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TW202342552A - 人胰島素類似物、其融合蛋白及醫藥用途 - Google Patents

人胰島素類似物、其融合蛋白及醫藥用途 Download PDF

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TW202342552A
TW202342552A TW112109789A TW112109789A TW202342552A TW 202342552 A TW202342552 A TW 202342552A TW 112109789 A TW112109789 A TW 112109789A TW 112109789 A TW112109789 A TW 112109789A TW 202342552 A TW202342552 A TW 202342552A
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insulin
fusion protein
seq
amino acid
analog
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TW112109789A
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吳方舟
姜鵬
申晨曦
杜延平
劉仁志
李元元
黃旭超
賀旭剛
王雷
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大陸商北京拓界生物醫藥科技有限公司
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Abstract

本揭露關於人胰島素類似物、其融合蛋白及醫藥用途。具體而言，本揭露關於人胰島素類似物-Fc融合蛋白，其具有超長的體內藥物代謝動力學特性，可用於代謝類疾病(如I型糖尿病和II型糖尿病)的治療。

Description

人胰島素類似物、其融合蛋白及醫藥用途
本揭露涉及生物醫藥領域，具體涉及一類人胰島素類似物及其融合蛋白，以及應用該類融合蛋白治療代謝類疾病(如，糖尿病)的用途。
糖尿病是由於體內分泌的胰島素不足進而引發的人體葡萄糖、蛋白質和脂質代謝失調的慢性、代謝性疾病，主要劃分為胰島素依賴性糖尿病(I型糖尿病)和非胰島素依賴性糖尿病(II型糖尿病)。全球範圍內90-95%的糖尿病患者為II型糖尿病，其由胰島β細胞功能受損和長期胰島素抗性導致，最主要特徵是體內胰島素水平的缺乏、胰島素敏感性降低和血漿中的高血糖濃度。研究表明，II型糖尿病與多種高危險性併發症相關，會導致心血管疾病、腎臟衰竭、失明、截肢以及其它多種併發症。
已經批准上市的糖尿病藥物主要包括化學合成小分子口服降糖藥物，例如雙胍類、磺醯類、胰島素增敏劑、α-糖苷類以及胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物等注射肽類降糖藥物。對於所有I型糖尿病及部分末期II型糖尿病而言，只有胰島素注射液相關藥物可以較好的控制血糖水平。然而，
目前，已經被批准上市的胰島素類似物產品主要分為速效胰島素和長效基礎胰島素這兩大類。已經上市的速效胰島素包括賴脯胰島素和門冬胰 島素等。速效胰島素主要在患者餐前進行皮下注射給藥，其藉由對胰島素分子結構上進行改造，抑制天然胰島素六聚體的形成，從而具有皮下注射給藥後快速起效和快速清除的藥物代謝動力學特徵。其中，賴脯胰島素在天然胰島素B-鏈末端藉由對28、29位點胺基酸位置的交替以實現抑制胰島素六聚體形成的功效，而門冬胰島素藉由在胰島素B-鏈28位將脯胺酸替換為天門冬胺酸，藉由電荷互斥相互作用以抑制六聚體的形成。已經批准上市的長效基礎胰島素包括甘精胰島素、地特胰島素和德穀胰島素。其中，甘精胰島素藉由對胰島素分子骨架引入正電荷精胺酸提升分子等電點至中性，使得該胰島素類似物皮下注射後在給藥部位形成沉澱，緩釋溶解後得到顯著延長的體內藥物代謝動力學特性。地特胰島素和德穀胰島素藉由在B-鏈末端賴胺酸側鏈引入長鏈脂肪酸修飾，藉由在給藥部位形成超分子高聚體，以及在血漿中與人類血清白蛋白可逆結合延長體內藥物代謝動力學特性。目前，甘精胰島素和德穀胰島素的給藥頻率為一天一次，而地特胰島素的給藥頻率為每天一到兩次。
然而，速效胰島素產品可能導致低血糖和嚴重的低血糖症狀等不良反應，且患者需要每天一次甚至多次注射胰島素類藥物，造成患者使用不便、治療負擔大且生活質量下降。而已有的長效基礎胰島素產品也需要一天一次的皮下注射給藥，注射頻率仍然較高。因此，具有更低注射頻率、更高安全性的超長效基礎胰島素產品是臨床患者的需求，這能顯著提高患者的依從性和便利性，本揭露提供了這樣的超長效基礎胰島素產品。
本揭露提供人胰島素類似物和IgG Fc區的融合蛋白，其製備方法，及將該融合蛋白用於治療代謝類疾病(如I型糖尿病或II型糖尿病)的用途。
胰島素類似物
本公升提供了胰島素類似物，其含有胰島素B鏈類似物和胰島素A鏈類似物，其中，胰島素B鏈類似物包含如下的胺基酸序列：
FVX1QHLCGX2HLVEALX3X4VCGERGFX5X6X7X8X9(SEQ ID NO：43)，其中，X1選自N、G或K；X2選自S或E；X3選自Y、H或E；X4選自H、R、L或E；X5選自F或H；X6選自G、T、S、H、V、Y或不存在；X7選自G、E、P、K、D、S、H或不存在；X8選自G、E、K、P、Q、D、H或不存在；X9選自G、T、S、E、K、A或不存在；
胰島素A鏈類似物包含如下的胺基酸序列：
GIVEQCCZ1SICSLZ2QLENYCZ3Z4(SEQ ID NO：44)，其中，Z1選自T、H或E，Z2選自Y、D、S或E，Z3選自G或N；Z4是任意天然胺基酸或不存在，當Z3為N，Z4不為G或N。
本公开提供了胰島素類似物，其含有胰島素B鏈類似物和胰島素A鏈類似物，其中，胰島素B鏈類似物包含如下的胺基酸序列：
FVX1QHLCGX2HLVEALX3X4VCGERGFX5Y(SEQ ID NO：1)，其中，X1選自N、G或K；X2選自S或E；X3選自Y、H或E；X4選自H、R、L或E；X5選自F或H；
胰島素A鏈類似物包含如下的胺基酸序列：
GIVEQCCZ1SICSLZ2QLENYCZ3(SEQ ID NO：2)，其中，Z1選自T、H或E，Z2選自Y、D、S或E，Z3選自G或N。
一些實施方案中，胰島素B鏈類似物包含(或為)SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，其在X1、X2、X3、X4、X5具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、或5個的胺基酸修飾。一些具體實施方案中，X1選自N或K，X2選自S或E，X3選自Y或H，X4選自L，和/或X5選自H。 一些具體實施方案中，X2為E，X5為H。一些具體實施方案中，X5為H。一些具體實施方案中，X3為H，X5為H。一些具體實施方案中，X1為K，X2為E，X5為H。
一些實施方案中，胰島素A鏈類似物包含(或為)SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，其在Z1、Z2、Z3具有至少1個、至少2個、或3個的胺基酸修飾。一些具體實施方案中，Z1選自T、H或E，Z2選自E，Z3選自G或N。一些具體實施方案中，Z1為E，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，Z1為H，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，Z2為E。一些具體實施方案中，Z1為E，Z2為E。
一些實施方案中，胰島素類似物中的胰島素B鏈類似物包含(或為)SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：1的序列，和胰島素A鏈類似物包含(或為)SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。其中，一些具體實施方案中，X1選自N或K，X2選自S或E，X3選自Y或H，X4選自L，X5選自H；和Z1選自T、H或E，Z2選自E，Z3選自G或N。一些具體實施方案中，X2為E，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，X5為H，Z1為H，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，X3為H，X5為H，Z2為E。一些具體實施方案中，X1為K，X2為E，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，X2為E，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，X2為E，X5為H，Z1為E，Z2為E。
一些具體實施方案中：
X1為N或K，X2為E，X3為Y，X4為L，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為G；
X1為N，X2為E，X3為Y，X4為L，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為N；
X1為N，X2為S，X3為Y，X4為L，X5為H，Z1為H，Z2為E，Z3為G；
X1為N，X2為S，X3為H，X4為L，X5為H，Z1為T，Z2為E，Z3為G；或
X1為N，X2為E，X3為Y，X4為L，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為G。
以上實施方案中，X6-X9或X7-X9可以各自為G；或，X6-X9或X7-X9可以不存在。
以上實施方案中，Z4可以不存在；或，當Z3為N時，Z4是除了G、N、S、V、L或P以外的胺基酸。
一些實施方案中，胰島素類似物中的胰島素B鏈類似物包含(或為)以下任一：
FVNQHLCGEHLVEALYLVCGERGFHY(SEQ ID NO：31)；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHY(SEQ ID NO：32)；
FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHY(SEQ ID NO：33)；
FVKQHLCGEHLVEALYLVCGERGFHY(SEQ ID NO：34)；
FVNQHLCGEHLVEALYLVCGERGFHY(SEQ ID NO：35)；
FVNQHLCGEHLVEALYLVCGERGFHY(SEQ ID NO：36)。
一些實施方案中，胰島素類似物中的胰島素A鏈類似物包含(或為)以下任一：
GIVEQCCESICSLEQLENYCG(SEQ ID NO：37)；
GIVEQCCHSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO：38)；
GIVEQCCTSICSLEQLENYCN(SEQ ID NO：39)；
GIVEQCCESICSLEQLENYCG(SEQ ID NO：40)；
GIVEQCCESICSLEQLENYCG(SEQ ID NO：41)；
GIVEQCCESICSLEQLENYCN(SEQ ID NO：42)。
一些實施方案中，胰島素類似物中的胰島素B鏈類似物和胰島素A鏈類似物包含(或為)以下任意一組所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：31和37；SEQ ID NO：32和38；SEQ ID NO：33和39；SEQ ID NO：34和40；SEQ ID NO：35和41；SEQ ID NO：36和42。
一些實施方案中，以上胰島素類似物中存在二硫鍵。一些具體實施方案中，在CysA7-CysB7和CysA20-CysB19處接合胰島素A鏈類似物和胰島素B鏈類似物的兩個二硫鍵；和/或在胰島素A鏈的類似物中CysA6-CysA11處的鏈內二硫鍵。
示例性地，“CysA7-CysB7”表示由胰島素A鏈類似物中從N端起第7位的Cys，與胰島素B鏈類似物中從N端起第7位的Cys之間形成鏈間二硫鍵。“CysA20-CysB19”表示由胰島素A鏈類似物中從N端起第20位的Cys，與胰島素B鏈類似物中從N端起第19位的Cys之間形成鏈間二硫鍵。
一些實施方案中，以上任一種的胰島素類似物具有胰島素受體激動活性。
一些實施方案中，以上胰島素類似物在胰島素A鏈類似物和胰島素B鏈類似物中的任意一個或任意多個(2、3、4、5、6、7、8等)位置處具有胺基酸修飾。一些實施方案中，該修飾為化學基團修飾，以改善胰島素類似物的化學和/或物理的穩定性，調節胰島素類似物的功效和/或提高表達。
一些實施方案中，經修飾的胰島素類似物為葡萄糖反應性胰島素。
一些實施方案中，以上胰島素類似物經脂肪酸鏈修飾。
融合蛋白
本揭露提供人胰島素類似物的融合蛋白。
一些實施方案中，融合蛋白包含胰島素類似物，
該胰島素類似物具有通式：B1-L1-A1；
其中，B1為胰島素B鏈類似物，其包含如下的胺基酸序列：
FVX1QHLCGX2HLVEALX3X4VCGERGFX5X6X7X8X9(SEQ ID NO：43)，其中，X1選自N、G或K；X2選自S或E；X3選自Y、H或E；X4選自H、R、L或E；X5選自F或H；X6選自G、T、S、H、V、Y或不存在；X7選自G、E、P、K、D、S、H或不存在；X8選自G、E、K、P、Q、D、H或不存在；X9選自G、T、S、E、K、A或不存在；
A1為胰島素A鏈類似物，其包含如下的胺基酸序列：
GIVEQCCZ1SICSLZ2QLENYCZ3Z4(SEQ ID NO：44)，其中，Z1選自T、H或E，Z2選自Y、D、S或E，Z3選自G或N；Z4是任意天然胺基酸或不存在，當Z3為N，Z4不為G或N。
L1為連接子。
一些實施方案中，融合蛋白包含胰島素類似物，
該胰島素類似物具有通式：B1-L1-A1；
其中，B1為胰島素B鏈類似物，其包含如下的胺基酸序列：
FVX1QHLCGX2HLVEALX3X4VCGERGFX5Y(SEQ ID NO：1)，其中，X1選自N、G或K，X2選自S或E，X3選自Y、H或E，X4選自H、R、L或E，X5選自F或H；
A1為胰島素A鏈類似物，其包含如下的胺基酸序列：
GIVEQCCZ1SICSLZ2QLENYCZ3(SEQ ID NO：2)，其中，Z1選自T、H或E，Z2選自Y、D、S或E，Z3選自G或N；
L1為連接子。
一些實施方案中，B1包含(或為)SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，其在X1、X2、X3、X4、X5具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、或5個的胺基酸修飾。一些具體實施方案中，X1選自N或K，X2選自S或E，X3選自Y或H，X4選自L，和/或X5選自H。一些具體實施方案中，X2為E，X5為H。一些具體實施方案中，X5為H。一些具體實施方案中，X3為H，X5為H。一些具體實施方案中，X1為K，X2為E，X5為H。
一些實施方案中，A1包含(或為)SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，其在Z1、Z2、Z3具有至少1個、至少2個、或3個的胺基酸修飾。一些具體實施方案中，Z1選自T、H或E，Z2選自E，Z3選自G或N。一些具體實施方案中，Z1為E，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，Z1為H，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，Z2為E。一些具體實施方案中，Z1為E，Z2為E。
一些實施方案中，胰島素類似物中的B1包含(或為)SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：1的序列，和，A1包含(或為)SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。其中，一些具體實施方案中，X1選自N或K，X2選自S或E，X3選自Y或H，X4選自L，X5選自H；和Z1選自T、H或E，Z2選自E，Z3選自G或N。一些具體實施方案中，X2為E，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，X5為H，Z1為H，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，X3為H，X5為H，Z2為E。一些具體實施方案中，X1為K，X2為E，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，X2為E，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為G。一些具體實施方案中，X2為E，X5為H，Z1為E，Z2為E。
一些具體實施方案中，X1為N或K，X2為E，X3為Y，X4為L，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為G；
X1為N，X2為E，X3為Y，X4為L，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為N；
X1為N，X2為S，X3為Y，X4為L，X5為H，Z1為H，Z2為E，Z3為G；
X1為N，X2為S，X3為H，X4為L，X5為H，Z1為T，Z2為E，Z3為G；或
X1為N，X2為E，X3為Y，X4為L，X5為H，Z1為E，Z2為E，Z3為G。
以上實施方案中，X6-X9或X7-X9可以各自為G；或，X6-X9或X7-X9可以不存在。
以上實施方案中，Z4可以不存在；或，當Z3為N時，Z4是除了G、N、S、V、L或P以外的胺基酸。
一些實施方案中，胰島素類似物中的B1包含(或為)SEQ ID NO：31-36中任一的胺基酸序列。
一些實施方案中，胰島素類似物中的A1包含(或為)SEQ ID NO：37-42中任一的胺基酸序列。
一些實施方案中，胰島素類似物中的B1和A1包含(或為)以下任意一組所示的胺基酸序列：SEQ ID NO：31和37；SEQ ID NO：32和38；SEQ ID NO：33和39；SEQ ID NO：34和40；SEQ ID NO：35和41；SEQ ID NO：36和42。
一些實施方案中，L1所示連接子為能夠實現連接功能的多肽，例如為柔性多肽。一些具體實施方案中，L1所示連接子包含(或為)以下序列：包括但不限於G4S(SEQ ID NO：53)、GS、GAP、ASGS(SEQ ID NO：54)、多聚鸟嘌呤(poly G)。一些具體實施方案中，L1所示連接子包括(或為)(GmSp)n，其中，m 各自獨立的選自1-10(例如，1、2、3、4、5、6)的整數，n各自獨立的選自1-10(例如，1、2、3、4、5、6)的整數，p各自獨立的選自0-4。一些具體實施方案中，GS或poly G連接子中至少具有5個G。
在本揭露中，GS連接子涵蓋連接子中包含胺基酸G和S的任意類型的連接子。
一些具體實施方案中，L1所示連接子包含(或為)GGSGGGG(SEQ ID NO：45)、GSGGGG(SEQ ID NO：46)、GGGGG(SEQ ID NO：47)、GGGGGGSGGGG(SEQ ID NO：3)或GGGGGSGGGG(SEQ ID NO：52)。
一些實施方案中，融合蛋白中還含有C1結構域，該C1結構域能夠延長胰島素類似物的半衰期。
一些實施方案中，融合蛋白中還含有C1結構域，該C1選自例如免疫球蛋白(例如IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM)的Fc区、HSA蛋白或多肽、HSA結合結构域(例如抗HSA抗體或其抗原結合片段)、XTEN、肽富含甘胺酸的高胺基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、彈性蛋白樣多肽(ELP)、CTP肽或明膠樣蛋白(GLK)聚合物。
一些具體實施方案中，XTEN肽是非結構化親水性長肽，其包含不同百分比的六種胺基酸：Ala、Glu、Gly、Ser和Thr，例如為XTENTM肽(Amunix Operating Inc.)。一些具體實施方案中，PAS多肽是由Pro、Ala和Ser殘基組成的親水性不帶電多肽，長度為至少約100、200、300、400、500或600個胺基酸。
一些實施方案中，一個融合蛋白中含有1個或多個(例如2、3、4個)胰島素類似物，和一個C1。
一些具體實施方案中，C1選自人IgG1、IgG2、IgG4的Fc區。一些具體實施方案中，Fc區含有突變，該Fc區的突變選自：IgG1上的L234A/L235A，IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S，IgG4上的F234A/ L235A，IgG4上的S228P或S228P/F234A/L235A，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A，IgG2上的V234A/G237A，IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358MV309L/A330S/P331S，IgG1上的L234F/L235E/D265A，IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S，IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S，以及IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。還可使用雜合IgG2/4Fc域，例如具有來自IgG2的殘基117-260和來自IgG4的殘基261-447的Fc。一些具體的實施方案中，該人IgG4的Fc區具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突變。一些具體的實施方案中，該人IgG1的Fc區具有L234A/L235A或L234A/L235A/P329G突變。一些實施方案中，上述Fc區的突變位點根據EU編號規則編號。
一些具體實施方案中，C1選自包含(或如)SEQ ID NO：17、18、48-51任一所示的胺基酸序列，或與之具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。
>人IgG1 Fc區1
Figure 112109789-A0202-12-0011-1
Figure 112109789-A0202-12-0011-2
Figure 112109789-A0202-12-0011-3
(SEQ ID NO：48)；
>人IgG1 Fc區2
Figure 112109789-A0202-12-0011-4
Figure 112109789-A0202-12-0011-5
Figure 112109789-A0202-12-0012-6
Figure 112109789-A0202-12-0012-7
(SEQ ID NO：49)：
>人IgG4 Fc區1
Figure 112109789-A0202-12-0012-8
Figure 112109789-A0202-12-0012-9
Figure 112109789-A0202-12-0012-10
(SEQ ID NO：50)；
>人IgG4 Fc區2
Figure 112109789-A0202-12-0012-12
Figure 112109789-A0202-12-0012-13
Figure 112109789-A0202-12-0012-11
(SEQ ID NO：51)。
一些实施方案中，融合蛋白中还含有L2，L2所示連接子為能夠實現連接功能的多肽(例如為柔性多肽)，C1藉由L2與B1-L1-A1形成融合蛋白。一些具體實施方案中，L2所示連接子包含(或為)以下序列：包括但不限於G4S、GS、GAP、ASGS、多聚鸟嘌呤(poly G)、(GmQ)n、(GmA)n、(GmQi)n、(GmAi)n或(PGPQ)s(SEQ ID NO：55)，其中，m各自獨立的選自1-10的整數(例如1、2、3、4、5、6)，n各自獨立的選自1-10的整數(例如1、2、3、4、5、6)，i各自獨立的選自0-4(例如0、1、2、3、4)，s選自1-10的整數(例如1、2、3、4、5、6)。一些具體實施方案中，L2包含(或為)SEQ ID NO：10-16任一所示的胺基酸序列。
一些實施方案中，融合蛋白中C1位於胰島素類似物的N端。另一些實施方案中，融合蛋白中C1位於胰島素類似物的C端。一些具體實施方案中， 融合蛋白中從N端到C端為B1-L1-A1-L2-C1，C1-L2-B1-L1-A1，A1-L1-B1-L2-C1或C1-L2-A1-L1-B1。
一些實施方案中，該胰島素類似物為具有胰島素受體激動活性的胰島素受體激動劑。
一些實施方案中，融合蛋白為單體、二聚體或多聚體。一些具體實施方案中，二聚體是同型二聚體，其中構成二聚體的兩個融合蛋白的胺基酸序列是相同或基本相同的。在另一些具體實施方案中，二聚體是異型二聚體，其中構成二聚體的兩個融合蛋白的胺基酸序列是不同的。
一些實施方案中，融合蛋白包含(或為)SEQ ID NO：19-27任一所示的胺基酸序列，或與之具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的序列。
一些實施方案中，本揭露的融合蛋白(例如SEQ ID NO：19-27任一的序列，更例如SEQ ID NO：19、20、21或27)具有降低的促細胞增殖的能力，從而具有降低的誘導腫瘤發生和/或腫瘤發展的風險。該細胞例如是表面表達IGF-1R的細胞。一些實施方案中，該降低是融合蛋白較之天然人胰島素促細胞(例如MCF-7)增殖的EC50值提高1至10倍、1至100倍、1至1000倍、1至10000倍、100至500倍、200至400倍；例如，EC50提高約100倍、約200倍、約300倍、約400倍、約500倍、約600倍、約700倍、約800倍、約900倍、約1000倍。一些具體實施方案中，SEQ ID NO：19所示的融合蛋白1具有較之天然人胰島素降低約200倍的促細胞增殖能力。可使用本揭露實施例5的方法檢測細胞(例如MCF-7)增殖的EC50。
一些實施方案中，本揭露的融合蛋白(例如SEQ ID NO：19-27任一的序列，更例如SEQ ID NO：19或20)具有1天至10天、2天至9天、2天至8天、3天至7天的半衰期，例如約1、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、 約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10天的半衰期。一些具體實施方案中，SEQ ID NO：19所示的融合蛋白1具有約4.5天的半衰期。可使用本揭露實施例6的方法檢測蛋白的半衰期。
多核苷酸
本揭露提供編碼本揭露的融合蛋白、胰島素類似物的多核苷酸。本揭露的多核苷酸可為RNA、DNA或cDNA。根據本揭露的一些實施方案，本揭露的核酸是基本上分離的核酸。
“基本上分離的”是指脫離其天然存在的狀態或經純化處理的狀態，並且在這種情況下意味著在指定的分子基本上不含其他生物分子或其他材料(例如細胞碎片或培養基)。“基本上分離的”並不意圖指完全不存在這些材料或不存在水、緩衝液或鹽，除非它們以顯著干擾治療用途的量存在。
本揭露的核酸也可呈載體形式，可存在於載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質粒、黏端質粒、YAC或病毒載體。載體可尤其為表達載體，即可提供融合蛋白、胰島素類似物在體外和/或體內(即在適合宿主細胞、宿主有機體和/或表達系統中)表達的載體。該表達載體通常包含至少一種本揭露的核酸，其可操作地連接至一個或多個適合的表達調控元件(例如啟動子、增強子、終止子等)。針對在特定宿主中的表達對該元件及其序列進行選擇為本領域技術人員的常識。對本揭露的融合蛋白、胰島素類似物表達有用或必需的調控元件及其他元件例如為啟動子、增強子、終止子、整合子、選擇標記物、前導序列、報告基因。
本揭露的核酸可基於本揭露的多肽的胺基酸序列的信息藉由已知的方式(例如藉由自動DNA合成和/或重組DNA技術)製備或獲得，和/或可從適合的天然來源加以分離。
宿主細胞
本揭露提供表達一種或多種本揭露的融合蛋白、胰島素類似物或含有本揭露的多核苷酸或載體的重組宿主細胞。一些實施方案中，宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。
細菌細胞例如包括革蘭氏陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株、鏈黴菌屬(Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細胞。
真菌細胞例如包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及麴菌屬(Aspergillus)的物種的細胞；或者包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)的物種的細胞。
哺乳動物細胞例如包括例如HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞等。
然而，本揭露也可使用兩栖類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及本領域中用於表達異源蛋白的任何其他細胞。
本揭露的細胞不能發育成完成的植株或動物個體。
生產或製備方法
本揭露提供製備本揭露的融合蛋白、胰島素類似物的方法，該方法通常包含以下步驟：
- 在允許表達本揭露的融合蛋白、胰島素類似物條件下，培養本揭露的宿主細胞；及
- 從培養物中回收由該宿主細胞表達的目的融合蛋白、胰島素類似物；及
- 視需要的，包括進一步純化和/或修飾本揭露的目的融合蛋白、胰島素類似物。
本揭露的融合蛋白、胰島素類似物可在如上所述細胞中以細胞內方式(例如在細胞質中、在周質中或在包涵體中)產生，接著從宿主細胞分離且視需要進一步純化；或其可以細胞外方式(例如在培養宿主細胞的培養基中)產生，接著自培養基分離且視需要進一步純化。
用於重組產生多肽的方法及試劑，例如特定適合表達載體、轉化或轉染方法、選擇標記物、誘導蛋白表達的方法、培養條件等在本領域中是已知的。類似地，適用於製造本揭露的蛋白的方法中的蛋白分離及純化技術為本領域技術人員所公知。作為一個示例，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的株。陽性的株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收 集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
然而，本揭露的融合蛋白、胰島素類似物也可以藉由本領域已知的其它產生蛋白質的方法獲得，例如化學合成，包括固相或液相合成。
醫藥組成物
本揭露提供醫藥組成物，其含有預防或治療有效量的選自以下的任一項或其組合：如上所述的融合蛋白、胰島素類似物或其編碼多核苷酸，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
一些具體實施方案中，該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的融合蛋白或胰島素類似物。另一些具體實施方案中，醫藥組成物單位劑量中含融合蛋白或胰島素類似物的量為0.1-2000mg；一些具體實施方案中為1-1000mg。
試劑盒(或藥盒)
本揭露提供試劑盒或藥盒，包含一個或多個容器，其各自獨立地包含選自以下的任一項或其組合：本揭露的融合蛋白、胰島素類似物或其編碼多核苷酸。
一些實施方案中，該裝置包含注射器和針。在一些具體實施方案中，該裝置是預充針。
預防、治療疾病的方法和製藥用途
本揭露提供了包含本揭露的融合蛋白或胰島素類似物的組成物、多核苷酸、醫藥組成物在預防、治療、緩解疾病或症狀中用途和方法。
一些實施方案中，包括向有需要的受試者施用有效量的本揭露的融合蛋白或胰島素類似物的方法，用於預防、治療、緩解疾病或症狀。
一些實施方案中，該疾病或症狀選自非胰島素依賴性糖尿病、胰島素依賴性糖尿病或其它代謝類疾病。該有需要的受試者未經治療，或用口服藥物(諸如，磺醯脲、二甲雙胍、噻唑烷二酮諸如吡格列酮、α-葡糖苷酶抑制劑諸如阿卡波糖)和/或非胰島素可注射劑(包括基於腸降血糖素的療法，諸如DPP-4抑制劑和GLP-1R激動劑)治療。
一些實施方案中，該疾病或症狀選自糖尿病、肥胖症、異常血脂症和/或代謝綜合症。
一些實施方案中，該疾病或症狀為糖尿病併發症，或糖尿病相關的心臟病、中風、腎病變、視網膜病、神經性病變或腎病。
一些實施方案中，該疾病或症狀選自高血糖症、II型糖尿病、葡萄糖耐量削弱、I型糖尿病、肥胖症、X綜合症或血脂異常。
一些實施方案中，提供向有需要的受試者施用有效量的本揭露的融合蛋白或胰島素類似物的方法，用於降低血糖。
本揭露還提供本揭露的融合蛋白、胰島素類似物用於製備預防、治療、緩解上述疾病或症狀的藥物的製藥用途。
定義
為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學。除非在本揭露中另有明確定義，本揭露使用的所有其它技術和科學都具有本揭露所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
“胰島素”包括天然存在的胰島素(例如人胰島素)，人胰島素由兩個多肽鏈組成，該兩個多肽鏈被稱為A和B鏈，其分別包含21個和30個胺基酸殘基且其藉由兩個半胱胺酸二硫鍵連接。A鏈示例性如本揭露SEQ ID NO：29所示，B鏈示例性如本揭露SEQ ID NO：30所示。
“胰島素類似物”包括多肽，其藉由去除和/或取代(置換)天然胰島素中存在的一個或多個胺基酸殘基和/或藉由添加一個或多個胺基酸殘基，具有形式上可以源自於天然存在胰島素(例如人胰島素結構)的分子結構。添加和/或取代的胺基酸殘基可以是可編碼的胺基酸殘基或其它天然存在的胺基酸殘基或純粹合成的胺基酸殘基。
“胰島素A鏈類似物”是指，相對於人胰島素的A鏈，其具有A鏈的一個或多個胺基酸取代、缺失和/或延長(添加)。
“胰島素B鏈類似物”是指，相對於人胰島素的B鏈，其具有B鏈的一個或多個胺基酸取代、缺失和/或延長(添加)。
“葡萄糖反應性胰島素”(GRI，glucose-responsive insulin)可以根據血糖水平調節胰島素的釋放和作用，從而達到降低低血糖發生率，使血糖控制更平穩。
術語“胰島素受體激動劑”是指結合至並且活化胰島素受體、導致血糖水平下降和/或肝葡萄糖排出抑制的蛋白，其特徵在於其可使用已知技術(諸如在本揭露實施例描述的研究中顯示的那些)進行測試和測量。在一些實施方案中，胰島素受體激動劑由胰島素A鏈類似物與胰島素B鏈類似物直接或間接連接(例如，藉由連接子連接)形成。
“序列”一般應理解為既包括相關胺基酸序列，又包括編碼該序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本揭露需要進一步限定的解釋。
“同源性”或“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
“核酸分子”與“多核苷酸”可互換使用，其是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。
“載體”意指能夠在宿主細胞中遞送並且表達一種或多種目的基因或序列的構建體。載體的例子包括但不限於病毒載體、裸露DNA或RNA表達載體、質粒、黏粒或噬菌體載體、與陽離子縮合劑結合的DNA或RNA表達載體、包封在脂質體中的DNA或RNA表達載體。
“宿主細胞”包括細胞或細胞培養物，其可為或已是載體的接受者。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，並且由於天然、偶然或有意的突變，子代可不一定與原始親本細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補體中)。宿主細胞包括用本揭露的多核苷酸在體內轉染和/或轉化的細胞。“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代(不考慮傳代次數)；例 如，包括與最初轉化細胞中篩選的親本細胞具有相同功能或生物學活性的突變後代。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述活性成分或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
“藥學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”包括當與活性成分組合時，允許該成分保留生物學活性並且不具有預期治療目的的任何材料。例子包括但不限於任何標準藥物載體，例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑如油/水乳劑、和各種類型的潤濕劑。在一些實施例中，用於氣霧劑或腸胃外施用的稀釋劑是磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理(0.9%)鹽水。包含此類載體的組成物藉由眾所周知的常規方法配製(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro，編輯，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；以及R Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing，2000)。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸，例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者治療劑，諸如包含本揭露的任一種融合蛋白或胰島素類似物為治療劑，該受試者已經患有、疑似患有、傾向於患有一種或多種糖尿病或高血糖相關疾病或其症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，是藉由以預防或延遲症狀或併發症的發作，減輕症狀或併發症，或者消除疾病、病況或病症到任何臨床能測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解某個受試者中目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。待治療的患者是哺乳動物，並且較佳地為人類。
“預防”是指降低一種或多種病況、症狀、併發症或病症的風險或發病率，或者消除或減緩一種或多種病況、症狀、併發症或病症的進展。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。
“受試者”、“患者”意指哺乳動物，尤其靈長類動物，尤其是人。
“約”、“大約”是指數值在由本領域一般技術人員所測定的具體值的可接受誤差範圍內，該數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。 例如，“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多20%的範圍，例如1%至15%之間、在1%至10%之間、在1%至5%之間、在0.5%至5%之間、在0.5%至1%之間變化，本揭露中，數字或數值範圍之前有術語“約”的每種情況也包括給定數的實施方案。除非另外說明，否則當具體值在本申請和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。
除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。
圖1為STZ誘導獲得的I型糖尿病大鼠模型中，單次皮下注射融合蛋白1後的降糖效果圖。
圖2為STZ誘導獲得的I型糖尿病大鼠模型中，單次皮下注射LY3209590、融合蛋白2、融合蛋白9後的降糖效果圖。
以下結合實施例用於進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制本揭露的範圍。
本揭露實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene 出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. 人胰島素類似物及其與Fc融合蛋白的設計
本實施例提供人胰島素類似物，從N端到C端的通式為：B1-L1-A1。
其中，B1為人胰島素B鏈類似物，序列為：
FVX1QHLCGX2HLVEALX3X4VCGERGFX5Y(SEQ ID NO：1)，其中，X1選自Asn，Gly或Lys的胺基酸殘基，X2選自Ser或Glu的胺基酸殘基，X3選自Tyr，His或Glu的胺基酸殘基，X4選自His，Arg，Leu或Glu的胺基酸殘基，X5選自Phe或His的胺基酸殘基；
A1為胰島素A鏈類似物，序列為：GIVEQCCZ1SICSLZ2QLENYCZ3(SEQ ID NO：2)，其中，Z1選自Thr，His或Glu的胺基酸殘基，Z2選自Tyr，Asp，Ser或Glu的胺基酸殘基，Z3選自Gly或Asn的胺基酸殘基；
L1為GGGGGGSGGGG(SEQ ID NO：3)或GGGGGSGGGG(SEQ ID NO：52)。
示例性人胰島素類似物的序列如下：
>人胰島素類似物1
FVNQHLCGHHLVEALYLVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCESICSLEQLENYCG(SEQ ID NO：4)
>人胰島素類似物2
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCHSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO：5)
>人胰島素類似物3
FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSICSLEQLENYCN(SEQ ID NO：6)
>人胰島素類似物4
FVKQHLCGEHLVEALYLVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCESICSLEQLENYCG(SEQ ID NO：7)
>人胰島素類似物5
FVNQHLCGEHLVEALYLVCGERGFHYGGGGGSGGGGGIVEQCCESICSLEQLENYCG(SEQ ID NO：8)
>人胰島素類似物6
FVNQHLCGEHLVEALYLVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCESICSLEQLENYCN(SEQ ID NO：9)。
進一步地，提供上述人胰島素類似物與Fc的融合蛋白，兩者的融合藉由如表1的連接子實現。
表1. 人胰島素類似物與Fc融合的連接子序列
Figure 112109789-A0202-12-0025-43
該Fc為人IgG2的Fc，胺基酸序列如下：
>IgG2 Fc1
Figure 112109789-A0202-12-0026-17
Figure 112109789-A0202-12-0026-18
(SEQ ID NO：17)
>IgG2 Fc2
Figure 112109789-A0202-12-0026-20
Figure 112109789-A0202-12-0026-19
(SEQ ID NO：18)。
示例性融合蛋白的胺基酸序列如下：
>融合蛋白1(胰島素類似物1+L2+IgG2 Fc1)
Figure 112109789-A0202-12-0026-21
(SEQ ID NO：19)
>融合蛋白2(胰島素類似物2+L2+IgG2 Fc1)
Figure 112109789-A0202-12-0027-22
(SEQ ID NO：20)
>融合蛋白3(胰島素類似物3+L2+IgG2 Fc1)
Figure 112109789-A0202-12-0027-23
(SEQ ID NO：21)
>融合蛋白4(胰島素類似物4+L2+IgG2 Fc1)
Figure 112109789-A0202-12-0027-24
(SEQ ID NO：22)
>融合蛋白5(胰島素類似物1+L2+IgG2 Fc1)
Figure 112109789-A0202-12-0027-25
Figure 112109789-A0202-12-0028-26
(SEQ ID NO：23)
>融合蛋白6(胰島素類似物5+L2+IgG2 Fc1)
Figure 112109789-A0202-12-0028-27
(SEQ ID NO：24)
>融合蛋白7(胰島素類似物1+L2+IgG2 Fc1)
Figure 112109789-A0202-12-0028-28
(SEQ ID NO：25)
>融合蛋白8(胰島素類似物1+L2+IgG2 Fc1)
Figure 112109789-A0202-12-0029-29
(SEQ ID NO：26)
>融合蛋白9(胰島素類似物6+L2+IgG2 Fc1)
Figure 112109789-A0202-12-0029-30
(SEQ ID NO：27)。
此外，LY3209590為美國禮來公司開發的一週給藥一次的超長效胰島素類似物，目前處於臨床三期研究階段，其胺基酸序列為：
Figure 112109789-A0202-12-0029-31
(SEQ ID NO：28)
下劃線均為連接子序列。
野生型人胰島素序列如下：
>A鏈
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO：29)
>B鏈
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO：30)。
實施例2. 人胰島素類似物-Fc融合蛋白的製備、表徵和鑑定
1.製備
1)HEK-293細胞表達
使用去除內毒素的中提試劑盒(Promega，A2495)抽提株正確的質粒，經測序正確後，準備細胞轉染生產蛋白。HEK293懸浮細胞使用Freestyle 293培養基(invitrogen，cat No.12338026)規律傳代，在轉染前一天傳代至密度6×105細胞/mL，轉染當天測定細胞活性與密度，保證細胞活性>90%，並調整細胞密度至1.1×106細胞/mL，按照1μg DNA/mL細胞的量準備質粒DNA，使用opti-MEM(invitrogen，cat No.51985-034)分別稀釋所用DNA及對應的293-feetin(Invitrogen，eat No.12347019)，輕搖混勻，室溫放置5min，將稀釋好的DNA和脂質體輕搖混合，室溫放置20min後緩慢加入待轉染的HEK293細胞中，輕輕旋轉細胞培養瓶。之後細胞放置在37℃搖床中懸浮震盪培養(5% CO2，135rpm，75%濕度)，轉染後5天收取細胞培養液上清，4000轉/min離心20min，取上清液並使用0.45um濾器進行過濾。
2)ExpiCHO細胞表達
ExpiCHO懸浮細胞使用ExpiCHO表達培養基(Invitrogen，Cat No.A2910002)規律傳代，按照1μg DNA/mL轉染細胞的量比使用ExpiCHO表達系統(Cat.no.A29133)進行轉染。採用說明書中“High protocol”，轉染後將細胞放置於32℃搖床懸浮震盪培養(5% CO2，110rpm，75%濕度)，轉染後第10-12天收取細胞培養液上清，4000轉/min離心20min，取上清並使用0.45μm的濾器過濾。
3)表達量檢測
將人胰島素類似物-Fc融合蛋白採用紫外吸收法測試純化後蛋白的OD280並以此為依據推算各融合蛋白在不同表達體系中的表達量。結果顯示，融合蛋白1至9在HEK293表達體系中均可表達，部分融合蛋白產量優異。例如，融合蛋白1為119mg/L，融合蛋白4為116mg/L，融合蛋白6為132mg/L，融合蛋白7為110mg/L，融合蛋白8為119mg/L。在ExpiCHO瞬轉表達體系中，融合蛋白1的表達量超過400mg/L。
4)純化
Protein-A親和層析：
將表達Fc融合蛋白的細胞培養上清進行高速離心收取上清後使用0.22μm濾膜過濾。Protein-A(GE，Cat：17-5474-99)親和管柱利用5倍柱體積的0.1M NaOH水溶液(Sigma：Cat：71687-500g)再生，然後用5倍管柱體積的1×PBS緩衝液(pH 7.4)(Sangon Biotech(Shanghai)co.，Ltd.：Cat.E607016-0500)清洗平衡。將上清低流速進行上樣，以便結合，控制流速使保留時間約至少1min，結合完畢後利用5-10倍柱體積的1×PBS緩衝液(pH 7.4)沖洗層析管柱至紫外吸收回落至基線。之後，利用0.1M甘胺酸(pH 3.0)(Sigma：Cat.410225-250G)緩衝液進行 樣品沖提，根據紫外檢測收集沖提峰，沖提產物利用1M Tris-HCl(pH7.5)(Vetec，Cat.V900483)快速調節pH至7-8，暫存。對於沖提產物，可以利用本領域技術人員熟知的方法進行溶液置換，如利用超濾管進行超濾濃縮，及溶液置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻(如G-25脫鹽)替換成所需的緩衝體系。人胰島素類似物-Fc融合蛋白最終的保存體系為1×PBS緩衝液，pH 7.4。
陰離子層析：
第一步，使用平衡緩衝液20mM Tris pH 8.0(Vetec，Cat.V900483)稀釋樣品，使其電導率低於3ms/cm，Q HP(GE，Cat：17-1014-01)陰離子層析管柱用5倍管柱體積的0.5M NaOH水溶液(Sigma Cat：71687-500g)再生後用15倍管柱體積的20mM Tris緩衝液pH 8.0(Vetec，Cat.V900483)清洗平衡。將上清低流速進行上樣，以便結合，控制流速使保留時間至少2min，結合完畢後利用10倍管柱體積的20mM Tris緩衝液pH 8.0(Vetec，Cat.V900483)沖洗層析管柱至紫外吸收回落至基線。用沖提緩衝液20mM Tris pH 8.0(Vetec，Cat.V900483)0.5M NaCl(Vetec，Cat.V900058)進行0-100%的梯度沖提；根據SEC-HPLC(Column：TSKgel G3000SWXL，5μm，Cat.008541)純度，檢測收集沖提峰。對於沖提產物可以利用所屬技術領域具有通常知識者熟知的方法進行溶液置換，如利用超濾管進行超濾濃縮及溶液置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻(如G-25脫鹽)替換成所需的緩衝體系。人胰島素類似物-Fc融合蛋白最終的保存緩衝體系為1×PBS緩衝液，pH 7.4。
2.表徵和鑑定
體積排阻色譜(SEC-HPLC)：使用安捷倫1260 infinity高效液相色譜系統，色譜管柱使用Tosoh(TSGel-G3000SWXL，色譜管柱尺寸為7.8mm×300 mm)。進樣前，使用含5%異丙醇的2×PBS緩衝液平衡色譜管柱及系統，接著進樣15μg後使用相同緩衝液沖提，方法持續時間為20min，方法流速為1mL/min。
超高效液相色譜-質譜聯用：使用安捷倫1290-6530超高效液相色譜-質譜聯用系統進行表徵，色譜管柱使用賽分-C4(粒徑3μm，色譜管柱尺寸為：2.1mm×50mm)，流動相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸的乙睛，流速為1mL/min，色譜管柱溫度維持在60℃，所使用的色譜梯度如表2所示。質譜儀相關檢測參數設置模式：1GHz，毛細管電壓：5000V，去溶劑氣體溫度：350℃，氣體流速：12L/min，Fragmentor電壓：380V，MS採集範圍：100m/z-4000m/z。
表2. 色譜梯度
Figure 112109789-A0202-12-0033-32
表3數據顯示，融合蛋白1至9經純化後皆具有良好的純度和符合預期的分子量。
表3. SEC-HPLC純度及分子量
Figure 112109789-A0202-12-0033-33
Figure 112109789-A0202-12-0034-34
以下實施例對本揭露融合蛋白的生物學活性進行測試。
實施例3. B型人胰島素受體(hIR-B)自磷酸化檢測實驗
在過表達人胰島素受體B亞型的CHO-K1細胞中考察不同人胰島素類似物-Fc融合蛋白促進人胰島素受體B亞型自磷酸化的活性，並進行對比。藉由計算在該測試體系中得到的EC50值對各融合蛋白促進人胰島素受體B亞型自磷酸化活性進行評估，更低的EC50值意味著更高的體外活性。
實驗方法：實驗開始前18個小時，用CHO-K1-hIRB細胞(上海輝源，CHO-K1-hIRB-M-20170706)鋪96孔板，104/孔，加入100μL生長培養基(F-12K培養基，含10% FBS，4μg/mL殺稻瘟菌素的1×青黴素-鏈黴素)，37℃，5% CO2培養過夜；實驗當天早上，按照需求稀釋人胰島素類似物-Fc融合蛋白於50μL饑餓培養基(F-12K培養基，含0.1% BSA，4ug/mL殺稻瘟菌素的1×青黴素-鏈黴素)，捨棄舊培養基後，用含人胰島素類似物-Fc融合蛋白的饑餓培養基孵育細胞，37℃，5% CO2孵育20分鐘；之後捨棄培養基，用試劑盒(IR-beta phospho-Y1150/1151試劑盒，Cisbio，批號：63ADK016PEG)中的細胞裂解液裂解細胞，37℃孵育30min；之後吸取16μL裂解液到96孔板中，加入4μL配好 的抗體混合液(含Phospho InsuLin Receptor beta Cryptate antibody及Phospho InsuLin Receptor beta d2 antibody)，室溫下孵育4h。
數據處理方法：使用Tecan酶標儀進行信號讀取，激發波長為320nm，發射波長為620nm和665nm。計算信號比值(665nm/620nm×10,000)，並在GraphPad Prism 6中將信號比值與樣品濃度使用四參數方程進行非線性擬合，得出EC50值，見表4。本實施例及在後實施例中作為對照的人胰島素購自Sigma-Aldrich。
表4. 人胰島素類似物-Fc融合蛋白的B型胰島素受體自磷酸化活性
Figure 112109789-A0202-12-0035-35
表4結果顯示，本揭露的融合蛋白均具有一定激活胰島素受體B亞型自磷酸化的活性，EC50值顯示所有融合蛋白的活性顯著弱於天然人胰島素，部分融合蛋白激活胰島素受體B亞型自磷酸化的活性與LY3209590相當或略強。這說明所揭露的融合蛋白均為人胰島素受體激動劑，但相比天然人胰島素而言，活性減弱，在臨床上具有更安全的給藥窗口，能降低患者的低血糖等相關副作用。
實施例4. C2C12小鼠成肌細胞AKT磷酸化活性檢測實驗
胰島素類似物結合胰島素受體後會激活下游的一系列信號通路，其中刺激AKT磷酸化是胰島素及其類似物產生降血糖效果的一條主要信號通路。因此，在C2C12小鼠成肌細胞中考察不同人胰島素類似物-Fc融合蛋白刺激AKT磷酸化的活性，並進行對比。藉由計算各融合蛋白在該測試體系中的EC50值對各融合蛋白刺激小鼠成肌細胞AKT磷酸化活性進行評估，更低的EC50值意味著更高的活性。
實驗方法：實驗開始前18個小時，用C2C12細胞(Procell，CL-0044)鋪96孔板，104/孔，加入100μL生長培養基(DMEM培養基，含10% FBS的1×青黴素-鏈黴素)，37℃，5% CO2培養過夜；實驗當天早上，按照需求稀釋人胰島素類似物-Fc融合蛋白於50μL饑餓培養基(DMEM培養基，不含FBS的1×青黴素-鏈黴素)，捨棄舊培養基後，用含人胰島素類似物-Fc融合蛋白的饑餓培養基孵育細胞，在37℃，含5% CO2培養箱內孵育20分鐘；之後捨棄培養基，用試劑盒(AKT phospho-S473 kit，Cisbio，64AKSPEG)中的細胞裂解液裂解細胞，37℃條件下孵育30min；之後吸取16μL裂解液於96孔板中，並加入4μL配好的抗體混合液(含Phospho-AKT Eu Cryptate antibody和Phospho-AKT d2 antibody)，室溫下孵育4h。使用實施例3中的數據處理方法，得出EC50值，見表5。
表5. 人胰島素類似物-Fc融合蛋白C2C12小鼠成肌細胞刺激AKT磷酸化活性
Figure 112109789-A0202-12-0037-36
結果顯示，本揭露的融合蛋白均具有一定激活胰島素受體AKT磷酸化的活性，EC50值顯示所有融合蛋白的活性顯著弱於天然人胰島素，部分融合蛋白的活性與LY3209590相當。這說明，融合蛋白皆具有顯著刺激小鼠成肌細胞AKT磷酸化的活性，但其活性弱於天然人胰島素。
實施例5. 促人MCF-7(人乳腺癌細胞)增殖實驗
在人MCF-7乳腺癌細胞中考察本揭露部分人胰島素類似物-Fc融合蛋白激活下游信號通路促進細胞增殖的能力。對於胰島素及胰島素類似物，有許多的研究表明除了其誘導的降血糖等一系列代謝活性，胰島素及胰島素類似物也有激活下游其它信號通路進而促進細胞增殖的活性。促進細胞增殖的活性與胰島素及其類似物誘導腫瘤生成的現象密切相關。其中，諾和諾德公司研發的速效胰島素類似物B10 Asp胰島素的後期開發被該化合物在大鼠模型中觀察到顯著的腫瘤生成所終止。因此，本實驗的目的在於使用MCF-7人類乳腺癌細胞對本揭露中的融合蛋白誘導細胞增殖的能力進行評估，大幅降低的促細胞增殖能力意味著後期更低的誘導腫瘤生成的風險。有研究顯示，胰島素或其類似物的這種促細胞增殖的能力與部分細胞表面表達IGF-1R有關，胰島素或其類似物與IGF-1R反應，會促進細胞的增殖，從而誘導腫瘤發生發展的可能性。
實驗方法：實驗開始前將MCF-7細胞(Procell,CL-147)在含0.5% FBS的DMEM培養基中重新懸浮並計數，在96孔透明底黑色細胞培養板中每孔加入100μL細胞懸液，密度為5×103細胞/孔，37℃，5% CO2培養過夜；實驗當天早上，按照需求稀釋人胰島素類似物-Fc融合蛋白於50μL饑餓培養基(DMEM培養基，含0.5% FBS)，捨棄舊培養基後，用含人胰島素類似物-Fc融合蛋白的饑餓培養基孵育細胞，37℃，5% CO2，孵育3天；孵育結束後，在96孔板中加入CellTiter-Glo檢測液(50μL)室溫搖晃混勻2min，避光放置10min後，使用Tecan酶標儀，讀取螢光值並計算EC50值，見表6。
表6. 人胰島素類似物-Fc融合蛋白促MCF-7增殖活性
Figure 112109789-A0202-12-0039-44
結果顯示，在多次平行實驗中(表6為其中一次)，融合蛋白1均相對於天然人胰島素皆具有較弱的刺激MCF-7細胞增殖的活性。令人意料不到的是，相對於LY3209590，融合蛋白1有顯著降低的刺激MCF-7人類乳腺癌細胞增殖的活性，提示該融合蛋白具有潛在更低的誘導腫瘤生成的風險。同時，本揭露的其他融合蛋白2至9也顯示對MCF-7較之人胰島素更低的促細胞增殖活性。例如，融合蛋白2的促MCF-7增殖活性的EC50為LY3209590的EC50值的約2倍。
實施例6. 人胰島素類似物-Fc融合蛋白藥物代謝動力學特性檢測
本實施例以SD大鼠為動物模型，研究融合蛋白1在正常雄性SD大鼠體內單次皮下或靜脈注射給藥後的藥物代謝動力學特性。
實驗方法：選取體重170-200克、週齡5-7週的雄性SD大鼠(購自維通利華)。用1×PBS緩衝液配製融合蛋白1，按照30nmol/kg的劑量藉由尾靜脈或背側皮下注射進入大鼠體內，給藥後不禁食，分別於給藥後15min、1h、2h、4h、第1天、第3天、第5天、第8天、第11天、第14天、第21天和第25天眼眶取血，EDTA抗凝，離心後得到血漿，用於體內藥物代謝動力學特性的分析。藥物代謝動力學特性分析採用酶聯免疫吸附法進行，使用捕獲抗體抗人IgG-Fc(I2136，sigma)包被多孔板，加入胰島素多株抗體(337E2A20，invitrogen)，其與待測分子發生特異性結合，然後用檢測抗體抗兔IgG過氧化物酶(A0545， sigma)去定量血漿中待測分子的濃度。測試中所實驗的標準曲線和樣品均使用採用含1%大鼠血漿(EDTA)配製。結果參見表7、表8。
表7. 融合蛋白1在SD大鼠中的血藥濃度-時間變化關係
Figure 112109789-A0202-12-0040-38
表8. 融合蛋白1在SD大鼠中的藥物代謝動力學特性
Figure 112109789-A0202-12-0041-39
結果顯示，融合蛋白1在正常大鼠體內單次靜脈/皮下注射給藥後均具有超長的體內藥物代謝動力學特性，半衰期在4.5天左右，意味著該融合蛋白可能具有臨床上更低的給藥頻率及更長的給藥間隔。
實施例7. 人胰島素類似物-Fc融合蛋白在I型糖尿病大鼠模型的藥效學研究
本實施例採用鏈脲佐菌素(STZ)誘導大鼠作為I型糖尿病動物模型，考察部分人胰島素類似物-Fc融合蛋白單次皮下注射給藥後的降糖效果及持續時間，以綜合評估降糖活性和體內藥物代謝動力學特性。
實驗方法：選取8週齡的雄性SD大鼠(購自維通利華)，體重350克左右，適應性餵養一週。配製pH範圍在4.2-4.5之間的檸檬酸/檸檬酸鈉緩衝液，使用該緩衝液溶解STZ至1%(w/v)濃度後根據大鼠實際空腹體重腹腔注射 STZ，劑量為每隻大鼠60mg/kg。STZ注射後第三天測試大鼠的空腹血糖，當血糖實測值高於15mM即判定為造模成功。
使用1×PBS緩衝液，pH 7.4，配製人胰島素類似物-Fc融合蛋白至相應的濃度。給藥前，測試各I型糖尿病大鼠的血糖，選取血糖值在20-30mM之間的大鼠進行隨機分組，確保每組(3隻或6隻)大鼠的平均血糖和標準差相當。分組完成後，對於每組大鼠基於其體重分別採用皮下注射的方式給予相應的人胰島素類似物-Fc融合蛋白，給藥後允許大鼠正常進食及飲水，並在給藥後1h、2h、4h、24h、48h等持續監測動物的血糖值，直到血糖恢復到給藥前血糖水平，並繪製相應的血糖值隨時間變化的曲線圖。
在STZ誘導I型糖尿病大鼠模型中，融合蛋白1(給藥劑量：90nmol/kg)單次皮下注射給藥後的血糖濃度隨時間變化關係如圖1所示；LY3209590、融合蛋白2和融合蛋白9(給藥劑量：均為30nmol/kg)的血糖濃度隨時間變化關係如圖2所示。結果顯示，融合蛋白1、融合蛋白2、融合蛋白9均具有時間較長的降糖效果，其中，融合蛋白1單次皮下注射給藥後的降糖效果至少可持續300小時。
實施例8. 人胰島素類似物-Fc融合蛋白在db/db二型糖尿病小鼠模型中的藥效學研究
本實施例採用db/db二型糖尿病小鼠模型，考察部分人胰島素類似物-Fc融合蛋白多次皮下注射給藥後對糖化血紅蛋白的改善，以綜合評估降糖活性和體內藥物代謝動力學特性。
實驗方法：購入50隻db/db小鼠，適應環境5天，選擇隨機血糖水平高於20mmol/L的動物繼續分組試驗。試驗共分為4個組，分別為模型對照組(溶媒對照組，成分為：0.08M組胺酸，70g/L蔗糖，0.4g/L聚山梨酯80)、融合蛋白1-低劑量組、融合蛋白1-中劑量組和融合蛋白1-高劑量組，每組10隻動 物，共40隻。分組後第一天開始給藥，每週給藥一次，共給藥4次，給藥方式為皮下注射。試驗終點對所有小鼠糖化血紅蛋白進行檢測，檢測方法為動物經腹主靜脈取血0.4mL，注入EDTA抗凝管，直接上機檢測糖化血紅蛋白。結果參見表9。
表9. 動物糖化血紅蛋白結果(%)
Figure 112109789-A0202-12-0043-40
根據試驗結果，模型對照組的糖化血紅蛋白含量為11.27±0.87%，融合蛋白1的低中高劑量組的糖化血紅蛋白含量分別為11.01±0.86%、10.58±0.44%(p=0.0481)和10.41±0.45%(p=0.0171)，中劑量組和高劑量組與模型對照組相比有統計學差異，三個劑量組間有一定的劑量效應關係。以上結果提示，融合蛋白1的中、高劑量組可以顯著降低db/db小鼠體內的糖化血紅蛋白含量，而低劑量組的作用不明顯，三個劑量組有一定的劑量效應關係。
實施例9. 人胰島素類似物-Fc融合蛋白在巴馬豬體內藥物代謝動力學特性測試
本實施例以巴馬豬為動物模型，研究融合蛋白1和LY3209590在巴馬豬體內單次皮下注射給藥後的藥物代謝動力學特性。
實驗方法：選取體重13-18千克、4-6月齡的雄性巴馬豬(宜賓橫豎生物科技有限公司)。用溶媒(成分：80mM組胺酸，70g/L蔗糖，0.4g/L吐溫 80)和1×PBS緩衝液分別配製融合蛋白1和LY3209590，分別按照5nmol/kg和2nmol/kg的劑量藉由皮下注射進入動物體內，給藥後的1h、4h、8h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h採集靜脈血約1mL，不抗凝。全血樣品離心前冰盒中暫存，於2至8℃、離心力約1800×g離心10分鐘，分離2管血清(其中1管約100μL，剩餘血清存於另1管)，-66℃以下保存用於體內藥物代謝動力學特性的分析。藥物代謝動力學特性分析採用和實施例6類似的方法進行，具體藥物代謝動力學參數見表10。
表10. 融合蛋白1和LY3209590在巴馬豬體內的藥物代謝動力學特性
Figure 112109789-A0202-12-0044-41
結果顯示，融合蛋白1在巴馬豬體內單次皮下注射給藥後具有超長的體內藥物代謝動力學特性。在表10中給藥劑量下，藥物半衰期(t1/2)不會隨給藥劑量發生明顯變化。與LY3209590相比，融合蛋白1的半衰期顯著延長，其半衰期在120小時左右，意味著該融合蛋白具有臨床上更低的給藥頻率及更長的給藥間隔。
本揭露提供新型人胰島素類似物和IgG Fc區的融合蛋白，可用於治療如I型糖尿病或II型糖尿病等代謝類疾病。該融合蛋白具有超長的體內藥 物代謝動力學特性，在STZ-誘導I型糖尿病大鼠模型和db/db二型糖尿病小鼠模型中顯示良好且持久的降糖效果，具有優異的物理/化學穩定性和較高的表達產量，相對於天然人胰島素具有顯著更低的體外誘導細胞增殖活性，提示具有潛在良好的安全性和較低的用藥風險，可滿足臨床對超長效胰島素產品的需求。
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Claims (19)

  1. 一種融合蛋白，其包含：
    胰島素類似物，其從N端向C端具有通式：B1-L1-A1；
    其中，
    B1為胰島素B鏈類似物，其包含如下的胺基酸序列：
    FVX1QHLCGX2HLVEALX3X4VCGERGFX5Y(SEQ ID NO：1)，其中，
    X1選自N、G或K，
    X2選自S或E，
    X3選自Y、H或E，
    X4選自H、R、L或E，
    X5選自F或H；
    A1為胰島素A鏈類似物，其包含如下的胺基酸序列：
    GIVEQCCZ1SICSLZ2QLENYCZ3(SEQ ID NO：2)，其中，
    Z1選自T、H或E，
    Z2選自Y、D、S或E，
    Z3選自G或N；
    L1為連接子，較佳為GS連接子和/或至少具有5個G的連接子，更佳為SEQ ID NO：3或52所示胺基酸序列的連接子。
  2. 如請求項1所述的融合蛋白，其中，
    X1選自N或K，X2選自S或E，X3選自Y或H，X4選自L，X5選自H；
    Z1選自T、H或E，Z2選自E，Z3選自G或N。
  3. 如請求項1或2所述的融合蛋白，其中，
    該胰島素B鏈類似物包含或選自SEQ ID NO：31-36任一所示的胺基酸序列，
    該胰島素A鏈類似物包含或選自SEQ ID NO：37-42任一所示的胺基酸序列；
    較佳地，該融合蛋白包含如SEQ ID NO：4-9任一所示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的融合蛋白，其還含有C1，9哀C1選自如下至少一種：免疫球蛋白的Fc區、HSA、HSA結合結構域；
    較佳地，該C1選自IgG的Fc區；
    更佳地，該C1選自人IgG1、IgG2、IgG4的Fc區。
  5. 如請求項4所述的融合蛋白，其中，該C1位於該胰島素類似物的N端或C端，較佳位於該胰島素類似物的C端。
  6. 如請求項4或5所述的融合蛋白，其中，該C1包含或為SEQ ID NO：17、18、48-51任一所示的胺基酸序列，或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  7. 如請求項4至6中任一項所述的融合蛋白，其還含有連接子L2，C1藉由L2與B1-L1-A1形成融合蛋白；
    較佳地，該L2選自以下任一項：(GmQi)n、(GmAi)n、(GmQ)n、(GmA)n、(PGPQ)s，其中，
    m各自獨立的選自1-10的整數，
    n各自獨立的選自1-10的整數，
    i各自獨立的選自0-4；
    s選自1-10的整數；
    更佳地，該L2包含或為SEQ ID NO：10-16任一所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項4至7中任一項所述的融合蛋白，其包含或為SEQ ID NO：19-27任一所示的胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的融合蛋白，其是二聚體，較佳為同二聚體。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的融合蛋白，其中，該胰島素類似物為具有胰島素受體激動活性的胰島素受體激動劑。
  11. 一種胰島素類似物，其含有胰島素B鏈類似物和胰島素A鏈類似物，其中，
    胰島素B鏈類似物包含如下的胺基酸序列：
    FVX1QHLCGX2HLVEALX3X4VCGERGFX5Y(SEQ ID NO：1)，其中，X1選自N、G或K，X2選自S或E，X3選自Y、H或E，X4選自H、R、L或E，X5選自F或H；
    胰島素A鏈類似物包含如下的胺基酸序列：
    GIVEQCCZ1SICSLZ2QLENYCZ3(SEQ ID NO：2)，其中，Z1選自T、H或E，Z2選自Y、D、S或E，Z3選自G或N；
    較佳地，X1選自N或K，X2選自S或E，X3選自Y或H，X4選自L，X5選自H；Z1選自T、H或E，Z2選自E，Z3選自G或N。
  12. 如請求項11所述的胰島素類似物，其中，
    胰島素B鏈類似物包含或選自SEQ ID NO：31-36任一所示的胺基酸序列，
    胰島素A鏈類似物包含或選自SEQ ID NO：37-42任一所示的胺基酸序列；
    較佳地，
    胰島素B鏈類似物和胰島素A鏈類似物分別包含或選自如下任意一組：
    SEQ ID NO：31和37所示胺基酸序列；
    SEQ ID NO：32和38所示胺基酸序列；
    SEQ ID NO：33和39所示胺基酸序列；
    SEQ ID NO：34和40所示胺基酸序列；
    SEQ ID NO：36和42所示胺基酸序列。
  13. 如請求項11或12所述的胰島素類似物，其中，該胰島素A鏈類似物和該胰島素B鏈類似物之間形成二硫鍵。
  14. 一種葡萄糖反應性胰島素，其包含如請求項11至13中任一項所述的胰島素類似物。
  15. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白、或如請求項11至13中任一項所述的胰島素類似物、或如請求項14所述的葡萄糖反應性胰島素。
  16. 一種宿主細胞，其含有如請求項15所述的多核苷酸。
  17. 一種製備融合蛋白或胰島素類似物的方法，包括：
    培養如請求項16所述的宿主細胞；
    回收如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白或如請求項11至13中任一項所述的胰島素類似物；
    視需要地，純化和/或修飾該融合蛋白、胰島素類似物。
  18. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白、如請求項11至13中任一項所述的胰島素類似物或如請求項14所述的葡萄糖反應性胰島素；以及一種或多種藥學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
  19. 一種治療糖尿病及其併發症或降低血糖的方法，包括向有需要的受試者施用治療有效量的如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白、如請求 項11至13中任一項所述的胰島素類似物、如請求項14所述的葡萄糖反應性胰島素或如請求項18所述的醫藥組成物；
    較佳地，該糖尿病及其併發症選自：I型糖尿病、II型糖尿病及其併發症；
    更佳地，該併發症選自糖尿病相關的心臟病、中風、視網膜病、神經性病變或腎病。
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