CN114907346B - 一种生物碱类化合物、提取物及其在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物化学技术领域，具体公开了一种生物碱类化合物、提取物及其在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的产品中的应用。所述的生物碱类化合物具有式I所示的结构。研究表明：式I所示结构的生物碱类化合物具有十分显著的抗呼吸道合胞病毒活性，且其抗呼吸道合胞病毒活性要优于阳性药利巴韦林；因此，将其作为活性成分用于制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的药物或保健品具有重要的应用价值。

Description

一种生物碱类化合物、提取物及其在制备具有抗呼吸道合胞 病毒作用的产品中的应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种生物碱类化合物、提取物及其在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的产品中的应用。

背景技术

人类呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科的一种包膜负链RNA病毒。呼吸道合胞病毒感染是呼吸道疾病的主要原因，每年导致全世界300多万与呼吸道合胞病毒相关的呼吸系统疾病病例和20万与呼吸道合胞病毒相关的死亡。目前，抗病毒治疗是治疗呼吸道合胞病毒感染的重要选择。利巴韦林是FDA批准的治疗RSV感染的抗病毒药物，是一种针对RNA转录和复制的核苷类似物。然而，过度使用这种药物导致了耐药菌株的出现。因此，需要开发新的抗呼吸道合胞病毒的替代抗病毒分子。

骆驼蓬子为蒺藜科(Zygophyllaceae)骆驼蓬属植物骆驼蓬(Peganum harmalaL.)的干燥成熟种子。骆驼蓬主要分布在新疆、内蒙古、宁夏、青海、甘肃等干旱草原和荒漠地区。骆驼蓬种子是用药历史悠久的名族药材，被列入《中华人民共和国卫生部药品标准》。它被广泛用作中药、维药和蒙药的传统药物，用于治疗关节痛、类风湿性关节炎、坐骨神经痛等。以前对骆驼蓬种子的化学成分研究表明，这种植物含有大量的生物碱成分，具有广泛的生物活性，包括抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗菌活性等。但目前并未报道有从骆驼蓬子中分离得到的生物碱成分从未报道过具有抗呼吸道合胞病毒(RSV)的活性。

此外，生物碱的结构和种类是多种多样的，不同结构的生物碱其抗病毒作用是完全不同的；如某种生物碱具有抗流感病毒作用，但其不一定具有抗呼吸道合胞病毒作用；即使具有抗呼吸道合胞病毒作用，但不同结构的生物碱其抗呼吸道合胞病毒的效果也不一样的；尤其是抗呼吸道合胞病毒作用强于利巴韦林的生物碱更是鲜有报道。因此，提供一种具有抗呼吸道病毒作用的生物碱，尤其是抗呼吸道合胞病毒作用强于利巴韦林的生物碱具有重要的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明提供了一种全新的生物碱类化合物；所述的生物碱类化合物具有十分优异的抗呼吸道合胞病毒作用，其抗呼吸道合胞病毒作用要强于利巴韦林。

本发明的技术方案如下：

一种生物碱类化合物，其具有式I所示的结构：

式I所示结构的生物碱类化合物(简写为PG)，是一种全新的化合物；研究表明：式I所示结构的生物碱类化合物对呼吸道合胞病毒的IC₅₀为5.01±0.14μM；要显著小于阳性药利巴韦林对呼吸道合胞病毒的IC₅₀(8.71±0.95μM)；这说明式I所示结构的生物碱类化合物具有十分显著的抗呼吸道合胞病毒活性，且其抗呼吸道合胞病毒活性要显著优于阳性药利巴韦林；该技术效果是本领域技术人员无法预料的。

本发明还提供了一种上述生物碱类化合物在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的产品中的应用。

由于式I所示结构的生物碱类化合物具有优异的抗呼吸道合胞病毒活性；因此，将其作为活性成分用于制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的产品具有重要的应用价值。

优选地，所述的产品为药物或保健品。

优选地，所述的药物或保健品含有治疗有效量的式I所示结构的化合物和药学上可接受的载体。

优选地，所述的药物或保健品的剂型为散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。

本发明还提供了一种提取物，其含有式I所示的结构的生物碱类化合物。

优选地，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为1％～80％。

进一步优选地，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为5％～50％。

进一步优选地，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为10％～30％。

优选地，所述的提取物为以骆驼蓬子为原料制备得到的提取物。

由于，式I所示结构的生物碱类化合物具有优异的抗呼吸道合胞病毒作用；因此，本领域技术人员可以预料含有式I所示结构的生物碱类化合物同样具有抗呼吸道合胞病毒作用。

本发明还提供了一种上述提取物在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的产品中的应用。

有益效果：本发明提供了一种全新结构的生物碱类化合物；研究表明：式I所示结构的生物碱类化合物具有十分显著的抗呼吸道合胞病毒活性，且其抗呼吸道合胞病毒活性要显著优于阳性药利巴韦林；此外，式I所示结构的生物碱类化合物的SI值达到了15.1，具有更大的安全范围。因此，将其作为活性成分用于制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的药物或保健品具有重要的应用价值。

附图说明

图1为化合物PG化学结构式。

图2为化合物PG的分子编号。

图3为化合物PG对呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用实验结果图；其中，图3A为化合物PG对HEp-2的细胞毒性作用；图3B和图3C为化合物PG和阳性对照药利巴韦林在不同浓度下对呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用；图3D为化合物PG在不同时间对呼吸道合胞病毒(RSV)增殖作用的影响；图3E为免疫荧光技术检测化合物PG在不同浓度下对代表病毒的F蛋白表达的影响。

图4为化合物PG的高分辨质谱。

图5为化合物PG的紫外光谱(溶于甲醇)。

图6为化合物PG的外红光谱(KBr压片)。

图7为化合物PG的核磁共振¹H谱(600MHz，溶于DMSO)。

图8为化合物PG的核磁共振¹³C谱(150MHz，溶于DMSO)。

图9为化合物PG的核磁共振DEPT-135谱(150MHz，溶于DMSO)。

图10为化合物PG的核磁共振¹H-¹H COSY谱(150MHz，溶于DMSO)。

图11为化合物PG的核磁共振HSQC谱(150MHz，溶于DMSO)。

图12为化合物PG的核磁共振HMBC谱(150MHz，溶于DMSO)。

图13为化合物PG的核磁共振NOESY谱(150MHz，溶于DMSO)。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1

将干燥的15.0kg骆驼蓬子药材粉碎，常温下用95％乙醇冷浸提取得总提取物1.6kg。为了富集其提取物中的生物碱成分，将总提取物经过“酸提碱沉”的方法处理，得到378.0g的总生物碱成分。将总生物碱成分经200-300目硅胶柱层析，用CH₂Cl₂-MeOH系统梯度洗脱(1000:0→0:1)，根据TLC检视进行合并，得到7个馏分(Fr.A-G)。取Fr.D(27.5g)馏分以甲醇/水(0:100→100:0)为流动相经ODS柱层析进行梯度洗脱，根据TLC检视进行合并，得到5个子馏分(Fr.D1-5)，Fr.D3(5.1g)再经制备型HPLC(以甲醇-水-氨水为流动相，按体积比甲醇：水：氨水＝60:40:0.01进行等度洗脱，收集保留时间t_R＝16.2min的色谱峰对应的馏分)制备得到化合物PG，即式I所示结构的生物碱类化合物。

结构鉴定依据：

化合物PG的结构，通过分析高分辨质谱(HRESIMS)、红外光谱(IR)、一维和二维核磁共振谱(NMR)得到。

用高分辨质谱HRESIMS:m/z测定分子量255.1126[M+H]⁺(理论值：255.1128)，显示分子式为C₁₅H₁₄N₂O₂。

用红外光谱法，测定结果数据显示存在氨基(3441cm^-1)和苯环(1625,1453cm^-1)。

表1.化合物PG的一维和二维核磁波谱数据(DMSO,δin ppm,J in Hz)

核磁共振氢谱(¹H NMR)的数据及归属，见表1。数据显示化合物PG有一个AMX自旋系统[δ_H 8.15(1H,d,J＝8.7Hz),7.30(1H,d,J＝2.2Hz),6.91(1H,dd,J＝8.7,2.2Hz)]，两个烯烃质子信号[δ_H 8.44(1H,d,J＝4.9Hz),8.29(1H,d,J＝4.9Hz)]，一个甲氧基的氢质子信号[δ_H 3.86(3H,s)]和一个乙基质子信号[δ_H3.33(2H,q,J＝7.3Hz),1.19(3H,t,J＝7.3Hz)]。

根据核磁共振碳谱(¹³C NMR)的数据及归属，见表1。数据显示化合物PG具有7个季碳(包含两个连氧的)、5个叔碳、1个仲碳和2个伯碳(包含一个连氧的)，共15个碳信号。

二维核磁共振谱的数据及结合关系见表1。

化合物PG的分子编号如图2所示。

实验例2化合物PG抗呼吸道合胞病毒活性测试

1.用MTT法测定化合物的细胞毒性，将1.5×10⁴个细胞置于96孔平板中，在37℃温度下于5％CO₂培养箱中培养18h；

2.加入含有不同浓度的化合物(100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM)的琼脂覆盖物培养；

3.细胞培养48h后，用MTT法处理4h；

4.随后，去除上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)溶解蓝紫色结晶甲瓒；

5.在570nm处测量吸光度,根据细胞存活率的非线性回归分析得到50％的细胞毒性浓度(CC₅₀)；

6.以最大无细胞毒性浓度(MNCC)为第一浓度，检测化合物的抗病毒活性；

7.细胞悬浮液(每孔1.5×10⁴个细胞)接种于96孔板中的每孔；

8.18h后，用RSV病毒和不同浓度的化合物PG处理单层HEp-2细胞，培养72h；

9.通过显微镜观察每孔合胞体的病变程度，通过观察评价其抑制半数CPE的浓度，即为半数最大抑制浓度(IC₅₀)。

10.用等体积RSV病毒(MOI＝0.1)和40μM化合物PG的混合液处理单层HEp-2细胞。采用利巴韦林(40μm)作为阳性对照。培养24h后，用抗RSV F抗体染色HEp-2细胞，荧光显微镜观察细胞荧光强度。

表2.化合物PG抗呼吸道合胞病毒活性

从表2实验数据可以看出，式I所示结构的化合物PG对呼吸道合胞病毒的IC₅₀为5.01±0.14μM；远远小于阳性药利巴韦林对呼吸道合胞病毒的IC₅₀(8.71±0.95μM)；这说明式I所示结构的化合物PG具有十分显著的抗呼吸道合胞病毒活性，且其抗呼吸道合胞病毒活性要显著优于阳性药利巴韦林；该技术效果是本领域技术人员无法预料的。

此外，从表2实验数据可以看出，化合物PG对呼吸道合胞病毒的SI值达到了15.1，远远大于最低标准1.00，这说明将化合物PG用于制备抗呼吸道合胞病毒的药物，具有更大的安全范围。

进一步地，图3A显示化合物PG对Hep-2细胞的细胞毒性(CC₅₀)为75.81±1.75μm。用不同滴度的RSV病毒感染Hep-2细胞(MOI＝0.1,1或5)评价化合物PG对高滴度病毒感染的耐受性(图3B)。然后，在无毒浓度下，斑块抑制实验测试化合物PG对呼吸道合胞病毒的抑制(图3C)。结果表明，化合物PG和RSV病毒同时作用于Hep-2细胞，可显著降低病毒产量，且具有浓度依赖性。病毒产量测定(图3D)表明，呼吸道合胞病毒(RSV)感染后第3天，子代病毒数量达到平台。在1d-4d时间内，化合物PG(40μm)对呼吸道合胞病毒(RSV)有明显的抑制作用。这些数据表明，化合物PG的抗呼吸道合胞病毒效果不是由于细胞毒性。绿色荧光代表病毒的F蛋白，在病毒组中观察到高水平的F蛋白。加入化合物PG后，与呼吸道合胞病毒感染相关的绿色荧光显著降低(图3E)。根据上述数据，表明不同滴度的化合物PG均能显著抑制呼吸道合胞病毒感染。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

Claims (11)

1.一种生物碱类化合物，其特征在于，具有式I所示的结构：

2.权利要求1所述的生物碱类化合物在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的产品为药物或保健品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物或保健品含有治疗有效量的式I所示结构的化合物和药学上可接受的载体。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物或保健品的剂型为散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。

6.一种提取物，其特征在于，含有式I所示的结构的生物碱类化合物；

7.根据权利要求6所述的提取物，其特征在于，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为1％～80％。

8.根据权利要求7所述的提取物，其特征在于，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为5％～50％。

9.根据权利要求8所述的提取物，其特征在于，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为10％～30％。

10.根据权利要求6所述的提取物，其特征在于，所述的提取物为以骆驼蓬子为原料制备得到的提取物。

11.权利要求6～10任一项所述的提取物在制备具有抗呼吸道合胞病毒作用的产品中的应用。

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