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CN114075296A - 一种多功能变体蛋白及其融合蛋白 - Google Patents

一种多功能变体蛋白及其融合蛋白 Download PDF

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CN114075296A
CN114075296A CN202110929926.9A CN202110929926A CN114075296A CN 114075296 A CN114075296 A CN 114075296A CN 202110929926 A CN202110929926 A CN 202110929926A CN 114075296 A CN114075296 A CN 114075296A
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CN
China
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protein
wild
fgf21
leu
replaced
Prior art date
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Application number
CN202110929926.9A
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余华星
花海清
包如迪
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Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co Ltd
Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd
Original Assignee
Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co Ltd
Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co Ltd, Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd filed Critical Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种多功能变体蛋白及其融合蛋白，包括成纤维细胞生长因21(Fibroblast growth factor 21,FGF21)蛋白或其突变体蛋白和胰高血糖素样肽‑1(Glucagon‑like peptide‑1,GLP‑1)受体或其突变体蛋白，本发明的融合蛋白的药物组合物可以用于糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎等相关疾病的治疗。

Description

一种多功能变体蛋白及其融合蛋白
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及成纤维细胞生长因21(FGF21)的新型突变体蛋白及其和胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)受体的融合蛋白，并可用于治疗糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎等相关疾病。
背景技术
成纤维细胞生长因21(Fibroblast growth factor 21,FGF21)是一种由209个氨基酸组成的多肽(SEQ ID NO:166)，其氨基酸序列与小鼠的FGF21具有约75％的同源性。FGF21 N末端含有28个氨基酸构成的信号肽，因而成熟的FGF21由181个氨基酸组成(SEQ IDNO:167)。FGF21主要在肝脏和胰腺中表达，同时也存在于脂肪和肌肉组织中。通过FCFR的介导和跨膜蛋白βKlotho(KLB)的辅助，FGF21能诱导肝脏、胰腺和脂肪组织中的多种信号通路和功能活动，进而实验对糖脂代谢的调节和对胰岛β细胞进行保护的生理功能。FGF21通过激活非胰岛素依赖的葡萄糖吸收，调节脂肪细胞对葡萄糖的摄取。另外，研究还表明，FGF21可剂量依赖性的减少体重和全身体脂。如向患糖尿病的恒河猴施用FGF21，发现其空腹血浆葡萄糖、甘油三酯和胰高血糖素水平均有显著减少。同时，在FGF21转基因小鼠身上发现，其白色脂肪组织脂肪酶表达增加，血浆β-羟丁酸和游离脂肪酸水平升高，这意味着FGF21可能是通过促进脂肪分解以及生酮作用调控脂质代谢。在胰岛细胞和INS-1E细胞中，FGF21能够抑制葡萄糖介导的胰高血糖素的释放，刺激胰岛素的产生，并防止胰岛细胞凋亡，进而改善胰腺细胞功能。此外，FGF21还能激活外分泌胰腺细胞和肝细胞信号通路，抑制肝糖原输出。
FGF21作为FGF基因家族的成员，大多数FGF具有光谱的促有丝分裂的能力，而探究结果表明，FGF21既没有促进细胞增值的能力，也不会拮抗FGF家族其他成员的功能。实验证明，FGF21转基因鼠(体内FGF21量是正常鼠的150倍左右)在整个生命周期内，体内未发现肿瘤以及组织增生等异常状况。同时，其代谢调节作用与机体的代谢水平相关，调节作用仅在代谢异常时发挥作用，即使超过药理学剂量的FGF21也不会出现低血糖症。而目前市场上主要的治疗糖尿病的药物(胰岛素，噻唑烷二酮等)在剂量不当时易产生副作用，如大剂量的胰岛素导致的低血糖，噻唑烷二酮导致的肝功能损坏和水肿，这些在接受FGF21治疗的动物实验中均没有发现，这也足以证明FGF21是一种理想的治疗糖尿病以及肥胖等疾病的药物。
FGF21在控制血糖和降低体重等方面的生理功能为治疗相关疾病带来了希望，但是野生型FGF21作为小分子蛋白易被蛋白酶水解，也可通过肾小球滤过，半衰期仅为0.5-2h，难以保证有效药物作用时间。面对这种困难，医药工业界通过进行酶切位点氨基酸定点突变，制备长效融合蛋白或将聚乙二醇连接到多肽骨架等方法来提高FGF21的半衰期。此外，在研发FGF21作为蛋白质制剂中的重大挑战还来自其自身聚集造成的不稳定性。目标治疗蛋白的理想效果是增加对蛋白水解的耐受性以及降低蛋白的聚集性，进而增强FGF21蛋白制剂的半衰期和稳定性，实现对患者的低频给药。
在WO2009/149171和WO2017/074117中已经描述了一些基于人野生型FGF21多肽序列的突变体。
胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1,GLP-1)是一个含有30或31个氨基酸残基的胃肠道调节多肽。GLP-1的分泌主要由小肠上的L-细胞根据营养的吸收和体内波动的血糖水平进行调节。在食物摄入后，小肠的L-细胞分泌大量的GLP-1以增强胰腺的内分泌功能。GLP-1多肽主要通过激活分布在细胞膜表面的GLP-1受体来完成其在体内控制血糖和降低食欲的生理功能。GLP-1控制体内血糖水平的机制主要为激活其分布在胰岛β细胞的GLP-1受体从而促进胰岛素的生物合成及分泌，同时GLP-1多肽可在体内高血糖水平的情况下抑制胰高血糖素的分泌，胃排空和食物摄入并通过特定的神经系统作用增强体内对葡萄糖的降解。值得注意的是，GLP-1多肽促进胰岛素分泌的生理功能是受到血浆葡萄糖浓度的高度控制的，因此与其它糖尿病治疗药物相比，GLP-1多肽不会引发严重和持久的低血糖。除此之外，文献中报导了GLP-1多肽及其类似物对实验动物β细胞的生长，分化和增殖具有直接的促进作用，表明GLP-1多肽及其类似物可以保护胰岛和延缓糖尿病进展的生理功能并抑制β细胞的凋亡。GLP-1多肽还具有潜在的抑制胃泌素和进食刺激的胃酸分泌作用，这些特征意味着GLP-1多肽还具有防止消化道溃疡的生理作用。GLP-1多肽还可以激活其在大脑中枢神经系统中分布的GLP-1受体从而增强饱腹感，降低食物摄入并达到保持或降低体重的生理效果。因此，GLP-1多肽及其类似物广泛的作用机制及其生理功能意味着GLP-1多肽是一种理想的治疗非胰岛素依赖性糖尿病以及肥胖型糖尿病的药物。
GLP-1多肽在控制血糖和降低体重等方面的生理功能为治疗非胰岛素依赖性糖尿病/肥胖型糖尿病带来了希望，但是人体天然GLP-1成药性较差，其在体内易被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)降解以至于其在人体内的半衰期仅为1-2分钟。面对这种困难，医药工业界通过进行酶切位点氨基酸定点突变，多肽骨架的脂肪酸修饰以及GLP-1多肽和多种蛋白/高分子多聚物结合来构造长效GLP-1类似物及其衍生物。现阶段已经上市并在临床上广泛应用的长效GLP-1类似物包括一天两次皮下注射给药的艾那赛肽，一天一次皮下注射给药的利拉鲁肽以及一周一次皮下注射给药的杜拉鲁肽和索马鲁肽等等。
临床上，GLP-1多肽及其衍生物的副作用主要表现在由胃肠道所引发的恶心，呕吐以及腹泻；除此之外，已经发现GLP-1多肽及其衍生物还会引发受试者心跳加速和并在特定情况下会增加患者胰腺炎的风险。因此，GLP-1多肽及其衍生物的给药剂量受到其引发的副作用的限制，故而其临床使用无法有效的实现患者的血糖控制和体重减轻。
本发明的目的在于提供一些FGF21突变体蛋白与GLP-1受体蛋白的融合蛋白，这些融合蛋白具有显著优于FGF21和本领域公开的已知的FGF21突变体的优点。这些优点包括显著且持久的降血糖和降体重作用。这些特征对于治疗性蛋白的制备和配制有利，并具有对糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎等相关疾病的潜在治疗效果。
发明内容
本发明的一个实施方案是基于野生型人类FGF21序列(SEQ ID NO:4)的多肽，其中：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起170位的Gly被Thr取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起172位的Ser被Leu取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起175位的Arg被Phe,Glu,Trp,Leu,Tyr，或Ile中的一种取代；
以及(5)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
又一个实施方案中：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起163位的Ser被Phe,Trp,Tyr,Leu,Gln或Thr中的一种取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起170位的Gly被Thr取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起172位的Ser被Leu取代；
以及(5)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明进一步优选的一个实施方案，其中：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起163位的Ser被Phe,Trp,Tyr,Leu,Glu Ile,Asp或His中的一种取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起170位的Gly被Thr取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起172位的Ser被Leu取代；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起175位的Arg被Phe,Glu,Trp,Leu,Tyr，或Ile中的一种取代；
(6)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明的另一个优选实施方案，其中：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起171位的Pro被Gly取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起175位的Arg被Phe,Glu,Trp,Leu,Tyr，或Ile中的一种取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明的另一个优选实施方案中：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起163位的Ser被Phe,Trp,Tyr,Leu,Gln或Thr中的一种取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起171位的Pro被Gly取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明的另一个优选实施方案中：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起163位的Ser被Phe,Trp,Tyr,Leu,Glu,Ile,Asp或His中的一种取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起171位的Pro被Gly取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起175位的Arg被Phe,Glu,Trp,Leu,Tyr，或Ile中的一种取代；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明的另一个优选实施方案中：
(1)从野生型F1.GF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起170-172位的Gly-Pro-Ser被Thr-Gly-Leu取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起175位的Arg被Phe,Glu,Trp,Leu,Tyr，或Ile中的一种取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明的又一个优选实施方案中：
(1)从野生型F1.GF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起163位的Ser被Phe,Trp,Tyr,Leu,Gln或Thr中的一种取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起170-172位的Gly-Pro-Ser被Thr-Gly-Leu取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明的又一个优选实施方案中：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起163位的Ser被Phe,Trp,Tyr,Leu,Glu,Ile,Asp或His中的一种取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起170-172位的Gly-Pro-Ser被Thr-Gly-Leu取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起175位的Arg被Phe,Glu,Trp,Leu,Tyr，或Ile中的一种取代；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明的另一个优选实施方案中：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起146位的Pro被Leu取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起166位的Leu被Phe取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起171位的Pro被Gly取代；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起175位的Arg被Trp取代；
(6)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明的另一个优选实施方案中：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起146位的Pro被Leu取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起166位的Leu被Phe取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起170-172位的Gly-Pro-Ser被Thr-Gly-Leu取代；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起175位的Arg被Trp取代；
(6)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明的又一个优选实施方案中：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起146位的Pro被Leu取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起163位的Ser被Phe,Trp,Asp,Leu,Glu或Ile中的一种取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起166位的Leu被Phe取代；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起171位的Pro被Gly取代；
(6)从野生型FGF21蛋白的N端起175位的Arg被Trp取代；
(7)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明的又一个优选实施方案中：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起98位的Leu被Arg取代；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起146位的Pro被Leu取代；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起163位的Ser被Phe,Trp,His,Leu,Glu或Ile中的一种取代；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起166位的Leu被Phe取代；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起170-172位的Gly-Pro-Ser被Thr-Gly-Leu取代；
(6)从野生型FGF21蛋白的N端起175位的Arg被Trp取代；
(7)从野生型FGF21蛋白的N端起180位的Ala被Glu取代；
本发明的一个优选实施方案，其中FGF21变体蛋白与GLP-1蛋白通过连接蛋白连接。本发明的另一个优选实施方案，其中FGF21变体蛋白与GLP-1蛋白通过连接蛋白连接，且连接蛋白含有免疫球蛋白的Fc片段。
本发明还涉及一种融合蛋白，其通式如下：
F1-F2-F3
(I)
其中：F1为GLP-1受体蛋白或其变体；F2为连接蛋白；F3为FGF21蛋白或其变体。
本发明的另一个实施方案是通式(II)所述的融合蛋白，所述的F2的连接蛋白通式为：
F4F5(GGGGS)m
(II)
其中：F4为SEQ ID NO：161；F5为免疫球蛋白的Fc片段；m＝1-20。
本发明的另一个实施方案是通式(I)所述的融合蛋白，所述的F2的连接蛋白通式(II)中F5为SEQ ID NO：162。
本发明的另一个实施方案是通式(I)所述的融合蛋白，所述的F2的连接蛋白通式(II)中m＝3。
本发明的另一个实施方案是通式(I)所述的融合蛋白，所述的F2的连接蛋白或其变体序列为SEQ ID NO：163。
本发明的另一个实施方案是通式(I)所述的融合蛋白，所述的F1的GLP-1受体蛋白或其变体序列为SEQ ID NO：164-165。
本发明的另一个实施方案是通式(I)所述的融合蛋白，所述的F3的FGF21蛋白或其变体序列为SEQ ID NO：1-160。
本发明的另一个实施方案是通式(I)所述的融合蛋白，具体序列为SEQ ID NO：168-171。
本发明还涉及一种多核苷酸，其编码包含通式(I)所述的融合蛋白。
本发明还涉及一种表达载体，其含有如上所述的多核苷酸。
另外，本发明还涉及一种宿主细胞，其导入或含有如上所述的表达载体，其中所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌；或者所述的宿主细胞为酵母菌，优选为毕赤酵母；或者所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为CHO细胞或HEK293细胞。
本发明还涉及一种生产蛋白的方法，包括步骤：
1)培养如上所述的宿主细胞；
2)从培养物中分离蛋白；
3)以及对所述的蛋白进行纯化。
本发明进一步包含一种药物组合物，其含有通式(I)所述的融合蛋白以及可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明还涉及所述的蛋白和/或如上所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防治疗糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎等相关疾病。
发明的详细说明
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
本发明的FGF21突变体中氨基酸的位置改变从成熟的人野生型FGF21(SEQ ID NO:4)多肽中的氨基酸位置决定。
本发明的氨基酸序列含有二十种氨基酸的标准单字母或三字母代码。
术语“FGF21多肽”是指人体内表达的天然存在的野生型多肽。包括SEQ ID NO:166组成由SEQ ID NO:172编码的全长形式和SEQ ID NO:167组成由SEQ ID NO:173编码的成熟形式。
术语“FGF21突变体”是指基于天然存在的FGF21氨基酸(SEQ ID NO:4)序列而修饰的FGF21多肽。这类修饰包括但不仅限于一个或多个氨基酸被取代，包括且不仅限于本文所述的蛋白酶抗性FGF21突变体、聚集减少的FGF21突变体以及FGF21组合突变体。
术语“保守氨基酸突变”指通过天然氨基酸残基的取代，使得该位置上的氨基酸残基的极性或电荷电荷几乎没有影响。
可根据氨基酸侧链的性质，将氨基酸分为以下几类：
(1)疏水性：Ala、Ile、Leu、Met、Phe、Pro和Trp；
(2)中性亲水性：Cys、Ser或Thr；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：Arg、Asn、Gln、His或Lys。
保守取代包括这些类别之一的成员被同一类别的另一个成员取代；非守取代包括这些类别之一的成员被另一类别的成员取代。
术语“脂血异常”指脂蛋白代谢病症，包括脂蛋白过量产生过量或不足。可表现为血液总胆固醇、低密度脂蛋白质胆固醇和甘油三酯浓度的升高和/或高密度脂蛋白胆固醇浓度的降低。
术语“患者”是哺乳动物，优选人。
术语“治疗”指减缓、降低或逆转症状、病症或疾病的进展或严重性。
术语“Fc片段”指免疫球蛋白的重链的恒定区。
术语“载体”指用于向宿主细胞传递编码信息的任何分子(例如核酸、质粒或病毒)。
术语“表达载体”指适于宿主细胞转化并含有指导和/或控制插入异源核酸序列表达的核酸序列的载体。包含但不限于诸如转录、翻译和RNA剪接等过程。
术语“宿主细胞”用来指被核酸序列转化或能够被所述核酸序列转化然后能够表达选定目标基因的细胞。该术语包括亲代细胞的子代，无论子代在形态或遗传组成上是否与最初的亲代相同，主要存在选定的基因。
具体实施方式
为了更详细的说明本发明，本说明书提供了下列具体实施方案，但本发明的方案并非仅限于此。
实施例1编号化合物1的制备
1.1实验目的：通过细胞表达和纯化的方法制备编号化合物1
1.2实验方案：
1.2.1主要实验试剂
名称 品牌 货号
NI Sepharose excel GE 17-3712-01
NaOH 沪试 10019718
咪唑 沪试 10000218
PBS 鼎国昌盛 BF-0012
75％乙醇 沪试 801769610
1.2.2主要实验仪器
名称 品牌 型号
蛋白纯化仪 GE AKTA-Pure150
移液器 Eppendorf 100-1000μL
移液器 Eppendorf 20-200μL
移液器 Eppendorf 2-20μL
磁力搅拌器 上海梅颖浦 H03-A
微量分光光度计 杭州奥盛 Nano-300
天平 Sartorius SQP QUINTIX124-1CN/120
PH计 梅特勒 FE28
多功能酶标仪 Thermo Lux
1.2.3试验方法
采用ExpiCHO系统(Thermo Fisher#A29133)表达融合蛋白。
具体的，将编码C端带有His标签的编号化合物蛋白序列的DNA序列克隆至pCDNA3.1载体中，得到表达融合蛋白的质粒。使用ExpiFectamine试剂将质粒转染至ExpiCHO-S细胞中，在100毫升的ExpiCHO培养基中培养细胞7天后，收获上清液；采用离心过滤或深层过滤的方法进行发酵液的澄清。
配置EQ缓冲液(PBS,pH7.4)的方法为取PBS磷酸缓冲液粉剂一袋，将该粉末用2000ml超纯水溶解，用0.22μm滤膜过滤备用。配置Elution缓冲液(500mM咪唑,pH7.4)的方法为称取咪唑34g加EQ缓冲液450ml，调节pH至7.4，定容至500ml，0.22μm滤膜过滤备用。将收获后的上清液通过AKTA Pure仪器进行纯化。首先用EQ缓冲液平衡仪器，直至流出液体的pH和电导值与EQ缓冲液一致；再用Elution缓冲液收集样品。
1.3实验结果：
用紫外分光光度法测定编号化合物1的浓度为847mg/L，纯度为96％。
实施例2编号化合物2-160的制备
2.1实验目的：通过细胞表达和纯化的方法制备编号化合物2-160
2.2实验方法：采用实施例2的方法制备化合物2-160。
2.3实验结果：用紫外分光光度法测定编号化合物2-160的浓度和纯度，如下表：
Figure BDA0003210180540000091
Figure BDA0003210180540000101
Figure BDA0003210180540000111
Figure BDA0003210180540000121
Figure BDA0003210180540000131
实施例3编号化合物168的制备
3.1实验目的：通过细胞表达和纯化的方法制备编号化合物168。
3.2实验方案：
3.2.1主要实验材料
名称 品牌 货号
Eshmuno A MERCK 1.25161.0001
NaOH 沪试 10019718
乙酸 沪试 10000218
乙酸钠(三水) 沪试 10018718
PBS 鼎国昌盛 BF-0012
75％乙醇 沪试 801769610
3.2.2主要实验仪器
名称 品牌 型号
蛋白纯化仪 GE AKTA-Pure150
移液器 Eppendorf 100-1000μL
移液器 Eppendorf 20-200μL
移液器 Eppendorf 2-20μL
磁力搅拌器 上海梅颖浦 H03-A
微量分光光度计 杭州奥盛 Nano-300
天平 Sartorius SQP QUINTIX124-1CN/120
PH计 梅特勒 FE28
多功能酶标仪 Thermo Lux
3.2.3实验方法
采用ExpiCHO系统(Thermo Fisher#A29133)表达融合蛋白。
具体的，将编码化合物168蛋白序列的DNA序列克隆至pCDNA3.1载体中，得到表达融合蛋白的质粒。使用ExpiFectamine试剂将质粒转染至ExpiCHO-S细胞中，在100毫升的ExpiCHO培养基中培养细胞7天后，收获上清液。采用离心过滤或深层过滤的方法进行发酵液的澄清。
配置EQ缓冲液(PBS,pH7.4)的方法为取PBS磷酸缓冲液粉剂一袋，将该粉末用2000ml超纯水溶解，用0.22μm滤膜过滤备用。配置Elution缓冲液(50mM HAc-NaAc,pH3.5)的方法为称取三水合乙酸钠1.91g，加冰醋酸调节pH至3.5，定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤备用。将收获后的上清液通过AKTA Pure仪器进行纯化。首先用EQ缓冲液平衡仪器，直至流出液体的pH和电导值与EQ缓冲液一致。再用Elution缓冲液收集样品。
3.3实验结果：
用紫外分光光度法测定编号化合物168的浓度680mg/L和纯度90％。
实施例4编号化合物168的体内药效
4.1实验目的：
测试编号化合物皮下给药对ob/ob小鼠体重的调节作用
4.2实验方法：
体重58-70克周龄15-19周的雄性ob/ob小鼠。对ob/ob小鼠皮下每3天注射给予编号化合物(2毫克/千克体重)。给药前和给药后第九天观察小鼠的体重和随机血糖。测量血糖值的具体方法是用物理方法固定住小鼠，暴露出尾巴并将尾部剪去少许，挤压尾巴使其出血，弃去第1滴血后用罗氏活力型血糖仪检测血糖。根据体重值计算体重降低百分比，计算方法：体重降低百分比％＝(第0天体重-第9天体重)/第0天体重*100。
4.3实验结果：
Figure BDA0003210180540000141
4.4实验结论：
在本实验中，在2毫克/千克体重的剂量下，本发明化合物168显示出显著且持久的降糖和降体重作用，说明其具有成为调节代谢的长效药物的潜力。
实施例5编号化合物168的体内药效
4.1实验目的：
测试编号化合物皮下给药对ob/ob小鼠体重、肝重和血糖的调节作用4.2实验方法：
体重35-50克周龄8-12周的雄性ob/ob小鼠。对ob/ob小鼠皮下每3天注射给予安慰剂和编号化合物(2毫克/千克体重)。给药前和给药后第九天观察小鼠的体重，根据体重值计算体重降低百分比，计算方法：体重降低百分比％＝(第0天体重-第9天体重)/第0天体重*100。终点前一天，过夜禁食(16h以上)；终点当天，安乐死后进行取材，采集全血，离心后收集血清测血糖，测量血糖值的具体方法是用物理方法固定住小鼠，暴露出尾巴并将尾部剪去少许，挤压尾巴使其出血，弃去第1滴血后用罗氏活力型血糖仪检测血糖；收集肝脏称重，计算肝脏体重比，计算方法：肝脏体重比％＝第9天肝重/第9天体重*100。
4.3实验结果：
Figure BDA0003210180540000142
Figure BDA0003210180540000151
4.4实验结论：
在本实验中，在2毫克/千克体重的剂量下，本发明化合物168显示出显著且持久的降体重、降血糖以及降肝重作用，说明其具有成为调节代谢以及改善肝脏状态的长效药物潜力。
Figure BDA0003210180540000161
Figure BDA0003210180540000171
Figure BDA0003210180540000181
Figure BDA0003210180540000191
Figure BDA0003210180540000201
Figure BDA0003210180540000211
Figure BDA0003210180540000221
Figure BDA0003210180540000231
Figure BDA0003210180540000241
Figure BDA0003210180540000251
Figure BDA0003210180540000261
Figure BDA0003210180540000271
Figure BDA0003210180540000281
Figure BDA0003210180540000291
Figure BDA0003210180540000301
Figure BDA0003210180540000311

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其通式如下：
F1-F2-F3
(I)
其中：
F1为GLP-1受体蛋白或其变体，具体序列为SEQ ID NO：164-165；
F2为连接蛋白；
F3为FGF21蛋白或其变体，具体序列为SEQ ID NO：1-160。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的F2的连接蛋白或其变体序列为SEQ ID NO：163。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，具体序列为SEQ ID NO：168-171。
4.一种多核苷酸，其编码包含权利要求1-3任一项所述的蛋白。
5.一种表达载体，其含有权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其导入或含有权利要求5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌；
或，所述的宿主细胞为酵母菌，优选为毕赤酵母；
优选地，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为CHO细胞或HEK293细胞。
8.一种生产蛋白的方法，包括步骤：
培养权利要求6或7所述的宿主细胞；
从培养物中分离蛋白；
以及对所述的蛋白进行纯化。
9.一种药物组合物，其含有权利要求1-3任一项所述的蛋白以及可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
10.根据权利要求1-3任一项所述的蛋白和/或权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防治疗糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎相关疾病。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116284441A (zh) * 2023-01-18 2023-06-23 上海民为生物技术有限公司 具有三重活性的融合蛋白及其应用
CN118307684A (zh) * 2024-06-11 2024-07-09 北京志道生物科技有限公司 一种经脂肪酸链修饰的glp-1-fgf21融合蛋白及其制备方法和应用
WO2024152419A1 (zh) * 2023-01-16 2024-07-25 上海民为生物技术有限公司 具有多重活性的融合蛋白及其应用

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CN118307684A (zh) * 2024-06-11 2024-07-09 北京志道生物科技有限公司 一种经脂肪酸链修饰的glp-1-fgf21融合蛋白及其制备方法和应用
CN118307684B (zh) * 2024-06-11 2024-10-18 北京志道生物科技有限公司 一种经脂肪酸链修饰的glp-1-fgf21融合蛋白及其制备方法和应用

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