CN107163141A

CN107163141A - 一种羊多抗血清特异性抗体的纯化方法

Info

Publication number: CN107163141A
Application number: CN201710391678.0A
Authority: CN
Inventors: 袁金城; 王耀; 莫爱娟
Original assignee: Haiaosi Biotechnology Zhenjiang Co Ltd
Current assignee: Haiaosi Biotechnology Zhenjiang Co Ltd
Priority date: 2017-05-27
Filing date: 2017-05-27
Publication date: 2017-09-15

Abstract

本发明公开了一种羊多抗血清特异性抗体的纯化方法，该方法包括：1）盐析法：用辛酸、硫酸铵三步沉淀法，将羊多抗血清中的特异性抗体全部提取；2）蛋白G柱纯化：取盐析后的羊多抗血清特异性抗体，用结合Buffer稀释，过滤，加入G柱中，收集流穿液，用结合Buffer加入G柱中，待全部流出，加洗脱Buffer，同时收集洗脱液；即得到纯化后的羊多抗血清特异性抗体。本发明操作简单，提取物纯度能提高20%。

Description

一种羊多抗血清特异性抗体的纯化方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种羊多抗血清特异性抗体的纯化方法。

背景技术

抗血清为含有某一类具有特异免疫功能的抗体分子的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。一种抗原能否引起抗体生成反应，一方面取决于抗原分子表面有无抗原决定簇（Antigenic determinant），另一方面取决于机体的免疫状态，当具备以上两个条件后，抗体生成将遵循抗体生成的一般规律——初次反应和再次反应。抗原的种类繁多，包括天然的蛋白质抗原和细胞性抗原、合成性抗原以及基因工程抗原等，不同的抗原免疫动物具有不同的特殊性。一般完全抗原免疫动物需加用佐剂，尤其在使用可溶性抗原时，以期得到高效价的抗血清；合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物质需先通过人工的方法与蛋白质载体连接后再与佐剂混合免疫动物，方可获得理想的免疫效果。使用佐剂后可增加抗原的免疫原性和延长抗原在机体内存留的时间，从而改变了抗原原有的免疫原性。

动物免疫系统是动物在种系发生和个体发育过程中逐渐进化和完善起来的，是机体执行免疫功能的组织机构，是产生免疫应答的物质基础。动物免疫系统是由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成的。

制备抗体的传统方法是用纯制的抗原多次接种于适当的成年健康动物，则激其产生免疫应答，血清中含有大量特异性抗体，又称抗血清或免疫血清。

目前，抗血清特异性抗体的纯化方法主要采用离心分离法、盐析法和层析法中任一种，每种方法都存在缺陷，比如离心分离法包括差速离心和梯度离心，二者操作过程比较复杂，差速离心是要在低速与高速交替进行，离心的对象是大小差别较大的颗粒；梯度离心要先进行前处理，然后等梯度形成后再离心，时间较长。盐析法会受到蛋白质浓度、pH值、离子强度、温度的影响，因此效果不好。层析法根据其原理不同可分为离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析；这种方法是目前提取物纯度较高的方法，但是操作复杂，适应性差。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种操作简单、能提高提取物纯度的羊多抗血清特异性抗体的纯化方法。

为达到上述目的，本发明是通过以下的技术方案来实现的。

一种羊多抗血清特异性抗体的纯化方法，该方法包括以下步骤：

1）盐析法：用辛酸、硫酸铵三步沉淀法，将羊多抗血清中的特异性抗体全部提取；

2）蛋白G柱纯化：取盐析后的羊多抗血清特异性抗体，用结合缓冲液稀释，过滤，加入G柱中，收集流穿液，用结合缓冲液加入G柱中，待全部流出，加洗脱缓冲液，同时收集洗脱液；即得到纯化后的羊多抗血清特异性抗体。

进一步地，步骤1）盐析法的具体步骤如下；

（11）羊多抗血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，用0.1M NaOH 调至pH4.5；

（12）室温下滴加辛酸，搅拌30min，按每升溶液滴加25mL辛酸的比例滴加；

（13）冷冻高速离心机离心，收集上清夜，弃去沉淀；

（14）过滤上清液；

（15）按上清液体积的l/10加入10×PBS（磷酸盐缓冲溶液，0.1M），用5M NaOH 调至pH7.4；

（16）按每升溶液加277g 硫酸铵，搅拌30min；

（17）冷冻高速离心机离心，弃去上清液，收集沉淀；

（18）沉淀用透析液溶解，透析脱盐。

作为盐析法的进一步改进，步骤（13）中的离心转速为10000rpm，离心30min。

作为盐析法的进一步改进，步骤（17）中的离心转速为5000rpm，离心15min。

进一步地，步骤2）中，蛋白G柱纯化法的步骤为：

（21）血清处理：取羊多抗血清，用结合Buffer（缓冲液） 1:1稀释，充分混匀，滤膜过滤；

（22）柱子平衡：用结合Buffer加入柱中，流至液面与胶面平；

（23）吸附：处理好的抗血清加入柱中，收集流穿液；

（24）洗杂：用结合Buffer加入柱中，待全部流出；

（25）洗脱抗体：加洗脱Buffer ，同时用离心管收集洗脱液，前1.5ml丢弃，收集后续全部洗脱液。

作为蛋白G柱纯化法的进一步改进，步骤2）中，

结合缓冲液为： 10mMPBS含NaN₃ 0.01% ，pH7.2—7.4。

洗脱缓冲液为：10 mM NaH₂PO₄ ， 150mM NaCl含NaN₃ 0.01% ，用盐酸调至pH 2.8±0.04，其中所用盐酸为 5M HCl。

作为蛋白G柱纯化法的进一步改进，步骤2）中，过滤采用0.22nm的滤膜过滤。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明操作简单，提取物纯度能提高20%。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：一种羊多抗血清特异性抗体的纯化方法，该方法包括以下步骤：

第一步，盐析法：用辛酸、硫酸铵三步沉淀法，将羊多抗血清中的特异性抗体全部提取；具体步骤如下；

（13）冷冻高速离心机离心，收集上清夜，弃去沉淀；离心转速为10000rpm，离心30min;

（14）过滤上清液；

（15）按上清液体积的l/10加入10×PBS，用5M NaOH 调至pH7.4；

（16）按每升溶液加277g 硫酸铵，搅拌30min；

（17）冷冻高速离心机离心，弃去上清液，收集沉淀；离心转速为5000rpm，离心15min;

（18）沉淀用透析液溶解，透析脱盐。透析液购买自天津市标准生物制剂有限公司。

第二步，蛋白G柱纯化：

具体步骤如下：

（21）血清处理：取盐析后的羊多抗血清，用结合Buffer（缓冲液） 1:1稀释，充分混匀，采用0.22nm的滤膜过滤；结合缓冲液为： 10mMPBS含NaN₃ 0.01% (重量百分比)，pH7.2—7.4。

（23）吸附：将步骤（21）处理好的抗血清加入柱中，收集流穿液；

（24）洗杂：用结合Buffer加入柱中，待全部流出；

（25）洗脱抗体：加洗脱Buffer ，同时用离心管收集洗脱液，前1.5ml丢弃，收集后续全部洗脱液。即得到纯化后的羊多抗血清特异性抗体。洗脱Buffer为：10 mM NaH₂PO₄ ，150mMNaCl 含NaN₃ 0.01%(重量百分比) ，用盐酸调至pH 2.8±0.04，其中所用盐酸为 5M HCl。

下面通过对纯化后的CRP羊多抗、ApoA1羊多抗、ApoB羊多抗进行检测，检测条件：OD280，免疫双向扩散，生化仪，SDS-PAGE；结果如下：

（一）CRP羊多抗优势：

1、将常规的低值检测范围从1 mg/L提高至0.3 mg/L，将高值范围从150 mg/L提高至500 mg/L，为全量程CRP检测试剂提供了高质的原料抗体；

2、特异性高，全量程定标样条法曲线平滑，达到定标接受标准；

3、亲和力高，将原料抗体稀释10倍测定，测量 25mg/L 的被测物时，吸光度变化值（∆A）0.02～0.20之间；

4、该法纯化各批次羊多抗批间差小，提供的三批次纯化羊多抗测定数据相对偏差≤10%；

（二）Apo B羊多抗优势：

1、纯化羊多抗线性范围为（0.3-2.0）g/L，在此线性范围内线性相关系数r≥0.990；

2、批间准确度：相对偏差≤10%；

3、分析灵敏度：测量0.60g /L的被测物时，吸光度之差（∆A）在0.10～0.40之间。

（三）Apo A1羊多抗优势：

1、纯化羊多抗线性范围为（0.3-2.4）g/L，在此线性范围内线性相关系数r≥0.990；

2、批间准确度：相对偏差≤10%；

3、分析灵敏度：测量1.20g /L 的被测物时，吸光度之差（∆A）在0.20～0.40之间。

本发明按照上述实施例进行了说明，应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种羊多抗血清特异性抗体的纯化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1 所述的羊多抗血清特异性抗体的纯化方法，其特征在于，步骤1）盐析法的具体步骤如下；

（13）冷冻高速离心机离心，收集上清夜，弃去沉淀；

（14）过滤上清液；

（15）按上清液体积的l/10加入10×PBS，用5M NaOH 调至pH7.4；

（16）按每升溶液加277g 硫酸铵，搅拌30min；

（17）冷冻高速离心机离心，弃去上清液，收集沉淀；

（18）沉淀用透析液溶解，透析脱盐。

3.根据权利要求2所述的羊多抗血清特异性抗体的纯化方法，其特征在于，步骤（13）中的离心转速为10000rpm，离心30min。

4.根据权利要求1 所述的羊多抗血清特异性抗体的纯化方法，其特征在于，步骤（17）中的离心转速为5000rpm，离心15min。

5.根据权利要求1 所述的羊多抗血清特异性抗体的纯化方法，其特征在于，步骤2）中，蛋白G柱纯化法的步骤为：

（21）血清处理：取羊多抗血清，用结合缓冲液 1:1稀释，充分混匀，滤膜过滤；

（22）柱子平衡：用结合缓冲液加入柱中，流至液面与胶面平；

（23）吸附：处理好的抗血清加入柱中，收集流穿液；

（24）洗杂：用结合缓冲液加入柱中，待全部流出；

（25）洗脱抗体：加洗脱缓冲液，同时用离心管收集洗脱液，前1.5ml丢弃，收集后续全部洗脱液。

6.根据权利要求1 或5所述的羊多抗血清特异性抗体的纯化方法，其特征在于，步骤2）中，结合缓冲液为： 10mMPBS含NaN₃ 0.01% ，pH7.2—7.4。

7.根据权利要求1或5所述的羊多抗血清特异性抗体的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，洗脱缓冲液为：10 mM NaH₂PO₄ ，150mM NaCl 含NaN₃ 0.01% （重量百分比），用盐酸调至pH 2.8±0.04，其中所用盐酸为 5M HCl。

8.根据权利要求1 或5所述的羊多抗血清特异性抗体的纯化方法，其特征在于，步骤2）中，过滤采用0.22nm的滤膜过滤。