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CN119285615A - 一种生物碱类化合物在制备具有抗ⅱ型单纯疱疹病毒作用的产品中的应用 - Google Patents

一种生物碱类化合物在制备具有抗ⅱ型单纯疱疹病毒作用的产品中的应用 Download PDF

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CN119285615A
CN119285615A CN202411373914.2A CN202411373914A CN119285615A CN 119285615 A CN119285615 A CN 119285615A CN 202411373914 A CN202411373914 A CN 202411373914A CN 119285615 A CN119285615 A CN 119285615A
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alkaloid compound
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吴忠南
张少杰
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Guangdong Medical University
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Guangdong Medical University
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Abstract

本发明涉及药物化学技术领域，具体公开了一种生物碱类化合物在制备具有抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用的产品中的应用。所述的生物碱类化合物具有式I所示的结构。研究表明：式I所示结构的生物碱类化合物具有十分显著的抗Ⅱ型单纯疱疹病毒活性，且其抗Ⅱ型单纯疱疹病毒活性要优于阳性药阿昔洛韦；因此，将其作为活性成分用于制备具有抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用的药物或保健品具有重要的应用价值。

Description

一种生物碱类化合物在制备具有抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用的 产品中的应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种生物碱类化合物在制备具有抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用的产品中的应用。
背景技术
Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)是疱疹病毒科α病毒亚科的线性双链DNA病毒。其容易通过感染泌尿、生殖器及肛周部位皮肤黏膜引起慢性、炎性、易复发、难治愈的性传播疾病，即生殖器疱疹。据WHO统计，在全球15～49岁人群中，有5.36亿人感染HSV-2，每年新增加的感染病例多达2300万例。男女双方都有感染可能，其中女性HSV-2感染率高达30％～80％，男性为10％～50％。此外，HSV-2病毒感染所造成的生殖道黏膜损伤，可增加艾滋病病毒、梅毒螺旋体等其他病原体的感染风险。临床上阿昔洛韦是主要用于生殖器疱疹的抗病毒药物。但是，临床上长期使用该药物，使编码胸腺嘧啶核苷激酶的UL23基因发生突变，引起耐药性病毒变异株的出现，越来越多的患者对阿昔洛韦产生了耐药性，造成治疗效果不理想。因此，需要开发新的抗Ⅱ型单纯疱疹病毒的替代药物。
天然药物具有作用范围广、安全可靠等优点，正逐渐成为抗病毒药物的研究热点。骆驼蓬子为蒺藜科骆驼蓬属植物骆驼蓬(Peganum harmala L.)的干燥成熟种子，又名苦苦菜、沙蓬豆豆、阿地热斯忙(维药名)、乌姆希-乌布斯(蒙药名)等。骆驼蓬子入药历史悠久，具有宣肺气、止咳平喘、祛风湿、消肿毒的功效。临床上用于治疗咳嗽气喘、风湿痹痛、无名肿毒、皮肤瘙痒等症。现代药学研究表明骆驼蓬子提取物具有抗病毒、抗肿瘤、抑菌、抗炎、抗氧化等多种药理活性，其中富含的生物碱成分是其发挥药理作用的主要药效物质基础。
发明内容
为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明提供了一种全新的生物碱类化合物；所述的生物碱类化合物具有十分优异的抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用，其抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用要强于阿昔洛韦。
本发明的技术方案如下：
一种生物碱类化合物，其具有式I所示的结构：
式I所示结构的生物碱类化合物(简写为PF)，是一种全新的化合物；研究表明：式I所示结构的生物碱类化合物对呼吸道合胞病毒的IC50为0.90±0.10μM；要显著小于阳性药阿昔洛韦对呼吸道合胞病毒的IC50(1.12±0.15μM)；这说明式I所示结构的生物碱类化合物具有十分显著的抗Ⅱ型单纯疱疹病毒活性，且其抗Ⅱ型单纯疱疹病毒活性要显著优于阳性药阿昔洛韦；该技术效果是本领域技术人员无法预料的。
本发明还提供了一种上述生物碱类化合物的制备方法，其以骆驼蓬子为原料，从中提取分离得到。
本发明首次从骆驼蓬子中分离出式I所示结构的生物碱类化合物；为式I所示结构的生物碱类化合物的制备提供了一种全新的方法。
优选地，所述的制备方法包含如下步骤：
(1)取骆驼蓬籽药材并粉碎，采用乙醇进行冷浸提得总提取物；
(2)将提取物进行“酸提碱沉”的处理步骤，得总生物碱成分；
(3)将总生物碱上D101大孔树脂柱进行分离，得大孔树脂洗脱馏分；
(4)将大孔树脂洗脱馏分上ODS柱进行分离得ODS洗脱馏分；
(5)ODS洗脱馏分再次经过HPLC制备得式I所示结构的生物碱类化合物。
本发明还提供了一种提取物，其含有式I所示的结构的生物碱类化合物。
由于，式I所示结构的生物碱类化合物具有优异的抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用；因此，本领域技术人员可以预料含有式I所示结构的提取物同样具有抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用。
优选地，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为1％～80％。
优选地，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为5％～50％；
进一步优选地，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为10％～30％。
优选地，所述的提取物为以骆驼蓬子为原料制备得到的提取物。
本发明还提供了一种上述生物碱类化合物或提取物在制备具有抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用的产品中的应用。
优选地，所述的产品为药物或保健品。
优选地，所述的药物或保健品含有治疗有效量的式I所示结构的化合物和药学上可接受的载体。
优选地，所述的药物或保健品的剂型为散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。
有益效果：本发明提供了一种全新结构的生物碱类化合物；研究表明：式I所示结构的生物碱类化合物具有十分显著的抗Ⅱ型单纯疱疹病毒活性，且其抗Ⅱ型单纯疱疹病毒活性要显著优于阳性药阿昔洛韦；此外，式I所示结构的生物碱类化合物的SI值达到了86.2，具有更大的安全范围。因此，将其作为活性成分用于制备具有抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用的药物或保健品具有重要的应用价值。
附图说明
图1为化合物PF化学结构式。
图2为化合物PF的分子编号。
图3为化合物PF对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)的抑制作用实验结果图；其中，图3A为化合物PF对Vero的细胞毒性作用；图3B和图3C为化合物PF和阳性对照药阿昔洛韦在不同浓度下对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)的抑制作用；图3D为化合物PF在不同时间对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)增殖作用的影响；
图4为化合物PF的高分辨质谱。
图5为化合物PF的紫外光谱(溶于甲醇)。
图6为化合物PF的外红光谱(KBr压片)。
图7为化合物PF的核磁共振1H谱(600MHz，溶于DMSO)。
图8为化合物PF的核磁共振13C谱(150MHz，溶于DMSO)。
图9为化合物PF的核磁共振DEPT-135谱(150MHz，溶于DMSO)。
图10为化合物PF的核磁共振1H-1H COSY谱(150MHz，溶于DMSO)。
图11为化合物PF的核磁共振HSQC谱(150MHz，溶于DMSO)。
图12为化合物PF的核磁共振HMBC谱(150MHz，溶于DMSO)。
图13为化合物PF的核磁共振NOESY谱(150MHz，溶于DMSO)。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1
(1)取15.0公斤干燥骆驼蓬籽药材并粉碎，采用95％乙醇以进行冷浸提，共制备出总提取物1.6公斤；
(2)为进一步浓缩生物碱成分，对总提取物实施了“酸提碱沉”的处理步骤，最终获得378克总生物碱成分；所述的“酸提碱沉”的步骤具体为：将总提取物分散在2L水中，以稀盐酸调节溶液pH至2，后加入两倍体积的二氯甲烷，萃取三次，弃去萃取物。然后以25％氨水调节酸液的pH至9，后加入两倍体积的二氯甲烷，萃取三次，得到萃取物，即总生物碱；
(3)将总生物碱上D101大孔树脂柱，先用体积比为10:90的乙醇/水混合溶剂进行洗脱，弃去该洗脱液；接着再用体积比为30:70的乙醇/水混合溶剂进行洗脱，收集该洗脱液，浓缩干燥后得大孔树脂洗脱馏分；
(4)将大孔树脂洗脱馏分上ODS柱，先用体积比为80:20的甲醇/水溶剂进行洗脱，弃去该洗脱液；接着再用体积比为体积比为90:10的甲醇/水溶剂进行洗脱，收集该洗脱液，浓缩干燥后得ODS洗脱馏分；
(5)ODS洗脱馏分再次经过HPLC(采用C18反相制备型色谱柱，以甲醇-水-氨水为流动相，按体积比甲醇：水：氨水＝38:62:0.01进行等度洗脱，收集保留时间tR＝21.2min的色谱峰对应的馏分)制备得到化合物PF，即式I所示结构的生物碱类化合物。
结构鉴定依据：
化合物PF的结构，通过分析高分辨质谱(HRESIMS)、红外光谱(IR)、一维和二维核磁共振谱(NMR)得到。
用高分辨质谱HRESIMS:m/z测定分子量355.1276[M+Na]+(理论值：355.1264)，显示分子式为C17H20N2O5。
用红外光谱法，测定结果数据显示存在氨基(3392cm-1)和苯环(1612,1464cm-1)。
表1.化合物PF的一维和二维核磁波谱数据(DMSO,δin ppm,J in Hz)
核磁共振氢谱(1H NMR)的数据及归属，见表1。数据显示化合物PF有一个AMX自旋系统[δH 7.20(1H,d,J＝8.2),6.52(1H,dd,J＝8.2,2.0),6.39(1H,d,J＝2.0)]，一个甲氧基的氢质子信号[δH 3.86(3H,s)]和两个甲基质子信号[δH1.14(1H,s),1.12(1H,s)]。
根据核磁共振碳谱(13C NMR)的数据及归属，见表1。数据显示化合物PF具有8个季碳(包含五个连氧的)、3个叔碳、3个仲碳和3个伯碳(包含一个连氧的)，共17个碳信号。
二维核磁共振谱的数据及结合关系见表1。
化合物PF的分子编号如图2所示。
实验例2化合物PF抗Ⅱ型单纯疱疹病毒活性测试
1.用MTT法测定化合物的细胞毒性，将1.5×104个细胞置于96孔平板中，在37℃温度下于5％ CO2培养箱中培养18h；
2.加入含有不同浓度的化合物(100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM)的琼脂覆盖物培养；
3.细胞培养48h后，用MTT法处理4h；
4.随后，去除上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)溶解蓝紫色结晶甲瓒；
5.在570nm处测量吸光度,根据细胞存活率的非线性回归分析得到50％的细胞毒性浓度(CC50)；
6.以最大无细胞毒性浓度(MNCC)为第一浓度，检测化合物的抗病毒活性；
7.细胞悬浮液(每孔1.5×104个细胞)接种于96孔板中的每孔；
8.18h后，用HSV-2病毒和不同浓度的化合物PF处理单层Vero细胞，培养72h；
9.通过显微镜观察每孔合胞体的病变程度，通过观察评价其抑制半数CPE的浓度，即为半数最大抑制浓度(IC50)。
10.最终，计算出化合物抑制HSV-2的选择性指数(SI＝CC50/IC50)。
表2.化合物PF抗Ⅱ型单纯疱疹病毒活性
从表2实验数据可以看出，式I所示结构的化合物PF对呼吸道合胞病毒的IC50为0.90±0.10μM；小于阳性药阿昔洛韦对呼吸道合胞病毒的IC50(1.12±0.15μM)；这说明式I所示结构的化合物PF具有十分显著的抗Ⅱ型单纯疱疹病毒活性，且其抗Ⅱ型单纯疱疹病毒活性要显著优于阳性药阿昔洛韦；该技术效果是本领域技术人员无法预料的。
此外，从表2实验数据可以看出，化合物PF对呼吸道合胞病毒的SI值达到了86.2，远远大于最低标准10.0，这说明将化合物PF用于制备抗Ⅱ型单纯疱疹病毒的药物，具有更大的安全范围。
进一步地，图3A显示化合物PF对Vero细胞的细胞毒性(CC50)为77.59±1.33μM。用不同滴度的HSV-2病毒感染Vero细胞(MOI＝0.1,1或5)评价化合物PF对高滴度病毒感染的耐受性(图3B)。然后，在无毒浓度下，斑块抑制实验测试化合物PF对呼吸道合胞病毒的抑制(图3C)。结果表明，化合物PF和HSV-2病毒同时作用于Vero细胞，可显著降低病毒产量，且具有浓度依赖性。病毒产量测定(图3D)表明，Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)感染后第3天，子代病毒数量达到平台。在1d-4d时间内，化合物PF(40μM)对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)有明显的抑制作用。这些数据表明，不同滴度的化合物PF均能显著抑制Ⅱ型单纯疱疹病毒感染。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

Claims (10)

1.一种生物碱类化合物，其特征在于，具有式I所示的结构：
2.权利要求1所述的生物碱类化合物的制备方法，其特征在于，以骆驼蓬子为原料，从中提取分离得到。
3.一种提取物，其特征在于，含有式I所示的结构的生物碱类化合物。
4.根据权利要求3所述的提取物，其特征在于，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为1％～80％。
5.根据权利要求4所述的提取物，其特征在于，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为5％～50％；
进一步优选地，提取物中式I所示结构的生物碱类化合物的质量分数为10％～30％。
6.根据权利要求3所述的提取物，其特征在于，所述的提取物为以骆驼蓬子为原料制备得到的提取物。
7.权利要求1所述的生物碱类化合物或权利要求3～6任一项所述的提取物在制备具有抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的产品为药物或保健品。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物或保健品含有治疗有效量的式I所示结构的化合物和药学上可接受的载体。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物或保健品的剂型为散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。
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