CN114438131A - 293细胞的转染方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了293细胞的转染方法，包括以下步骤：将293细胞与待转染物质混合，进行流式电转转染，所述流式电转转染的电压值为100V～300V，脉冲值为1000μs～5000μs，电击次数为1～10次，间隔为100ms～600ms，转染液流速为1mL/min～10mL/min，转染时的所述293细胞的细胞密度为1×105cells/mL～5×107cells/mL；将转染后的293细胞接种到转染培养基进行培养，所述转染培养基中含有L‑酪氨酸、烟酰胺、硫酸镁和氢化可的松，流式电转染条件和转染后营养环境相互配合，可使细胞的转染损伤修复并获得更好的生长环境，实现较高的基因表达强度、细胞密度和细胞存活率。
Description
技术领域
本发明涉及转染培养基技术领域，具体涉及一种293细胞的转染方法。
背景技术
在生物药物研发中，采用较多的是将目的基因质粒转染入宿主细胞进行培养，以期获得目标生物药物。流式电转技术是一种高效的转染技术，在较低电压下即能产生足够强度的均匀电场，可实现高转染率。转染培养基能更好的保护细胞、降低细胞死亡率的同时，显著提高细胞转染率。最初大量使用的宿主细胞是原核表达体系，真核表达体系由于技术问题导致应用受限，不及原核表达体系。近年来，由于技术的进步，加之真核表达体系具有的特有优势，在部分领域开始取代原有的原核体系。例如一些研究机构使用真核293细胞用于生产蛋白药物或其他生物药物。
293细胞(人胚肾细胞，又称为HEK细胞)比较容易转染，是一种很常用的表达研究外源基因的细胞株。而且由于293细胞对蛋白的翻译和修饰功能，使该药物的活性的效价会更好。由于真核细胞和原核细胞的结构区别，使其培养的条件适应性并不相同，所需的转染条件不同，原核细胞转染条件并不适合真核细胞。由于细胞转染过程会引发细胞膜表面的变化，对细胞造成刺激，细胞在转染后是比较脆弱的，转染后细胞的修复和转染物质的表达对于培养环境的要求较高。除了细胞的生长健康状态，不同的转染方法、条件和转染后的培养方法对于转染的效果也起着重要作用。市场上对于真核细胞转染的研究非常有限，尤其是针对真核细胞的流式电转方案的开发更是少之又少。
鉴于此，开发适用于293细胞的流式电转方案很有必要。
发明内容
基于此，本发明提供一种能够实现高效转染的流式电转方法转染293细胞。
本发明的目的在于提供一种293细胞的转染方法，包括以下步骤：
将293细胞与待转染物质混合，进行流式电转转染，所述流式电转转染的电压值为100V～300V，脉冲值为1000μs～5000μs，电击次数为1～10次，间隔为100ms～600ms，转染液流速为1mL/min～10mL/min，转染时的所述293细胞的细胞密度为1×105cells/mL～5×107cells/mL；
将转染后的293细胞接种到转染培养基进行培养，所述转染培养基中含有L-酪氨酸、烟酰胺、硫酸镁和氢化可的松。
在其中一个实施例中，所述流式电转转染的电压值为160V～250V，脉冲值为1000μs～2000μs，电击次数为3～6次，间隔为200ms～400ms，转染液流速为3.5mL/min～5.5mL/min。
在其中一个实施例中，转染时的所述293细胞的细胞密度为1×106cells/mL～5×107cells/mL。
在其中一个实施例中，所述转染培养基为无血清转染培养基，所述转染培养基包含如下浓度的组分：
L-酪氨酸 0.1843g/L～0.396g/L、
天冬酰胺 0.1704g/L～0.1874g/L、
L-胱氨酸 0.3361g/L～0.3697g/L、
L-谷氨酸 0.1722g/L～0.1895g/L、
异亮氨酸 0.1052g/L～0.1157g/L、
亮氨酸 0.1322g/L～0.1454g/L、
甲硫氨酸 0.0903g/L～0.0993g/L、
苯丙氨酸 0.0940g/L～0.1034g/L、
脯氨酸 0.0521g/L～0.0573g/L、
丝氨酸 0.0940g/L～0.1034g/L、
苏氨酸 0.1518g/L～0.1669g/L、
色氨酸 0.4255g/L～0.4680g/L、
缬氨酸 0.1508g/L～0.1659g/L、
氯化胆碱 0.0010g/L～0.0011g/L、
葡萄糖 5.5860g/L～6.1446g/L、
烟酰胺 0.0014g/L～0.0016g/L、
核黄素 0.00015g/L～0.00025g/L、
维生素 B12 0.0009g/L～0.0010g/L、
吡哆醛 0.0112g/L～0.0123g/L、
盐酸硫胺素 0.0033g/L～0.0036g/L、
生物素 0.00025g/L～0.00035g/L、
肌醇 0.0009g/L～0.0010g/L、
氯化钾 0.2346g/L～0.2581g/L、
氯化镁 0.1080g/L～0.1188g/L、
硫酸镁 0.0200g/L～0.0369g/L、
磷酸二氢钠 0.0205g/L～0.0225g/L、
磷酸氢二钠 0.0326g/L～0.0358g/L、
碳酸氢钠 1.8732g/L～2.0605g/L、
七水硫酸锌 0.00055g/L～0.00065g/L、
亚油酸 0.00015g/L～0.00025g/L、
亚硒酸钠 0.00025g/L～0.00035g/L、
氢化可的松 0.0001g/L～0.0002g/L、
硫辛酸 0.0003g/L～0.0004g/L、
丙酮酸钠 0.0633g/L～0.0696g/L。
本发明提供一种293细胞的转染方法，采用流式电转转染，通过设置合适的电转染条件，电压值为100V～300V，脉冲值为1000μs～5000μs，电击次数为1～10次，间隔为100ms～600ms，转染液流速为1mL/min～10mL/min，转染时的所述293细胞的细胞密度为1×105cells/mL～5×107cells/mL，并在流式电转后在合适的转染培养基中进行培养，流式电转条件和转染培养基条件相互配合，能够缓解流式电转的刺激，转染后实现较高的基因表达强度、细胞密度和细胞存活率。
附图说明
图1为本发明实施例1的使用不同无血清转染培养基培养的HEK293细胞表达蛋白的荧光强度图；
图2A为本发明实施例1的使用不同无血清转染培养基培养的HEK293细胞的细胞密度；
图2B为本发明实施例1的使用不同无血清转染培养基培养的HEK293细胞的细胞存活率图；
图3为本发明实施例2～5的使用不同无血清转染培养基培养的HEK293细胞表达蛋白的荧光强度图；
图4A为本发明实施例2～5的使用不同无血清转染培养基培养的HEK293细胞的细胞密度图；
图4B为本发明实施例2～5的使用不同无血清转染培养基培养的HEK293细胞存活率图；
图5为本发明实施例的无血清转染培养基优化前后培养的HEK293细胞表达蛋白的荧光强度对比图。
图6为本发明实施例6的HEK293细胞表达蛋白的荧光强度对比图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本发明实施例提供一种293细胞的转染方法，包括以下步骤：
将293细胞与待转染物质混合，进行流式电转转染，所述流式电转转染的电压值为100V～300V，脉冲值为1000μs～5000μs，电击次数为1～10次，间隔为100ms～600ms，转染液流速为1mL/min～10mL/min，转染时的所述293细胞的细胞密度为1×105cells/mL～5×107cells/mL；
将转染后的293细胞接种到转染培养基进行培养，所述转染培养基中含有L-酪氨酸、烟酰胺、硫酸镁和氢化可的松。
本发明提供一种293细胞的转染方法，采用流式电转转染，通过设置合适的电转染条件，电压值为100V～300V，脉冲值为1000μs～5000μs，电击次数为1～10次，间隔为100ms～600ms，转染液流速为1mL/min～10mL/min，转染时的所述293细胞的细胞密度为1×105cells/mL～5×107cells/mL，并在流式电转后在合适的转染培养基中进行培养，流式电转条件和转染培养基条件相互配合，能够缓解流式电转的刺激，转染后实现较高的基因表达强度、细胞密度和细胞存活率。
如本文所描述的，“待转染物质”指的是转染入293细胞的物质，例如为核酸(DNA/RNA)/糖类或蛋白质等。
如本文所描述的，“接种”是指将细胞培养物供予生物反应器或另一容器的方法。之前细胞可在另一生物反应器或容器中增殖。或者细胞为冰冻并于供予生物反应器或容器之前解冻。该术语用于指任意数目细胞，包括单个细胞。
如本文所描述的，“培养基”指含有滋养细胞生长的营养素的溶液。这些溶液提供细胞基本生长和/或存活所需的必需和非必需的营养成分。溶液中也可含有促进最低速率以上生长和/或存活的成分。所述培养基可为“化学限定培养基”——不含蛋白质、水解产物或未知组合物成分的无血清培养基。化学限定培养基中不含有动物来源的成分，并且其所有成分均具有已知的化学结构。
如本文所描述的，“细胞密度”是指在指定体积培养基中存在的细胞数目。
如本文所描述的，“细胞存活率”是指培养物中的细胞在一组指定培养条件或试验变量下存活的能力。此处所用的术语也指在某一特定时间内存活的那部分细胞与该时间培养物中活细胞和死细胞总数之间的关系。
本文所述的293细胞是人胚肾(HEK)细胞。
293细胞是人肾上皮细胞系，有多种衍生株，比如HEK293，293T/17等，来源都是人胚胎肾细胞，其极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
其中所述HEK细胞选自：HEK293、HEK 293T、HEK 293S和HEK 293EBNA中的任一种。
流式电转仪的工作原理是让细胞与特制电转专用缓冲液的混合液连续流过脉冲电场，通过精准控制脉冲电流的电压、脉冲宽度(即续航时间，微秒级精度)、脉冲间隔(毫秒级精度)，使细胞膜上的蛋白分子产生位移，形成若干微孔，使得外源分子/物质(例如DNA、RNA、蛋白质等)能够在电场作用下通过这些细胞膜微孔进入细胞内部。
流式电转技术在较低电压下即能产生足够强度的均匀电场，可实现高转染率和高细胞存活率；转染表达培养基能更好的保护细胞、降低细胞死亡率的同时，显著提高细胞转染率；蛋白表达培养基从细胞代谢的角度分析出发，可大大提高蛋白表达量。
在一些实施方式中，所述流式电转转染的电压值为160V～250V，脉冲值为1000μs～2000μs，电击次数为3～6次，间隔为200ms～400ms，转染液流速为3.5mL/min～5.5mL/min。
在一些实施方式中，加入待转染物质时的所述293细胞的细胞密度为1×106cells/mL～5×107cells/mL。例如可以为1×106cells/mL、2×106cells/mL、3×106cells/mL、4×106cells/mL、5×106cells/mL、6×106cells/mL、7×106cells/mL、8×106cells/mL、9×106cells/mL、1×107cells/mL、1.5×107cells/mL、2×107cells/mL、2.5×107cells/mL、3×107cells/mL、3.5×107cells/mL、4×107cells/mL、4.5×107cells/mL、5×107cells/mL。
在一些具体实施方式中，在电压值为210V，脉冲值1000μs，电击次数6次，流速4.5mL/min，间隔350ms，转染前细胞生长48h，转染时细胞密度4×107cells/mL时转染获得。
在一些实施方式中，所述转染培养基为无血清转染培养基，所述转染培养基包含如下浓度的组分：
L-酪氨酸 0.1843g/L～0.396g/L、
天冬酰胺 0.1704g/L～0.1874g/L、
L-胱氨酸 0.3361g/L～0.3697g/L、
L-谷氨酸 0.1722g/L～0.1895g/L、
异亮氨酸 0.1052g/L～0.1157g/L、
亮氨酸 0.1322g/L～0.1454g/L、
甲硫氨酸 0.0903g/L～0.0993g/L、
苯丙氨酸 0.0940g/L～0.1034g/L、
脯氨酸 0.0521g/L～0.0573g/L、
丝氨酸 0.0940g/L～0.1034g/L、
苏氨酸 0.1518g/L～0.1669g/L、
色氨酸 0.4255g/L～0.4680g/L、
缬氨酸 0.1508g/L～0.1659g/L、
氯化胆碱 0.0010g/L～0.0011g/L、
葡萄糖 5.5860g/L～6.1446g/L、
烟酰胺 0.0014g/L～0.0016g/L、
核黄素 0.00015g/L～0.00025g/L、
维生素 B12 0.0009g/L～0.0010g/L、
吡哆醛 0.0112g/L～0.0123g/L、
盐酸硫胺素 0.0033g/L～0.0036g/L、
生物素 0.00025g/L～0.00035g/L、
肌醇 0.0009g/L～0.0010g/L、
氯化钾 0.2346g/L～0.2581g/L、
氯化镁 0.1080g/L～0.1188g/L、
硫酸镁 0.0200g/L～0.0369g/L、
磷酸二氢钠 0.0205g/L～0.0225g/L、
磷酸氢二钠 0.0326g/L～0.0358g/L、
碳酸氢钠 1.8732g/L～2.0605g/L、
七水硫酸锌 0.00055g/L～0.00065g/L、
亚油酸 0.00015g/L～0.00025g/L、
亚硒酸钠 0.00025g/L～0.00035g/L、
氢化可的松 0.0001g/L～0.0002g/L、
硫辛酸 0.0003g/L～0.0004g/L、
丙酮酸钠 0.0633g/L～0.0696g/L。
该转染培养基，包含氨基酸、盐类、微量元素和其他添加剂。通过对配方的种类和含量的整体设计，得到适用于采用流式电转法转染的293细胞转染后的培养。将293细胞转染后接种到该培养基进行培养，能够缓解流式电转的刺激，转染后实现较高的基因表达强度、细胞密度和细胞存活率。
在一些实施方式中，所述转染培养基包含如下浓度的组分：
L-酪氨酸 0.198g/L～0.396g/L、
天冬酰胺 0.1704g/L～0.1830g/L、
L-胱氨酸 0.3361g/L～0.3610g/L、
L-谷氨酸 0.1722g/L～0.1850g/L、
异亮氨酸 0.1052g/L～0.1130g/L、
亮氨酸 0.1322g/L～0.1420g/L、
甲硫氨酸 0.0903g/L～0.0970g/L、
苯丙氨酸 0.0940g/L～0.1010g/L、
脯氨酸 0.0521g/L～0.0560g/L、
丝氨酸 0.0940g/L～0.1010g/L、
苏氨酸 0.1518g/L～0.1630g/L、
色氨酸 0.4255g/L～0.4570g/L、
缬氨酸 0.1508g/L～0.1620g/L、
氯化胆碱 0.0010g/L～0.0011g/L、
葡萄糖 5.5860g/L～6.0000g/L、
烟酰胺 0.0014g/L～0.0016g/L、
核黄素 0.00018g/L～0.00022g/L、
维生素 B12 0.0009g/L～0.0010g/L、
吡哆醛 0.0112g/L～0.01230g/L、
盐酸硫胺素 0.0033g/L～0.0035g/L、
生物素 0.00028g/L～0.00032g/L、
肌醇 0.0009g/L～0.0010g/L、
氯化钾 0.2346g/L～0.2520g/L、
氯化镁 0.1080g/L～0.1160g/L、
硫酸镁 0.0200g/L～0.0369g/L、
磷酸二氢钠 0.0205g/L～0.0220g/L、
磷酸氢二钠 0.0326g/L～0.0350g/L、
碳酸氢钠 1.8732g/L～2.0120g/L、
七水硫酸锌 0.00058g/L～0.00062g/L、
亚油酸 0.00018g/L～0.00022g/L、
亚硒酸钠 0.00028g/L～0.00032g/L、
氢化可的松 0.0001g/L～0.0015g/L、
硫辛酸 0.0003g/L～0.0004g/L、
丙酮酸钠 0.0633g/L～0.0680g/L。
在一些优选的实施方式中：
天冬酰胺为0.1820g/L～0.1830g/L；
L-胱氨酸为0.3600g/L～0.3610g/L；
L-谷氨酸为0.1840g/L～0.1850g/L；
异亮氨酸为0.1120g/L～0.1130g/L；
亮氨酸为0.1410g/L～0.1420g/L；
甲硫氨酸为0.0960g/L～0.0970g/L；
苯丙氨酸为0.1000g/L～0.1010g/L；
脯氨酸为0.0550g/L～0.0560g/L；
丝氨酸为0.1000g/L～0.1010g/L；
苏氨酸为0.1620g/L～0.1630g/L；
色氨酸为0.4560g/L～0.4570g/L；
缬氨酸为0.1610g/L～0.1620g/L；
氯化胆碱为0.0010g/L～0.0011g/L；
葡萄糖为5.9000g/L～6.0000g/L；
核黄素为0.00021g/L～0.00022g/L；
维生素B12为0.0009g/L～0.0010g/L；
吡哆醛为0.01220g/L～0.01230g/L；
盐酸硫胺素为0.0034g/L～0.0035g/L；
生物素为0.00028g/L～0.00032g/L；
肌醇为0.0009g/L～0.0010g/L；
氯化钾为0.2510g/L～0.2520g/L；
氯化镁为0.1150g/L～0.1160g/L；
磷酸二氢钠为0.0219g/L～0.0220g/L；
磷酸氢二钠为0.0340g/L～0.0350g/L；
碳酸氢钠为2.0110g/L～2.0120g/L；
七水硫酸锌为0.00061g/L～0.00062g/L；
亚油酸为0.00021g/L～0.00022g/L；
亚硒酸钠为0.00031g/L～0.00032g/L；
硫辛酸为0.00039g/L～0.0004g/L；
丙酮酸钠为0.0670g/L～0.0680g/L。
优选的，所述转染培养基中L-酪氨酸的浓度为0.198g/L～0.208g/L。更优选可以为0.198g/L～0.199g/L。
优选的，所述转染培养基中所述烟酰胺的浓度为0.0015g/L～0.0016g/L。
优选的，所述转染培养基中所述硫酸镁的浓度为0.026g/L～0.036g/L。更优选可以为0.035g/L～0.036g/L。
优选的，所述转染培养基中所述氢化可的松的浓度为0.0009g/L～0.0010g/L。
在一些实施方式中，所述转染培养基还包括浓度为0.4g/L～0.5g/L的谷氨酰胺。
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1转染培养基的筛选
取出在生长培养基MEM培养基中培养48h的悬浮HEK293细胞进行计数，将细胞转移至离心管内，以1000rpm转速离心5min，弃上清，用DPBS清洗细胞两次以去除生长培养基，取5mL转染缓冲液将细胞重悬，调整细胞密度至4×106cells/mL，加入质粒混匀、转染。电压值为200V，脉冲值600μs，电击次数3次，流速4mL/min，间隔300ms，转染前细胞生长48h。
转染后细胞置于37℃培养箱内孵育20min，以1000rpm离心10min，弃上清，分别使用表1中4款不同配方的无血清转染培养基将细胞重悬，使得细胞以4×106cells/mL的密度接种到细胞培养摇瓶中，置于37℃，8％CO2，130rpm摇床培养箱进行培养，检测表达蛋白的荧光强度、细胞密度和细胞活率，用以衡量转染效率。
使用的无血清转染培养基M1、M2、M3和M4具体组分如表1所示。
表1 M1、M2、M3和M4无血清转染培养基配方
转染培养基培养48h后检测荧光强度、细胞密度和活率，结果如图1、图2A、图2B所示，结果表明，HEK293细胞转染后在M2和M3培养基中生长较好，M2培养基中更好。
实施例2L-酪氨酸的优化实验
与实施例1的转染方法和条件基本相同，区别仅在于转染培养基的组分不同。
本实施例的转染培养基为在实施例1的M2培养基的基础上进行L-酪氨酸的优化实验，按照表2测试浓度进行单因素实验。
无血清转染培养基培养48h后检测荧光强度、细胞密度和活率，结果如图3、图4A、图4B所示，结果表明，L-酪氨酸对于HEK293细胞流式电转染后的培养至关重要。转染后L-酪氨酸浓度为0.1980g/L时更适宜HEK293细胞转染后的生长。
表2 L-酪氨酸优化实验设计
实施例3烟酰胺的优化实验
与实施例1的转染方法和条件基本相同，区别仅在于无血清转染培养基的组分不同。
本实施例的转染培养基为在实施例2的CD3培养基的基础上进行烟酰胺的优化实验，按照表3测试浓度进行单因素实验。
无血清转染培养基培养48h后检测荧光强度、细胞密度和活率，结果如图3、图4A、图4B所示，结果表明，烟酰胺对于HEK293细胞流式电转染后的培养至关重要。烟酰胺浓度为0.0016g/L时更适宜HEK293细胞转染后的生长。
表3烟酰胺优化实验设计
实施例4硫酸镁的优化实验
与实施例1的转染方法和条件基本相同，区别仅在于无血清转染培养基的组分不同。
本实施例的转染培养基为在实施例3的CD7培养基的基础上进行硫酸镁的优化实验，按照表4测试浓度进行单因素实验。
无血清转染培养基培养48h后检测荧光强度、细胞密度和活率，结果如图3、图4A、图4B所示，结果表明，硫酸镁对于HEK293细胞流式电转染后的培养至关重要。硫酸镁浓度为0.036g/L时更适宜HEK293细胞转染后的生长。
表4硫酸镁优化实验设计
实施例5氢化可的松的优化实验
与实施例1的转染方法和条件基本相同，区别仅在于无血清转染培养基的组分不同。
本实施例的转染培养基为在实施例4的CD11培养基的基础上进行氢化可的松的优化实验，按照表5测试浓度进行单因素实验。
无血清转染培养基培养48h后检测荧光强度、细胞密度和活率，结果如图3、图4A、图4B所示，结果表明，氢化可的松对于HEK293细胞流式电转染后的培养至关重要。氢化可的松浓度为0.0010g/L时更适宜HEK293细胞转染后的生长。
表5氢化可的松优化实验设计
通过上述培养基的优化实验，开发出了可使HEK293细胞株高效瞬时表达目的蛋白质的化学限定转染培养基。化学限定转染培养基在优化L-酪氨酸、烟酰胺、硫酸镁和氢化可的松前后对比结果如图5。
实施例6流式电转染条件的优化在实施例5优化得到的转染培养基的基础上进行流式电转染条件的优化。
所述流式电转转染的电压值为100V～300V，脉冲值为1000μs～5000μs，转染液流速为1mL/min～10mL/min，转染时的所述293细胞的细胞密度为1×105cells/mL～5×107cells/mL，进行单因素实验。电击次数为6次，间隔为350ms。
表6流式电转转染的电压值优化实验设计
表7流式电转转染的脉冲值优化实验设计
表8流式电转转染的转染液流速优化实验设计
表9流式电转转染转染时293细胞的细胞密度优化实验设计
结果如图6所述，结果表明，在转染电压值为210V，脉冲值1000μs，电击次数6次，流速4.5mL/min，间隔350ms，转染前细胞生长48h，转染时细胞密度4×107cells/mL时转染能够获得更好的转染结果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.293细胞的转染方法，其特征在于，包括以下步骤：
将293细胞与待转染物质混合，进行流式电转转染，所述流式电转转染的电压值为100V～300V，脉冲值为1000μs～5000μs，电击次数为1～10次，间隔为100ms～600ms，转染液流速为1mL/min～10mL/min，转染时的所述293细胞的细胞密度为1×105cells/mL～5×107cells/mL；
将转染后的293细胞接种到转染培养基进行培养，所述转染培养基中含有L-酪氨酸、烟酰胺、硫酸镁和氢化可的松。
2.根据权利要求1所述的293细胞的转染方法，其特征在于，所述流式电转转染的电压值为160V～250V，脉冲值为1000μs～2000μs，电击次数为3～6次，间隔为200ms～400ms，转染液流速为3.5mL/min～5.5mL/min。
3.根据权利要求1所述的293细胞的转染方法，其特征在于，转染时的所述293细胞的细胞密度为1×106cells/mL～5×107cells/mL。
4.根据权利要求1所述的293细胞的转染方法，其特征在于，所述转染培养基为无血清转染培养基，所述转染培养基包含如下浓度的组分：
L-酪氨酸0.1843g/L～0.396g/L、
天冬酰胺0.1704g/L～0.1874g/L、
L-胱氨酸0.3361g/L～0.3697g/L、
L-谷氨酸0.1722g/L～0.1895g/L、
异亮氨酸0.1052g/L～0.1157g/L、
亮氨酸0.1322g/L～0.1454g/L、
甲硫氨酸0.0903g/L～0.0993g/L、
苯丙氨酸0.0940g/L～0.1034g/L、
脯氨酸0.0521g/L～0.0573g/L、
丝氨酸0.0940g/L～0.1034g/L、
苏氨酸0.1518g/L～0.1669g/L、
色氨酸0.4255g/L～0.4680g/L、
缬氨酸0.1508g/L～0.1659g/L、
氯化胆碱0.0010g/L～0.0011g/L、
葡萄糖5.5860g/L～6.1446g/L、
烟酰胺0.0014g/L～0.0016g/L、
核黄素0.00015g/L～0.00025g/L、
维生素B12 0.0009g/L～0.0010g/L、
吡哆醛0.0112g/L～0.0123g/L、
盐酸硫胺素0.0033g/L～0.0036g/L、
生物素0.00025g/L～0.00035g/L、
肌醇0.0009g/L～0.0010g/L、
氯化钾0.2346g/L～0.2581g/L、
氯化镁0.1080g/L～0.1188g/L、
硫酸镁0.0200g/L～0.0369g/L、
磷酸二氢钠0.0205g/L～0.0225g/L、
磷酸氢二钠0.0326g/L～0.0358g/L、
碳酸氢钠1.8732g/L～2.0605g/L、
七水硫酸锌0.00055g/L～0.00065g/L、
亚油酸0.00015g/L～0.00025g/L、
亚硒酸钠0.00025g/L～0.00035g/L、
氢化可的松0.0001g/L～0.0002g/L、
硫辛酸0.0003g/L～0.0004g/L、
丙酮酸钠0.0633g/L～0.0696g/L。
5.根据权利要求4所述的293细胞的转染方法，其特征在于，所述转染培养基包含如下浓度的组分：
L-酪氨酸0.198g/L～0.396g/L、
天冬酰胺0.1704g/L～0.1830g/L、
L-胱氨酸0.3361g/L～0.3610g/L、
L-谷氨酸0.1722g/L～0.1850g/L、
异亮氨酸0.1052g/L～0.1130g/L、
亮氨酸0.1322g/L～0.1420g/L、
甲硫氨酸0.0903g/L～0.0970g/L、
苯丙氨酸0.0940g/L～0.1010g/L、
脯氨酸0.0521g/L～0.0560g/L、
丝氨酸0.0940g/L～0.1010g/L、
苏氨酸0.1518g/L～0.1630g/L、
色氨酸0.4255g/L～0.4570g/L、
缬氨酸0.1508g/L～0.1620g/L、
氯化胆碱0.0010g/L～0.0011g/L、
葡萄糖5.5860g/L～6.0000g/L、
烟酰胺0.0014g/L～0.0016g/L、
核黄素0.00018g/L～0.00022g/L、
维生素B12 0.0009g/L～0.0010g/L、
吡哆醛0.0112g/L～0.01230g/L、
盐酸硫胺素0.0033g/L～0.0035g/L、
生物素0.00028g/L～0.00032g/L、
肌醇0.0009g/L～0.0010g/L、
氯化钾0.2346g/L～0.2520g/L、
氯化镁0.1080g/L～0.1160g/L、
硫酸镁0.0200g/L～0.0369g/L、
磷酸二氢钠0.0205g/L～0.0220g/L、
磷酸氢二钠0.0326g/L～0.0350g/L、
碳酸氢钠1.8732g/L～2.0120g/L、
七水硫酸锌0.00058g/L～0.00062g/L、
亚油酸0.00018g/L～0.00022g/L、
亚硒酸钠0.00028g/L～0.00032g/L、
氢化可的松0.0001g/L～0.0015g/L、
硫辛酸0.0003g/L～0.0004g/L、
丙酮酸钠0.0633g/L～0.0680g/L。
6.根据权利要5所述的293细胞的转染方法，其特征在于，所述转染培养基中所述L-酪氨酸的浓度为0.198g/L～0.208g/L。
7.根据权利要5所述的293细胞的转染方法，其特征在于，所述转染培养基中所述烟酰胺的浓度为0.0015g/L～0.0016g/L。
8.根据权利要5所述的293细胞的转染方法，其特征在于，所述转染培养基中所述硫酸镁的浓度为0.026g/L～0.036g/L。
9.根据权利要5所述的293细胞的转染方法，其特征在于，所述转染培养基中所述氢化可的松的浓度为0.0009g/L～0.0010g/L。
10.根据权利要5所述的293细胞的转染方法，其特征在于，所述转染培养基中还包括浓度为0.4g/L～0.5g/L的谷氨酰胺。
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|---|
| KRISTA STEGER，ET AL: "CHO-S Antibody Titers ＞1 Gram/liter Using Flow Electroporation-Mediated Transient Gene Expression followed by Rapid Migration to High-Yield Stable Cell Line", 《JOURNAL OF BIOMOLECULAR SCREENING》 * |
| MAXCYTE: "https://maxcyte.com/stx/", 《EXPERT-STX》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE2230210A1 (en) * | 2022-06-24 | 2023-12-25 | Fixell Biotech Ab | High eukaryotic cell density transient transfection process for manufacturing of recombinant viral vectors |
| CN119061076A (zh) * | 2024-11-04 | 2024-12-03 | 南京大学 | 一种转染试剂及其应用 |
| CN119061076B (zh) * | 2024-11-04 | 2025-05-16 | 南京大学 | 一种转染试剂及其应用 |
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