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CN1149875A - 皂树皂苷佐剂及含有该佐剂的疫苗配制器 - Google Patents

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CN1149875A CN96190306A CN96190306A CN1149875A CN 1149875 A CN1149875 A CN 1149875A CN 96190306 A CN96190306 A CN 96190306A CN 96190306 A CN96190306 A CN 96190306A CN 1149875 A CN1149875 A CN 1149875A
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Abstract

本发明公开了一种分子量约为956道尔顿的新的皂苷成分，一种从Quillajasaponaria Molina的树皮中分离该皂苷成分的方法，一种包含该皂苷成分作为免疫佐剂的疫苗配制品，一种通过采用包括皂苷成分和第二佐剂的佐剂组合物增加对抗原的免疫应答的方法。

Description

皂树皂苷佐剂及含有该佐剂的疫苗配制品
发明领域
本发明涉及一种新的皂苷成分及含有该皂苷成分作为免疫佐剂的疫苗配制品。更具体地，本发明涉及一种分子量约为956道尔顿的新的皂苷成分，一种从Quillaja saponariaMolina的树皮中分离皂苷成分的方法，一种含有该皂苷成分作为免疫佐剂的疫苗配制品，一种增强对抗原的免疫应答的方法，该方法采用一包含该皂苷成分和一第二佐剂的佐剂组合物。
发明背景
生物工程技术对于开发含有来自各种病毒外壳蛋白的重组抗原的疫苗作出了重大贡献，然而，有效地防止由HIV(人免疫缺陷病毒)和HCV(丙型肝炎病毒)引起的可怕的疾病的疫苗尚未问世，其部分原因是由于缺少能有效地加强这些重组抗原的相对较弱的抗原性的佐剂。因此，已开展了深入的研究来开发适用于这些疫苗的佐剂。
目前，氢氧化铝(明矾)由于其低毒性因而是唯一能用于人的佐剂，然而，已知当明矾与由HIV、HCV、HSV(单纯疱疹病毒)引起的疾病以及血吸虫病、百日咳和伤寒的抗原一起使用时效果不佳(Sanchez-Pescador等，免疫学杂志，141，1720-1727(1988)；James，S.L.等，文献同上，140，2753-2759(1988)；Edelman R.，感染病综述，2，370-383(1980))。因此已认识到需开发新的佐剂，为此，已提出了多种佐剂，例如，皂苷、油乳、单磷脂A和Freund’s佐剂，然而已发现每种佐剂均有不满意的佐剂活性、高毒性和/或不希望的副作用等问题。例如，Freund’s佐剂可引起granulomatous炎症，而在现有技术中描述的皂苷则易产生下述的毒性问题。
皂苷是植物糖苷，其具有许多商业用途例如饮料中的起沫剂、纺织工业中的洗涤剂等。最近证明从南美树木Quillaja saponaria Molina的树皮中抽提得到的皂树皂苷混合物显示有体液和细胞免疫应答(Espinet R.G.，Gac.Vet.，13，268-273(1951)；Dalsgaard K.，Arch.Gesamte Virus Forsch.，44，243-254(1974)；Morein B.，自然，322，287-288(1988))。一种皂树皂苷的提纯形式以“Quil-A”的品名出售(Iscotec AB，瑞典；以及Superfos Biosector a/s，Frydenlundsvej 30，DK-Vedbaek，丹麦)。
然而，Quil-A是许多可由下述通用化学结构代表的同系物糖苷的混合物，在所述的通用化学结构中，三萜皂酸即糖苷配基通过一糖苷键与各种类型和长度的糖组分键合。还已知每种这些糖苷成分具有变化很大的佐剂活性和毒性，因此，Quil-A用在人用药物配制品中是不安全的(Kersten等，Infect. Immun.，56，432-438(1988))。因此，已有尝试来鉴别安全和有效的皂树皂苷成分并开发一种制备其的方法。
Kansil等使用在甲醇/水(58∶42(v/v))中的40mM乙酸溶液将皂树树皮粗提物的甲醇可溶组分进行反相高压液相色谱(“RP-HPLC”)，并得到了几种纯化的皂苷成分。在这些成分中，一种称为QS-18的成分发现有高溶血性，即高毒性。相反，另一种称为QS-21的成分具有低毒性并显示有高佐剂活性。也已报道称为QS-7和QS-17的成分具有佐剂效果(Kensil等，免疫学杂志，146，431-437(1991)；Kensil等，美国专利5,057,540(1991))。另外还报道了成分QS-21能增强HIV和其它病毒抗原的免疫原性(Kensil等，JAMA，199，1423-1427(1991)；Wu，J.W.等，免疫学杂志，148，1519-1525(1992))。
然而，Kensil等人公开的制备方法非常复杂，其需要结合使用硅胶层析和RP-HPLC，另外，所分离的QS-7、QS-17、QS-18和QS-21成分的分子量范围从1800-2600道尔顿，仅代表一部分存在于树皮抽提物中的皂树皂苷。
另一方面，Kersten等采用疏水性RP-HPLC分离出Quil-A的超过23种成分，并发现一种称为QA-3的特定成分在与甾醇、磷脂和抗原以二维或三维免疫原性复合物形式使用时在毒性和佐剂活性方面均优于QS-21(Kersten等，W092/06710)。
然而，Kersten等的免疫原性复合物中所含的甾醇未被允许用在注射配制品中，而且，Kersten等人分离并公开的所有成分包括QA-3仅代表了分子量范围为1300-2400道尔顿的皂苷。因此，现有的研究尚未揭示在皂树树皮抽提物的其它部分中发现有效并安全的佐剂的可能性，特别是较低分子量皂树皂苷成分。
发明概述
因此，本发明的一个目的在于提供一种当用于疫苗时具有高佐剂活性的无毒或低毒的新的皂苷成分。
本发明的另一个目的在于提供一种从Quillaja saponaria Molina的树皮中分离所述的皂苷成分的方法。
本发明的再一个目的在于提供一种包含所述的皂苷成分作为佐剂并任选地包含另一种佐剂的疫苗配制品。
本发明的进一步目的在于提供一种增强对疫苗配制品中的抗原的免疫应答的方法，包括采用皂苷成分作为佐剂并任选地与一种第二佐剂联合使用。
根据本发明的一个方面，提供了一种分子量约为956道尔顿的称为QS-L1的皂苷成分，其是从Quillaja saponaria Molina的树皮中分离出，并且无毒或低毒，当于第二佐剂联合使用时具有高的协同佐剂活性。
附图简述
本发明的上述和其它目的和特征参照下述描述及结合附图将更加明了，其中：
图1为Quillaja saponaria Molina的树皮抽提物的RP-HPLC扫描图；
图2为Quil-A的RP-HPLC扫描图；
图3为Quil-A和纯化的皂苷成分QS-L1、QS-L2、QS-L3、QS-L4和QS-L5的硅胶薄层层析结果；
图4显示了QS-L1的电子喷射电离质谱(ESI-MS)分析的结果；
图5代表磷酸盐缓冲盐水(PBS)、QS-L1、QS-L2、QS-L3、QS-L4、QS-L5和Quil-A对于绵羊血红细胞的溶血活性；以及
图6A和6B比较了在与抗原HBsAg一起免疫时所观察到的QS-L1/明矾中的QS-L1的佐剂活性和明矾和Freund’s完全佐剂(FCA)的佐剂活性。
发明详述
本发明的皂苷成分即QS-L1可以从Quillaja saponaria Molina的树皮中分离出，并无毒或低毒，而且当与另一种佐剂例如明矾联合使用时显示出令人惊奇的高免疫佐剂活性。
术语“免疫佐剂”用于本文中是指这样一种化合物，当其与一种抗原一起给予人时或在体外测试时，能增强试验对象对抗原的免疫应答。
当用电子喷射电离方法(Electron Spray Ionization，ESI-MS)的质谱分析时，QS-L1的特征是其在m/z 979.4时为分子离子，当在一4.6×250mm Vydac C4柱中使用0.1％(重量)的在水/乙腈(7∶3(v/v))中的三氟乙酸水溶液以1ml/min的流速进行反相高压液相色谱分析时，QS-L1的特征是保留时间为约13.98分钟。
本发明还提供了一种从Q.saponaria Molina的树皮中分离QS-L1的方法，该方法简述如下：首先，通过用水处理Q.saponaria Molina的形成层并冻干粗提物而制备Q.saponaria Molina的树皮抽提物。
然后，可通过下述方法从Q.saponaria Molina的树皮抽提物中纯化QS-L1，该方法包括：
(a)离心该树皮抽提物于乙酸水溶液中的溶液，得到上清；
(b)使用超透析膜将上清对乙酸水溶液进行透析；
(c)离心得到的透析液，获得上清；
(d)冻干上清，获得皂苷抽提物粉末；以及
(e)将皂苷抽提物粉末溶于合适的溶剂，将该溶液进行RP-HPLC以获得含有基本上纯的QS-L1的组分。
步骤(a)中的乙酸水溶液的浓度可以为10-100mM，优选为40mM。步骤(b)中使用的透析膜的分子量截流值可以为12-14kDa，其适于除去低分子量的水溶性杂质。步骤(e)中用RP-HPLC的分级分离优选用C4 RP-HPLC柱，并用0.1％三氟乙酸水溶液作为洗脱剂，在30-40％的含0.1％三氟乙酸的乙腈的线性浓度梯度下进行。
树皮抽提物的RP-HPLC扫描图显示有超过32个峰，这些峰的一些可通过制备分级分离除去，以提供高纯度的各种皂苷成分，包括一种新的低分子量皂苷成分，命名为QS-L1。当使用4.6×250mm Vydac C4柱时，QS-L1在保留时间为13.98分钟时被洗脱。QS-L1的ESI-MS分析表明在m/z 979.4时为分子离子，当扣除Na的因素时，推导QS-L1的分子量约为956道尔顿。
使用上述相同的RP-HPLC方法还可从其它皂树抽提物例如Quil-A(SuperfosBiosector a/s，Frydenlundsvej 30，DK-Vedbaek，丹麦)中分离出QS-L1。
QS-L1的毒性可通过使小鼠在72小时内死亡的腹膜内注射剂量而确定，这种实验显示QS-L1在剂量水平高达500μg时对于小鼠仍是不致死的。
QS-L1当与抗原单独使用时显示出与现有技术中已知的一些皂苷成分例如QS-21相近的低免疫佐剂活性，然而，当QS-L1与另一种边缘佐剂例如明矾联合使用时显示出非常高的免疫佐剂活性。从未观察到到达如此高点的这种在两种或多种佐剂之间的强协同作用。
因此，本发明还提供了一种疫苗配制品，其包括一种抗原和一种包含QS-L1和另一种佐剂优选明矾的佐剂组合物。明矾优选以吸附抗原在其中的形式使用。适用于本发明的抗原不受任何特定抗原族的限制，其包括B型肝炎病毒表面抗原、HIV和HCV抗原，等等。在本发明的配制品中抗原的浓度可根据各种因素调节，例如抗原种类、所需的抗原性水平、接种对象的特异性及所需的免疫程度。
本发明的疫苗配制品可以是注射溶液或悬浮液的形式，其可根据任何常规程序制备。该配制品还可包括药物学可接受赋形剂、载体或稀释剂。合适的赋形剂可包括水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇及其混合物。另外，该组合物还可包括湿润剂、乳化剂、pH缓冲液，等等。
疫苗配制品的典型单剂量可以根据配制品的形式而变化，并应根据上述各种相关因素进行确定。本发明的疫苗配制品中的QS-L1的量可为1-500μg/单剂量，优选为10-50μg/单剂量，明矾的量优选为50-500μg/单剂量。
另外，本发明提供了一种增强所述疫苗配制品中的抗原的抗原性的方法，该方法采用与第二佐剂优选明矾联合应用的皂苷成分QS-L1作为免疫佐剂。
下述参考例和实施例意在进一步描述本发明而非限制其范围。
另外，除非另有说明，下述给出的固固混合物、液液、固液百分比分别基于重量/重量、体积/体积、重量/体积。参考例  确定皂苷成分的免疫佐剂活性
根据制备商购的EuVax(LG化学株式会社，韩国专利38837)的方法制备吸附在明矾上的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，  HBsAg与明矾(3％氢氧化铝)以100μgHBsAg比2500μg明矾的比例在10mM磷酸钠缓冲液(1.2mM Na2HPO4·7H2O，8.8mM K3PO4，0.8％NaCl，pH6.3-6.5)中混合，在一定轨摇床(“Red Rotor”，Hoefer，U.S.A.)上振荡混合物6小时以得到吸附在明矾上的HBsAg。
然后，使用吸附在明矾上的HBsAg如下测定皂苷成分的免疫佐剂活性。将皂苷成分溶解在蒸馏水中至浓度为2mg/ml，通过将50μl该皂苷溶液加到1ml吸附在明矾上的HBsAg(100μgHBsAg/2500μg明矾)中而制备HBsAg疫苗注射液。将每个50μl疫苗注射液皮下注射到7-8周龄的雌性Balb/c小鼠(Charle”s River Institute，Japan)的背部的两个位点，然后将小鼠进行两次加强免疫注射，每次采用相同量的疫苗注射液，间隔为3周。在最后一次加强免疫注射后的17天从小鼠尾巴提取血样，并如下测定所形成的抗HBsAg的抗体的滴度。
将纯化的HBsAg溶解在50mM硼酸钠缓冲液(pH9.0)中至浓度为0.5μg/ml，以200μl/孔的量将该溶液加到微滴定板(Immulon type 1 microtiter plate，Dynatech，U.S.A)的孔中，并于37℃保温2小时。随后以250μl/孔的量加入含0.2％(w/v)明胶的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)，将板在37℃保温1小时以封阻剩余的蛋白质吸附位点以防止任何以后会发生的非特异性反应。用含0.05％(v/v)吐温-20的PBS(“洗涤溶液”)洗孔两次。将取自小鼠的血样用含0.25％(w/v)明胶、1.0mM EDTA、1％(v/v)Triton X-100和0.02％(v/v)thimerosal的PBS(“稀释溶液”)稀释400倍，然后用该稀释溶液进行两倍连续稀释直至最终稀释819，200倍，加到孔中。
用洗涤溶液将在37℃保温2小时的板孔洗5次；以200μl/孔的量将含有用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG抗体的溶液(American Qualex，Cat.No.A106PS，U.S.A)  (该溶液已用所述的稀释溶液稀释4000倍)加到孔中。
得到物在37℃保温2小时并用所述的洗涤溶液洗5次，然后将200μl底物溶液加到每孔中并将板在室温于暗处保温30分钟，所述的底物溶液是通过将邻苯二胺二盐酸(OPD)片(Sigma，U.S.A.)用50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH5.5)溶解至浓度为2mg/ml而制备。向得到物中加入50μl 4N硫酸/孔以终止显色反应，在492nm用TitertechMultiscan Plus(Flowlab)测定每孔的O.D.。
抗体滴度用0.D.值达到0.5所需的稀释倍数的倒数来确定。实施例1  从Quillaja saponaria Molina中分离皂苷成分(步骤1)  制备纯化的皂苷抽提物
用水抽提Q.saponaria Molina的树皮，如此获得的含大于50％皂苷的抽提物是从Berghansen Corp.(Cincinnati，Ohio，U.S.A.)购得的。将这种皂苷粉末溶于40mM乙酸水溶液中至浓度为250mg/ml，得到的溶液用离心机(Beckman J2-21，JA 14)在12000rpm离心30分钟以除去不溶物质。用分子量截流值为12-14kDa的超透析膜(SpectrumMedical Industries Inc.，Cat.No.132676)将上清对50倍体积的40mM乙酸溶液透析两次以除去低分子量的可溶物质。将透析液再离心以完全除去不溶性杂质，将上清冻干以获得纯化的皂苷粉末。
如此获得的皂苷抽提物的硅胶薄层层析显示该抽提物的组成和纯度与Quil-A的组成和纯度很类似。(步骤2)  用C4 RP-HPLC分离皂苷成分
将(步骤2)中得到的皂苷抽提物溶解在0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液中至浓度为20mg/ml，将0.1ml得到的溶液以1ml/min的流速过C4 RP-HPLC柱(Vydac，4.6×250mm)，所述的柱用0.1％TFA水溶液预先平衡。通过采用示于表1中的乙腈浓度梯度洗脱结合的皂苷，在214nm处检测洗脱液。
                           表1
   No.     时间   流速(ml)     ％A*     ％B*
    1     0.00     1.00     70.0     30.0
    2     5.00     1.00     70.0     30.0
    3     30.00     1.00     60.0     40.0
    4     35.00     1.00     0.0     100.0
    5     40.00     1.00     0.0     100.0
    6     41.00     1.00     70.0     30.0
    7     51.00     1.00     70.0     30.0
    8     52.00     0.00     70.0     30.0
A*：0.1％TFA于蒸馏水中
B*：0.1％TFA于乙腈中
观察到多于32种皂苷成分在不同的保留时间被洗脱，根据保留时间收集组分以得到许多纯化的皂苷成分。每种皂苷成分在皂苷抽提物中的相对比例在0.13-32％之间变化。
根据参考例的方法测定纯化的皂苷成分的免疫佐剂活性，五种显示相对高免疫原性增强活性的成分分别被命名为QS-L1、QS-L2、QS-L3、QS-L4和QS-L5。表2示出对应于此五种成分的峰的面积(％)及其保留时间，对应于此五种成分的峰的位置示于图1。
                    表2
    成分   保留时间(分钟)     面积(％)
   QS-L1     13.967     4.23
   QS-L2     16.483     1.45
   QS-L3     28.900     2.01
   QS-L4     32.233     5.27
   QS-L5     35.500     2.40
将含有QS-L1、QS-L2、QS-L3、QS-L4或QS-L5的每种组分冻干并重复上述相同的RP-HPLC程序以获得纯度为90-97％的相应成分。
当相同的RP-HPLC程序应用于Quil-A(Superfos Biosectora/s，Frydenlundsvej 30，DK-Vedbaek，丹麦)时，观察到上述相同系列的皂苷成分，只是各成分之间的相对比例与从树皮抽提物中得到的成分的相对比例不同。(步骤3)  纯化的皂苷成分的硅胶薄层层析
将1μg(步骤2)中得到的每种皂苷成分QS-L1、QS-L2、QS-L3、QS-L4和QS-L5及40μg Quil-A(Superfos Biosectora/s，Frydenlundsvej 30，DK-Vedbaek，丹麦)放入硅胶薄层层析板(Si60 HPTLC，E.M.Science)并用氯仿/甲醇/蒸馏水(62∶32∶6(v/v/v))的混合物作为显色溶液洗脱3-4小时。
将板在80℃干燥约1小时，然后向其上喷射Bial’s试剂(orcinol Ferric Chloride，Sigma，Cat.No.0-7875)以促进显色，随后将板在80℃干燥30分钟以选择性染色皂苷成分的糖组分。结果示于图3，其中1道为Quil-A，2-6道依次为QS-L1、QS-L2、QS-L3、QS-L4和QS-L5，每种皂苷成分均显示为单一条带。实施例2  质谱
使用电子喷射电离(ESI)-MS方法，采用乙腈/蒸馏水/乙酸(60∶40∶0.5(v/v/v))作为洗脱剂，用VG Quattro LC/MS(Vacuum Generator，UK)测定皂苷成分QS-L1的分子量。结果如图4所示，在979.4(m/z)检测到一[M＋Na]+离子化分子峰。然而因为钠离子包括在内，因此(m/z)值应减去23，所以，纯QS-L1的分子量经测定为约956道尔顿，其比由Kersten等(WO92/06710)披露的QA-3的分子量1862道尔顿低得多，另外，其与Kensil等(疫苗，92，35-40，Cold Spring Harbor Laboratory Press)披露的QS-17、QS-18和QS-21的分子量(分别为2371、2174和2012道尔顿)也明显不同。因此，证明QS-L1是一新的皂树皂苷成分。实施例3  皂苷成分和Quil-A的毒性
随着给予粗皂树皂苷成分，在小鼠中的主要毒性症状为肝坏死。为研究QS-L1、QS-L2、QS-L3、QS-L4、QS-L5和Quil-A的毒性，如表3所示，给8周CD-1雄性小鼠(Charle’s River Institute，Japan)皮内注射125、250或500μg每种皂苷成分和Quil-A。对照组仅注射生理盐水。
                           表3
注射剂量(μg)     注射小鼠的数目
 生理盐水  Quhl-A   QS-L1   QS-L2   QS-L4   QS-L5
  125     -     5     5     5     5     5
  250     -     5     5     5     5     5
  500     5     5     5     5     5     5
结果是，表4示出了与Kensil，C.R.等(免疫学杂志，146，431-437(1991))公开的结果相比，注射皂苷成分和Quil-A 72小时内小鼠死亡的数目。表4  皂苷成分对CD-1小鼠的毒性(a)本实施例的结果
 注射剂量(μg)                  死亡小鼠的数目/注射小鼠
生理盐水    Quil-A    QS-L1    QS-L2   QS-L4   QS-L5
   125     -     1/5     0/5     0/5     2/5     0/5
   250     -     1/5     0/5     0/5     4/5     0/5
   500     0/5     5/5     0/5     0/5     5/5     3/5
(b)Kensil等公开的结果
 注射剂量(μg)                  死亡小鼠的数目/注射小鼠
  Quil-A     QS-7     QS-18     QS-21
   125     1/5     0/5     4/5     0/5
   250     2/5     0/5     5/5     0/5
   500     4/5     0/5     5/5     1/5
结果显示Quil-A具有相当高的毒性，其主要原因是QS-L4，QS-L4被认为是与QS-18相当。QS-L1和QS-L2在剂量水平为500μg时仅表现出很小的毒性或无毒。而被认为与QS-21相同的QS-L5据信具有高毒性因为用500μg剂量注射时5只小鼠中有3只死亡。实施例4  皂苷成分的溶血活性
根据Kersten等(W092/06710)或Kensil等(USP5，057，540(1991))的方法用绵羊血红细胞(SRBC)确定QS-L1、QS-L2、QS-L3、QS-L4、QS-L5和Quil-A的溶血活性。
首先，通过连续二倍稀释分别将500μg/ml的QS-L1、QS-L2、QS-L3、QS-L4、QS-L5和Quil-A稀释至终浓度为4μg/ml。将5ml分散在Alserver’s溶液中的SRBC(Korea medical Co.)放入15ml锥形试管中，然后在2,000rpm离心10分钟，向沉淀的SRBC中加入10ml生理盐水并在上述相同条件下离心混合物，将这一清洗程序重复一次，回收沉淀的SRBC并分散在生理盐水中至终浓度为4％(v/v)。在96孔圆底微滴板的每孔中加入150μl这种4％SRBC溶液，并以50μl/孔的量向孔中加入上述制备的皂苷成分稀释液。在37℃温育30分钟后，用微板离心机(Hanil，Korea)将板在2500rpm离心10分钟以沉降未溶血的细胞。将100μl上清从每孔中转移至平底微滴板的孔中，用Dynatech微滴板阅读器在405nm测定吸收值，结果示于图5，其中QS-L3、QS-L4和QS-L5在20μg/ml显示相当高的溶血活性，而QS-1在高达500μg/ml时仍未观察到溶血活性。这一结果表明QS-1可以安全而有效地以高至500μg/ml的浓度用作抗原的免疫佐剂，其可任选地吸附在明矾上。实施例5  皂苷成分的免疫佐剂活性
皂苷成分QS-L1、QS-L2、QS-L3、QS-L4和QS-L5的免疫佐剂活性根据参考例中相同的程序进行测定，所得的抗体效价示于表5。
表5  皂苷成分的免疫佐剂活性(抗体效价)
   小鼠No.                                 佐剂
    明矾   明矾＋QS-L1   明矾＋QS-L2   明矾＋QS-L3   明矾＋QS-L4   明矾＋QS-L5
    1     25600   102400   25600   51200   25600   51200
    2     51200   204800   25600   204800   102400   25600
    3     12800   102400   51200   51200   204800   204800
    4     6400   51200   12800   51200   102400   102400
    5     25600   204800   12800   51200   25600   102400
  平均值     24320   133120   25600   81920   92160   97280
  S.D.*     17173   68692   15677   68692   73753   68692
S.D.*：标准偏差
当与明矾联合使用时，皂苷成分QS-L1、QS-L2、QS-L3、QS-L4和QS-L5显示出优于明矾单独使用时的免疫佐剂活性，特别是明矾＋QS-L1表现出最高的免疫佐剂活性。因此，从实施例3和本实施例的结果可以看出，明矾＋QS-L1将显示出优于其它现已存在的佐剂的优异的免疫佐剂活性，同时仅有很小的毒性。实施例6  包含皂苷成分QS-L1作为免疫佐剂的疫苗配制品
如下测定当与另一种免疫佐剂一起应用时QS-L1在疫苗配制品中的免疫佐剂活性。
首先，将1ml EuVax(LG Chemical Ltd.，Korea)，其是包含20μg HBsAg/500μg明矾/ml的重组乙型肝炎疫苗，与50μl QS-L1溶液(其中皂苷成分QS-L1溶解在蒸馏水中至浓度为2mg/ml)混合以制备含明矾和QS-L1作为免疫佐剂的乙型肝炎疫苗配制品(配制品1)。另外，将1ml的20μg/ml未吸附在明矾上的游离HBsAg与50μl的2mg/ml QS-L1混合以制备仅含QS-L1作为佐剂的乙型肝炎疫苗配制品(配制品2)。作为阳性对照，制备油包水乳液形式的含Freund’s完全佐剂(FCA)作为佐剂的乙型肝炎疫苗配制品(配制品3)，其是通过将FCA与相同量的HBsAg混合至浓度为20μg/ml而制备。
将50μl每种配制品1、2和3以及EuVax皮下注射到7-8周龄雌性Balb/c小鼠的背部的两个位点。将0.1ml配制品3即FCA配制品腹膜注射给该小鼠。
根据参考例相同的方法进行进一步的小鼠免疫及测定抗体效价，条件是在增强免疫注射中使用配制品3的FCA代替Freund’s不完全佐剂，结果示于表6。
                              表6
   小鼠No.                    佐剂(疫苗配制品)
     明矾(EuVax)  明矾＋QS-L1(配制品1)   QS-L1(配制品2)      FCA(配制品3)
    1     51200     51200   12800     204800
    2     51200     204800   6400     409600
    3     51200     204800   6400     409600
    4     102400     204800   51200     204800
    5     25600     409600   25600     812000
  平均值     56320     215040   20480     408160
  S.D.*     28043     127487   18877     247892
S.D.*：标准偏差
如表6所示，当QS-L1单独使用时显示出比明矾单独使用时低的免疫佐剂活性，然而，当QS-L1与明矾联合使用时，其显示出是明矾单独使用时的活性的3-4倍的增加的免疫佐剂活性。因此，明矾＋QS-L1可用作优于明矾单独使用的免疫佐剂，这一结果提示明矾和皂苷成分QS-L1之间可能存在增加免疫佐剂活性的协同效应。实施例7  QS-L1在细胞免疫应答中的效应
QS-L1在细胞免疫应答中的效应是通过测定得自小鼠的脾细胞的增殖来检测，该小鼠注射了实施例6中制备的乙型肝炎疫苗配制品后用HBsAg处理。根据Byars等(疫苗，9,309-317(1991))的方法测定脾细胞的增殖。
首先，根据参考例的方法用实施例6制备的疫苗配制品免疫小鼠，最后一次增强免疫后2周将脾从小鼠中无菌取出，并从中得到脾细胞。
向一U型96孔温育板的每孔中放入2×105个脾细胞，所述的孔含有包含10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培养基。向每孔加入HBsAg至浓度为1μg/ml，留出4孔不加以作为对照组，将板在7％ CO2气氛中于37℃温育4天。
培养结束后，向每孔中加入0.5μ Ci 3H-胸腺嘧啶(Amersham Cat.No.TRK 686)并将板在上述相同条件下继续温育24小时。通过细胞收获器(Skatron)收集细胞并用液闪计数器测定掺入细胞的3H-胸腺嘧啶的量。用刺激指数(SI)代表每种佐剂的免疫佐剂活性，SI由下述等式计算：
Figure A9619030600161
结果示于图6A和6B，其中通过分配2只(图6A)或4只(图6B)小鼠给每种疫苗配制品而进行两个单独的实验。“正常”表示得自未用HBsAg处理的小鼠的脾细胞，结果表明含有与明矾联合应用的Qs-L1的疫苗显示比仅含明矾的疫苗配制品高得多的细胞免疫应答。
尽管本发明已参照上述实施方案进行了描述，应理解的是本领域熟练技术人员可以对本发明作出各种改进和变动，这些改进和变动仍落入本发明权利要求书的范围。

Claims (10)

1、得自一种皂树树皮抽提物的一种基本上纯的皂苷成分，称为QS-L1，其特征在于
当在一4.6×250mm Vydac C4柱上使用在水/乙腈(7/3；v/v)中的0.1％(重量)三氟乙酸溶液以1ml/分钟的流速进行反相高压液相层析时其保留时间约为14分钟；以及
当用ESI-MS分析时其在m/z979.4处有分子离子。
2、一种从Quillaja saponaria Molina的树皮抽提物中分离权利要求1的皂苷成分QS-L1的方法，包括：
(a)离心该树皮抽提物于乙酸水溶液中的溶液，得到上清；
(b)使用分子量截流值为12-14kDa的超透析膜将上清对乙酸水溶液进行透析；
(c)离心得到的透析液，获得第二种上清；
(d)冻于第二种上清，获得皂苷抽提物粉末；以及
(e)将皂苷抽提物粉末溶于合适的溶剂，将该溶液进行RP-HPLC以获得含有基本上纯的QS-L1的组分，所述的RP-HPLC使用C4 RP-HPCL柱在含0.1％三氟乙酸的30-40％乙腈线性浓度梯度下进行。
3、一种疫苗配制品，包括抗原、作为免疫佐剂的权利要求1的皂苷成分QS-L1以及一种第二佐剂。
4、权利要求3的疫苗配制品，其中的第二佐剂是明矾。
5、权利要求4的疫苗配制品，其中的抗原吸附在明矾上。
6、权利要求3的疫苗配制品，其中的抗原是乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。
7、权利要求3的疫苗配制品，其包括的QS-L1的量为1-500μg/单剂量。
8、一种增强疫苗配制品中的抗原的抗原性的方法，包括采用权利要求1的皂苷成分QS-L1作为免疫佐剂与一种第二佐剂联合应用。
9、权利要求8的方法，其中的第二佐剂是明矾。
10、权利要求8的方法，其中在疫苗配制品中的QS-L1的量为1-500μg/单剂量。
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