、４０〜１５００μｍ程度、好ましくは、目詰まりを起こしずらく、不溶な未消化物を除くため、４００〜１０００μｍが適応可能である。多段で使用する場合は口径の大きいフィルタから小さいフィルタへ順番に懸濁液を流していく。多段ろ過用のフィルタの口径は、４０〜２０００μｍ程度が適応可能である。また多段式フィルタの最終フィルタの口径を１０μｍ以下にすることにより、細胞を最終フィルタ上に捕らえることが可能である。

フィルタの形状の一例を図５に示す。例えば、図５のフィルタの仕上がり形状が、開口部直径：６０ｍｍ、底部直径：２０ｍｍ、高さ：２００ｍｍで、容器挿入時の挿入高さ：１７０ｍｍのものが例示される。図１〜３に示したものは，側面にもフィルタが存在する漏斗型立体型フィルタである。しかし、ろ過面が側面のみである側面型円筒フィルタでも適用可能である。更にフィルタ面を凹凸のあるひだ状にすることにより、懸濁液との接触面積を増やした形状に変えることも可能である。

フィルターの材質はポリナイロン製が望ましい。しかし他にも適切な口径や形状のフィルタを作製できる材質ならば適用可能である。具体的な例としては、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、不織布などが挙げられる。このろ過ステップは、室温で行った。

（ステップ３：磁気ビーズ反応）
ろ液中に含まれるがん細胞を、がん細胞にアフィニティーをもった担体を用いて回収する。担体にはがん細胞に対するアフィニティーを持った抗体が表面に結合した磁気ビーズを使用する。具体的にはダイナル社から市販されているＢｅｒ−ＥＰ４抗体結合磁気ビーズ（Dynabeads Epithelial Enrich、ダイナル社）を使用する。Ｂｅｒ−ＥＰ４以外にも大腸がん細胞に対するアフィニィティーを持った抗体ならば適応可能である。抗体以外にも大腸がん細胞にアフィニィティーのあるアプタマー、リガンドなどが使用できる。

分注したろ液が約２０〜４５ ｍｌ 入ったチューブ一本当たり、４０μｌの磁気ビーズを加える。磁気ビーズの量は５〜４００μｌ程度の範囲で変えることが可能である。

磁気ビーズを加えたろ液はミックスローターを用いて常時撹拌により混和し、ろ液中の細胞を磁気ビーズに結合させる。混和は室温もしくは４℃のコールドルーム内で行なうことが望ましい。混和時間は３０分間以上が望ましい。この磁気ビーズ反応のステップは、室温で行った。

（ステップ４：磁気分離）
混和したろ液入りチューブは磁気スタンドに設置した後、１５分間混和液を撹拌し、磁気ビーズをチューブ側面に集める。撹拌時間は１０分間以上が望ましい。撹拌方法はシーソー運動、回転、旋回など、ろ液が緩やかに混和する条件であれば問題ない。

磁気ビーズが壁面に付着した後、ろ液は取り除く。ろ液除去後、磁気スタンドからチューブを外し、上記メディウムに再縣濁し、再び磁気スタンドを用いて磁気ビーズを洗浄し、ビーズ洗浄液を回収する。メディウムの量はチューブ当たり５００μｌ使用するが、次の実験を想定して、任意に量を変動させることが出来る。この磁気分離のステップは、室温で行った。

（ステップ５：磁気分離，エッペンチューブ）
洗浄液は先に使用したチューブよりも小型のエッペンチューブ等に回収する。洗浄液の入ったチューブは直ちに専用磁気スタンドに設置し、エッペンチューブの側壁に磁気ビーズを集めた後、上清を除去し、細胞-ビーズ複合体のペレットを得る。この磁気分離、エッペンチューブのステップは、室温で行った。

＜大腸がん診断＞
本標準化プロトコールで回収したペレットは、続いて大腸がん判定用の検体として使用する。がんの判定には細胞そのものを利用する場合と細胞から抽出した物質を利用する場合がある。細胞そのものを利用する場合は回収後、直ちに使用する。抽出物質を利用する場合は−８０℃にペレットを凍結保存することが可能である。

細胞そのものを利用する場合はパパニコロウ染色により、細胞を染色し、顕微鏡で観察し判定する。細胞質に対する核の比率（Ｎ／Ｃ比）が高く、クロマチンが凝集した異型性の細胞が確認できた場合、がん細胞であると判定を下す。染色法はその他にもがん細胞を同定できるものであれば適応可能である。一般染色以外にもがん細胞特異的抗体を利用した免疫染色が適応可能である。

細胞からはＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出して、がん判定に利用することが可能である。ＤＮＡ、ＲＮＡの抽出には各社から発売されている核酸抽出キットが使用出来る。具体的にはＤＮＡの抽出にはダイナル社のＤｙｎａｂｅａｄｓＤＮＡ ＤＩＲＥＩＣ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ，キアゲン社のＱＩＡａｍｐＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、三光純薬社のセパジーンなどが挙げられる。ＲＮＡの抽出にはニッポンジーン社のＩＳＯＧＥＮ,インビトロジェン社のＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔなどが挙げられる。抽出した核酸は従来技術の項で示したような様々な方法に利用できる。

＜糞便処理トータルシステム＞
本システムを応用した糞便処理トータルシステムの概念を以下に示す。収集された検体はストマッカーを用いて懸濁する。懸濁液をろ過する装置は、図１〜３に示した様な本発明の糞便ろ過装置が適用できる。また多段式のフィルタ装置とすることも可能である。ろ液は分注し、ビーズを添加した後、攪拌する。攪拌装置は既存の製品の転用あるいは多検体処理に適応した装置を使用する。磁気分離には既存の磁気スタンドもしくは、磁力を強めた多検体同時処理対応スタンドを使用する。

回収した細胞-ビーズ複合体を用いてがん判定を行なう。がんの判定には細胞からの抽出物あるいは細胞自身を利用する。ＤＮＡチップやプロテインチップを利用した発現解析あるいはフローサイトメトリーを利用したがん細胞の同定などの検査法を適応して自動化システムを構築する。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜糞便からの細胞の回収＞
手術前の大腸がん患者由来糞便を検体として使用した。糞便の使用に関しては事前に被験者へ実験内容の説明を行い、同意を得た。

糞便（約５〜８０ｇ）が入ったストマッカーバッグに２００ｍｌの１０％ＦＢＳ含有Ｈａｎｋｓ液（ニッスイ）を入れ、シールした後、ストマッカーを用いて（２００ｒｐｍ，１ｍｉｎ）糞便の懸濁液を作成した。

図１に示される糞便ろ過装置を用いて懸濁液をろ過した。フィルタがないストマッカーバッグを使用した場合は筒状プラスチック容器にセットした漏斗型フィルタに懸濁液を通してろ過し、ろ液をビーカーに回収した。ろ液は更に、５０ｍｌの遠沈管５本に分注した。

遠沈管一本当たり、４０μｌのＢｅｒ−ＥＰ４抗体結合磁気ビーズ（Dynabeads Epithelial Enrich、 ダイナル社）を加え、ミックスローター(VMR-5、 AS ONE社)を用いて混和し（４℃、６０ｒｐｍ、３０分間）、ろ液中の細胞をＢｅｒ−ＥＰ４抗体に結合させた。

各遠沈管を磁石スタンド（Dynal MPC-1、ダイナル社）にセットした後、マイルドミキサー（SI-36、TAITEC社）上に横向きに置き、１５分間シーソー運動を行い（６０往復／１分間）、ろ液を混和し、磁気ビーズを遠沈管側壁へ集めた。

ろ液を除去した後、遠沈管をスタンドから外し、一本当たり５００μｌの１０％ＦＢＳ含有Ｈａｎｋｓ液を加えて、壁面に集められたビーズを洗浄した。

ビーズを含んだ洗浄液をあらかじめ５００μｌの１０％ＦＢＳ含有Ｈａｎｋｓ液が入れられたエッペンチューブ（１．５ｍｌ用）５本に回収した。軽く懸濁後、磁石スタンド（Dynal MPC-S、ダイナル社）にセットし、エッペンチューブの側壁に磁気ビーズを集めた。

洗浄液を除去した後、エッペンチューブをスタンドから外し、一本当たり１ｍｌの１０％ＦＢＳ含有Ｈａｎｋｓ液を加えて、壁面に集められたビーズを洗浄した。同様に、チューブを磁石スタンドにセットし、エッペンチューブの側壁に磁気ビーズを集めた後、上清を除去して、細胞−ビーズ複合体のペレットを得た。この回収は、室温で行った。

＜回収細胞の細胞学的分析＞
実施例で回収したチューブ１本分の細胞−ビーズ複合体ペレットにＹＭ固定液１００μｌを加えて懸濁した後、５０ｍｌの遠沈管に移し、ＹＭ固定液で全量２５ｍｌにして細胞含有固定液を作成した。細胞含有固定液をスライドグラス８枚分のオートスメア装置に分注し、更にＹＭ固定液を加えて装置を固定液で満たした後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心して、スライドグラスに細胞を塗抹した。スライドに冷風を当てて乾燥させた後、９５％エタノールで固定した。

細胞形態観察用の代表的な染色法であるパパニコロウ染色法により、細胞を染色し、がん細胞の有無を顕微鏡で観察して判断した。その結果、直腸がん患者４０〜１８０細胞／検体の細胞を検出できた。これらは、がん組織由来の上皮細胞と推測される。健康人の糞便からは上皮細胞と思われる細胞は検出されなかった。

＜Ber-Ep４抗体固定フィルムを用いたがん細胞検出例＞
糞便縣濁液をろ過し、ろ過中に含まれるがん細胞をBer-Ep４抗体を固定したフィルムで直接検出する方法を図３を用いて説明する。Ber-EP４抗体固定フィルムはポリスチレンシートを酵素プラズマで室温９０秒間処理したシートに、Ber-EP４抗体を固定した。固定条件を以下に示す。Ber-EP４抗体（２μg／１００μl）と２０μg／１００μlのBSAを含む、PH７．４緩衝液（０．１５MNaCl、０．１％NaN₃、５０mMリン酸ナトリウムPH７．４）に、５mm×２０mmのポリスチレンシートを接触させ、２５℃で４時間放置する。５mg／μlBSAを含む上記PH７．４緩衝液で洗浄後、同溶液中で４℃に保存する。このBer-Ep４抗体固定シート７−３を容器３の側面に固定する。固定した容器３に２箇所の突起を設けておき、突起間にBer-Ep４抗体固定シートを抗体固定面を内側に向けて固定する。

前記＜糞便からの細胞の回収＞にしたがっって、糞便をストマッカーでFBS含有Hanks液に縣濁し、図３の漏水型フィルタに添加した。１２０rpmで容器３ごとフィルター１を回転軸６−１の周りで５分間回転させ、がん細胞を含むと思われる糞便縣濁液をろ過する。その後１０秒間回転停止、１０秒間１２０rpmで回転のシーケンスを２０回くりかえす。

回転を停止すると、ろ液は容器３の底にたまり、ろ液７−２のように側面のBer-Ep４抗体固定フィルムに接触する。ろ液とBer-Ep４抗体固定フィルムの接触が繰り返されるうちに、縣濁液中のがん細胞が効率よくBer-Ep４抗体固定フィルムの上にトラップされる。

縣濁液を除去後、PH７．４緩衝液１００μlを加え、１０秒間回転を続け、がん細胞をトラップしたプレートを洗浄する。回転をやめ、洗浄液を除去する。この洗浄工程を２回繰り返す。

染色は、FITC標識AFP抗体で行う。FITC標識抗体の５mg／mlBSAを含むPH７．４緩衝液５mlを加え、３００rpmで容器を回転させ１０分間FITC標識抗体溶液をがん細胞をトラップしたプレートと接触させる。５mg／mlBSAを含むPH７．４緩衝液で洗浄後、がん細胞を蛍光スキャナー７−４で検出する。スキャニングの容器３をモータ５で往復させスキャナー７．４を上下にスキャンすることで５mm×２０mmの範囲のすべてを測定する。その結果、ある大腸がん患者由来の糞便（約２５g）の例での、４３個の細胞と思われる蛍光スポットが検出された。健常人で同様の実験を行うと蛍光スポットの数は６個であった。これはFITC標識抗体が非特異的に結合した蛍光像と考えられ、明瞭に健常人とがん患者では蛍光スポット数が異なる。

本発明の糞便ろ過装置の一例を示す。 糞便ろ過の様子を示す。 本発明の糞便ろ過装置の他の一例を示す。 糞便中の細胞安定度及び抗原−抗体結合反応速度の温度依存性を示すグラフである。 糞便からの大腸がん細胞回収法の標準化プロトコールの模式図である。 糞便懸濁液をろ過する漏斗型フィルタの形状を示す図である。

符号の説明

１ フィルタ
２ 支持機構
３ 容器
４ 開口部
５ モータ
６ 回転運動伝達機構
６−１ 軸
７ 試料
７−２ ろ液
７−３ プレート
７−４ 画像スキャナー

Claims (17)

1. 採取された自然排出便にバッファ液が添加された試料をろ過し、ろ液よりがん細胞を採取するための糞便ろ過装置であって、
   前記自然排出便及び前記バッファ液の混合物をろ過するフィルタが、円錐状又は筒状フィルタであり、
   前記フィルタを装着させる多孔質又は網目構造の支持機構を有し、
   前記フィルタ及び支持機構を回転させる機構を有し、
   前記支持機構の外周部に、遠心力によりろ過されたろ液を採取する容器を有することを特徴とする糞便ろ過装置。
2. 前記ろ液を採取する容器の底部に、ろ液を採取する排出口を有することを特徴とする請求項１に記載の糞便ろ過装置。
3. 前記ろ液を採取する容器自体が、採取したろ液を保管するリザーバを兼ねることを特徴とする請求項１に記載の糞便ろ過装置。
4. 前記ろ液を採取する容器の側壁又は底部に、ろ液中のがん細胞と抗原−抗体反応を生ずる抗体が結合されたプレートを有することを特徴とする請求項３に記載の糞便ろ過装置。
5. 前記抗体が結合されたプレートの前記がん細胞と抗原−抗体反応を判定するための画像スキャナを有することを特徴とする請求項４に記載の糞便フィルタ装置。
6. 前記容器には、前記試料を攪拌させるための攪拌手段が設けられていることを特徴とする請求項１記載の糞便ろ過装置。
7. 前記糞便ろ過装置は、温度管理手段を有さないことを特徴とする請求項１記載の糞便ろ過装置。
8. 自然排出便よりがん細胞を回収するための糞便ろ過方法であって、
   採取された自然排出便に、バッファ液が添加された試料を準備するステップと、
   前記自然排出便及び前記バッファ液の混合物を、円錐状又は筒状フィルタを用いてろ過するステップと、
   前記フィルタを回転させ、前記フィルタの外周部に配置された容器内に、遠心力によりろ過されたろ液を採取するステップを有することを特徴とする糞便ろ過方法。
9. 前記ろ液を採取する容器の底部に設けられた排出口より、ろ液を採取することを特徴とする請求項８に記載の糞便ろ過方法。
10. 前記糞便ろ過の全工程を温度管理無しに行うことを特徴とする請求項８に記載の糞便ろ過方法。
11. 前記温度管理無しとは、１５℃以上３５℃以下であることを特徴とする請求項１０記載の糞便ろ過方法。
12. 前記バッファ液は、血清が含まれていることを特徴とする請求項８に記載の糞便ろ過方法。
13. 前記バッファ液の量は、前記糞便の量の等倍以上であることを特徴とする請求項８記載の糞便ろ過方法。
14. 請求項８に記載の糞便ろ過方法によって採取したろ液中のがん細胞を、前記ろ液を採取する容器の側壁又は底部に設けられた、抗体結合プレートにより抗原−抗体反応を生じさせるステップを有することを特徴とするがん細胞回収方法。
15. 請求項１４に記載の糞便ろ過方法によって採取したろ液中のがん細胞を、前記ろ液を採取する容器の側壁又は底部に設けられた、抗体結合プレートにより抗原−抗体反応を生じさせるステップにおいて、前記容器を円筒軸を中心に回転と停止を繰り返し、糞便ろ過液を撹拌させ、ろ過液と抗体結合プレートの接触効率を向上させるステップを有することを特徴とするがん細胞回収方法。
16. 請求項９に記載の糞便ろ過方法によって採取されたろ液を、抗体が結合されたプレートを用いて前記がん細胞と抗原−抗体反応を生じさせるステップと、
    前記プレートを画像診断するステップを有することを特徴とするがん細胞診断方法。
17. 請求項９に記載のがん細胞回収方法によって採取されたろ液を、画像スキャナを用いて、前記抗体が結合されたプレートの前記がん細胞と抗原−抗体反応を判定するステップを有することを特徴とするがん細胞診断方法。
    

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