CN113105561B

CN113105561B - 一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用

Info

Publication number: CN113105561B
Application number: CN202110499380.8A
Authority: CN
Inventors: 朱升龙; 陈永泉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Wuxi Daida Kangjian Biomedical Technology Co ltd; Zhu Shenglong
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2041-04-30
Also published as: US11845781B2; WO2022227707A1; CN113105561A; US20230265141A1

Abstract

本发明公开了一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明对于FGF19序列进行改造，并将其与GLP‑1进行融合，得到的新型融合蛋白与野生型FGF19及GLP‑1相比具有更长效、更稳定的效果，进一步减少了FGF19致癌的风险，能更好的改善肝脏损伤及纠正代谢紊乱、胖症、超重、代谢综合征、糖尿病、血脂异常等病症，且治疗过程中均未出现GLP‑1治疗引起饮食下降等胃肠道不适的副作用，具备广阔的应用前景。

Description

一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用，属于医药技术领域。

背景技术

成纤维细胞生长因子19(FGF19)是新近发现的一种代谢调节因子，由胆汁酸分泌进入肠道后刺激肠道分泌和表达。FGF19经肠道分泌后可随循环进入肝脏并与肝脏中的FGFR4结合起作用，它具有激素样作用，发挥着重要的代谢调节作用，如调节胆汁酸代谢、调节胆囊的充盈、提高能量代谢降低体质量、改善血糖等。由于前期多项研究表明FGF19具有促有丝分裂作用，FGFR4能促进FGF19在肝脏中的增殖并具有促癌作用。2014年有研究发现FGF19N末端结构域是与FGFR相互作用至关重要的区域，因此，选择性地敲除识别FGFR4受体的区域，能消除FGF19促有丝分裂的活性，因此，多篇文章集中在FGF19的N端进行突变。

NGM282就是在人FGF19的N端进行突变得到的非致瘤性工程化变体。NGM282刚刚在美国完成II期临床研究，结果显示，79％的患者达到主要治疗终点，34％的患者在12周时达到正常的肝脏脂肪含量。该突变体改善了患者肝功能、脂质代谢和纤维化的血清生物标志物，显示出治疗代谢类疾病的疗效。但是在上述临床研究中除了观察到一些常见的消化道症状、恶心和注射部位红斑外，还发现FGF19突变体NGM282注射后可以显著提高胆固醇含量，而多项研究表明胆固醇含量升高是代谢类疾病的显著高危因素之一，这对代谢类疾病治疗来说是个巨大的风险。此外，FGF19还会引起厌食，食欲降低等症状，对未来治疗过程存在一定的隐患。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)作为胰高血糖素原(proglucagon)基因的翻译加工后，产物于1984年被首次发现(MajaovS等，JBiolChem，1986，261：11880-11889)。在肠道的L细胞中，胰高血糖素原被剪切为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和肠高血糖素(NielsenLL等，RegulPept，2004，117：77-88)。肠道最初产生的GLP-1为无活性的37肽，需要切除N末端6肽后，形成具有生物活性的GLP-1(7-37)，其C末端甘氨酸可以作为酰胺化酶的底物，降解为GLP-1(7-36)酰胺形式，C末端酰胺化增加了GLP-1的体内稳定性。肠道中天然产生的GLP-1有80％左右以后一种形式存在(KiefferTJ等，EndocrRev，1999，25：876-913)。食物在肠道的消化吸收过程中，刺激肠道L细胞分泌GLP-1，其中糖类和脂类的刺激作用最强。正常人餐后5-30分钟内，血浆GLP-1浓度即显著上升。GLP-1作为一种重要的肠降血糖素，其主要的生物学功能包括：(1)与胰岛β细胞上的特异受体GLP-1R结合，刺激胰岛素的生成与释放；(2)降低体重；(3)改善脂质代谢紊乱；(4)降低胃排空的速度、抑制食欲(Vaidya，HB等，CurrDrugTargets，2008，9：911-92)。

尽管天然GLP-1在治疗糖尿病及改善血脂上有诸多优点，但在体内血浆半衰期很短限制了其临床上的直接应用。体内二肽酰基肽酶IV(dipeptidylpeptidaseIV，DPPIV)可特异性识别GLP-1N末端第二位的Ala残基，从肽链的N末端切除二肽，使GLP-1在体内很快被降解为无活性的GLP-1(9-36)和GLP-1(9-37)，其生物半衰期仅为2分钟左右。

由此可见，尽管目前对于GLP-1的研究已较为深入，对其结构和功能的研究已较充分，但是其仍然存在半衰期短仍然抑制着其发挥更大的作用，而FGF19作为新发现的代谢调节因子，虽然其具备降低肝脏脂肪的功效，但同时又提升了血清中胆固醇含量，对机体造成另一方面的损伤，同样阻碍着其更一步的应用。

发明内容

为了解决目前存在的GLP-1半衰期段、FGF19副作用大的问题，发明人对GLP-1和FGF19的氨基酸序列进行改造，并将其进行融合，来降低两者的副作用，如GLP-1半衰期短等副作用，增加FGF19降糖功效并减少其升高胆固醇的功能且进一步减少FGF19致癌的风险。

本发明提供的含有GLP-1或其类似物exendin-4和人FGF19突变体的融合蛋白，通过重组DNA技术实现制备和生产。该融合蛋白作为一种治疗药物或者药物组合物，可用于高血糖和高血脂相关联的疾病如糖尿病、肥胖、脂肪性肝炎或心血管疾病的治疗。

本发明提供了融合蛋白，所述融合蛋白包括R1-R2、R2-R1、R1-L-R2或R2-L-R1；

其中，R1为人成纤维细胞生长因子FGF19蛋白、或FGF19蛋白突变体或活性片段；R2为胰高血糖素类似肽1GLP-1或其类似物Exendin-4、或GLP-1突变体或活性片段；L为连接肽。

在一种实施方式中，所述FGF19蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3任一所示，或是将SEQID NO.1-3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失得到的蛋白，或含有具有与SEQ ID NO.1-3的氨基酸序列相同生物活性的由SEQ ID NO.1-3衍生的蛋白质；所述胰高血糖素类似肽1含有如SEQ ID NO.4-5所示的氨基酸序列，或是将SEQ ID NO.4-5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失得到的蛋白，或含有具有与SEQID NO.4-5的氨基酸序列相同生物活性的由SEQ ID NO.4-5衍生的蛋白质。

在一种实施方式中，所述连接肽由0-30个氨基酸组成，所述连接肽包括(a)-(e)所示任一：

(a)(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n-(Ser)_m，n可以是0-5之间的整数，m为0或1；

(b)(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n-(Ser-Pro)_m，n可以是0-5之间的整数，m为0或1；

(c)(Pro-Glu-Ala-Pro-Thr-Asp)_n，n可以是0-5之间的整数；

(d)(Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)_n-(Ser-Pro)_m，n可以是0-5之间的整数，m为0或1；

(e)亚部分(a)-(d)之间的任意组合。

本发明提供了编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3任一所示的融合蛋白的基因。

本发明提供了携带所述基因的载体或微生物细胞。

本发明提供了所述融合蛋白在制备预防、缓解和/或治疗肥胖及其并发症中的应用。

在一种实施方式中，所述肥胖及其并发症包括高血脂、脂肪肝、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受。

在一种实施方式中，所述缓解和/或治疗肥胖及其并发症包括抑制体重增加、降低血脂和血糖、提高胰岛素敏感性。

本发明提供了一种治疗肝炎或相关疾病的药物，所述药物以所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3任一所示的融合蛋白为有效成分。

在一种实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载剂或辅料。

在一种实施方式中，所述药物的给药途径包括口服、腹腔注射、皮下注射、静脉注射或肌肉注射。

在一种实施方式中，所述治疗肝炎或相关疾病包括降低肝脏重量和肝脏甘油三酯的含量、修复肝脏损伤、抑制炎症因子的表达，改善非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、肝损伤、肝硬化及肝癌、原发性胆汁性胆管炎和/或原发性硬化性胆管炎。

本发明提供了一种改善胰岛素敏感性、调节血糖的药物，所述药物以所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3任一所示的融合蛋白为有效成分。

本发明的有益效果：

本发明的3种新型双靶点融合蛋白与原始FGF19类似物及GLP-1相比，半衰期显著增加，并且改善了GLP-1本身会引起的肠胃不适及饮食下降的副作用，对机体正常生命活动影响较小，具有更长效、更稳定、更好的治疗胖症，超重，代谢综合征，糖尿病，高血糖症，血脂异常，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、动脉粥样硬化、肝损伤、肝硬化、肝癌、原发性胆汁性胆管炎(PBC)及原发性硬化性胆管炎(PSC)的功效。

附图说明

图1是5种蛋白的体内半衰期比较图；

图2是5种蛋白对db/db小鼠体重和饮食的影响图；

图3是5种蛋白对db/db小鼠血脂的影响图；

图4是5种蛋白对db/db小鼠糖尿病相关指标的影响图；

图5是5种蛋白对NASH模型小鼠脂肪性肝炎及肝纤维化等相关指标的影响图；

具体实施方式

实验动物及饲养：db/db小鼠购于上海斯莱克公司；饲养于江南大无锡医学院动物中心，每12小时交替照明，温度20±2℃。

其他药品为国产分析纯。

实施例1：重组蛋白的构建、表达及纯化

(1)GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3表达载体的构建

将氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的FGF19分别与SEQID NO.4所示的GLP-1进行融合(FGF19与GLP-1中可选择性使用常用的蛋白连接肽连接)，得到3种新型融合蛋白基因，分别为GLP-FGF19-1(SEQ ID NO.6所示)、GLP-FGF19-2(SEQ IDNO.7所示)GLP-FGF19-3(核SEQ ID NO.8所示)所示，根据大肠杆菌密码子偏好性，设计出相应的编码基因序列。将这3种基因送至上海捷瑞生物公司合成，同时在各基因两端设计NdeI与BamHI两酶切位点。将3种合成的含有各自目的基因片段的载体和pET30a(+)分别用NdeI与BamHI双酶切，酶切完毕后，分别胶回收需要的目标片段。使用T4 DNA连接酶将4种目的片段分别与原核表达载体pET30a(+)连接，连接反应体系为10μL，混匀，4℃连接过夜，然后分别转化至大肠杆菌DH5α中。挑取阳性克隆，经过酶切鉴定后，即分别构建得到3种重组质粒pET30a-GLP-FGF19-1、pET30a-GLP-FGF19-2及pET30a-GLP-FGF19-3。

(2)蛋白的表达及纯化

将含有正确序列的重组质粒pET30a-GLP-FGF19-1、pET30a-GLP-FGF19-2及pET30a-GLP-FGF19-3转化至表达菌株Rosseta(DE3)感受态细胞中。转化后的单菌落分别接种至20mL含Kan(50μg/mL)的LB培养基中，37℃培养8h，以体积比为1:100接种于另一20mL含Kan(50μg/mL)的LB培养基中，37℃培养，当A600在0.35左右时，加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L进行诱导，诱导温度为30℃，5h后收获菌体，用Lysisbuffer(20mmol/LTris，150mmol/LNaCl，pH8.0)重悬菌体，破碎菌体后离心，分别取上清和沉淀进行12wt％SDS-PAGE电泳分析。结果显示GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及pET30a-GLP-FGF19-3蛋白在大肠杆菌中表达量显著增加，目标蛋白大部分以包涵体形式存在。

收集大量诱导后的菌体，向菌体中加入溶菌酶(1mg/mL)，冰上放置30min，超声波细胞破碎菌体细胞(工作1s，间隔1s，4min/次，共3次循环)。菌体破碎彻底后，利用QuixStand预处理系统(750kD超滤中空纤维柱)处理细胞破碎液，富集包涵体，弃去膜透过端液体。当总体积约为60mL时，加入100mLwashbuffer(20mmol/L Tris，2mol/L Urea，150mmol/L NaCl，pH8.0)洗涤包涵体。当溶液体积为50mL，再向其中加入洗涤液100mL，重复上述实验4次。洗涤完毕后，当溶液体积为50mL，关闭透过端，向洗涤后的包涵体中加入150mL的变性液(20mmol/L Tris，10mol/L Urea，150mmol/L NaCl，pH8.0)，循环变性2小时。打开透过端，膜透过端收集液即为mFGF19变性液。用5KD中空纤维柱对变性后的mFGF19进行浓缩，至体积80mL后进行复性，将装有复性液(20mmol/L Tris，50mmol/L NaCl，pH8.0)的容器用胶皮管与中空纤维柱的储液器连接。储液器密封后，透过端流出液体后，由于储存器中产生负压，使复性液以一定的速度滴加至变性液中，缓慢匀速复性。当加入复性液体积为变性液6倍时，即复性完毕，8000rpm/min，4℃离心20min，收集上清。复性上清液经AKTApurifier100系统，与5倍柱体积IEXbufferA(20mmol/LTris、10mmol/LNaCl，pH8.0)平衡好的CaptoQ柱(装于XK16/20空柱，柱高10cm，流速300cm/h)完全结合后，用3-4倍柱体积IEXbufferA冲洗；当紫外曲线达到稳定的基线时，利用IEXbufferA和IEXbufferB(20mmol/LTris，1mol/LNaCl，pH8.0)混合液洗脱，15wt％和100wt％IEX bufferB液冲洗杂蛋白，18.5wt％-19wt％IEXbufferB液洗脱目标蛋白，收集各洗脱峰，并进行15wt％SDS-PAGE电泳分析。结果显示纯化后蛋白纯度在95％以上。

实施例2：重组蛋白体内半衰期的检测

对5种蛋白FGF19(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)、GLP-1(氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示)、GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3的体内半衰期检测。

选取体重约2kg的家兔25只，随机分为5组。每组分别皮下注射5种蛋白FGF19、GLP-1、GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3，剂量5mg/kg，在给药后的0h、1h、3h、5h、7h、24h，于耳缘静脉采血800μL左右。12000r/m离心10min，取上清保存于-20℃备用。ELISA间接法测定5种蛋白的体内半衰期：用稀释好不同浓度的FGF19、GLP-1、GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3蛋白(2μg/mL、0.2μg/mL、200ng/mL、20ng/mL和2ng/mL)分别建立蛋白浓度含量的标准曲线，将稀释后的标准蛋白和血清包被酶标板，应用ELISA间接法测定各血清中目标蛋白的含量，统计学分析并计算出5种蛋白的体内半衰期。

体内半衰期

其中OD1和OD2分别表示t1和t2时取出血清所对应酶标板上的平均光吸收值。

结果如图1所示，经公式计算出FGF19、GLP-1、GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3的体内半衰期分别约为10h、6h、24h、23h及24h，说明了3种新型GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3体内半衰期显著增加。

实施例3：重组蛋白对体重、饮食、血脂及糖尿病相关指标的影响

按照实施例1的方法制备GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3这3种蛋白。

取SPF级8周龄雄性db/db小鼠50只，预饲养1周后称重，次日禁食不禁水6h，尾静脉取血测定小鼠的空腹血糖，剔除体重异常，筛选血糖及体重值相对接近均值的成模小鼠36只，随机分为生理盐水注射组(Saline)、FGF19组、GLP-1组、GLP-FGF19-1组、GLP-FGF19-2组及GLP-FGF19-3组，每组6只。于每天早上8点半左右给予实验组相应的受试物一次，腹腔注射，剂量2mg/kg，生理盐水组注射相同体积的生理盐水，连续给药8周。实验过程中自由饮食、饮水。期间监测小鼠饮食和体重状况。给药8周后，各实验组小鼠处死(前夜禁食)，眼球取血测定实验小鼠血糖、甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)水平。所得实验数据进行统计学分析。

实验检测数据如图2～图4所示，图2结果表明，相对于生理盐水对照组，FGF19蛋白和GLP-1及3种新型蛋白GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3均可显著降低小鼠体重，但GLP-1蛋白注射后可显著降低小鼠饮食，抑制其食欲，而相对于GLP-1，3种新型蛋白GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3给药后不仅能更为强劲和显著的抑制体重外，且并不影响小鼠进食，表明此种融合改造成功的改善了原始GLP-1饮食下降的副作用。

给药8周后，各实验组小鼠血清血脂水平结果如图3所示，相对于生理盐水组，5种蛋白FGF19、GLP-1、GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3注射后均可显著降低血清中甘油三脂、总胆固醇的含量，但GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3的治疗效果要优于原始GLP-1及FGF19。

给药8周后，各实验组小鼠空腹血糖及胰岛素敏感性、糖耐量结果如图4所示，相对于生理盐水组，5种FGF19、GLP-1、GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2注射后均可显著改善血糖及胰岛素抵抗，但GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3的治疗效果要优于原始GLP-1及FGF19。

实施例4：重组蛋白对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关指标的影响

取SPF级8周龄雄性C57BL/6小鼠60只，预饲养1周后喂食蛋氨酸胆碱缺失MCD饲料，喂食8周后，剔除体重异常，筛选血糖及体重值相对接近均值的成模小鼠36只，随机分为生理盐水注射组(Saline)、FGF19组、GLP-1组、GLP-FGF19-1组、GLP-FGF19-2组及GLP-FGF19-3组，每组6只。于每天早上8点半左右给予实验组相应的受试物一次，腹腔注射，剂量2mg/kg，生理盐水组注射相同体积的生理盐水，连续给药8周。实验过程中自由饮食、饮水。给药8周后，各实验组小鼠处死(前夜禁食)，测定实验小鼠肝脏甘油三脂(TG)、碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)水平并进行组织切片染色和炎症指标检测。所得实验数据进行统计学分析。

实验检测数据如图5所示，图5A结果表明，相对于生理盐水对照组(Saline)，FGF19、GLP-1、GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3均可显著降低小鼠肝脏重量和肝脏甘油三酯(TG)含量，但GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3的治疗效果要优于原始GLP-1及FGF19。图5B转氨酶结果进一步显示5种新型蛋白GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3对肝脏损伤的保护功能显著优于原始FGF19及GLP-1。此外，HE染色结果直接显示出GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3注射后可显著降低肝脏脂肪空泡，显微镜下几乎观察不到空泡，而FGF19、GLP-1治疗后还存在部分脂肪空泡(图5C)。图5D是天狼星红染色结果，用以观察肝脏胶原纤维沉积情况，反应肝脏纤维化，结果显示突变改造后的3种新型蛋白GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3均可逆转肝脏纤维化，而FGF19、GLP-1治疗会还存在部分纤维化状态，表明改造后的重组蛋白对肝脏纤维化的逆转效果显著优于原始蛋白。通过上述多项指标检测发现融合改造后的3种新型蛋白GLP-FGF19-1、GLP-FGF19-2及GLP-FGF19-3针对NASH和肝脏损伤的治疗效果显著优于对照。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用

<130> BAA210530A

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Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu Glu Thr

180 185 190

Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

195 200 205

Ser Pro Ser Phe Glu Lys

210

<210> 7

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Val

20 25 30

His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Arg His Leu Tyr Thr Ser

35 40 45

Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala Asp Gly

50 55 60

Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu Glu Ile

65 70 75 80

Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His Ser Val

85 90 95

Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu Leu Gln

100 105 110

Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly

115 120 125

Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Cys Leu Ser

130 135 140

Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro Leu

145 150 155 160

Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro

165 170 175

Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro

180 185 190

Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

195 200

<210> 8

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Val

20 25 30

His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Arg His Leu Tyr Thr Ser

35 40 45

Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala Asp Gly

50 55 60

Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu Glu Ile

65 70 75 80

Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His Ser Val

85 90 95

Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu Leu Gln

100 105 110

Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly

115 120 125

Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Cys Leu Ser

130 135 140

Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro Leu

145 150 155 160

Cys His Phe Leu Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro Glu Asp

165 170 175

Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Pro Asp Val

180 185 190

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

195 200 205

Pro Ser Tyr Ala Ser

210

<210> 9

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Arg Asp Ser Ser Pro Leu Val His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro Ile

1 5 10 15

Arg Leu Arg His Leu Tyr Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys

20 25 30

Phe Leu Arg Ile Arg Ala Asp Gly Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln

35 40 45

Ser Ala His Ser Leu Leu Glu Ile Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val

50 55 60

Ala Ile Lys Gly Val His Ser Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp

65 70 75 80

Gly Lys Met Gln Gly Leu Leu Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe

85 90 95

Glu Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys

100 105 110

His Arg Leu Pro Val Ser Leu Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr

115 120 125

Lys Asn Arg Gly Phe Leu Pro Leu Ser His Phe Leu Pro Met Leu Pro

130 135 140

Met Val Pro Glu Glu Pro Glu Asp Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp

145 150 155 160

Met Phe Ser Ser Pro Leu Glu Thr Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu

165 170 175

Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Phe Glu Lys

180 185 190

Claims

1.融合蛋白，其特征在于，包括R1-R2或R1-L-R2；

其中，R1为人成纤维细胞生长因子FGF19蛋白；R2为胰高血糖素类似肽1；L为连接肽；

所述FGF19蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3任一所示；所述胰高血糖素类似肽1序列如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体或微生物细胞。

4.权利要求1所述融合蛋白在制备预防、缓解和/或治疗肥胖及其并发症的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肥胖及其并发症包括高血脂、脂肪肝、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受。

6.一种治疗肝炎或相关疾病的药物，其特征在于，以权利要求1所述融合蛋白为有效成分；所述治疗肝炎或相关疾病为降低肝脏重量和肝脏甘油三酯的含量、修复肝脏损伤，改善非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、肝损伤、原发性胆汁性胆管炎和/或原发性硬化性胆管炎。

7.一种改善胰岛素敏感性、调节血糖的药物，其特征在于，以权利要求1所述融合蛋白为有效成分。