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CN114923837A - 具有可调光学性质的水凝胶颗粒以及使用其的方法 - Google Patents

具有可调光学性质的水凝胶颗粒以及使用其的方法 Download PDF

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CN114923837A
CN114923837A CN202210217902.5A CN202210217902A CN114923837A CN 114923837 A CN114923837 A CN 114923837A CN 202210217902 A CN202210217902 A CN 202210217902A CN 114923837 A CN114923837 A CN 114923837A
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CN202210217902.5A
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J·金
O·刘
J·阿格雷斯蒂
A·T·阮
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Original Assignee
Slingshot Biosciences Inc
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Abstract

本申请描述了水凝胶颗粒和它们在细胞计数应用中的用途。本申请描述的水凝胶颗粒是选择性可调的，从而具有至少一种光学性质，其基本上相似于靶细胞的该至少一种光学性质。就此而言，在一个方面中，本申请提供的水凝胶颗粒用作检测样本中靶细胞的标定试剂。

Description

具有可调光学性质的水凝胶颗粒以及使用其的方法
本发明申请是基于申请日为2016年2月8日，申请号为2016800199084，发明名称为“具有可调光学性质的水凝胶颗粒以及使用其的方法”的专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年2月9日提交的美国临时申请62/114,004和2015年6月24日提交的美国临时申请62/184,192的优先权，它们各自的公开内容完全并入本申请以作参考。
背景技术
流式细胞计数法是这样的技术，其可快速分离、计数、和表征个体细胞，其通常用于多种应用的临床和实验室环境。该技术依赖于将光束导向到液体的流体聚焦流上。然后多个检测器瞄准下述点，其中液体流在所述点穿过光束：一个点与光束成一直线(前向散射或FSC)，几个点与光束垂直(侧向散射或SSC)。FSC与细胞体积相关，且SSC取决于颗粒的内在复杂性(例如，细胞核的形状，细胞质颗粒的数量和类型或细胞膜表面粗糙度)。由于这些相关性，不同的具体细胞类型表现出不同的FSC和SSC，使得可在流式细胞计数法中区别细胞类型。
但是，确认具体细胞类型的能力依赖于对仪器的适当标定，这是有赖于使用目标细胞类型的纯化细胞的方法。获得这些纯化细胞可能需要昂贵费力的过程，容易带来批次差异。因此，在本领域需要具有可调光学性质的合成组合物，其可以模拟在诸如流式细胞仪中的具体细胞类型。
发明内容
在本发明的一方面，提供了包含聚合的单体并且具有至少一个表面的水凝胶颗粒。水凝胶颗粒具有的至少一种光学性质基本上相似于靶细胞的至少一种光学性质。在一种实施方式中，光学性质是侧向散射波形(SSC)，前向散射波形(FSC)，荧光发射波形，或其组合。靶细胞可以是用户指定的任何靶细胞。例如，在一种实施方式中，靶细胞是免疫细胞，干细胞或癌细胞。
另一方面，提供了标定用于分析靶细胞的细胞计数装置的方法。在一种实施方式中，所述方法包括向所述装置中插入具有至少一种基本上相似于靶细胞的光学性质的水凝胶颗粒，其中所述水凝胶颗粒包含聚合的单体并且具有至少一个表面。所述方法进一步包括使用所述细胞计数装置测量所述水凝胶颗粒的所述至少一种光学性质。在一种实施方式中，所述至少一种光学性质用作检测样本中的靶细胞的参照物。
再在另一方面，提供了检测样本中靶细胞的方法。所述方法包括向所述装置中插入具有至少一种基本上相似于靶细胞的光学性质的水凝胶颗粒，其中所述水凝胶颗粒包含聚合的单体。所述方法还包括使用所述细胞计数装置测量所述水凝胶颗粒的所述至少一种光学性质。将包含细胞群体的样本插入所述细胞计数装置中，并测量所述群体中的个体细胞的至少一种光学性质。最后，基于所述光学性质测量结果确定所述靶细胞或其群体是否存在于所述样本中。
在本申请提供的方法的一种实施方式中，水凝胶颗粒包含可生物降解的单体。在进一步的实施方式中，可生物降解的单体是单糖，二糖，多糖，肽，蛋白质，或蛋白质结构域。在甚至进一步的实施方式中，可生物降解的单体用丙烯酰胺或丙烯酸酯官能化。
本发明包括：
1.标定用于分析靶细胞的细胞计数装置的方法，其包括：
向所述装置中插入具有至少一种基本上相似于靶细胞的光学性质的水凝胶颗粒，其中所述水凝胶颗粒包含聚合的单体并且具有至少一个表面；
使用所述细胞计数装置测量所述水凝胶颗粒的所述至少一种光学性质。
2.检测样本中的靶细胞的方法，其包括：
向所述装置中插入具有至少一种基本上相似于靶细胞的光学性质的水凝胶颗粒，其中所述水凝胶颗粒包含聚合的单体；
使用所述细胞计数装置测量所述水凝胶颗粒的所述至少一种光学性质；
将包括细胞群体的样本插入所述细胞计数装置中；
测量所述细胞群体中的个体细胞的所述至少一种光学性质；
基于所述光学性质测量结果确定所述靶细胞或其群体是否存在于所述样本中。
3.项2的方法，其进一步包括：如果所述靶细胞或靶细胞群体存在于所述样本中，则将其分选到单独的容器中。
4.项1-3任一项的方法，其进一步包括：将水凝胶颗粒的群体插入所述细胞计数装置中，其中所述水凝胶颗粒各自具有至少一种基本上相似于靶细胞的光学性质。
5.项4的方法，其中对于所述水凝胶颗粒的群体中的每一个而言，所述至少一种光学性质是相同的。
6.项1-5任一项的方法，其中所述至少一种光学性质是侧向散射(SSC)。
7.项1-4任一项的方法，其中所述至少一种光学性质是前向散射(FSC)。
8.项1-4任一项的方法，其中所述至少一种光学性质是荧光发射。
9.项1-5任一项的方法，其中所述至少一种光学性质是FSC和SSC。
10.项1-6任一项的方法，其中所述单体选自：甲基丙烯酸羟基乙基酯，甲基丙烯酸乙基酯，甲基丙烯酸2-羟基乙基酯(HEMA)，甲基丙烯酸丙二醇酯，丙烯酰胺，N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)，甲基丙烯酸甲基酯，甲基丙烯酸缩水甘油基酯，甲基丙烯酸甘油酯(GMA)，甲基丙烯酸乙二醇酯，乙二醇，富马酸，甲基丙烯酸2-羟基乙基酯，甲基丙烯酸羟基乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸羟基二乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸甲氧基乙基酯，甲基丙烯酸甲氧基乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸甲氧基二乙氧基乙基酯，聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯，甲氧基-聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸，甲基丙烯酸钠，甲基丙烯酸甘油酯，甲基丙烯酸羟基丙基酯，甲基丙烯酸羟基丁基酯，丙烯酸苯基酯，甲基丙烯酸苯基酯，丙烯酸苄基酯，甲基丙烯酸苄基酯，丙烯酸2-苯基乙基酯，甲基丙烯酸2-苯基乙基酯，丙烯酸2-苯氧基乙基酯，甲基丙烯酸2-苯氧基乙基酯，丙烯酸苯基硫代乙基酯，甲基丙烯酸苯基硫代乙基酯，丙烯酸2，4，6-三溴苯基酯，甲基丙烯酸2，4，6-三溴苯基酯，丙烯酸五溴苯基酯，甲基丙烯酸五溴苯基酯，丙烯酸五氯苯基酯，甲基丙烯酸五氯苯基酯，丙烯酸2，3-二溴丙基酯，甲基丙烯酸2，3-二溴丙基酯，丙烯酸2-萘基酯，甲基丙烯酸2-萘基酯，丙烯酸4-甲氧基苄基酯，甲基丙烯酸4-甲氧基苄基酯，丙烯酸2-苄氧基乙基酯，甲基丙烯酸2-苄氧基乙基酯，丙烯酸4-氯苯氧基乙基酯，甲基丙烯酸4-氯苯氧基乙基酯，丙烯酸2-苯氧基乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸2-苯氧基乙氧基乙基酯，N-苯基丙烯酰胺，N-苯基甲基丙烯酰胺，N-苄基丙烯酰胺，N-苄基甲基丙烯酰胺，N，N-二苄基丙烯酰胺，N，N-二苄基甲基丙烯酰胺，N-二苯基甲基丙烯酰胺，N-(4-甲基苯基)甲基丙烯酰胺，N-1-萘基丙烯酰胺，N-4-硝基苯基丙烯酰胺，N-(2-苯基乙基)丙烯酰胺，N-三苯基甲基丙烯酰胺，N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺，N，N-甲基苯基丙烯酰胺，N，N-苯基苯基乙基丙烯酰胺，N-二苯基甲基甲基丙烯酰胺，N-(4-甲基苯基)甲基甲基丙烯酰胺，N-1-萘基甲基丙烯酰胺，N-4-硝基苯基甲基丙烯酰胺，N-(2-苯基乙基)甲基丙烯酰胺，N-三苯基甲基甲基丙烯酰胺，N-(4-羟基苯基)甲基丙烯酰胺，N，N-甲基苯基甲基丙烯酰胺，N，N′-苯基苯基乙基甲基丙烯酰胺，N-乙烯基咔唑，4-乙烯基吡啶，2-乙烯基吡啶，或其组合。
11.项1-9任一项的方法，其中所述单体是可生物降解的单体。
12.项11的方法，其中所述可生物降解的单体是单糖，二糖，多糖，肽，蛋白质，或蛋白质结构域。
13.项12的方法，其中所述可生物降解的单体是包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质或蛋白质结构域。
14.项11的方法，其中所述可生物降解的单体是结构多糖。
15.项11的方法，其中所述可生物降解的单体是琼脂，琼脂糖，海藻酸，微藻多糖酸(alguronic acid)，α-葡聚糖，支链淀粉，直链淀粉，阿拉伯木聚糖，β-葡聚糖，胼胝质，capsullan，角叉菜胶多糖，纤维糊精，动物纤维素，纤维素，壳质，壳聚糖，金藻昆布多糖，凝胶多糖，环糊精，α-环糊精，糊精，右旋糖苷，聚蔗糖，果聚糖，岩藻依聚糖，半乳葡甘露聚糖，半乳甘露聚糖，半乳糖胺半乳糖，结冷胶，葡聚糖，葡甘露聚糖，葡萄醛酸木聚糖，糖萼，糖原，半纤维素，同多糖，羟丙甲纤维素，艾考糊精，菊粉，开菲尔多糖，海带多糖，蘑菇多糖，果聚糖多糖，地衣多糖，甘露聚糖，混联葡聚糖，裸藻淀粉，果胶酸，果胶，喷他淀粉，植物糖原，平菇葡聚糖，聚葡萄糖，多糖肽，金属卟啉，普鲁兰多糖，裂褶菌多醣，左旋糖，西佐糖，文莱胶，黄原胶，木聚糖，木葡聚糖，酵母聚糖，或其组合。
16.项11的方法，其中所述可生物降解的单体是壳聚糖或透明质酸。
17.项12的方法，其中所述蛋白质是结构蛋白，其结构域，或其组合。
18.项12的方法，其中所述蛋白质是蛋白多糖，其结构域，或其组合。
19.项12的方法，其中所述蛋白质是细胞外基质组分。
20.项18的方法，其中所述蛋白多糖是核心蛋白多糖，双糖链蛋白多糖，睾丸蛋白聚糖，双库尼茨抑制剂，纤维调节素，光蛋白聚糖，其结构域，或其组合。
21.项19的方法，其中所述蛋白质是胶原蛋白，弹性蛋白或蛋白多糖。
22.项21的方法，其中所述蛋白质是胶原蛋白。
23.项22的方法，其中所述胶原蛋白是胶原蛋白I型，胶原蛋白II型，胶原蛋白III型，其结构域或其组合。
24.项1-23任一项的方法，其中所述单体是官能化的。
25.项24的方法，其中所述单体用丙烯酸酯或丙烯酰胺官能化。
26.项1-25任一项的方法，其中所述单体是双官能的。
27.项1-26任一项的方法，其中所述水凝胶颗粒在所述至少一个表面上官能化。
28.项27的方法，其中所述所述水凝胶颗粒用抗体或其片段官能化。
29.项27的方法，其中所述水凝胶以至少一种细胞表面标记物官能化。
30.项29的方法，其中所述细胞表面标记物是表2中列出的细胞表面标记物之一，或其组合。
30.项27的方法，其中所述水凝胶颗粒以所述至少一个表面上的荧光团官能化。
31.项1-30任一项的方法，其中由所述水凝胶颗粒包封物质。
32.项31的方法，其中所述物质是小珠。
33.项32的方法，其中所述小珠是荧光小珠。
34.项33的方法，其中所述荧光小珠以一个波长、两个波长、三个波长、四个波长、五个波长、六个波长、七个波长、八个波长或九个波长发射荧光。
35.项32-34任一项的方法，其中所述小珠的直径为约500nm至约10μm。
36.项31的方法，其中所述物质是生物分子。
37.项36的方法，其中所述生物分子是核酸，蛋白质，肽，碳水化合物或其组合。
38.项32-35任一项的方法，其进一步包括：用所述水凝胶颗粒标定所述细胞计数装置的一种或多种性质。
39.项38的方法，其中所述细胞计数装置的一种或多种性质是细胞分选系统，激光源，光学性质，流量，或其组合。
附图说明
图1说明公开的水凝胶颗粒相比于聚苯乙烯小珠的光学性质。
图2描述制备本申请标记的水凝胶颗粒的方法。
图3提供本申请标记的水凝胶颗粒的亮视野图像和荧光图像。
图4说明本申请水凝胶颗粒作为展示多种光学散射性质的细胞类型的标定物的用途。
图5提供显示流式细胞仪的液滴间延迟与水凝胶颗粒直径之间关系的数据(dating)。
图6提供中国仓鼠卵巢细胞(6A和6B)和本申请水凝胶颗粒(6C和6D)的亮视野图像(6A和6C)和荧光图像(6B和6D)。
图7提供数据，其显示人口腔黏膜细胞与包封不同量的DNA的水凝胶颗粒的比较，通过荧光激活细胞分选系统(FACS)测定。
图8提供包封不同浓度的纳米粒子的水凝胶颗粒的数据，其表明侧向散射的调节独立于前向散射。
图9提供用不同百分比聚合物制备的水凝胶颗粒的数据，其表明通过前向散射测量折射率的调节。
图10显示调节成匹配和/或模拟所需细胞种群指标的水凝胶参数的一种实施方式。
图11和12是显示如何调整水凝胶颗粒的前向散射性质、侧向散射性质和表面性质的实施方式的示意图。
图13是各种水凝胶颗粒(A)和(B)和商业血液样本(C)的散点图。
具体实施方式
除非上下文明确指出，否则不定冠词“一个”和“一种”和定冠词“这个”意在包括单数和复数两者。
“至少一种”和“一种或多种”可互换使用，表示该冠词可以包括一个或多于一个所列要素。
除非另有指出，否则应该理解说明书和权利要求书中使用的表达成分、反应条件等的量、比率、和数值性质的所有数目在所有情况下均可由术语“约”修饰。
流式细胞仪的几种临界标定(critical calibration)测量法需要精确的时间分辨率，例如设置激光之间的偏移时间，和计算对象的检测和分选之间的延迟时间。由于仪器内的流体条件，精确设置这些正时参数需要使用尺寸与待分析细胞尺寸一样的标定颗粒。正时标定通常使用具有可变荧光强度的聚苯乙烯小珠进行以标定激发源的响应和设置激光间正时延迟和分选延迟。流式细胞仪也可以使用前向散射和侧向散射信号标定，所述信号是靶样本的尺寸和粒度或复杂性的通用量度。这些标定对于细胞仪的精确性能和对于细胞种群(population)的任何下游分析或分选都是关键的。公开的水凝胶颗粒表现出可调的散射性质，且适宜用作多种哺乳动物或细菌细胞类型的标定试剂。对于临床、食品安全、和研究目的而言，散射是在非均相混合物中区分细胞类型的标准度量。
尽管聚苯乙烯颗粒可用于设置一些应用的激光间延迟和分选延迟，但是很多真核细胞类型都处于商购聚苯乙烯颗粒(1-20μm)的尺寸范围外，使其对于这些靶细胞而言几乎不可能精确标定流式细胞仪。同样，如图1所示，聚苯乙烯颗粒在光学性质上基本上是有限度的，其可具有例如侧向散射，这是细胞复杂性的一般量度。聚苯乙烯颗粒因此在用于流式细胞计数法的两种最重要的被动光学测量上是有限度的：FSC(前向散射)，和SSC(侧向散射)，它们分别测量靶细胞的尺寸和复杂性。由于聚苯乙烯的这些限度，用户必须依赖于纯化的细胞系来标定实验的荧光强度、激光间延迟，分选延迟、尺寸和细胞复杂性。这是费时费力的过程，会显著增加流式细胞计数法验证和研究管道的成本。最重要的是，这些标定细胞系会带来生物学变动，在解释数据时导致数据存在差异。
此外，当这些仪器用于临床应用例如为分离人调节性T细胞或干细胞而用于下游细胞疗法时，标定流式细胞仪的品质控制(QC)也是关键的考量。FDA规定，在施用给患者之前，必须证实细胞疗法产品的无菌、身份、纯度、和效力(Riley et al.(2009)。Immunity30，pp.656-665)。因此，聚苯乙烯QC颗粒污染细胞种群也是一个问题，因为聚苯乙烯已牵涉到某些癌症中。另外，由QC标准物污染的在施用给患者之后在体内酶降解或消化的细胞种群可能需要克服它们所引起的污染问题。
本发明解决这些和其它需要，如以下讨论。
一方面，提供了包含水凝胶颗粒群体(plurality)的组合物，其中所述水凝胶颗粒群体的个体水凝胶颗粒各自具有的一种或多种光学性质基本上相似于靶细胞的一种或多种光学性质。所述水凝胶颗粒群体的个体水凝胶颗粒各自包含水凝胶，所述水凝胶通过使一种或多种单体聚合、即从而形成均聚物或共聚物来合成。如以下进一步讨论，使用双官能单体允许将水凝胶进一步衍生化，例如，用荧光染料、细胞表面标记物或其抗原表位结合片段、或其组合衍生化。调节成满足/匹配所需细胞子群落指标的水凝胶参数的一个实例在图10中给出。调节水凝胶性质的方法如本申请所述。调整包括水凝胶组分及其浓度等参数范围的能力提供了调节颗粒以模拟广泛细胞例如本申请所述细胞类型之一的能力。
如上提供，一方面，本发明提供个体水凝胶颗粒，其各自具有的一种或多种光学性质基本上相似于靶细胞的一种或多种光学性质。在一种实施方式中，一种或多种光学性质是侧向散射波形，前向散射波形或二级标记物波形，例如荧光标记物波形，例如结合于水凝胶颗粒表面的荧光标记抗体的荧光标记物波形。本申请使用的“基本上相似”表示至少40％相似，至少50％相似，至少60％相似，至少70％相似，至少80％相似，至少90％相似，至少95％相似，至少96％相似，至少97％相似，至少98％相似或至少99％相似。
本发明部分基于以下预料不到的发现，水凝胶颗粒的一种或多种光学性质可以如下独立地调整：改变水凝胶颗粒的组成，例如，改变组合物中初始单体(或共聚单体)的量；改变表面官能化；改变聚合引发剂的量；或改变交联剂的量。例如，可以调整侧向散射(SSC)，而不会显著影响前向散射(FSC)，反之亦然。此外，可以调节水凝胶颗粒的光学性质(例如折射率)，而对颗粒密度不会产生显著应用。这是令人惊奇且有用的特性，因为用作细胞计数方法例如流式细胞计数法或(荧光激活细胞分选系统)FACS中的细胞替代品的水凝胶颗粒需要最小的密度以便于在这些试验中起作用。
另一方面，提供了制备水凝胶颗粒的方法，其中水凝胶颗粒具有的一种或多种光学性质基本上相似于一种或多种靶细胞的光学性质。在一种实施方式中，水凝胶颗粒具有预定的光学性质。在一种实施方式中，光学性质是SSC，FSC，荧光发射，或其组合。
再在另一方面，提供了标定用于分析靶细胞的细胞计数装置的方法。在一种实施方式中，所述方法包括(a)向所述装置中插入具有至少一种基本上相似于靶细胞的光学性质的水凝胶颗粒；b)使用所述细胞计数装置测量所述水凝胶颗粒的所述至少一种光学性质，从而标定用于分析靶细胞的细胞计数装置。细胞计数装置是本领域已知的，并且包括进行流式细胞计数法和FACS的商购装置。
如上提供，在本发明的一方面，提供了包含水凝胶颗粒的群体的组合物。水凝胶是包含大分子三维网络的材料，这种网络使得其当存在水时可溶胀，当不存在水(或减少水的量)时会收缩，但不溶解于水。溶胀，即，吸水，是由于存在连接于大分子网络或分散在大分子网络内的亲水性官能团产生的。相邻大分子间的交联使这些水凝胶在含水介质中不溶解。交联可能是由于化学结合(即，共价键)或物理结合(即，范德华力，氢键结合，离子力等)。合成制备的水凝胶可以如下制备：使单体性物质聚合以形成主链，和使主链与交联剂交联。本申请提及的术语“水凝胶”是指大分子物质，不管其是脱水状态还是水合状态。水凝胶特别有价值的特征是该物质不管是脱水还是水合状态均保持大体形状。因此，如果水凝胶在脱水状态具有近似球形的形状，则其在水合状态也将是球形的。
在一种实施方式中，本申请公开的水凝胶颗粒包含大于约30％的水、大于约40％的水、大于约50％的水、大于约55％的水、大于约60％的水、大于约65％的水、大于约70％的水、大于约75％的水、大于约80％的水、大于约85％的水、大于约90％的水、或大于约95％的水。在另一种实施方式中，水凝胶颗粒的水含量为约10重量％至约95重量％，或约20重量％至约95重量％，或约30重量％至约95重量％，或约40重量％至约95重量％，或约50重量％至约95重量％，或约60重量％至约95重量％，或约70重量％至约95重量％，或约80重量％至约95重量％。
本申请提供的水凝胶为颗粒形式，如下合成：使本申请提供的一种或多种单体聚合。进行合成以形成个体水凝胶颗粒。在一种实施方式中，单体性物质(单体)聚合以形成均聚物。但是，在另一种实施方式中，合成不同单体性单元(即，共聚单体)的共聚物并将其用于本申请提供的方法。在一种实施方式中，用于本申请所述方法和组合物的单体和共聚单体是双官能单体或包括双官能单体(其中使用共聚单体)。在一种实施方式中，水凝胶在交联剂的存在下合成。在进一步的实施方式中，水凝胶在聚合引发剂的存在下合成。
单体的量可以由本发明的用户改变，例如以获得基本上相似于靶细胞的特定光学性质。在一种实施方式中，单体性组分(即，单体，共聚单体，双官能单体，或其组合，例如，各种交联比率的双/丙烯酰胺，烯丙基胺或为二级标记/缀合提供化学官能度的其它共聚单体或藻酸盐)的存在量为水凝胶的10重量％至约95重量％。在进一步的实施方式中，单体性组分的存在量为水凝胶的约15重量％至约90重量％，或水凝胶的约20重量％至约90重量％。
可用于本发明的各种单体和交联化学的实例提供于Thermo Scientific交联技术手册中题为“Easy molecular bonding crosslinking technology”的内容(可查阅于tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163- CrosslinkingReagents-Handbook.pdf，其公开内容全部并入本申请以作参考，用于所有目的。例如，肼偶联反应(例如，与NHS酯化合物)或EDC偶联反应(例如，与马来酰亚胺化合物)可用于构建本发明的水凝胶。
在一种实施方式中，用于本申请提供的水凝胶的单体是乳酸，乙醇酸，丙烯酸，甲基丙烯酸1-羟基乙基酯，甲基丙烯酸乙基酯，甲基丙烯酸2-羟基乙基酯(HEMA)，甲基丙烯酸丙二醇酯，丙烯酰胺，N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸缩水甘油酯，甲基丙烯酸甘油酯(GMA)，甲基丙烯酸甘油酯，乙二醇，富马酸，其衍生化类型，或其组合。
在一种实施方式中，一种或多种以下单体用于本申请以形成本发明的水凝胶：甲基丙烯酸2-羟基乙基酯，甲基丙烯酸羟基乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸羟基二乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸甲氧基乙基酯，甲基丙烯酸甲氧基乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸甲氧基二乙氧基乙基酯，聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯，甲氧基-聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸，甲基丙烯酸钠，甲基丙烯酸甘油酯，甲基丙烯酸羟基丙基酯，甲基丙烯酸羟基丙基酯，或其组合。
在另一种实施方式中，一种或多种以下单体用于本申请以形成可调的水凝胶：丙烯酸苯基酯，甲基丙烯酸苯基酯，丙烯酸苄基酯，甲基丙烯酸苄基酯，丙烯酸2-苯基乙基酯，甲基丙烯酸2-苯基乙基酯，丙烯酸2-苯氧基乙基酯，甲基丙烯酸2-苯氧基乙基酯，丙烯酸苯基硫代乙基酯，甲基丙烯酸苯基硫代乙基酯，丙烯酸2，4，6-三溴苯基酯，甲基丙烯酸2，4，6-三溴苯基酯，丙烯酸五溴苯基酯，甲基丙烯酸五溴苯基酯，丙烯酸五氯苯基酯，甲基丙烯酸五氯苯基酯，丙烯酸2，3-二溴丙基酯，甲基丙烯酸2，3-二溴丙基酯，丙烯酸2-萘基酯，甲基丙烯酸2-萘基酯，丙烯酸4-甲氧基苄基酯，甲基丙烯酸4-甲氧基苄基酯，丙烯酸2-苄氧基乙基酯，甲基丙烯酸2-苄氧基乙基酯，丙烯酸4-氯苯氧基乙基酯，甲基丙烯酸4-氯苯氧基乙基酯，丙烯酸2-苯氧基乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸2-苯氧基乙氧基乙基酯，N-苯基丙烯酰胺，N-苯基甲基丙烯酰胺，N-苄基丙烯酰胺，N-苄基甲基丙烯酰胺，N，N-二苄基丙烯酰胺，N，N-二苄基甲基丙烯酰胺，N-二苯基甲基丙烯酰胺，N-(4-甲基苯基)甲基丙烯酰胺，N-1-萘基丙烯酰胺，N-4-硝基苯基丙烯酰胺，N-(2-苯基乙基)丙烯酰胺，N-三苯基甲基丙烯酰胺，N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺，N，N-甲基苯基丙烯酰胺，N，N-苯基苯基乙基丙烯酰胺，N-二苯基甲基甲基丙烯酰胺，N-(4-甲基苯基)甲基甲基丙烯酰胺，N-1-萘基甲基丙烯酰胺，N-4-硝基苯基甲基丙烯酰胺，N-(2-苯基乙基)甲基丙烯酰胺，N-三苯基甲基甲基丙烯酰胺，N-(4-羟基苯基)甲基丙烯酰胺，N，N-甲基苯基甲基丙烯酰胺，N，N′-苯基苯基乙基甲基丙烯酰胺，N-乙烯基咔唑，4-乙烯基吡啶，2-乙烯基吡啶，如描述于美国专利号6,657,030，其全部并入本申请以作参考，用于所有目的。
合成单体和生物单体都可用于本申请提供的水凝胶，以形成包含合成组分和生物组分(例如，存在于生物分子上的肽、蛋白质、单糖、二糖、多糖、伯胺巯基、羰基、碳水化合物、羧酸)的合成水凝胶、生物水凝胶、或杂合水凝胶。例如，蛋白质、肽或碳水化合物可以用作独立单体以形成水凝胶，该水凝胶包括或不包括合成单体(或聚合物)且与化学相容共聚单体和交联剂组合(参见例如，Thermo Scientific交联技术手册中题为“Easy molecularbonding crosslinking technology”的内容，可查阅于tools.lifetechnologies.com/ content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf，其公开内容全部并入本申请以作参考，用于所有目的)。相容的交联剂包括但不限于，胺，羧基，和其它反应性化学侧基。可用于本申请所述水凝胶和单体的代表性的反应性基团列在下表1中。
Figure BDA0003534811680000111
Figure BDA0003534811680000121
通常，本领域技术人员常规已知的任何形式的聚合化学/方法可以用于形成聚合物。在一些实施方式中，聚合可以通过紫外线诱导的自由基形成和反应级数催化。在其它实施方式中，公开的水凝胶颗粒通过丙烯酰胺的聚合或丙烯酸酯的聚合制备。例如，在一种实施方式中，丙烯酰胺是可聚合碳水化合物衍生化的丙烯酰胺，如描述于美国专利号6,107,365，其公开内容全部并入本申请以作参考，用于所有目的。如本申请所述且如本领域技术人员已知，丙烯酰胺基团与糖的特异性连接便于施用于多种单糖或级数更高的多糖，例如，血清或组织中发现的合成多糖或源自天然来源的多糖例如糖蛋白。
在一种实施方式中，丙烯酸酯官能化的聚(亚乙基)二醇单体用作水凝胶单体。例如，在一种实施方式中，PEG是丙烯酸酯或丙烯酰胺官能化的PEG。
在一些实施方式中，水凝胶颗粒包含与至少一种双官能单体聚合的单官能单体。一个实例包括但不限于，使用丙烯酰胺和双丙烯酰胺(双官能单体)形成聚丙烯酰胺聚合物。在另一种实施方式中，本申请提供的水凝胶颗粒包含与第二双官能单体聚合的双官能单体。一个实例包括但不限于，用包含相容化学物质的混合组合物例如丙烯酰胺、双丙烯酰胺、和包含众多另外化学物质的双丙烯酰胺结构同系物形成聚合物。化学相容单体、双官能单体、和混合组合的反应对于本领域技术而言是显而易见的，且遵循本领域技术人员已知的化学反应原理。(参考Thermo手册和丙烯酰胺聚合手册)。参见，例如，Thermo Scientific交联技术手册中题为“Easy molecular bonding crosslinking technology”的内容(可查阅于tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochurs/1602163-Crosslinking- Reagents-Handbook.pdf)，和聚丙烯酰胺乳化手册(SNF Floerger，可查阅于snf.com.au/downloads/Emulsion_Handbook_E.pdf)，其各自的公开内容完全并入本申请以作参考，用于所有目的。
在一种实施方式中，本申请提供的水凝胶颗粒包含可聚合的单官能单体并且是单官能丙烯酸类单体。用于本申请的单官能丙烯酸类单体的非限制性实例是丙烯酰胺；甲基丙烯酰胺；N-烷基丙烯酰胺，例如N-乙基丙烯酰胺，N-异丙基丙烯酰胺或N-叔丁基丙烯酰胺；N-烷基甲基丙烯酰胺，例如N-乙基甲基丙烯酰胺或N-异丙基甲基丙烯酰胺；N，N-二烷基丙烯酰胺，例如N，N-二甲基丙烯酰胺和N，N-二乙基-丙烯酰胺；N-[(二烷基氨基)烷基]丙烯酰胺，例如N-[3-(二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺或N-[3-(二乙基氨基)丙基]丙烯酰胺；N-[(二烷基氨基)烷基]甲基丙烯酰胺，例如N-[3-二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺或N-[3-(二乙基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺；丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯，例如丙烯酸2-(二甲基氨基)乙基酯，丙烯酸2-(二甲基氨基)丙基酯，或丙烯酸2-(二乙基氨基)乙基酯；和甲基丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯，例如甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙基酯。
双官能单体是可与本申请单官能单体聚合以形成本申请所述水凝胶的任何单体，所述双官能单体进一步包含第二官能团，该第二官能团可参与第二反应，例如，荧光团或细胞表面受体(或其结构域)的缀合。
在一些实施方式中，双官能单体选自：烯丙基胺，烯丙基醇，异硫氰酸烯丙基酯，烯丙基氯，和烯丙基马来酰亚胺。
双官能单体可以是双官能丙烯酸类单体。双官能丙烯酸类单体的非限制性实例是N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，N，N′-亚甲基双甲基丙烯酰胺，N，N′-亚乙基双丙烯酰胺，N，N′-亚乙基双甲基丙烯酰胺，N，N′-亚丙基双丙烯酰胺和N，N′-(1，2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺。
高阶支化链和直链共聚单体可在聚合物混合物中被取代，以调整折射率同时保持聚合物密度，如描述于美国专利号6,657,030，其全部并入本申请以作参考，用于所有目的。
在一些实施方式中，水凝胶包含调整水凝胶光学性质的分子。以下进一步讨论能够改变水凝胶光学性质的分子。
在一种实施方式中，个体水凝胶颗粒或其群体包含作为水凝胶单体的可生物降解的聚合物。在一种实施方式中，可生物降解的聚合物是基于聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)的聚(酯)，和它们的共聚物。在一种实施方式中，可生物降解的聚合物是碳水化合物或蛋白质，或其组合。例如，在一种实施方式中，单糖、二糖、或多糖(例如，葡萄糖，蔗糖，或麦芽糊精)、肽、蛋白质(或其结构域)用作水凝胶单体。其它可生物降解的聚合物包括PHB-PHV类的聚(羟基玩醇酸酯)，另外的聚(酯)，和天然聚合物，例如，改性的多(糖)类，例如，淀粉，纤维素，和壳聚糖。在另一种实施方式中，生物相容聚合物是黏附蛋白，纤维素，碳水化合物，淀粉(例如，麦芽糊精，2-羟基乙基淀粉，海藻酸)，右旋糖苷，木质素，聚氯基酸，氨基酸，或壳质。这样的可生物降解的聚合物可商购，例如，购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)。
在一种实施方式中，蛋白质仅包含天然氨基酸。但是，本发明并不限于此。例如，自组装人工蛋白和含有非天然氨基酸(例如，结合到非核糖体肽或经合成方法合成引入的那些，参见例如，Zhang et al.(2013)。当前观点在Structural Biology 23，pp.581-587中，其公开内容全部并入本申请以作参考，用于所有目的)、或其蛋白质结构域的蛋白质也可以用作水凝胶单体。可结合到这些组合物中的非天然(非自然)氨基酸的范围是本领域技术人员熟知的(Zhang et al.(2013)。当前观点在Structural Biology 23，pp.581-587中；其完全并入本申请以作参考，用于所有目的)。在一种实施方式中，可生物降解的聚合物用作共聚单体，即，单体混合物中。在一种实施方式中，可生物降解的聚合物是双官能单体。
在一种实施方式中，生物单体用丙烯酰胺或丙烯酸酯官能化。例如，在一种实施方式中，可聚合丙烯酰胺官能化的生物分子是丙烯酰胺或丙烯酸酯官能化的蛋白质(例如，丙烯酰胺官能化的胶原蛋白或官能化的胶原蛋白结构域)，丙烯酰胺或丙烯酸酯官能化的肽，或丙烯酰胺或丙烯酸酯官能化的单糖、二糖或多糖。
任何单糖、二糖或多糖(官能化的或相反)可以用作水凝胶单体。在一种实施方式中，丙烯酰胺或丙烯酸酯官能化的单糖、二糖、或多糖用作可聚合的水凝胶单体。在一种实施方式中，结构多糖用作可聚合的水凝胶单体。在进一步的实施方式中，结构多糖是阿拉伯木聚糖，纤维素，壳质或胶质。在另一种实施方式中，海藻酸(海藻酸盐)用作可聚合的水凝胶单体。再在另一种实施方式中，糖胺多糖(GAG)在本申请提供的水凝胶中用作可聚合的单体。在进一步的实施方式中，GAG是硫酸软骨素，硫酸皮肤素，硫酸角质素，肝素，硫酸肝素或透明质酸(在本领域也称为透明质酸酶或透明质酸盐/酯)，其用作可聚合水凝胶单体。相容生物单体和它们的反应性化学的另外的范围是本领域技术人员已知的并且遵循一般化学反应性原理。
可以结合的生物相容单体的另外的范围是本领域已知的，参见，例如不可降解的生物相容单体公开于Shastri(2003)。Current Pharmaceutical Biotechnology 4，pp.331-337，其完全并入本申请以作参考，用于所有目的。其它单体提供于de MoraesPorto(2012).Polymer Biocompatibility，Polymerization，Dr.Ailton De Souza Gomes(Ed.)，ISBN：978-953-51-0745-3；InTech，DOI：10.5772/47786；Heller et al.(2010).Journal of Polymer Science Part A：Polymer Chemistry 49，pp.650-661；FinalReport for Biocompatible Materials(2004)，The Board of the BiocompatibleMaterials and the Molecular Engineering in Polymer Science programmes，ISBN91-631-4985-0，其各自的公开内容完全并入本申请以作参考。
在一种实施方式中，用于本申请所述水凝胶的生物相容单体包括而甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)，甲基丙烯酸2-羟基乙基酯(HEMA)，甲基丙烯酸甲酯(MMA)，甲基丙烯酰氧基甲基三甲基硅烷(TMS-MA)，N-乙烯基-2-吡咯烷酮(N-VP)，苯乙烯，或其组合。
用于本发明的天然存在的水凝胶包括可得自天然来源的各种多糖，例如植物，藻类，真菌，酵母，海洋无脊椎动物和节肢动物。非限制性实例包括琼脂糖，右旋糖苷，壳质，基于纤维素的化合物，淀粉，衍生化淀粉等。这些将通常具有重复的葡萄糖单元作为多糖主链的主要部分。这些多糖的交联化学是本领域已知的，参见例如Thermo Scientific交联技术手册中题为“Easy molecular bonding crosslinking technology”的内容，(可查阅于tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking- Reagents-Handbook.pdf)。
在一种实施方式中，透明质酸用作水凝胶单体(或作为单一单体或作为共聚单体)。在一种实施方式中，透明质酸例如用丙烯酸酯或丙烯酰胺官能化。透明质酸是由通过交替的β-1，4糖苷键和β-1，3糖苷键连接在一起的N-乙酰葡糖胺和葡糖醛酸的二糖重复单元构成的高分子量GAG。在人体中，透明质酸盐/酯存在于几种软结缔组织中，包括皮肤，脐带，滑膜液，和玻璃体。因此，在一种实施方式中，当需要模拟皮肤细胞、脐带细胞或玻璃体细胞时，在一种实施方式中，透明质酸用作水凝胶单体。制造水凝胶颗粒的方法描述于Xuet al.(2012).Soft Matter.8，pp.3280-3294，其公开内容完全并入本申请以作参考，用于所有目的。如本申请所述，根据所需的交联剂和用于形成水凝胶颗粒的其它单体，透明质酸可以用各种反应性臂(reactive handles)衍生化。
再在其它实施方式中，壳聚糖、由无规分布的β-(1-4)-连接的D-葡糖胺(脱乙酰基单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)组成的直链多糖用作水凝胶单体(或作为单独单体或作为共聚单体)。
用作水凝胶单体或共聚单体的其它多糖包括但不限于，琼脂，琼脂糖，海藻酸，微藻多糖酸(alguronic acid)，α-葡聚糖，支链淀粉，直链淀粉，阿拉伯木聚糖，β-葡聚糖，胼胝质，capsullan，角叉菜胶多糖(例如，κ、ι或λ类)，纤维糊精，动物纤维素，纤维素，壳质，壳聚糖，金藻昆布多糖，凝胶多糖，环糊精，α-环糊精，糊精，聚蔗糖，果聚糖，岩藻依聚糖，半乳葡甘露聚糖，半乳甘露聚糖，半乳糖胺半乳糖，结冷胶，葡聚糖，葡甘露聚糖，葡萄醛酸木聚糖，糖萼，糖原，半纤维素，同多糖，羟丙甲纤维素，艾考糊精，菊粉，开菲尔多糖，海带多糖，蘑菇多糖，果聚糖多糖，地衣多糖，甘露聚糖，混联葡聚糖，裸藻淀粉，果胶酸，果胶，喷他淀粉，植物糖原，平菇葡聚糖，聚葡萄糖，多糖肽，金属卟啉，普鲁兰多糖，裂褶菌多醣，左旋糖，西佐糖，文莱胶，黄原胶，木聚糖，木葡聚糖，酵母聚糖，或其组合。如全文所述，根据所需交联剂和/或用于水凝胶的另外的共聚单体，多糖可以是进一步官能化的。例如，在一种实施方式中，一种或多种本申请所述的多糖用丙烯酸酯或丙烯酰胺官能化。
在一种实施方式中，个体水凝胶颗粒或其群体包含肽、蛋白质、蛋白质结构域、或其组合作为水凝胶单体或其群体。在进一步的实施方式中，蛋白质是结构蛋白，或其结构域，例如，例如蚕丝蛋白，弹性蛋白，肌联蛋白或胶原蛋白，或其结构域。在一种实施方式中，蛋白质是细胞外基质(ECM)成分(例如，胶原蛋白，弹性蛋白，蛋白多糖)。在甚至进一步的实施方式中，结构蛋白是胶原蛋白。再在进一步的实施方式中，胶原蛋白是胶原蛋白I型，胶原蛋白II型，或胶原蛋白III型或其组合。在另一种实施方式中，水凝胶单体包括蛋白多糖。在进一步的实施方式中，蛋白多糖是核心蛋白多糖，双糖链蛋白多糖，睾丸蛋白聚糖，双库尼茨抑制剂，纤维调节素，光蛋白聚糖，或其结构域。
在另一种实施方式中，丙烯酸酯官能化的结构蛋白水凝胶单体用作本申请提供的水凝胶的组分(例如，丙烯酸酯官能化的蛋白质或蛋白质结构域，例如，蚕丝蛋白，弹性蛋白，肌联蛋白，胶原蛋白，蛋白多糖，或其官能化的结构域)。在进一步的实施方式中，丙烯酸酯官能化的结构蛋白水凝胶单体包括蛋白多糖，例如，核心蛋白多糖，双糖链蛋白多糖，睾丸蛋白聚糖，双库尼茨抑制剂，纤维调节素，光蛋白聚糖，或其结构域。
在一种实施方式中，PEG单体和寡肽可以模拟细胞外基质蛋白质用于本申请提供的水凝胶，例如，用乙烯基砜官能化的多臂PEG、整合素结合肽和双-半胱氨酸基质金属蛋白酶肽进行，如由Lutolf et al.(2003).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100，5413-5418所述，其完全并入本申请以作参考，用于所有目的。在该特定的实施方式中，水凝胶通过二硫醇化寡肽和PEG上的乙烯基砜基团之间的Michael类型加成反应形成。可以结合到本申请的另外的相容性化学物质的范围是本领域技术人员显而易见的并且遵循一般化学反应性原理，参见例如Thermo Scientific交联技术手册中题为“Easy molecular bonding crosslinkingtechnology”的内容(可查阅于tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/ 1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf)。
天然蛋白质中的其它生物活性结构域也可以用作水凝胶单体或其部分。例如，细胞粘附整合素结合结构域、控释亲和力结合结构域或谷氨酰胺转胺酶交联结构域可以用于本申请提供的水凝胶。制备这些水凝胶的详情可见Martino et al.(2009).Biomaterials30，1089；Martino et al.(2011).Sci.Trans.Med.3，100ra89；Hu and Messersmith(2003).J.Am.Chem.Soc.125，14298，其各自完全并入本申请以作参考，用于所有目的。
在一种实施方式中，重组DNA方法用于产生蛋白质，该蛋白质设计为响应pH温度的变化而胶凝，例如，通过Petka et al.(1998).Science 281，pp.389-392所述的方法进行，其完全并入本申请以作参考，用于所有目的。简言之，蛋白质由位于水溶性聚电解质段侧面的末端亮氨酸拉链结构域组成。在近乎中性的水性溶液中，末端结构域的卷曲螺旋聚集体形成三维水凝胶聚合物网络。
可用于使本申请提供的水凝胶交联的常用交联剂包括但不限于二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)，二甲基丙烯酸四甘醇酯，和N，N′-15-亚甲基双丙烯酰胺。可以使用的另外的交联剂的范围是本领域技术人员显而易见的并且遵循一般化学反应性原理，参见例如Thermo Scientific交联技术手册中题为“Easy molecular bonding crosslinkingtechnology”的内容(可查阅于tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/ 1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf)。
在一种实施方式中，水凝胶的聚合由过硫酸盐或催化自由基形成的等效引发剂引发。相容引发剂的范围是本领域技术人员已知的并且遵循一般化学反应性原理，参见例如Thermo Scientific交联技术手册中题为“Easy molecular bonding crosslinkingtechnology”的内容(可查阅于tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/ 1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf)。过硫酸盐可以是任何水溶性过硫酸盐。水溶性过硫酸盐的非限制性实例是过硫酸铵和碱金属过硫酸盐。碱金属包括锂，钠和钾。在一些实施方式中，过硫酸盐是过硫酸铵或过硫酸钾。在进一步的实施方式中，本申请提供的水凝胶的聚合由过硫酸铵引发。
水凝胶的聚合可以由可催化聚合不稳定的化学侧基的形成的促进剂加速。可用促进剂的范围是本领域技术人员已知的并且遵循一般化学反应性原理，参见例如ThermoScientific交联技术手册中题为“Easy molecular bonding crosslinking technology”的内容(可查阅于tools.lifetechnologies.com/content/sts/brochures/1602163- Crosslinking-Reagents-Handbook.pdf)。在一种实施方式中，促进剂是叔胺。叔胺可以是任何水溶性叔胺。在一种实施方式中，促进剂用于聚合反应且为N，N，N′，N′-四甲基乙二胺，3-二甲基氨基)丙腈，或N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)。在另一种实施方式中，促进剂用于聚合反应且为偶氮二(异丁腈)(AIBN)。
如上讨论，用于本申请组合物和方法的水凝胶可以包括本申请所述的任何单体性单元和交联剂，且在一方面，作为水凝胶颗粒通过使液滴制备(参见，例如，图2)。制备多个液滴(包括流体液滴和僵化液滴)微流体方法是本领域技术人员已知的，且描述于美国专利公开号2011/0218123和美国专利号7,294,503，各自全部并入本申请以作参考，用于所有目的。这样的方法提供包含第一流体且基本上由第二流体包围的多个液滴，其中第一流体和第二流体基本上不溶混(例如，包含基本上由油基液体包围的水基液体液滴)。
多个流体液滴(例如，使用微流体装置制备)可以是多分散的(例如，具有一系列不同尺寸)，或在一些情况下，流体液滴可以是单分散的或基本上单分散的，例如，具有直径的均匀分布，例如，使得不多于约10％、约5％、约3％、约1％、约0.03％、或约0.01％的液滴具有的平均直径大于平均直径的约10％、约5％、约3％、约1％、约0.03％、或约0.01％。如本申请使用的液滴的群落的平均直径是指液滴的直径的算术平均值。可以例如通过光散射技术测量颗粒的平均直径。在一种实施方式中，如下调整水凝胶颗粒的平均直径：例如改变微流体装置的通道内第一和第二流体的液流的流速，或改变微流体装置的通道的体积。
另外，本申请提供水凝胶颗粒的群落，其包含多个水凝胶颗粒，其中水凝胶颗粒的群落基本上是单分散的。
术语微流体是指包括至少一个流体通道的装置、设备或系统，所述流体通道的横截面尺寸小于1mm，且长度与垂直于通道的最大横截面尺寸之比为至少约3：1。包括微流体通道的微流体装置特别适于制备多个单分散液滴。
可用于本发明的微流体系统的非限制性实例公开于美国专利申请公开号2006/0163385；美国专利申请公开号2005/0172476；美国专利申请公开号2007/000342；国际专利申请公开号WO2006/096571；美国专利申请公开号2007/0054119；美国专利号7,776,927；和国际专利申请公开号WO2006/078841，各自全部并入本申请以作参考，用于所有目的。
液滴尺寸与微流体通常尺寸有关。微流体通道可以具有任何尺寸，例如，垂直于液流的最大尺寸为小于约5mm或2mm，或小于约1mm，或小于约500μm，小于约200μm，小于约100μm，小于约60μm，小于约50μm，小于约40μm，小于约30μm，小于约25μm，小于约10μm，小于约3μm，小于约1μm，小于约300nm，小于约100nm，小于约30nm，或小于约10nm。
液滴尺寸可以通过调整相对流速来调节。在一些实施方式中，液滴直径等于通道宽度，或在通道宽度的约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％内。
公开的水凝胶颗粒的尺寸基本上相似于由其形成的小滴。因此，在一些实施方式中，水凝胶的直径为小于约1μm，小于约2μm，小于约5μm，小于约10μm，小于约15μm，小于约20μm，小于约25μm，小于约30μm，小于约35μm，小于约40μm，小于约45μm，小于约50μm，小于约60μm，小于约70μm，小于约80μm，小于约90μm，小于约100μm，小于约120μm，小于约150μm，小于约200μm，小于约250μm，小于约300μm，小于约350μm，小于约400μm，小于约450μm，小于约500μm，小于约600μm，小于约800μm，或小于1000μm。在一些实施方式中，水凝胶的直径为大于约1μm，大于约2μm，大于约5μm，大于约10μm，大于约15μm，大于约20μm，大于约25μm，大于约30μm，大于约35μm，大于约40μm，大于约45μm，大于约50μm，大于约60μm，大于约70μm，大于约80μm，大于约90μm，大于约100μm，大于约120μm，大于约150μm，大于约200μm，大于约250μm，大于约300μm，大于约350μm，大于约400μm，大于约450μm，大于约500μm，大于约600μm，大于约800μm，或大于1000μm。在一种实施方式中，水凝胶颗粒的直径为5μm至100μm。
在一些实施方式中，公开的水凝胶颗粒的形状为球形。
在一些实施方式中，公开的水凝胶颗粒不包含琼脂糖。
在一种实施方式中，水凝胶颗粒通过悬浮液聚合进行，该聚合法在本领域也称为成珠聚合、珠状聚合、或成粒聚合(参见Elbert(2011)。Acta Biomater.7，pp.31-56，其完全并入本申请以作参考，用于所有目的)。在悬浮液聚合中，单体不溶于连续相，例如单体水性溶液在油连续相中。在悬浮液聚合中，聚合引发在富含单体的液滴内进行，且在任何时候需要针对每个液滴存在大于一个自由基才能进行。在一种实施方式中，单体相包括可以是双官能单体或多种单体物质(共聚单体，其可以是多种双官能单体)的单体。在一种实施方式中，单体相包括引发剂和/或交联剂。
乳液聚合也可以用于形成本申请所述的水凝胶颗粒。但是，类似于悬浮液聚合，在乳液聚合中，单体在连续相中具有差的溶解性，聚合引发在单体液体之外进行(参见Elbert(2011).Acta Biomater.7，pp.31-56，其完全并入本申请以作参考，用于所有目的)。在乳液聚合实施方式中，引发剂引起溶解于连续相中的单体(或共聚单体)或在存在表面活性剂时包含在胶束中的单体的链增长。
在另一种实施方式中，水凝胶颗粒通过沉淀聚合形成，例如描述于Elbert(2011).Acta Biomater.7，pp.31-56，其完全并入本申请以作参考，用于所有目的。沉淀聚合是一种利用单体和聚合物溶解度之差来产生微粒子的技术。具体地，已知较大的聚合物链的溶解度通常小于较小的聚合物链。因此，针对具有的分子量，相分离可能是有利的。沉淀聚合最初作为在单一相、均匀系统中的溶液聚合开始。在一种实施方式中，在聚合开始以后，立即存在相对较高浓度的聚合物链，利于通过成核作用发生相分离。随着聚合的进行，聚合物链的浓度变低，在可出现新颗粒的成核之前，现存颗粒捕获链。因此，颗粒的成核仅在反应开始后即刻出现片刻，这在一种实施方式中使颗粒的尺寸分布较窄。另外的方法包括但不限于光刻粒子形成(Helgeson et al.(2011).Curr.Opin.Colloid.Interface Sci.16，pp.106-117，其完全并入本申请以作参考，用于所有目的)，膜乳化(例如，通过Nanomi B.V.(Netherlands)所述的微筛乳化(micosieve emulsification)工艺技术进行)，和微通道乳化(Sugiura et al.(2002).Languimir 18，pp.5708-5712，其完全并入本申请以作参考)，和本体乳化(SNF Floerger，可查阅于snf.com.au/downloads/Emulsion_Handbook_E.pdf，其完全并入本申请以作参考)。
在一种实施方式中，水凝胶颗粒在具有两个在单体水性溶液的中心流处交汇的油通道的微流体装置内形成。在该实施方式中，液滴在两个通道和中心流的界面处形成，打破油包水乳液中的液滴。在一种实施方式中，一旦形成液滴，它们在聚合之前稳定化，例如，通过向油相中添加表面活性剂稳定化。但是，在另一种实施方式中，液滴在聚合之前不稳定化。在一种实施方式中，单体的聚合如下触发：在形成初始液滴之后，向油通道之一或两者添加促进剂(例如，N，N，N′，N′-四甲基乙二胺)。
如上提供的单体水性溶液可以包括单一单体物质或多种单体物质。单体水性溶液可以包括共聚单体、双官能单体或其组合。在一种实施方式中，单体或单体的群体可以包括双官能单体，例如，上述单体之一。如下所述，共聚单体可以用于调整前向散射或侧向散射，例如，通过调节水凝胶颗粒的折射率进行。
在一种实施方式中，单体水性溶液的中心流包含交联剂，例如，N，N′-双丙烯酰胺。在进一步的实施方式中，除了单体之外，单体水性溶液的中心流还包含交联剂和促进剂。再在进一步的实施方式中，单体水性溶液包含引发剂，例如氧化剂，如过硫酸铵。
前向散射经由调节凝胶的折射率来调整，折射率的调节通过添加共聚单体丙烯酸烯丙基酯和甲基丙烯酸烯丙基酯实现(也参见图11和12)。前向散射也可以用包含足够光学分辨率/尺寸/密度的侧向散射纳米粒子调节，包括但不限于，二氧化硅和/或PMMA颗粒的较高密度胶态悬浮体。液滴的侧向散射如下调节：在聚合之前，将二氧化硅纳米粒子和/或PMMA(聚(甲基丙烯酸甲酯))粒子的胶态悬浮体(～100nm)添加到中心水相(图11和12)。
在一种实施方式中，小珠、多个小珠、生物分子、或多个生物分子嵌埋(包封)在水凝胶颗粒内。在一种实施方式中，包封的小珠或生物分子用于模拟靶细胞的一个或多个细胞内细胞器，或当细胞吞没颗粒后模拟细胞本身。在一种实施方式中，包封或嵌埋小珠或生物分子在水凝胶颗粒形成时完成。例如，小珠可以按适当的浓度悬浮，从而使平均一个小珠嵌埋/包封在单个水凝胶颗粒中。小珠悬浮液可以包含例如在单体的水性溶液内。类似地，生物分子或生物分子的混合物可以结合到单体的水性溶液中以包封一个或多个生物分子。
或者，一旦例如通过上述方法形成水凝胶颗粒，在一种实施方式中，其可以进一步如下处理：例如，将小珠、多个小珠、生物分子或多个生物分子嵌埋在水凝胶颗粒内。
因此，在本发明的一方面，提供了包含嵌埋物质的水凝胶。
在一种实施方式中，嵌埋物质是嵌埋分子，例如生物分子。生物分子可以是单一物质或多种不同物质。例如，蛋白质、肽、碳水化合物、核酸或其组合可以包封在本发明水凝胶颗粒内。此外，不同的核酸分子(例如，具有不同序列或核酸类型，例如基因组DNA，信使RNA或DNA-RNA杂合体)可以由本发明水凝胶颗粒包封。这些可以包含任何蛋白质或核酸作为包含不稳定化学侧基(或可以由供应商改性(例如，Integrated DNA Technology化学侧基改性)的生物材料的两种形式。这样的侧基与共聚单体组合物中常见的反应化学物质(例如丙烯酸酯化学物质，NHS酯，伯胺，铜催化的点击化学(Sharpless))相容。可用的包含相容化学物质的嵌埋分子的范围是本领域技术人员可理解的。
在一种实施方式中，制造水凝胶颗粒的不同子群落，每种具有不同浓度的生物分子。在进一步的实施方式中，生物分子是核酸，蛋白质，细胞内离子例如酸钙(或用户选择的其它生物分子，例如，钙)。在另一种实施方式中，制造水凝胶颗粒的不同子群落，每种具有不同浓度的药物物质。在一种实施方式中，药物物质是生物分子(即，生物药物，抗体药物，抗体药物缀合物，蛋白质/酶，肽，非核糖体肽，或有关分子)或小分子合成药物(例如，I/II/III型聚酮化合物，具有生物活性性质的非核糖体肽，或通常由本领域技术人员归类的其它小分子实体)。
在这点上，本发明特别适用于确定试验分辨率，其中将细胞中的各核酸或蛋白质内容物染色。在一种实施方式中，本申请提供的水凝胶颗粒的不同群落用已知的不同量的细胞内物质例如核酸或蛋白质包封。将个体水凝胶颗粒中的细胞内物质染色，通过细胞计数装置测量多种群落的个体水凝胶的荧光。这使得能够产生标准曲线以确立细胞内试验的灵敏度和动态量程。一旦确立，可以通过细胞仪运行样本以检测是否存在靶细胞，和定量各靶细胞中细胞内物质的量。在一种实施方式中，嵌埋的物质是传染病生物标记物，例如传染病生物标记物数据库(IDBD，参见Yang et al.(2008)IDBD：Infectious DiseaseBiomarker Database.Nucleic Acid Res.36，pp.D455-D460，其完全并入本申请以作参考，用于所有目的)中的传染病生物标记物之一。在进一步的实施方式中，传染病生物标记物是以下的生物标记物：胃肠道感染，呼吸道感染，神经系统感染，泌尿生殖器感染，病毒感染，出血热，动物传染病，虫媒病毒，抗生素耐药性或生物恐怖。在进一步的实施方式中，病毒感染是埃博拉病毒感染。
在一种实施方式中，本申请提供的方法用于确定细胞核酸定量试验的灵敏度和/或动态量程。在该实施方式中，对于样本，询查样本内(是否存在)的细胞类型，以及细胞内的细胞核酸的量。
在另一种实施方式中，本发明提供确定细胞内蛋白质定量试验的分辨率和/或灵敏度的手段。在一种实施方式中，水凝胶颗粒以各种浓度包封已知量的蛋白质，然后用适当的蛋白质抗体染色。测量各种颗粒的荧光以确定试验的灵敏度和/或动态量程。然后将该荧光值与从样本中的细胞获得的荧光值相比较，以确定是否存在靶细胞，以及其是否包含细胞内蛋白质，以及蛋白质的量。
在一种实施方式中，调节个体水凝胶颗粒，使其具有的至少一种光学性质基本上相似于存在于母血中存在的循环肿瘤细胞或胎儿细胞。个体颗粒用已知量的待分析生物分子嵌埋。对于特定细胞类型，颗粒用于产生生物分子检测试验的标准曲线。
如上提供，在本发明的一方面，提供包含嵌埋的物质的水凝胶。在一种实施方式中，嵌埋的物质是一个小珠或多个小珠。在一种实施方式中，水凝胶颗粒用单个小珠嵌埋。在另一种实施方式中，对于个体水凝胶，嵌埋的小珠在多个水凝胶颗粒中的平均数为1。
在将一个或多个小珠嵌埋进水凝胶颗粒的情况中，在一种实施方式中，为了流式细胞计数试验的品质控制，将一个或多个小珠的光学性质水凝胶颗粒的FSC和SSC性质组合使用。例如，在一种实施方式中，嵌埋的小珠用作标定流式细胞仪系统的控制物，包括激光源，光学性质，和流量。在另一种实施方式中，嵌埋的小珠用作定量样本例如特定细胞中的荧光量的手段。关于这点，各种浓度的嵌埋的小珠可以用于产生荧光标准曲线，以确定细胞是否表达某些标记物以及处于何种表达水平。
在一种实施方式中，直径为约1μm至约3μm、约2μm至约4μm或约3μm至约7μm的小珠嵌埋在本申请提供的水凝胶中。例如，在一种实施方式中，小珠的直径为约3μm至约3.5μm。在进一步的实施方式中，小珠是荧光小珠。在另一种实施方式中，小珠的直径为约1μm至约2.5μm或约1.5μm至约3μm。在进一步的实施方式中，小珠是荧光小珠且可以是内部染色的或在其表面染色。在甚至进一步的实施方式中，荧光小珠是内部染色的。不希望受任何理论限制，认为内部染色使荧光团与可引起荧光输出变化的环境相互作用隔绝。
如上提供，在一种实施方式中，嵌埋的小珠是荧光小珠，在进一步的实施方式中，荧光小珠是内部染色的。本领域技术人员能够选择适当的荧光团来与嵌埋的小珠联用。在一种实施方式中，小珠用以下荧光染料中的一种或多种衍生化：6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基曙红；5-羧基荧光素；6羧基荧光素；5-(和-6)-羧基荧光素；S-羧基荧光素-二-(5-羧基甲氧基-2-硝基苄基)醚，-丙氨酸-甲酰胺、或琥珀酰亚胺酯；5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；5-(4，6-二氯三嗪基)氨基荧光素；2′，7′-二氟荧光素；曙红-5-异硫氰酸酯；赤藓红5-异硫氰酸酯；6-(荧光素-5-甲酰氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；6-(荧光素-5-(和-6)-甲酰氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；荧光素-S-EX琥珀酰亚胺酯；荧光素-5-异硫氰酸酯；荧光素-6-异硫氰酸酯；
Figure BDA00035348116800002515
488羧酸、或琥珀酰亚胺酯；
Figure BDA00035348116800002516
488异硫氰酸酯；
Figure BDA00035348116800002517
488-X琥珀酰亚胺酯；
Figure BDA00035348116800002518
500羧酸；
Figure BDA00035348116800002519
500羧酸、琥珀酰亚胺酯或三乙铵盐；
Figure BDA00035348116800002520
514羧酸；
Figure BDA00035348116800002521
514羧酸或琥珀酰亚胺酯；罗丹明绿TM羧酸、琥珀酰亚胺酯或盐酸盐；罗丹明绿TM羧酸、三氟乙酰胺或琥珀酰亚胺酯；罗丹明绿TM-X琥珀酰亚胺酯或盐酸盐；罗德尔绿TM羧酸，N，O-二-(三氟乙酰基)或琥珀酰亚胺酯；二-(4-羧基哌啶基)砜罗丹明或二(琥珀酰亚胺酯)；5-(和-6)羧基萘并荧光素，5-(和-6)羧基萘并荧光素琥珀酰亚胺酯；5-羧基罗丹明6G盐酸盐；6-羧基罗丹明6G盐酸盐，5-羧基罗丹明6G琥珀酰亚胺酯；6-羧基罗丹明6G琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基罗丹明6G琥珀酰亚胺酯；5-羧基-2′，4′，5′，7′-四溴砜荧光素琥珀酰亚胺酯或二-(二异丙基乙基铵)盐；5-羧基四甲基罗丹明；6-羧基四甲基罗丹明；5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明；5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯；6-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯；6-羧基-X-罗丹明；5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯；6-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯；5-羧基-X-罗丹明三乙铵盐；丽丝胺TM罗丹明B磺酰氯；孔雀绿；异硫氰酸酯；
Figure BDA0003534811680000251
单(磺基琥珀酰亚胺酯)；
Figure BDA0003534811680000252
21羧酸或琥珀酰亚胺酯；
Figure BDA0003534811680000253
7羧酸或琥珀酰亚胺酯；罗丹明红TM-X琥珀酰亚胺酯；6-(四甲基罗丹明-5-(和-6)-甲酰氨基)己酸；琥珀酰亚胺酯；四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯；四甲基罗丹明-6-异硫氰酸酯；四甲基罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯；
Figure BDA0003534811680000254
磺酰基；
Figure BDA0003534811680000255
磺酰氯；
Figure BDA0003534811680000256
-X STP酯或钠盐；
Figure BDA0003534811680000257
-X琥珀酰亚胺酯；
Figure BDA0003534811680000258
-X琥珀酰亚胺酯；和X-罗丹明-5-(和-6)异硫氰酸酯，商购自Invitrogen的
Figure BDA0003534811680000259
染料，其包括但不限于
Figure BDA00035348116800002510
FL；
Figure BDA00035348116800002511
TMR STP酯；
Figure BDA00035348116800002512
TR-X STP酯；
Figure BDA00035348116800002513
630/650-X STP酯；
Figure BDA00035348116800002514
650/665-X STP酯；6-二溴-4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3，5-二丙酸；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-戊酸；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-戊酸琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a二氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4，4二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3丙酸；磺基琥珀酰亚胺酯或钠盐；6-((4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酰基)氨基)己酸；6-((4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酰基)氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；N-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酰基)磺基丙氨酸，琥珀酰亚胺酯或三乙铵盐；6-4，4-二氟-1，3-二甲基-5-(4-甲氧基苯基)-4-硼杂3a，4a4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸；4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼杂3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5-苯基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸；琥珀酰亚胺酯；6-((4，4-二氟-5-苯基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酰基)氨基己酸或琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5-(4-苯基-1，3-丁二烯基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；6-(((4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-基)苯乙烯氧基)乙酰基)氨基己酸或琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸；4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸；琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-1，3，5，7-四甲基-4-硼杂-3a，4a二氮杂-对称-引达省-8-丙酸；4，4-二氟-1，3，5，7-四甲基-4硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-8-丙酸琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；6-(((4-(4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼杂-3a，4a二氮杂对称-引达省-3-基)苯氧基)乙酰基)氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；和6-(((4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-yl)苯乙烯氧基)乙酰基)氨基己酸或琥珀酰亚胺酯，商购自Invitrogen的Alexa fluor染料，其包括但不限于
Figure BDA0003534811680000261
350羧酸；
Figure BDA0003534811680000262
430羧酸；
Figure BDA0003534811680000263
488羧酸；
Figure BDA0003534811680000264
532羧酸；
Figure BDA0003534811680000265
546羧酸；
Figure BDA0003534811680000266
555羧酸；
Figure BDA0003534811680000267
568羧酸；
Figure BDA0003534811680000268
594羧酸；
Figure BDA0003534811680000269
633羧酸；
Figure BDA00035348116800002610
647羧酸；
Figure BDA00035348116800002611
Figure BDA0003534811680000271
660羧酸；和
Figure BDA0003534811680000272
680羧酸，商购自Amersham-PharmaciaBiotech的花青染料，其包括但不限于Cy3 NHS酯；Cy 5 NHS酯；Cy5.5 NHS酯；和Cy7 NHS酯。
可用于本发明的其它荧光团在以下表2中给出。
Figure BDA0003534811680000281
Figure BDA0003534811680000291
Figure BDA0003534811680000301
Figure BDA0003534811680000311
Figure BDA0003534811680000321
Figure BDA0003534811680000331
Figure BDA0003534811680000341
Figure BDA0003534811680000351
Figure BDA0003534811680000361
Figure BDA0003534811680000371
Figure BDA0003534811680000381
可商购的小珠包括但不限于由Bangs Laboratories，Inc，Sperhotech Inc.，Thermo Scientific，Inc.以及同等的供应商出售的那些，其可与本申请所述的水凝胶颗粒组合使用。本领域技术人员根据试验可以选择适当小珠直径、荧光发射和/或激发光谱和/或荧光强度的小珠。例如，与蓝色、红色、或紫外激光联用的品质控制小珠可以嵌埋进本申请提供的一个或多个水凝胶颗粒中。例如，对于蓝色激光(目录号A-16500(2.5μm)，A-16503(6.0μm))、红色激光(目录号A-16501(2.5μm)，A-16504(6.0μm))或紫外激光(目录号A-16502(2.5μm)，A-16505(6.0μm))，AlignflowTM流式细胞仪定位小珠可以嵌埋在本申请提供的一个或多个水凝胶颗粒中。
在一种实施方式中，可在在365nm-650nm范围内任何波长激发的荧光小珠嵌埋在水凝胶颗粒中。在一种实施方式中，小珠是“彩虹粒子”，其包含荧光团的混合物，例如4个荧光团，5个荧光团，6个荧光团，7个荧光团或8个荧光团。鉴于此，用户根据待问询的荧光团选择用哪一波长来激发粒子。彩虹粒子可商购，例如，商购自BD Biosciences(目录号556298(中波程FL1荧光)，556286(6色，3.0-3.4μm)，556288(6色，6.0-6.4μm)，559123(8色))和各种直径的Spherotech(例如，目录号RCP20-5(4色)，RCP-30-5(6个峰)，RCP-30-5A(8个峰)
细胞分选设置小珠可以嵌埋在本申请提供的一个或多个水凝胶颗粒中。在一种实施方式中，细胞分选设置小珠在尺寸、发射波长、和强度上近似于生物样本，并且可以用于标定流式细胞仪的细胞分选系统，包括激光源、光学性质、和流量。在一种实施方式中，细胞分选设置小珠嵌埋在一个或多个水凝胶颗粒中并且可用于紫外激光、蓝色激光、绿色/黄色激光或红色激光。在一种实施方式中，当使用绿色激光时，嵌埋的小珠在570nm激发并在575nm发射，但是也可以在488nm激发。商购细胞分选设置小珠购自，例如LifeTechnologies(目录号C-16506(紫外激光)，C-16508(蓝色激光)，C-16509(绿色-黄色激光)，C-16507(红色激光))。
补偿控制小珠也可以嵌埋在本申请提供的一个或多个水凝胶颗粒中。精确补偿对于流式细胞计数法中的有效多色分析是重要参数。但是，基于细胞的补偿控制并不是完全有效的，因为很多抗原并不是高表达的，且依稀染色的细胞可能导致补偿设置不准确。
在一种实施方式中，补偿控制小珠包括荧光抗体缀合物捕获能力(正补偿小珠)或者是惰性的(负补偿小珠)。将补偿小珠与缀合荧光团的人、小鼠、大鼠、仓鼠、或兔子抗体混合；两种组分提供了明显的高信号正控制与适度的负群落，该负群落然后可用于适当地设置补偿，而不管细胞在实际实验中的浓度如何。一旦将抗体与小珠混合，则抗体嵌埋在本申请提供的一个或多个水凝胶颗粒中。商购补偿小珠购自，例如Life Technologies(目录号A-10344，A-10389，A10497，A10513)和Spherotech(目录号CMIg-P-08-2K，CMIg-P-30-2K，CMIg-P-50-3K，CMIg-P-70-3K)。
在一种实施方式中，含有嵌埋/包封小珠的水凝胶颗粒用作细胞试验的参照物，例如，吞噬试验，细胞毒性试验，运动性试验，细胞活性试验等。吞噬作用是下述过程，通过该过程细胞吞没固体颗粒，形成称为吞噬体的内囊。鉴于此，可以调节水凝胶颗粒，使其具有一种或多种基本上相似于在吞噬细胞吞没颗粒之前和之后吞噬细胞的光学性质。因此，在一种实施方式中，本申请提供的水凝胶颗粒用作吞噬试验的控制颗粒。在进一步的实施方式中，(i)水凝胶颗粒的一种或多种光学性质基本上相似于在吸收颗粒之前的吞噬细胞，和(ii)第二水凝胶颗粒的一种或多种光学性质基本上相似于在吸收颗粒之后的吞噬细胞。鉴于此，对于测量由吞噬细胞吸收的颗粒，产生控制。
在一种实施方式中，吞噬细胞是专业吞噬细胞。在另一种实施方式中，吞噬细胞是非专业吞噬细胞(即，消耗濒死细胞和外来有机体的细胞)。在进一步的实施方式中，非专业吞噬细胞是上皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞或间充质细胞。在一种实施方式中，调解水凝胶颗粒，使其具有的一种或多种光学性质基本上相似于以下表3中列出的专业吞噬细胞(在颗粒吸收之前和/或之后)。
Figure BDA0003534811680000401
Figure BDA0003534811680000411
在一种实施方式中，由诸如核酸或小珠等物质嵌埋的本发明的水凝胶颗粒群体用作基因组细胞计数试验的控制试剂。鉴于此，特定染色体、RNA序列和/或DNA序列的特定数目的拷贝可以由嵌埋的物质模拟。水凝胶颗粒然后可以用作有待探测基因信息的样板的控制物，例如染色体的拷贝数目，RNA序列的拷贝数目和/或DNA序列的拷贝数目。
流式细胞计数法的反卷积的三种主要模式是颗粒的两种被动光学性质(前向散射，FSC，对应于折射率，或RI；和侧向散射，SSC)和存在于给定细胞类型表面上的生物标记物。因此，允许本申请水凝胶颗粒对于这三种模式模拟具体细胞类型的组合物用于为流式细胞计数法提供合成的强效的标定剂。
在一种实施方式中，公开的水凝胶颗粒的折射率(RI)大于约1.10，大于约1.15，大于约1.20，大于约1.25，大于约1.30，大于约1.35，大于约1.40，大于约1.45，大于约1.50，大于约1.55，大于约1.60，大于约1.65，大于约1.70，大于约1.75，大于约1.80，大于约1.85，大于约1.90，大于约1.95，大于约2.00，大于约2.10，大于约2.20，大于约2.30，大于约2.40，大于约2.50，大于约2.60，大于约2.70，大于约2.80，或大于约2.90。
在另一种实施方式中，公开的水凝胶颗粒的折射率(RI)为约1.10至约3.0，或约1.15至约3.0，或约1.20至约3.0，或约1.25至约3.0，或约1.30至约3.0，或约1.35至约3.0，或约1.4至约3.0，或约1.45至约3.0，或约1.50至约3.0，或约1.6至约3.0，或约1.7至约3.0，或约1.8至约3.0，或约1.9至约3.0，或约2.0至约3.0。
在一些实施方式中，公开的水凝胶颗粒的折射率(RI)小于约1.10，小于约1.15，小于约1.20，小于约1.25，小于约1.30，小于约1.35，小于约1.40，小于约1.45，小于约1.50，小于约1.55，小于约1.60，小于约1.65，小于约1.70，小于约1.75，小于约1.80，小于约1.85，小于约1.90，小于约1.95，小于约2.00，小于约2.10，小于约2.20，小于约2.30，小于约2.40，小于约2.50，小于约2.60，小于约2.70，小于约2.80，或小于约2.90。
最有意义的是将公开的水凝胶颗粒的SSC相比于靶细胞进行测量。在一些实施方式中，公开的水凝胶颗粒的SSC在靶细胞SSC的30％内、在其25％内、在其20％内、在其15％内、在其10％内、在其5％内、或在其1％内，通过细胞计数装置测得。
在一种实施方式中，如下调整水凝胶颗粒的SSC：将高折射率分子(或其群体)结合到水凝胶中。在一种实施方式中，将高折射率分子配置在水凝胶颗粒中，且在进一步的实施方式中，高折射率分子是硅胶，丙烯酸烷基酯，甲基丙烯酸烷基酯或其组合。因此，在一些实施方式中，公开的水凝胶颗粒丙烯酸烷基酯和/或甲基丙烯酸烷基酯。在一种实施方式中，调节单体的浓度，以进一步调节水凝胶颗粒的折射率。
丙烯酸烷基酯或甲基丙烯酸烷基酯可以在烷基中包含1至18个碳原子、1至8个碳原子、或2至8个碳原子，例如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基或叔丁基，2-乙基己基，庚基或辛基。烷基可以是支化或直链的。
高折射率分子也可以包括乙烯基芳烃例如苯乙烯和甲基苯乙烯，其在芳环上任选取代有烷基例如甲基、乙基或叔丁基，或取代有卤素，例如氯苯乙烯。
在一些实施方式中，FSC如下调整：调节单体在组合物中存在的百分比，从而改变水凝胶形成过程中存在的水含量。在一种实施方式中，当使用单体和共聚单体时，调解单体和共聚单体的比率以改变水凝胶颗粒的前向散射性质。这在图11和图12中都有显示。
最有意义的是将公开的水凝胶颗粒的FSC相比于靶细胞进行测量。在一些实施方式中，公开的水凝胶颗粒的FSC在靶细胞FSC的30％内、在其25％内、在其20％内、在其15％内、在其10％内、在其5％内、或在其1％内，通过细胞计数装置测得。
FSC涉及颗粒体积，因此可以通过改变颗粒直径调整，如本申请所述。通常，已经观察到，相比于小的物体，大的物体折射折射更多的光，从而得到高的前向散射信号(反之亦然)。因此，在一种实施方式中，改变颗粒直径以调整水凝胶颗粒的FSC性质。例如，在一种实施方式中，水凝胶颗粒直径的增大是通过在流体形成过程中利用较大的微流体通道改变的。
SSC可如下设计：将纳米粒子包封在水凝胶内，以模拟靶细胞中的细胞器。在一些实施方式中，公开的水凝胶颗粒包含一种或多种类型的纳米粒子，其选自：聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)纳米粒子，聚苯乙烯(PS)纳米粒子，和二氧化硅纳米粒子。也参见图11和12，其表明添加各种浓度的纳米粒子使得可调整颗粒的侧向散射。不希望受理论限制，选择性调节本申请所述水凝胶的前向散射和侧向散射两者的能力可提供强效平台来模拟众多细胞类型。
尽管本发明主要描述光学性质的改性，但是本发明并不限于此。例如，可以制造和调整水凝胶颗粒，从而调节颗粒的容量，例如，从而标定库尔特计数器。在一种实施方式中，水凝胶颗粒的容量通过改变水凝胶单体在组合物中的量来调节。例如，聚苯胺，聚乙炔；聚亚苯基亚乙烯基；聚吡咯(X＝NH)和聚噻吩(X＝S)共聚单体；和聚苯胺(X＝NH/N)和聚亚苯基硫醚(X＝S)共聚单体浓度均可调节以改变容量。在一种实施方式中，提高这些单体的一种或多种的浓度，以提高水凝胶颗粒的容量。
在一些实施方式中，与具有相同直径的聚苯乙烯小珠相比，公开的水凝胶颗粒具有的材料模量性质(例如，弹性)更加极为相似于靶细胞的所述性质。
在水凝胶颗粒形成之后，可以将一个或多个颗粒表面官能化，例如，从而模拟靶细胞或标记靶细胞的一种或多种光学性质。官能化的水凝胶颗粒也可以包括嵌埋的小珠或物质例如生物分子，如上所述。在一种实施方式中，一个或多个水凝胶颗粒用一种或多种荧光染料、一种或多种细胞表面标记物(或其抗原表位结合区)、或其组合官能化。在一种实施方式中，水凝胶颗粒通过使至少一种双官能单体聚合形成，且在形成之后，水凝胶颗粒包括一个或多个可用于进一步连接细胞表面标记物、细胞表面标记物的抗原表位结合区、荧光染料、或其组合的官能团。在一种实施方式中，自由官能团是胺基，羧基，羟基或其组合。根据所需的官能化作用，应该理解的是，可以使用多种双官能单体，例如，以使用不同的化学方法和不同的分子将颗粒官能化。
水凝胶颗粒可以使用本领域已知的任何荧光染料官能化，包括The
Figure BDA0003534811680000441
Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies中列出的荧光染料，其全部并入本申请以作参考，用于所有目的。官能化可以通过包含自由胺基的化合物例如烯丙基胺介导，所述化合物可被引入所用的双官能单体中以形成水凝胶，如上讨论。
可用于将本申请所述水凝胶颗粒的表面官能化的已知荧光染料的非限制性实例包括：6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基曙红；5-羧基荧光素；6羧基荧光素；5-(和-6)-羧基荧光素；S-羧基荧光素-二-(5-羧基甲氧基-2-硝基苄基)醚，-丙氨酸-甲酰胺、或琥珀酰亚胺酯；5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；5-(4，6-二氯三嗪基)氨基荧光素；2′，7′-二氟荧光素；曙红-5-异硫氰酸酯；赤藓红5-异硫氰酸酯；6-(荧光素-5-甲酰氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；6-(荧光素-5-(和-6)-甲酰氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；荧光素-S-EX琥珀酰亚胺酯；荧光素-5-异硫氰酸酯；荧光素-6-异硫氰酸酯；
Figure BDA0003534811680000442
488羧酸、或琥珀酰亚胺酯；
Figure BDA0003534811680000443
488异硫氰酸酯；
Figure BDA0003534811680000444
488-X琥珀酰亚胺酯；
Figure BDA0003534811680000445
500羧酸；
Figure BDA0003534811680000446
500羧酸、琥珀酰亚胺酯或三乙铵盐；
Figure BDA0003534811680000447
514羧酸；
Figure BDA0003534811680000448
514羧酸或琥珀酰亚胺酯；罗丹明绿TM羧酸，琥珀酰亚胺酯或盐酸盐；罗丹明绿TM羧酸、三氟乙酰胺或琥珀酰亚胺酯；罗丹明绿TM-X琥珀酰亚胺酯或盐酸盐；罗德尔绿TM羧酸，N，O-二-(三氟乙酰基)或琥珀酰亚胺酯；二-(4-羧基哌啶基)砜罗丹明或二(琥珀酰亚胺酯)；5-(和-6)羧基萘并荧光素，5-(和-6)羧基萘并荧光素琥珀酰亚胺酯；5-羧基罗丹明6G盐酸盐；6-羧基罗丹明6G盐酸盐，5-羧基罗丹明6G琥珀酰亚胺酯；6-羧基罗丹明6G琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基罗丹明6G琥珀酰亚胺酯；5-羧基-2′，4′，5′，7′-四溴砜荧光素琥珀酰亚胺酯或二-(二异丙基乙基铵)盐；5-羧基四甲基罗丹明；6-羧基四甲基罗丹明；5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明；5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯；6-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯；6-羧基-X-罗丹明；5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯；6-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯；5-(和-6)-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯；5-羧基-X-罗丹明三乙铵盐；丽丝胺TM罗丹明B磺酰氯；孔雀绿；异硫氰酸酯；
Figure BDA0003534811680000449
单(磺基琥珀酰亚胺酯)；
Figure BDA00035348116800004410
21羧酸或琥珀酰亚胺酯；
Figure BDA00035348116800004411
7羧酸或琥珀酰亚胺酯；罗丹明红TM-X琥珀酰亚胺酯；6-(四甲基罗丹明-5-(和-6)-甲酰氨基)己酸；琥珀酰亚胺酯；四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯；四甲基罗丹明-6-异硫氰酸酯；四甲基罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯；
Figure BDA0003534811680000451
磺酰基；
Figure BDA0003534811680000452
磺酰氯；
Figure BDA0003534811680000453
-X STP酯或钠盐；
Figure BDA0003534811680000454
-X琥珀酰亚胺酯；
Figure BDA0003534811680000455
-X琥珀酰亚胺酯；和X-罗丹明-5-(和-6)异硫氰酸酯。
用于本申请所述的水凝胶颗粒的荧光染料的其它实例包括但不限于，商购自Invitrogen的
Figure BDA0003534811680000456
染料，包括但不限于
Figure BDA0003534811680000457
FL；
Figure BDA0003534811680000458
TMR STP酯；
Figure BDA0003534811680000459
TR-X STP酯；
Figure BDA00035348116800004510
630/650-X STP酯；
Figure BDA00035348116800004511
650/665-X STP酯；6-二溴-4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3，5-二丙酸；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-戊酸；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-戊酸琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a二氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3丙酸；磺基琥珀酰亚胺酯或钠盐；6-((4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3丙酰基)氨基)己酸；6-((4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酰基)氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；N-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酰基)磺基丙氨酸，琥珀酰亚胺酯或三乙铵盐；6-4，4-二氟-1，3-二甲基-5-(4-甲氧基苯基)-4-硼杂3a，4a4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸；4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼杂3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5-苯基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸；琥珀酰亚胺酯；6-((4，4-二氟-5-苯基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酰基)氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5-(4-苯基-1，3-丁二烯基)-4-硼杂-3a，4a-二-氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；6-(((4，4-二氟-5-(2-吡咯基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-基)苯乙烯氧基)乙酰基)氨基己酸或琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸；4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸；琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-1，3，5，7-四甲基-4-硼杂-3a，4a二氮杂-对称-引达省-8-丙酸；4，4-二氟-1，3，5，7-四甲基-4硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-8-丙酸琥珀酰亚胺酯；4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-丙酸琥珀酰亚胺酯；6-(((4-(4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼杂-3a，4a二氮杂对称-引达省-3-基)苯氧基)乙酰基)氨基)己酸或琥珀酰亚胺酯；和6-(((4，4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-对称-引达省-3-基)苯乙烯氧基)乙酰基)氨基己酸或琥珀酰亚胺酯。
在一种实施方式中，用于衍生化一个或多个水凝胶颗粒的表面的荧光染料包括但不限于，商购自Invitrogen的Alexa fluor染料，其包括但不限于
Figure BDA0003534811680000461
350羧酸；
Figure BDA0003534811680000462
430羧酸；
Figure BDA0003534811680000463
488羧酸；
Figure BDA0003534811680000464
Figure BDA0003534811680000465
532羧酸；
Figure BDA0003534811680000466
546羧酸；
Figure BDA0003534811680000467
555羧酸；
Figure BDA0003534811680000468
568羧酸；
Figure BDA0003534811680000469
594羧酸；
Figure BDA00035348116800004610
633羧酸；
Figure BDA00035348116800004611
647羧酸；
Figure BDA00035348116800004612
660羧酸；和
Figure BDA00035348116800004613
680羧酸。在另一种实施方式中，用于本申请所述水凝胶颗粒和方法的荧光染料包括商购自Amersham-Pharmacia Biotech的花青染料，其包括但不限于Cy3 NHS酯；Cy5 NHS酯；Cy5.5 NHS酯；和Cy7 NHS酯。
本领域技术人员可根据水凝胶颗粒的所需光谱激发和发射性质选择适宜的一种或多种染料。
水凝胶颗粒，在一种实施方式中用一种或多种细胞表面标记物(参见，例如，表4和7-8)或其片段(例如，在跨膜蛋白的情况中为其细胞外部分)衍生化，例如如下进行：将一种或多种细胞表面标记物，其细胞外部分或配套结合区经自由胺、存在于水凝胶颗粒表面上的自由胺、自由羧基和/或自由羟基连接于颗粒。用染料或细胞表面分子将水凝胶颗粒官能化也可以通过连接物例如链霉亲和素/生物素缀合物进行。
根据靶细胞，个体水凝胶颗粒科员用一种或多种细胞表面标记物或其片段(例如，在跨膜蛋白的情况下为其细胞外部分)衍生化，以进一步模拟靶细胞的结构性质。以下给出的表4和7-8列出根据靶细胞可用于将水凝胶颗粒衍生化的细胞表面标记物的非限制性清单。尽管提供的是细胞表面标记物，但是应该理解的是，细胞表面标记物的部分，例如受体结合部分、配体结合部分、或标记物的细胞外部分也可以用于将水凝胶颗粒衍生化(在自由官能团，如上所述)。也参见图11和12，其表明用例如细胞表面受体将水凝胶表面改性连同选择性调节FSC和/或SSC使得能够制造具有所需特性的水凝胶颗粒。
Figure BDA0003534811680000471
细胞类型包括但不限于各种细胞系，例如CHO，HEK-293，BHK-21，NSO，MDCK，VERO，MRC-S，W1-38和Sp2/0小鼠骨髓瘤(杂交瘤)。表5和表6各自提供了用于本申请所述的水凝胶颗粒的其它细胞类型。
Figure BDA0003534811680000472
Figure BDA0003534811680000481
Figure BDA0003534811680000491
Figure BDA0003534811680000501
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Figure BDA0003534811680000652
表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
Figure BDA0003534811680000653
表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
Figure BDA0003534811680001321
表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
Figure BDA0003534811680001351
表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
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表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
Figure BDA0003534811680001391
表8.与本申请描述的水凝胶颗粒一起使用的细胞表面标记物。
Figure BDA0003534811680001401
在一种实施方式中，水凝胶颗粒的群体用于确定在靶细胞群落上检测特定细胞表面标记物或其组合的动态量程和/或灵敏度。例如，可以调节水凝胶颗粒的群落以使其具有靶细胞的SSC和/或FSC波形，且将水凝胶颗粒的子群落用特定数目的细胞表面标记物例如细胞表面受体或其结构域如其表面抗原结合区的拷贝衍生化。例如，可以将水凝胶颗粒的个体子群落各自衍生化以具有独特数目的拷贝，例如，一个子群落将包含100份拷贝的细胞表面标记物，第二子群落将包含1，000份拷贝的同一细胞表面标记物，第三子群落将包含10,000份拷贝的同一细胞表面标记物等。将水凝胶颗粒的群落的各细胞表面标记物荧光染色，并检测各子群落中的水凝胶颗粒。鉴于此，对于具有各细胞标记物的靶细胞，水凝胶颗粒的子群落可用于产生荧光发射的标准曲线。细胞表面标记物可以是其提供的任何细胞表面标记物，或其结合区，或本领域技术人员已知的细胞表面标记物。
本申请的水凝胶颗粒在例如染色和通过流式细胞计数法或FACS进行分析等过程中的行为相似于靶细胞。例如，在一种实施方式中，水凝胶颗粒具有的一种或多种光学性质基本上类似于表1、表2或表3中陈列的细胞类型之一。
在一些实施方式中，靶细胞是免疫细胞。免疫细胞的非限制性实例包括B淋巴细胞，也称为B细胞，T淋巴细胞，也称为T细胞，自然杀伤(NK)细胞，淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞，单核细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，粒细胞，肥大细胞，血小板，朗格汉斯细胞，干细胞，树突状细胞，外周血单核细胞，肿瘤浸润(TIL)细胞，基因修饰的免疫细胞，包括杂交瘤，药物修饰的免疫细胞，以及本申请列出的任何细胞类型的衍生物、前体或祖细胞。
在一些实施方式中，靶细胞包括具有共享属性的特定类别细胞的所有细胞。例如，靶细胞可以是淋巴细胞，包括NK细胞、T细胞、和B细胞。靶细胞可以是激活的淋巴细胞。
在一些实施方式中，靶细胞是原代细胞，培养细胞，建成细胞，正常细胞，转化细胞，受感染细胞，稳定转染的细胞，瞬时转染的细胞，增殖细胞，或分化终末细胞。
在一种实施方式中，靶细胞是原代神经元细胞。多种神经元均可以是靶细胞。作为非限制性实例，靶细胞可以是原代神经元；建成神经元；转化神经元；稳定转染的神经元；或运动或感觉神经元。
在其它实施方式中，靶细胞选自：原发性淋巴细胞，单核细胞，和粒细胞。
靶细胞本质上可以是任何类型的细胞，包括原核细胞和真核细胞。
适宜的原核靶细胞包括但不限于，细菌例如大肠杆菌(E.coli)，各种芽孢杆菌属，和极端微生物细菌例如嗜热生物。
适宜的真核靶细胞包括但不限于，真菌例如酵母和丝状真菌，包括以下属种：酵母属(Saccharomyces)，曲霉属(Aspergillus)，木霉属(Trichoderma)，和链孢霉属(Neurospora)；植物细胞，包括来自以下植物的那些：玉米(com)，高粱，烟草，低芥酸油菜，大豆，棉花，番茄，马铃薯，首蓿，向日葵等；和动物细胞，包括鱼类、鸟类和哺乳动物。适宜的鱼类细胞包括但不限于来自以下物种的那些：鲑鱼，鳟鱼，罗非鱼，金枪鱼，鲤鱼，比目鱼，大比目鱼，旗鱼，鳕鱼和斑马鱼。适宜的鸟类细胞包括但不限于以下动物的细胞：鸡，鸭，鹌鹑，雉和火鸡，和其它丛林竞技或游戏鸟类。适宜的哺乳动物细胞包括但不限于来自以下动物的细胞：马，奶牛，水牛，鹿，绵羊，兔子，啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠，山羊，猪，灵长目动物，海洋哺乳动物，包括海豚和鲸鱼，以及细胞系，例如任何组织或干细胞类型的人细胞系，和干细胞，包括全能和非全能细胞，和非人类受精卵。
适宜的细胞也包括涉及在众多疾病状态(即使还处于非疾病状态)中的那些细胞类型。因此，适宜的真核细胞类型包括但不限于，所有类型的肿瘤细胞(例如，黑色素瘤，骨髓性白血病，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，结肠癌，肾癌，前列腺癌，胰腺癌和睾丸癌)，心肌细胞，树突状细胞，内皮细胞，上皮细胞，淋巴细胞(T细胞和B细胞)，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，血管内膜细胞，巨噬细胞，自然杀伤细胞，红血球，肝细胞，白细胞(包括单核白细胞)，干细胞例如造血干细胞、神经肝细胞、皮肤肝细胞、肺肝细胞、肾肝细胞、肝肝细胞和心肌干细胞(用于筛选分化因子和去分化因子)，破骨细胞，软骨细胞和其它结缔组织细胞，角化细胞，黑色素细胞，肝细胞，肾细胞，和脂肪细胞。在某些实施方式中，细胞是是原发疾病状态细胞，例如原发肿瘤细胞。适宜的细胞也包括已知的研究细胞，包括但不限于，Jurkat T细胞，NIH3T3细胞，CHO，COS等。参见ATCC细胞系目录，其明确并入本申请以作参考。
在一些实施方式中，靶细胞是肿瘤微囊泡或肿瘤大多孔室脂质体。肿瘤细胞微泡也称为肿瘤分泌的微囊泡或肿瘤分泌的外泌体，其可见于循环血液中并且具有免疫抑制活性。肿瘤细胞微泡的直径尺寸通常为30-200nm。较大的肿瘤微囊泡可以称为肿瘤大囊泡，且直径尺寸可以为3-10μm。
本申请所述的水凝胶颗粒可以用于本领域技术人员已知的任何流式细胞仪。例如，以下表9中给出的一个或多个流式细胞仪可用于本申请所述的水凝胶和试验。
Figure BDA0003534811680001431
Figure BDA0003534811680001441
Figure BDA0003534811680001451
Figure BDA0003534811680001461
Figure BDA0003534811680001471
实施例
通过参照以下实施例来进一步说明本发明。但是，应该注意的是，这些实施例与上述实施方式一样是说明性的，并不应以任何方式解释为对本发明的范围进行限制。
实施例1：产生水凝胶颗粒
紫外光刻法的光掩模得自CADart Services Inc.且使用AutoCad(AutoDesk，Inc.)设计。使用校准紫外光源(OAI，Inc.)将SU-8光刻抗蚀剂(Microchem，Inc.)在4″硅片上光交联，以产生微流体装置制造的掩模。PDMS(聚二甲基硅氧烷，Sigma Aldrich，Inc.)使用软光刻法和微流体装置制造的标准公开方法(参见，McDonald JC，et al.，2000，Electrophoresis 21：27-40)制备和成型。
液滴使用流动聚焦几何形成，其中两个油通道汇聚单体水性溶液的中心流，从而打破油包水乳液中的液滴。对于液滴形成，氟碳化合物油(Novec 7500 3M，Inc.)用作外部的连续相液体。为使液滴在聚合前稳定，将表面活性剂以0.5％w/w添加到油相(Krytox 157FSH的羧酸铵盐，Dupont)。为制备碱性聚丙烯酰胺凝胶颗粒，使用单体水性溶液的中心相，该水溶液包含N-丙烯酰胺(1-20％w/v)、交联剂(N，N′-双丙烯酰胺，0.05-1％w/v)、促进剂、和过硫酸铵(1％w/v)。将促进剂(N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(2％vol％)添加到油相中，以便于在液滴形成之后触发水凝胶颗粒聚合。
将几种共聚单体添加到碱性凝胶制剂中以增加官能度。在凝胶形成之后，烯丙基胺为二次标记提供伯胺基团。我们通过添加共聚单体丙烯酸烯丙基酯和甲基丙烯酸烯丙基酯来调节凝胶的折射率，从而调节前向散射。液滴的侧向散射如下调节：在聚合之前将二氧化硅纳米粒子和/或PMMA(聚(甲基丙烯酸甲酯))颗粒(～100nm)的胶状悬浮体添加到中心水相。
水凝胶颗粒的化学计量倍增通过利用共聚单体实现，所述共聚单体包含用于二次标记的化学正交侧基(胺，羧基，马来酰亚胺，环氧化物，炔烃等)。
以5kHz的平均速率形成液滴，将其在氟碳化合物油相中收集。聚合在50℃进行30分钟，将所得水凝胶颗粒从油相洗涤到水性溶液中。
实施例2：12 11m水凝胶颗粒的产生和显像
使包含5％丙烯酰胺、0.25％双丙烯酰胺、0.05％烯丙基胺、和0.1％过硫酸铵的水流过中心通道，并由包含0.1％TEMED的油汇聚穿过10微米喷嘴，以制得10μm水凝胶颗粒，如图3A所示。聚合之后，将颗粒在水中洗涤，如图3B所示，并将其缀合于相关的染料。荧光水凝胶颗粒用荧光显微镜显像，如图3C所示。
实施例3：水凝胶颗粒光学性质的多维调节
如图4所述，在多个维度上调节水凝胶颗粒，以匹配不同于聚苯乙烯小珠的具体细胞类型。使用光学参数例如FSC和SSC(图4A)或二次标记物的组合将细胞去卷积。调节水凝胶颗粒以匹配不同于聚苯乙烯小珠(棕色)的具体细胞类型SSC和FSC，其在尺寸(FSC)和侧向散射上是有限度的(图4B)。水凝胶颗粒用化学计量比调节的具体化学侧基和二次标记物进一步官能化，从而使细胞类型精确匹配，而又不会损害生物噪声，依然与固定细胞系行为一样(图4C)。
实施例4：流式细胞仪延迟时间与水凝胶颗粒直径的关系
如图5所示，流式细胞仪的液滴间延迟可与水凝胶颗粒直径精确相关。所示数据为当使用流式细胞仪喷嘴尺寸为70至100μm时，直径为3μm、6μm、10μm、32μm、和50μm的水凝胶颗粒。
实施例5：含有包封的DNA的水凝胶颗粒与细胞的比较
为形成含有包封的DNA的水凝胶颗粒，将40μg/mL-1000μg/mL的重组小牛胸腺DNA添加到包含20％在水中的19∶1(丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)和0.1％烯丙基胺的聚合物混合物中。在液滴形成前，将0.4％过硫酸铵添加到混合物中。水凝胶颗粒按照实施例1所述形成。当使用商业成像细胞仪和使用碘化丙锭显像时，含有200μg/mL包封的小牛胸腺DNA的水凝胶颗粒显示出细胞样的染色，并将其与使用相同过程染色的中国仓鼠卵巢细胞进行比较。图像使用Nexcelom CellometerTM获得(图6)。
将得自颊粘膜拭子的细胞在PBS中洗涤并用碘化丙锭染色。平行地，包含一系列DNA浓度的水凝胶颗粒的各群落也以相同方式染色。细胞和颗粒悬浮液都在流式细胞仪(488/590nm激发/发射)上分析。面颊细胞和相同量程的包封的DNA颗粒的流式细胞计数法分析表明，颗粒显示出一系列细胞样的荧光性质(图7，左图)。染色的强度显示与中位强度线性相关，通过流式细胞计数法测得(图7，右图)。
实施例6：调节水凝胶颗粒侧向散射
将硅胶以12.5％、6.25％、3.125％和0％添加到聚合物混合物的水性部分，水凝胶颗粒按照实施例1所述形成。前向散射和侧向散射数据使用流式细胞仪获得。结果表明，侧向散射信号(图8，左图)随着包封的纳米粒子的百分增高会增加，而前向散射(图8，右图)总体保持未变，表明与侧向散射和前向散射的调节无关。
实施例7：调节水凝胶颗粒前向散射
在该实验中，在10至40％的范围内改变丙烯酰胺：双丙烯酰胺在水凝胶组合物中的百分比，以调节水凝胶颗粒的折射率，通过在流式细胞仪中的前向散射测得。如图9所示，前向散射随着丙烯酰胺：双丙烯酰胺相对于的百分比增加而增加。
实施例8：调节水凝胶颗粒光学性质
调节水凝胶颗粒以匹配所需细胞亚型的光学性质的实例。可以将共聚单体与纳米粒子组合以在流式细胞仪中使用被动光学测量调节水凝胶的前向散射和侧向散射两种性质。通过将这些性质与化学不稳定的共聚单体(例如烯丙基胺，丙烯酸)组合，可以增加和标记(如果需要)另外的荧光团/蛋白质/生物侧基，以便于除了散射性质之外还匹配细胞子群落染色。这些是三种主要的可利用流式细胞计数法确定细胞的度量。另外的侧基例如包含重金属的那些可以用于例如Cy-TOF(细胞计数法，飞行时间质谱)标定。最后，可以包封生物相容材料以模拟亚细胞细胞器染色。
实施例9：调节水凝胶颗粒光学性质
将50nm纳米粒子胶状悬浮体结合到水凝胶基质中以模拟淋巴细胞和单核细胞的光学性质(图13A和13B)。改变悬浮体的百分比组成以匹配来自血液样本对照的血细胞子群落(Streck)(图13C)。
特别地，调节水凝胶颗粒的丙烯酰胺单体浓度(0.7-0.8M)以增加颗粒的前向散射，从而匹配血细胞子群落。也可以改变双丙烯酰胺交联剂的百分比来影响前向散射(1-5％)。二氧化硅纳米粒子以5％或10％用于组合物来调节侧向散射。该实验的结果显示于图13。
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本申请通篇引用的所有文件、专利、专利申请、出版物、产品说明书、和规程完全并入本申请以作参考，用于所有目的。
本说明书中例证和讨论的实施方式仅意在以发明人所知的最好方式教导本领域技术人员制备和使用本发明。在不背离本发明的情况下，上述本发明实施方式的修改和变型也是可行的，本领域技术人员根据以上教导是可以知晓的。因此应该理解的是，在权利要求及其等价物的范围内，本发明可以按没有具体说明的方式实践。

Claims (10)

1.一种水凝胶颗粒的群体，每个水凝胶颗粒包括：
(i)包括聚合的单体和共聚单体的聚合物；
(ii)一种或多种生物分子；和
(iii)包封在所述水凝胶中的纳米粒子，
其中所述水凝胶颗粒的群体具有基本上相似于靶细胞的对应性质的光学性质，所述光学性质由共聚单体、单体与共聚单体的比率或包封的纳米粒子提供。
2.根据权利要求1所述的水凝胶颗粒的群体，其中所述聚合的单体为乳酸，乙醇酸，丙烯酸，甲基丙烯酸1-羟基乙基酯，甲基丙烯酸乙基酯，甲基丙烯酸2-羟基乙基酯(HEMA)，甲基丙烯酸丙二醇酯，丙烯酰胺，N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸缩水甘油酯，甲基丙烯酸甘油酯(GMA)，甲基丙烯酸甘油酯，乙二醇，富马酸，甲基丙烯酸2-羟基乙基酯，甲基丙烯酸羟基乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸羟基二乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸甲氧基乙基酯，甲基丙烯酸甲氧基乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸甲氧基二乙氧基乙基酯，聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯，甲氧基-聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸，甲基丙烯酸钠，甲基丙烯酸甘油酯，甲基丙烯酸羟基丙基酯，甲基丙烯酸羟基丁基酯，丙烯酸苯基酯，甲基丙烯酸苯基酯，丙烯酸苄基酯，甲基丙烯酸苄基酯，丙烯酸2-苯基乙基酯，甲基丙烯酸2-苯基乙基酯，丙烯酸2-苯氧基乙基酯，甲基丙烯酸2-苯氧基乙基酯，丙烯酸苯基硫代乙基酯，甲基丙烯酸苯基硫代乙基酯，丙烯酸2,4,6-三溴苯基酯，甲基丙烯酸2,4,6-三溴苯基酯，丙烯酸五溴苯基酯，甲基丙烯酸五溴苯基酯，丙烯酸五氯苯基酯，甲基丙烯酸五氯苯基酯，丙烯酸2,3-二溴丙基酯，甲基丙烯酸2,3-二溴丙基酯，丙烯酸2-萘基酯，甲基丙烯酸2-萘基酯，丙烯酸4-甲氧基苄基酯，甲基丙烯酸4-甲氧基苄基酯，丙烯酸2-苄氧基乙基酯，甲基丙烯酸2-苄氧基乙基酯，丙烯酸4-氯苯氧基乙基酯，甲基丙烯酸4-氯苯氧基乙基酯，丙烯酸2-苯氧基乙氧基乙基酯，甲基丙烯酸2-苯氧基乙氧基乙基酯，N-苯基丙烯酰胺，N-苯基甲基丙烯酰胺，N-苄基丙烯酰胺，N-苄基甲基丙烯酰胺，N,N-二苄基丙烯酰胺，N,N-二苄基甲基丙烯酰胺，N-二苯基甲基丙烯酰胺，N-(4-甲基苯基)甲基丙烯酰胺，N-1-萘基丙烯酰胺，N-4-硝基苯基丙烯酰胺，N-(2-苯基乙基)丙烯酰胺，N-三苯基甲基丙烯酰胺，N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺，N,N-甲基苯基丙烯酰胺，N,N-苯基苯基乙基丙烯酰胺，N-二苯基甲基甲基丙烯酰胺，N-(4-甲基苯基)甲基甲基丙烯酰胺，N-1-萘基甲基丙烯酰胺，N-4-硝基苯基甲基丙烯酰胺，N-(2-苯基乙基)甲基丙烯酰胺，N-三苯基甲基甲基丙烯酰胺，N-(4-羟基苯基)甲基丙烯酰胺，N,N-甲基苯基甲基丙烯酰胺，N,N'-苯基苯基乙基甲基丙烯酰胺，N-乙烯基咔唑，4-乙烯基吡啶，2-乙烯基吡啶，2-乙烯基吡啶甲基丙烯酰胺，N-烷基丙烯酰胺，N-烷基甲基丙烯酰胺，N,N-二烷基丙烯酰胺，N-[(二烷基氨基)烷基]丙烯酰胺，N-[(二烷基氨基)烷基]甲基丙烯酰胺，丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯或甲基丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯。
3.根据权利要求1所述的水凝胶颗粒的群体，其中所述聚合的单体为丙烯酰胺。
4.根据权利要求1所述的水凝胶颗粒的群体，其中所述共聚单体包含一个或多个能够与染料分子反应的化学侧基。
5.根据权利要求1所述的水凝胶颗粒的群体，其中所述共聚单体是烯丙基胺、丙烯酸烯丙基酯、甲基丙烯酸烯丙基酯、烯丙基醇、异硫氰酸烯丙基酯、烯丙基氯、烯丙基马来酰亚胺或双丙烯酰胺。
6.根据权利要求5所述的水凝胶颗粒的群体，其中所述双丙烯酰胺是N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，N,N'-亚甲基双甲基丙烯酰胺，N,N'-亚乙基双丙烯酰胺，N,N'-亚乙基双甲基丙烯酰胺，N,N'-亚丙基双丙烯酰胺和N,N'-(1,2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺。
7.根据权利要求1所述的水凝胶颗粒的群体，其中所述聚合物包括聚合的丙烯酰胺和双丙烯酰胺。
8.根据权利要求7所述的水凝胶颗粒的群体，其中所述光学性质由丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比率提供。
9.根据权利要求1所述的水凝胶颗粒的群体，其中所述包封的纳米粒子是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)或二氧化硅。
10.根据权利要求1所述的水凝胶颗粒的群体，其中所述包封的纳米粒子是PMMA。
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