CN114606225A - 一种基于磁珠法的口腔拭子人类基因组dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基因组DNA提取技术领域的一种基于磁珠法的口腔拭子人类基因组DNA提取方法，其特征在于：所述提取方法是基于磁珠法提取人类基因组DNA，去除抑制性物质残留，获取高纯度的DNA，口腔拭子样本通过在高效的裂解液和蛋白酶K的作用下裂解消化，将DNA释放到裂解液中；加入独特的结合磁珠使其与DNA特异性结合，在75％乙醇溶液洗涤中将该体系中的蛋白质和其余杂质去除，留下磁珠上结合的DNA，最后DNA在水溶液或低盐缓冲液中进行洗脱，得到的DNA可用于后续实验，本发明具有样本获取方便、提取过程无毒无害、提取操作简单、操作时间短和可用于自动化提取等特点。
Description
技术领域
本发明涉及基因组DNA提取技术领域的一种基于磁珠法的口腔拭子人类基因组DNA提取方法。
背景技术
基因组DNA提取是当前分子扩增和检测领域中基本的实验操作之一，口腔黏膜为复层鳞状上皮，由多层细胞组成，基底层具有旺盛的分裂能力，其上皮脱落的细胞与其他组织细胞一样具有完整的基因组DNA，可成为法医学和遗传学DNA多态性检测分型的生物性检验材料；口腔黏膜代谢旺盛，容易脱落，口腔拭子(口腔脱落细胞)采样方法是一种简单、无痛、无创的DNA样本采集方法，该方法适用于采集任何年龄段人群的DNA样本，也适用新生儿、婴幼儿或老弱病残者等不便采血人群。
传统从口腔拭子中提取DNA多采用酚氯仿法或者Chelex-100等方法，存在酚氯仿污染或DNA得率低，纯度差等缺点；采用柱提法存在操作繁琐和用时长等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于磁珠法的口腔拭子人类基因组DNA提取方法，以解决目前传统方法中采用酚氯仿、Chelex-100、柱提法等方法从口腔拭子中提取DNA过程中存在酚氯仿污染、DNA得率低、纯度差或者操作繁琐、用时长等的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于磁珠法的口腔拭子人类基因组DNA提取方法，其特征在于：所述提取方法是基于磁珠法提取人类基因组DNA，去除抑制性物质残留，获取高纯度的DNA，提取方法包括以下步骤：
1)采样
在面颊内擦拭过的拭子或者棉签转置于1.5mL的离心管中，将拭子剪下或者使其脱落，加入300μL裂解液，震荡混匀离心，将200μL液体转移至新的1.5mL离心管中；
2)加10μL蛋白酶K，吹打混匀，56℃，800rpm，孵育30min；
3)室温放置5min后，12000rpm离心2min；
4)将200μL上清转移至含100μL结合磁珠的1.5mL离心管中；
5)涡旋混匀，室温静置孵育5min，短离，将离心管置于磁力架上至溶液澄清；
6)移除上清，向离心管中加入500μL 75％乙醇溶液，在Vortex涡旋混匀仪器剧烈混合，混匀后再将离心管放回磁力架上静置30S；
7)重复步骤6一次；
8)使用移液器移除底部残留乙醇溶液；
9)室温静置2-5min，至磁珠不反光；
10)加入50μL的Nuclease free water/低盐缓冲液，把离心管从磁力架取下，重悬磁珠，室温静置5min；
11)将离心管置于磁力架上2min；
12)用移液器吸取上清液，取出下面的DNA溶液转移到新的1.5ml离心管中；
对上述技术方案做进一步的说明：
所述裂解液组成成分为：
盐酸胍，20-100mM；
Tris缓冲溶液pH8.0，10-50mM；
KCl溶液50-250mM；
EDTA螯合剂pH8.0，10-100mM；
SDS亲水基表面活性剂0.1％-1％；
对上述技术方案做进一步的说明：
所述结合磁珠组成成分为：
GE磁珠100-500μL；
聚乙二醇1-5g；
KCl溶液1-4mM；
Tris缓冲溶液PH8.0，5-25mM。
与现有技术相比，本发明具有样本获取方便、提取过程无毒无害、提取操作简单、操作时间短和可用于自动化提取等特点。
附图说明
图1为一种基于磁珠法的口腔拭子人类基因组DNA提取方法流程图；
图2为提取方法实例比对表。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明：
磁珠法口腔拭子人类基因组DNA提取方法是通过由高效的裂解液和独特的结合磁珠组成的基因组DNA试剂盒提取人类基因组DNA，通过对口腔拭子采集的样本在高效的裂解液和蛋白酶K的作用下裂解消化，进行细胞洗脱，将DNA释放到裂解液中，得到细胞悬浮液，加入独特的结合磁珠(已含特定的反应体系)使其与DNA特异性结合，在75％乙醇洗涤下，将该体系中的蛋白质和其余杂质去除，留下磁珠上结合的DNA，最后DNA在Nuclease freewater/低盐缓冲液中进行洗脱，得到浓度及纯度都高的DNA可用于后续实验。
实施例
实验所需的试剂及仪器
1.基因组DNA试剂盒，试剂盒包括高效的裂解液及独特结合磁珠；
无水乙醇
2.仪器
恒温混匀仪器
磁力架
离心机
移液器
涡旋混匀仪器Vortex
口腔拭子
具体操作步骤
1.裂解液洗脱
在装有口腔拭子样品中的离心管中加入300u L裂解液，震荡混匀离心，将液体转移至新的1.5mL离心管中(约200mL)得混合液一；
2.蛋白酶K消化
往混合液一中加入10uL蛋白酶K，吹打混匀，在56℃，800rpm的转速的条件下孵育30min得混合液二；
3.磁珠纯化
混合液二在室温放置5min后，在12000rpm离心2min，将200uL上清转移至含100uL结合磁珠的1.5mL离心管中，涡旋混匀，室温静置孵育5min，短离，将离心管置于磁力架上至溶液澄清；
4.溶液洗涤：
移除上清，向离心管中加入500uL 75％乙醇溶液，剧烈Vortex，磁力架上30s，重复该步骤一次，即75％乙醇溶液洗涤步骤实施两次，短离，使用移液器移除底部残留乙醇溶液，室温静置2-5min，至磁珠不反光；
5.低盐缓冲液洗脱
加入20-50uL的含Nuclease free water低盐缓冲液，把离心管从磁力架取下，重悬磁珠，室温静置5min，将离心管置于磁力架上2min，用移液器吸取上清液，转移到新的1.5ml离心管中。
基于磁珠法的口腔拭子人类基因组DNA提取方法设计合理，其提取口腔拭子样本的基因组DNA，其A260/280大于1.8，片段完整度高，提取的整个过程不涉及有毒有害试剂，操作过程安全，全程仅需60分钟即可完成高质量DNA的提取，方便便捷快速稳定，而且操作用时短，产物浓度和纯度高，提取的DNA可用于高通量测序实验、酶切、PCR扩增、荧光定量PCR等实验，所述的一种基于磁珠法的口腔拭子人类基因组DNA提取方法值得在口腔拭子样本的基因组DNA提取领域推广与使用。
以上是本发明的较佳实施方式的说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的技术人员在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化均在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种基于磁珠法的口腔拭子人类基因组DNA提取方法，其特征在于：所述提取方法是基于磁珠法提取人类基因组DNA，去除抑制性物质残留，获取高纯度的DNA，包括以下步骤：
1)采样
在面颊内擦拭过的拭子或者棉签转置于1.5mL的离心管中，将拭子剪下或者使其脱落，加入300μL裂解液，震荡混匀离心，将200μL液体转移至新的1.5mL离心管中；
2)加10μL蛋白酶K，吹打混匀，56℃，800rpm，孵育30min；
3)室温放置5min后，12000rpm离心2min；
4)将200μL上清转移至含100μL结合磁珠的1.5mL离心管中；
5)涡旋混匀，室温静置孵育5min，短离，将离心管置于磁力架上至溶液澄清；
6)移除上清，向离心管中加入500μL 75％乙醇溶液，在Vortex涡旋混匀仪器剧烈混合，混匀后再将离心管放回磁力架上静置30S；
7)重复步骤6一次；
8)使用移液器移除底部残留乙醇溶液；
9)室温静置2-5min，至磁珠不反光；
10)加入50μL的Nuclease free water/低盐缓冲液，把离心管从磁力架取下，重悬磁珠，室温静置5min；
11)将离心管置于磁力架上2min；
12)用移液器吸取上清液，取出下面的DNA溶液转移到新的1.5ml离心管中。
2.根据权利要求1所述的一种基于磁珠法的口腔拭子人类基因组DNA提取方法，其特征在于：所述裂解液组成成分为：盐酸胍，20-100mM；
Tris缓冲溶液pH8.0，10-50mM；
KCl溶液50-250mM；
EDTA螯合剂pH8.0，10-100mM；
SDS亲水基表面活性剂0.1％-1％。
3.根据权利要求1所述的一种基于磁珠法的口腔拭子人类基因组DNA提取方法，其特征在于：所述结合磁珠组成成分为：
GE磁珠100-500μL；
聚乙二醇1-5g；
KCl溶液1-4mM；
Tris缓冲溶液PH8.0，5-25mM。
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