CN113795574A - 具有降低的肝向性和增加的肌肉转导的AAV9和AAVrh74之间的肽修饰的杂合重组腺相关病毒血清型 - Google Patents
具有降低的肝向性和增加的肌肉转导的AAV9和AAVrh74之间的肽修饰的杂合重组腺相关病毒血清型 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及重组腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其是包含至少一个拷贝的包含RGD基序的肽的AAV血清型9(AAV9)和AAV血清型74(AAVrh74)衣壳蛋白之间的肽修饰的杂合体，其中与不具有所述肽的重组杂合AAV衣壳蛋白相比，所述重组肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白具有进一步降低的肝向性和增加的肌肉转导。本发明还涉及包装目标基因的衍生的肽修饰的杂合AAV血清型载体颗粒及其在基因治疗中的用途，特别是用于治疗神经肌肉遗传疾病，特别是肌肉遗传疾病。
Description
技术领域
本发明涉及重组腺相关病毒(AAV)衣壳，其是AAV血清型9(AAV9)和AAV血清型rh74(AAVrh74)衣壳蛋白之间的肽修饰的杂合体，与不具有所述肽的杂合AAV衣壳蛋白相比，该衣壳蛋白具有进一步降低的肝向性和增加的肌肉转导。本发明还涉及包装目标基因的衍生的肽修饰的杂合AAV血清型载体颗粒，及其在基因治疗中的用途，特别是用于治疗神经肌肉遗传疾病，特别是用于肌肉遗传疾病的用途。
背景技术
重组腺相关病毒(rAAV)载体被广泛用于体内基因转移。rAAV载体是由直径20nm的衣壳和4.7kb的单链DNA组成的无包膜载体。基因组携带两个基因rep和cap，其侧接称为反向末端重复序列(ITR)的两个回文末端区域。cap基因编码组成AAV衣壳的三个结构蛋白VP1、VP2和VP3。VP1、VP2和VP3共享作为VP3全部的相同的C端。使用AAV2具有参考，VP1具有735个氨基酸序列(GenBank YP_680426)；VP2(598个氨基酸)从苏氨酸138(T138)开始并且VP3(533个氨基酸)从蛋氨酸203(M203)开始。AAV血清型由其衣壳定义。存在不同的血清型，每种血清型显示其自身的组织靶向特异性。因此，使用血清型的选择取决于待转导的组织。骨骼肌和肝组织被不同血清型的AAV载体(如AAV8、AAV9和AAV-rh74)感染并有效转导。
嵌合或杂合AAV血清型已经通过在不同的天然存在的AAV血清型的衣壳之间交换衣壳序列的片段而产生，以增加AAV转导效率或增加AAV向目标细胞或组织类型的向性。
通过将AAV8衣壳的结构域与分离自灵长类动物脑中的AAV血清型组合来生成杂合AAV衣壳。与AAV2和AAV5载体相比，所得的AAV杂合血清型可以转导人和小鼠的视网膜组织，但效率没有增加(Charbel Issa et al.,PLOS ONE,2013,8,e60361)。但是，与AAV1、AAV8和AAV9相比，杂合AAV血清型之一显示出对脂肪组织的改进的转导效率(Liu et al.,Molecular Therapy,2014,1,8,doi:10.1038/mtm)。
WO 2015/191508公开了通过交换来自各种物种(人、灵长类动物、禽、蛇、牛)的AAV衣壳的可变区而产生的重组杂合AAV衣壳，特别是具有中枢神经系统向性的AAV衣壳以产生CNS特异性嵌合衣壳。
WO 2017/096164公开了表现出增强的人骨骼肌向性的AAV1、AAV2、AAV3b、AAV6和AAV8血清型之间的重组杂合AAV衣壳。
但是，迄今为止测试的所有天然存在的AAV血清型和变体都具有在肝内积聚的倾向。这引起问题，特别是当通过全身途径施用AAV载体时。首先，旨在于肌肉中表达的转基因可能对肝脏有毒性作用。其次，AAV载体进入肝脏减少可用于骨骼肌的载体数量。因此，需要更高剂量的AAV载体。这增加了诱导肝毒性的可能性和载体生产的成本。
组织特异性启动子和基于microRNA的基因调控策略已用于隔离不同组织类型之间的基因表达模式。但是，这种调控策略不排除系统施用后在靶外器官(如肝脏)中隔离AAV载体基因组。
显示通过使衣壳蛋白的碱性残基R585或R588突变来减弱肝素结合以消除了硫酸肝素结合并降低AAV2衍生载体的肝向性(Asokan et al.,Nat.Biotechnol.,2010,28,79-82)。但是，此策略仅适用于血清型(如AAV2和AAV6)，它们的肝向性由结合肝素的碱性残基确定。
因此，需要具有降低的肝向性和伴随的增加的肌肉转导的新的AAV载体。
展示插入AAV衣壳(相对于VP1蛋白编号的第R588位)的RGDLGLS(SEQ ID NO:8)肽的AAV2载体在体外有效转导原发性鼠乳腺癌细胞，但未能在体内转导乳腺癌肿瘤细胞(Michelfelder et al.,PLoS ONE,2009,4,e5122)。展示相同表面肽(RGDLGLS或P1)的AAV9在体外有效靶向人星形胶质细胞(Kunze et al.,Glia,2018,66,413-427)。
发明概述
发明人已使用有效感染肌肉和肝脏组织的两种血清型AAV9和AAV-rh74的组合产生了新的肽修饰的杂合AAV血清型。新的肽修饰的杂合AAV血清型通过将包含RGD基序的肽插入AAV9和AAVrh74血清型之间的cap基因的可变区而产生(图1)。发明人已发现，令人惊讶地，在杂合衣壳蛋白上插入包含RGD基序的肽增加肌肉转导并改善肝脏脱靶(图2)。
新的肽修饰的杂合AAV血清型可用于影响肌肉组织，特别是骨骼肌组织和/或心脏组织的疾病的基因治疗，例如神经肌肉疾病，特别是肌肉疾病，包括遗传疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病和癌症。
因此，本发明涵盖具有增加的肌肉转导和降低的肝向性的AAV9和AAVrh74衣壳之间的肽修饰的杂合重组AAV衣壳，包含肽修饰的杂合重组AAV衣壳的AAV载体颗粒，包含肽修饰的杂合AAV血清型载体颗粒的组合物，以及制备和使用所述肽修饰的杂合AAV血清型载体颗粒和组合物的方法，特别是在基因治疗中。
发明详述
肽修饰的重组杂合AAV衣壳蛋白
本发明的一个方面涉及重组腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其是包含至少一个拷贝的包含RGD基序的肽的AAV血清型9(AAV9)和AAV血清型74(AAVrh74)衣壳蛋白之间的肽修饰的杂合体，其中与不具有所述肽的杂合AAV衣壳蛋白相比，所述重组肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白具有进一步降低的肝向性和增加的肌肉转导。
如本文所用，术语“向性(tropism)”是指存在于AAV病毒颗粒中的AAV衣壳蛋白用于感染或转导特定类型的细胞或组织的特异性。
用于特定类型的细胞或组织的AAV衣壳的向性可以使用本领域已知的标准测定法(如本申请的实施例中公开的那些)，通过测量包含肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白的AAV载体颗粒感染或转导特定类型的细胞或组织的能力来测定。
如本文所用，术语“肝脏向性”或“肝向性”是指肝或肝组织和细胞(包括肝细胞)的向性。
在一些实施方案中，与不具有所述肽的杂合AAV衣壳蛋白的肝向性相比，肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白的肝向性进一步降低了至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多。
根据本发明，与不具有所述肽的杂合AAV衣壳相比，肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白对肌肉细胞和组织具有增加的向性或转导。
特别地，肌肉组织包括心脏和骨骼肌组织。
如本文所用，术语“肌肉细胞”是指肌细胞、肌管、成肌细胞和/或卫星细胞。
如本文所用，“或”是指“和/或”。
在一些实施方案中，与不具有所述肽的杂合AAV衣壳蛋白相比，肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白的肌肉向性或肌肉转导增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多；优选至少50％、60％、70％、80％、90％、99％、100％或更多。
在一些实施方案中，肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白是肽修饰的杂合VP1、VP2或VP3蛋白。
在一些实施方案中，肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白具有至少骨骼肌组织的向性。在一些优选实施方案中，肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白对骨骼和心肌组织均具有向性。这种类型的肽修饰的杂合体的实例是SEQ ID NO：5的肽修饰的杂合AAV衣壳(在实施例中命名为AAV-MT)。这种类型的肽修饰的杂合AAV衣壳可用于治疗心脏和骨骼肌疾病。
根据本发明的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白可以衍生自任何AAV9和AAVrh74衣壳蛋白序列；这种序列是本领域众所周知的，并且可以在公共序列数据库中获得。例如，AAV9衣壳蛋白对应于GenBank登录号：AY530579.1；WO 2005/033321的SEQ ID NO：123；WO 2012/112832的SEQ ID NO：1；WO 2016049230的clade F AAV；如WO 2012/112832中公开的AAV9衣壳变体，其中在第271(D)、446(Y)和470(N)位的一个或多个天然残基被另一种氨基酸(优选丙氨酸)取代；如US2014/0162319中公开的，在一个或多个K143R、T251A、S499A、S669A和S490A位置处的AAV9衣壳变体。AAVrh74衣壳蛋白对应于WO 2015/013313的SEQ ID NO：1；WO2006/110689的SEQ ID NO：6；WO 2013/123503的SEQ ID NO：1；WO 2013/158879的SEQ IDNO：4；和K137R、K333R、K550R、K552R、K569R、K691R、K695R、K709R变体及其组合。
在一些实施方案中，根据本发明的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白衍生自SEQ ID NO：1(GenBank AY530579.1)的AAV9衣壳蛋白和SEQ ID NO：2的AAVrh74蛋白。
在一些实施方案中，根据本发明的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白通过将AAV9或AAVrh74衣壳序列中的可变区替换为其他AAV血清型衣壳序列的相应可变区而产生，
其中AAV9衣壳的可变区对应于位于SEQ ID NO：1(参考序列)的AAV9衣壳中从第331-493位的任一个至第556-736位的任一个的序列，或位于SEQ ID NO：1的AAV9衣壳中第493-556位的序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个连续氨基酸的片段，和
AAVrh74衣壳的可变区对应于位于SEQ ID NO：2(参考序列)的AAVrh74衣壳中从第332-495位的任一个至第558-738位的任一个的序列，或位于SEQ ID NO：2的AAVrh74衣壳中第495-558位的序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个连续氨基酸的片段。
本发明涵盖通过将AAV9或AAVrh74衣壳序列中的可变区替换为其他AAV血清型衣壳序列的相应可变区而衍生自任何AAV9和AAVrh74衣壳蛋白序列的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白，如上文所定义。根据本发明，使用SEQ ID NO：1的AAV9衣壳和SEQ ID NO：2的AAVrh74衣壳作为参考来定义可变区。使用本领域熟知的标准蛋白质序列比对程序(诸如例如BLAST、FASTA、CLUSTALW等)将任何其他AAV9衣壳序列与SEQ ID NO：1或将任何其他AAVrh74衣壳序列与SEQ ID NO：2进行序列比对后，本领域技术人员可以容易地获得其他AAV9或AAVrh74衣壳序列中可变区的相应位置。
在一些优选实施方案中，根据本发明的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白通过将对应于位于SEQ ID NO：1的AAV9衣壳序列中第449-609位或位于SEQ ID NO：2的AAVrh74衣壳序列中第450-611位的可变区替换为其他血清型的相应可变区而产生。
在一些优选实施方案中，根据本发明的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白衍生自选自下组的杂合AAV衣壳：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、以及与所述序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。通过将AAV9可变区(SEQ ID NO：1的第449-609位)替换为AAVrh74衣壳蛋白的可变区(SEQ ID NO：2的第450-611位)，SEQ ID NO：3衍生自SEQ ID NO：1的AAV9衣壳蛋白；在实施例中，相应的杂合体被命名为杂合Cap9-rh74。VP2对应于从T138到SEQ ID NO：3末端的氨基酸序列。VP3对应于从M203到SEQ ID NO：3末端的氨基酸序列。通过将rh74可变区(SEQ ID NO：2的第450-611位)替换为AAV9衣壳蛋白的可变区(SEQ ID NO：1的第449-609位)，SEQ ID NO：4衍生自SEQ ID NO：2的AAVrh74衣壳蛋白；在实施例中，相应的杂合体被命名为杂合Caprh74-9。VP2对应于从T138到SEQ ID NO：4末端的氨基酸序列。VP3对应于从M204到SEQ ID NO：4末端的氨基酸序列。
在一些优选实施方案中，通过将AAV9衣壳序列的可变区替换为如上所定义的AAVrh74衣壳序列的相应可变区，根据本发明的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白衍生自AAV9衣壳蛋白，优选肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白包含将对应于位于SEQ ID NO：1的AAV9衣壳中第449-609位的可变区替换为对应于位于SEQ ID NO：2的AAVrh74衣壳中第450-611位的可变区。在一些更优选实施方案中，根据本发明的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白衍生自选自下组的杂合AAV衣壳蛋白：SEQ ID NO：3以及与所述序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列；优选SEQ ID NO：3。
术语“同一性”是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或相同的氨基酸残基占据时，则各分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比对应于两个序列共享的匹配位置数除以比较的位置数再乘以100。通常，将两个序列进行比对以给出最大的同一性时进行比较。例如，可以使用GCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)累积程序或任何序列比较算法(诸如BLAST、FASTA或CLUSTALW)通过比对来计算同一性。
包含RGD基序的肽优选至多30个氨基酸。
在一些实施方案中，至多30个氨基酸的肽包含以下任一种或由以下任一种组成：RGDLGLS(SEQ ID NO:8)、LRGDGLS(SEQ ID NO:14)、LGRGDLS(SEQ ID NO:15)、LGLRGDS(SEQID NO:16)、LGLSRGD(SEQ ID NO:17)和RGDMSRE(SEQ ID NO:18)；优选SEQ ID NO：8。序列SEQ ID NO：8和14-18可以在它们的N-和/或C-末端侧接至多五个或更多个氨基酸，例如分别在肽的N和C末端侧接GQSG(SEQ ID NO:9)和AQAA(SEQ ID NO:10)。
本发明的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白可包含至多5个拷贝的包含RGD基序的肽，优选1个拷贝的所述肽。肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白可包含相同肽的多个拷贝或不同肽的一个或多个拷贝。
本发明的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白包含插入暴露在AAV衣壳表面上的位点中的一种或多个包含RGD基序的肽。暴露在衣壳表面上并耐受肽插入(即不影响病毒衣壳的组装和包装)的AAV衣壳上的位点是本领域众所周知的，并且包括例如AAV衣壳表面环或抗原环(Girod et al.,Nat.Med.,1999,5,1052-1056；Grifman et al.,Molecular Therapy,2001,3,964-975)；其他位点公开于Rabinowitz et al.,Virology,1999,265,274-285；Wuet al.,J.Virol.,2000,74,8635-8647中。
特别地，根据SEQ ID NO：3中的编号，包含RGD基序的肽插入第261、383、449、575或590位的任一个附近，优选第449或590位附近，更优选第590位附近。位置通过参考SEQ IDNO：3指出；本领域技术人员在与SEQ ID NO:3比对后将能够容易地找到另一序列中的相应位置。
根据SEQ ID NO:3中的编号，插入位点有利地从第587-592位或第588-593位，优选从第587-592位。肽的插入可能会或可能不会导致一些或全部来自插入位点的残基的缺失。根据SEQ ID NO:3中的编号，所述肽有利地替换了AAV衣壳蛋白的第587-592位或第588-593位的所有残基，优选第587-592位的所有残基。
在一些优选实施方案中，根据SEQ ID NO：3中的编号，所述肽替换AAV衣壳蛋白第587-592位的所有残基。优选地，所述肽包括RGDLGLS(SEQ ID NO:8)、LRGDGLS(SEQ ID NO:14)、LGRGDLS(SEQ ID NO:15)、LGLRGDS(SEQ ID NO:16)、LGLSRGD(SEQ ID NO:17)和RGDMSRE(SEQ ID NO:18)的任一种，优选SEQ ID NO：8。更优选的肽是分别在其N-和C-末端侧接GQSG(SEQ ID NO:9)和AQAA(SEQ ID NO:10)的RGDLGLS(SEQ ID NO：8)，对应于GQSGRGDLGLSAQAA(SEQ ID NO:13)。
在一些优选实施方案中，肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白包含选自下组的序列或由其组成：SEQ ID NO:5、与所述序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的序列及其对应于VP2或VP3衣壳蛋白的片段。VP2对应于SEQ ID NO:5的从T138到末端的氨基酸序列。VP3对应于SEQ ID NO:5的从M203到末端的氨基酸序列。在一些优选实施方案中，所述肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO：5或其对应于VP2或VP3衣壳蛋白的片段。SEQ ID NO:5通过插入SEQ ID NO:8的肽而衍生自SEQ ID NO:3的杂合体Cap9-rh74。
在一些优选实施方案中，肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白包含选自下组的序列或由其组成：SEQ ID NO:5、与所述序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的序列及其对应于VP2或VP3衣壳蛋白的片段。VP2对应于SEQ ID NO:5的从T138到末端的氨基酸序列。VP3对应于SEQ ID NO:5的从M203到末端的氨基酸序列。在一些优选实施方案中，所述肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO：5或其对应于VP2或VP3衣壳蛋白的片段。
本发明还涵盖衍生自根据本发明的AAV9/rh74杂合VP3衣壳蛋白的肽修饰的AAVVP1和VP2嵌合衣壳蛋白，其中VP1特异性N端区域和/或VP2特异性N端区域来自除AAV9和AAVrh74以外的天然或人工AAV血清型。
在一些实施方案中，肽修饰的AAV VP1嵌合衣壳蛋白包含：
(i)VP1特异性N端区域，其具有来自除AAV9和AAVrh74以外的天然或人工AAV血清型的序列，
(ii)VP2特异性N端区域，其具有来自AAV9、AAVrh74或除AAV9和AAVrh74以外的天然或人工AAV血清型的序列，和
(iii)VP3 C-端区域，其具有根据本发明的肽修饰的杂合VP3蛋白的序列。
在一些实施方案中，AAV VP2嵌合衣壳蛋白包含：
(i)VP2特异性N端区域，其具有来自除AAV9和AAVrh74以外的天然或人工AAV血清型的序列，和
(ii)VP3 C-端区域，其具有根据本发明的肽修饰的杂合VP3蛋白的序列。
多核苷酸、载体及其用于AAV载体生产的用途
本发明的另一方面是以可表达形式编码重组肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白的多核苷酸。该多核苷酸可以是DNA、RNA或合成或半合成的核酸。
在一些实施方案中，多核苷酸是编码根据本发明的肽修饰的杂合VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的AAV9/rh74杂合cap基因。在一些优选实施方案中，多核苷酸包含序列SEQ ID NO：6(编码SEQ ID NO：5的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白)。
在一些其他实施方案中，多核苷酸是编码根据本发明的肽修饰的AAV9/rh74杂合VP3衣壳蛋白和嵌合VP1衣壳蛋白的嵌合cap基因，并且还可以是嵌合VP2衣壳蛋白，其中VP1特异性N端区域，并且还可以是VP2特异性的N端区域，是来自除AAV9和AAVrh74以外的天然或人工AAV血清型。可以通过任何合适的技术，使用根据本发明的肽修饰的AAV9/rh74杂合VP3衣壳蛋白的编码序列与异源序列结合来产生这种嵌合cap基因，所述异源序列可以从不同选择的AAV血清型、相同AAV血清型的非连续部分、非病毒AAV来源或非病毒来源获得。
在一些实施方案中，多核苷酸进一步以可表达形式编码AAV复制酶(Rep)蛋白，优选来自AAV2的Rep。
有利地，将多核苷酸插入重组载体中，所述重组载体以非限制性方式包括由染色体、非染色体、合成或半合成核酸组成的线性或环状DNA或RNA分子，例如特别是病毒载体、质粒或RNA载体。
本身已知许多其中可插入目标核酸分子以将其引入并维持在真核宿主细胞中的载体；适当载体的选择取决于该载体的预期用途(例如，目标序列的复制、该序列的表达、该序列以染色体外形式维持或整合入宿主的染色体材料中)，并且还取决于宿主细胞的性质。
在一些实施方案中，载体是质粒。
用于本发明的重组载体是表达载体，其包含用于表达肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白的适当手段，也可以是AAV Rep蛋白。通常，将每个编码序列(杂合AAV Cap和AAV Rep)插入同一载体或不同载体的单独表达盒中。每个表达盒包含功能性连接于调控序列的编码序列(开放阅读框或ORF)，所述调控序列允许相应的蛋白在AAV生产细胞中表达，例如特别是启动子、启动子/增强子、起始密码子(ATG)、终止密码子、转录终止信号。或者，可以使用插入两个编码序列或病毒2A肽之间的内部核糖体进入位点(IRES)从独特的表达盒中表达杂合AAV Cap和AAV Rep蛋白。另外，有利地优化了编码杂合AAV Cap和AAV Rep(如果存在)的密码子序列，以在AAV生产细胞，特别是人生产细胞中表达。
载体，优选重组质粒，可用于使用本领域众所周知的标准AAV生产方法来生产包含本发明的肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白的杂合AAV载体(Review in Aponte-Ubillus et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,2018,102:1045-1054)。
共转染后，将细胞孵育足以允许产生AAV载体颗粒的时间，然后收获、裂解细胞，并通过标准纯化方法(如亲和层析或氯化铯密度梯度超速离心)纯化AAV载体颗粒。
AAV颗粒、药物组合物和治疗用途
本发明的另一方面是包含本发明的肽修饰的杂合重组AAV衣壳蛋白的AAV颗粒。AAV颗粒可以包含由根据本发明的杂合cap基因编码的肽修饰的杂合VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。替代地或另外，AAV颗粒可包含嵌合VP1和VP2衣壳蛋白和由根据本发明的嵌合cap基因编码的肽修饰的杂合VP3蛋白。
在一些实施方案中，AAV颗粒是嵌合AAV颗粒，其还包含来自除AAV9和AAVrh74血清型以外的天然或人工AAV血清型的另一种AAV衣壳蛋白，其中与AAV9和AAVrh74血清型相比，嵌合AAV颗粒具有降低的肝向性。人工AAV血清型可以是但不限于，嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或人源化AAV衣壳。这种人工衣壳可以通过任何合适的技术，使用选择的AAV序列(例如VP1衣壳蛋白的片段)结合异源序列来产生，所述异源序列可以从不同选择的AAV血清型、相同AAV血清型的非连续部分、非病毒AAV来源或非病毒来源获得。
优选地，AAV颗粒是AAV载体颗粒。AAV载体的基因组可以是单链或自互补的双链基因组(McCarty et al,Gene Therapy,2003,Dec.,10(26),2112-2118)。通过从AAV末端重复序列之一中删除末端解析位点(trs)来生成自互补载体。这些修饰的载体的复制基因组是野生型AAV基因组长度的一半，具有包装DNA二聚体的趋势。AAV基因组侧接ITR。在具体实施方案中，AAV载体是假型化载体，即其基因组和衣壳衍生自不同血清型的AAV。在一些优选实施方案中，假型化载体的基因组衍生自AAV2。
在一些优选实施方案中，AAV载体颗粒包装目标基因。
可以使用产生本发明的重组AAV载体颗粒的方法获得AAV颗粒。
“目标基因”是指对特定应用有用的基因，例如但不限于，诊断、报告、修饰、治疗和基因组编辑。
例如，目标基因可以是治疗基因、报道基因或基因组编辑酶。
“用于治疗的目标基因”、“治疗目的的基因”或“异源目标基因”是指治疗基因或编码治疗蛋白、肽或RNA的基因。
目标基因是能够修饰特别是肌肉细胞中的靶基因或靶细胞途径的任何核酸序列。例如，基因可以修饰靶基因或细胞途径的表达、序列或调控。在一些实施方案中，目标基因是基因或其片段的功能形式。所述基因的功能形式包括野生型基因、变体基因(如属于同一家族和其他家族的变体)、或截短形式，其至少部分地保留了编码蛋白的功能。基因的功能形式可用于替换或附加基因治疗以替换患者中缺失或无功能的基因。在其他实施方案中，目标基因是失活导致常染色体显性遗传疾病的显性等位基因的基因。基因片段可用作与基因组编辑酶组合使用的重组模板。
或者，目标基因可以编码用于特定应用的目标蛋白质(例如抗体或抗体片段、基因组编辑酶)或RNA。在一些实施方案中，蛋白质是包括治疗性抗体或抗体片段或基因组编辑酶的治疗性蛋白质。在一些实施方案中，RNA是治疗性RNA。目标基因是能够在疾病的靶细胞(特别是肌肉细胞)中产生编码的蛋白质、肽或RNA的功能基因。AAV病毒载体包含在包括心肌和骨骼肌细胞的肌肉细胞中可表达的形式的目标基因。特别地，目标基因与在肌肉细胞中起作用的普遍存在的、组织特异性的或诱导型启动子可操作地连接。可以将目标基因插入进一步包含polyA序列的表达盒中。
RNA有利地与靶DNA或RNA序列互补或与靶蛋白结合。例如，RNA是干扰RNA，如shRNA、microRNA、与Cas酶或类似酶组合使用以进行基因组编辑的向导RNA(gRNA)、能够外显子跳跃的反义RNA(例如修饰的小核RNA(snRNA))或长的非编码RNA。干扰RNA或microRNA可用于调节参与肌肉疾病的靶基因的表达。与Cas酶或类似酶复合以用于基因组编辑的向导RNA可用于修饰靶基因的序列，特别是用于校正突变/缺陷基因的序列或修饰参与疾病的靶基因的表达，特别是神经肌肉疾病。能够外显子跳跃的反义RNA特别用于校正阅读框和恢复具有破坏的阅读框的缺陷基因的表达。在一些实施方案中，RNA是治疗性RNA。
根据本发明的基因组编辑酶是能够修饰特别是在肌肉细胞中的靶基因或靶细胞途径的任何酶或酶复合物。例如，基因组编辑酶可以修饰靶基因或细胞途径的表达、序列或调控。基因组编辑酶有利地是工程化核酸酶，例如但不限于，大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应基核酸酶(TALEN)、来自簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)-Cas系统的Cas酶和类似酶。基因组编辑酶，特别是工程化核酸酶(如Cas酶)和类似酶，可以是在目标基因组基因座产生双链断裂(DSB)的功能性核酸酶，并且用于位点特异性基因组编辑应用，包括但不限于：基因校正、基因替换、基因敲入、基因敲除、诱变、染色体易位、染色体缺失等。对于位点特异性基因组编辑应用，可以将基因组编辑酶(特别是工程化核酸酶，如Cas酶和类似酶)与同源重组(HR)基质或模板(也称为DNA供体模板)组合使用，其通过双链断裂(DSB)诱导的同源重组修饰靶基因组位点。特别地，HR模板可以将目标转基因引入靶基因组基因座中或修复靶基因组基因座中的突变，优选在引起神经肌肉疾病的异常或缺陷基因中。或者，可以将基因组编辑酶(如Cas酶和类似酶)工程化为核酸酶缺陷并用作DNA结合蛋白，以用于各种基因组工程化应用，例如但不限于：转录激活、转录抑制、表观基因组修饰、基因组成像、DNA或RNA下拉等。
本发明的另一方面是药物组合物，其包含治疗有效量的AAV颗粒，所述AAV颗粒包含本发明的肽修饰的杂合重组AAV衣壳蛋白，优选包装目标治疗基因的AAV载体颗粒。
在本发明的一些实施方案中，本发明的药物组合物用作特别是基因治疗中的药物。本发明涵盖本发明的药物组合物作为药物，特别是用于通过基因疗法治疗疾病的用途。
基因治疗可以通过基因转移、基因编辑、外显子跳跃、RNA干扰、反式剪接或细胞中任何编码或调控序列(包括细胞核、线粒体中包含的序列或作为常见核酸，例如但不限于细胞中包含的病毒序列)的任何其他遗传修饰来进行。
基因治疗的两种主要类型如下：
-旨在为缺陷/异常基因提供功能性替代基因的疗法：这是替代或附加基因疗法；
-针对基因或基因组编辑的疗法：在这种情况下，目的是向细胞提供必要工具以纠正序列或修饰缺陷/异常基因的表达或调控，从而表达功能基因或抑制(失活)异常基因：这是基因编辑疗法。
在附加基因疗法中，目标基因可以是基因的功能形式，其在患者中是缺陷或突变的，例如在遗传疾病中的情况。在这种情况下，目标基因将恢复功能基因的表达。
基因或基因组编辑使用一个或多个目标基因，例如：
(i)编码如上定义的治疗性RNA的基因，例如干扰RNA，如shRNA或microRNA；与Cas酶或类似酶组合使用的向导RNA(gRNA)；或能够外显子跳跃的反义RNA，如修饰的小核RNA(snRNA)；和
(ii)编码如上定义的基因组编辑酶的基因，例如工程化核酸酶，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应基核酸酶(TALEN)、Cas酶或类似酶；或此类基因的组合，也可能是如上所述用作重组模板的基因功能形式的片段。
基因疗法用于治疗各种疾病，包括但不限于遗传疾病，特别是神经肌肉遗传疾病，如肌肉遗传疾病；癌症；神经退行性疾病和自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，基因疗法用于治疗影响肌肉组织，特别是骨骼肌组织和/或心脏组织的疾病，例如但不限于：神经肌肉遗传疾病，特别是肌肉遗传疾病。
下表列出了可以通过使用本发明的药物组合物基因治疗而靶向的神经肌肉遗传疾病(包括肌肉遗传疾病)中突变基因的实例：
肌营养不良
先天性肌营养不良
先天性肌病
| 基因 | 蛋白 |
| TPM3 | 原肌球蛋白3 |
| NEB | 伴肌动蛋白 |
| ACTA1 | α肌动蛋白，骨骼肌 |
| TPM2 | 原肌球蛋白2(β) |
| TNNT1 | 慢肌钙蛋白T |
| KBTBD13 | 包含凯尔奇重复序列和BTB(POZ)结构域13 |
| CFL2 | 纤溶蛋白2(肌肉) |
| KLHL40 | 凯尔奇样家族成员40 |
| KLHL41 | 凯尔奇样家族成员41 |
| LMOD3 | 平滑肌蛋白3(胎儿) |
| SEPN1 | 硒蛋白N1 |
| RYR1 | 鱼尼丁受体1(骨骼) |
| MYH7 | 肌球蛋白，重多肽7，心肌，β |
| MTM1 | 肌管蛋白 |
| DNM2 | 发动蛋白2 |
| BIN1 | 双载蛋白 |
| TTN | 肌联蛋白 |
| SPEG | SPEG复合基因座 |
| MEGF10 | 多个EGF样结构域10 |
| MYH2 | 肌球蛋白，重多肽2，骨骼肌 |
| MYBPC3 | 心肌肌球蛋白结合蛋白-C |
| CNTN1 | 接触蛋白-1 |
| TRIM32 | 包含三方基序32 |
| PTPLA | 蛋白酪氨酸磷酸酶样(3-羟酰基-CoA脱水酶 |
| CACNA1S | 钙离子通道，电压依赖性，L型，α1S亚基 |
远端肌病
其他肌病
| 基因符号 | 蛋白 |
| ISCU | 铁硫簇支架同源物(大肠杆菌) |
| MSTN | 肌生成抑制蛋白 |
| FHL1 | 加半LIM域1 |
| BAG3 | BCL2-相关致癌基因3 |
| ACVR1 | 激活素A受体，II型样激酶2 |
| MYOT | 肌醇蛋白 |
| FLNC | 细丝蛋白C，γ(肌动蛋白结合蛋白-280) |
| LDB3 | LIM结构域结合3 |
| LAMP2 | 溶酶体相关膜蛋白2前体 |
| VCP | 含缬酪肽的蛋白 |
| CAV3 | 小窝蛋白3 |
| SEPN1 | 硒蛋白N1 |
| CRYAB | 晶状体蛋白，αB |
| DES | 肌间线蛋白 |
| VMA21 | VMA21液泡H+-ATP酶同源物(酿酒酵母) |
| PLEC | 凝集素 |
| PABPN1 | 聚(A)结合蛋白,核1 |
| TTN | 肌联蛋白 |
| RYR1 | 鱼尼丁受体1(骨骼的) |
| CLN3 | 蜡样质脂褐质沉积症，神经元3(＝battenin) |
| TRIM54 | |
| TRIM63 | 包含三方基序63,E3泛素蛋白连接酶 |
强直性综合征
| 基因 | 蛋白 |
| DMPK | 强直性营养不良蛋白激酶 |
| CNPB | 细胞核酸结合蛋白 |
| CLCN1 | 氯离子通道1，骨骼肌(Thomsen病，常染色体显性遗传) |
| CAV3 | 小窝蛋白3 |
| HSPG2 | 基底膜聚糖 |
| ATP2A1 | ATP酶,Ca++转运，快速颤搐1 |
离子通道肌肉疾病
恶性高热
| 基因 | 蛋白 |
| RYR1 | 鱼尼丁受体1(骨骼的) |
| CACNA1S | 钙离子通道，电压依赖性，L型，α1S亚基 |
代谢性肌病
遗传性心肌病
先天性肌无力综合征
运动神经元疾病
遗传性运动和感觉神经病
遗传性截瘫
其他神经肌肉疾病
上文列出的任何基因中的任何一个都可以作为替代基因治疗的靶标，其中目标基因是缺陷或突变基因的功能形式。
或者，上文列出的基因可用作基因编辑的靶标。基因编辑用于校正突变基因的序列或修饰缺陷/异常基因的表达或调控，从而在肌肉细胞中表达功能基因。在这种情况下，目标基因选自编码治疗性RNA的基因(如干扰RNA)、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA的那些，其中治疗性RNA靶向前述基因。工具(如CRISPR/Cas9)可用于该目的。
因此，通过基因编辑或基因替代，在患病患者的肌肉细胞中提供了该基因的正确形式，这可以有助于针对该疾病的有效治疗。
在一些实施方案中，用于基因治疗(附加基因治疗或基因编辑)的靶基因是引起上列神经肌肉疾病之一的基因，优选选择下组：杜氏肌营养不良症(DMD基因)、肢带状肌营养不良症(LGMD)(CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5基因等)、脊髓性肌萎缩症(SMN1基因)、肌管性肌病(MTM1基因)、庞贝病(GAA基因)和糖原贮积病III(GSD3)(AGL基因)。
营养不良性疾病是由编码蛋白营养不良蛋白的DMD基因中的致病性变异引起的X连锁肌病谱。营养不良性疾病包括杜兴氏肌营养不良症(DMD)、贝克尔肌营养不良症(BMD)和DMD相关性扩张型心肌病；
肢带状肌营养不良(LGMD)是与DMD临床相似但由于常染色体隐性遗传和常染色体显性遗传而在两性中均发生的一组疾病。肢带营养不良由编码肌糖蛋白和与肌细胞膜相关的其他蛋白的基因突变引起，所述蛋白与肌营养不良蛋白相互作用。术语LGMD1是指显示显性遗传(常染色体显性)的遗传类型，而LGMD2是指具有常染色体隐性遗传的类型。已报道超过50个基因座的致病性变体(从LGMD1A到LGMD1G；从LGMD2A到LGMD2W)。钙蛋白酶病(LGMD2A)由具有描述的超过450种致病性变体的基因CAPN3的突变引起。LGMD表型的贡献基因包括：anoctamin 5(ANO5)、血管心外膜物质(BVES)、钙蛋白酶3(CAPN3)、caveolin 3(CAV3)、CDP-L-核糖醇焦磷酸化酶A(CRPPA)、营养不良聚糖1(DAG1)、结蛋白(DES)、DnaJ热休克蛋白家族(Hsp40)同源物、亚家族B、成员6(DNAJB6)、dysferlin(DYSF)、fukutin相关蛋白(FKRP)、fukutin(FKT)、GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)、异质核核糖核蛋白D样(HNRNPDL)、包含LIM锌指结构域的2(LIMS2)、lain A:C(LMNA)、肌球蛋白(MYOT)、网蛋白(PLEC)、蛋白O-葡萄糖基转移酶1(PLOGLUT1)、蛋白O-连锁的甘露糖N-乙酰葡糖胺基转移酶1(β1,2-)(POMGNT1)、蛋白O-甘露糖激酶(POMK)、蛋白O-甘露糖基转移酶1(POMT1)、蛋白O-甘露糖基转移酶2(POMT2)、肌聚糖α(SGCA)、肌聚糖β(SGCB)、肌聚糖δ(SGCD)、肌聚糖γ(SGCG)、肌联蛋白帽(TCAP)、转运蛋白3(TNPO3)、torsin 1A相互作用蛋白(TOR1AIP1)、转运蛋白颗粒复合物11(TRAPPC11)、包含32(TRIM 32)和肌联蛋白(TTN)的三联基序。LGMD表型的主要贡献基因包括CAPN3、DYSF、FKRP和ANO5(Babi Ramesh Reddy Nallamilli et al.,Annals of Clinical and Translational Neurology,2018,5,1574-1587。
脊髓性肌萎缩症是一种由生存运动神经元1(SMN1)基因突变引起的遗传性疾病，其特征是用于运动的肌肉无力和消瘦(萎缩)。
X连锁肌管肌病是一种由肌管蛋白(MTM1)基因突变引起的遗传性疾病，该基因影响用于运动的肌肉(骨骼肌)，并且几乎只发生在男性身上。这种病症的特点是肌肉无力(肌病)和肌张力降低(张力减退)。
庞贝病是一种由酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因突变引起的遗传性疾病。GAA基因的突变阻止酸性α-葡萄糖苷酶有效分解糖原，从而使这种糖在溶酶体中堆积到毒性水平。这种堆积损害贯穿机体的器官和组织，特别是肌肉，导致庞贝病的渐进性体征和症状。
糖原贮积病III(GSD3)是一种常染色体隐性代谢紊乱，由编码糖原脱支酶的淀粉-α-1、6-葡萄糖苷酶、4-α-葡聚糖转移酶(AGL)基因的纯合或复合杂合突变引起，并与具有短外链的异常糖原的积累有关。临床上，GSD III患者在婴儿期或幼儿期出现肝肿大、低血糖和生长迟缓。IIIa患者的肌肉无力在儿童时期是轻微的，但在成人中可能会变得更加严重；一些患者发展为心肌病。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物用于在无肝损害的情况下治疗肌肉疾病(即，肌病)或肌肉损伤，特别是神经肌肉遗传疾病，例如：肌营养不良、先天性肌营养不良、先天性肌病、远端肌病、其他肌病、强直性综合征、离子通道肌肉疾病、恶性高热、代谢性肌病、遗传性心肌病、先天性肌无力综合征、运动神经元疾病、遗传性截瘫、遗传性运动和感觉神经病及其他神经肌肉疾病。在一些优选实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗肌肉疾病(即肌病)或肌肉损伤，特别是肌肉遗传疾病，而没有肝损伤，例如：如上定义的肌营养不良症、先天性肌营养不良症、先天性肌病、远端肌病、其他肌病、强直综合征、离子通道肌肉疾病、恶性高热、代谢性肌病、遗传性心肌病和先天性肌无力综合征；更特别是如上定义的肌营养不良症、先天性肌营养不良症、先天性肌病、远端肌病、离子通道肌病、恶性高热、代谢性肌病和遗传性心肌病。
替代或附加基因疗法可用于治疗癌症，特别是横纹肌肉瘤。癌症中的目标基因可以调节肿瘤细胞的细胞周期或代谢和迁移，或诱导肿瘤细胞死亡。例如，诱导型半胱天冬酶-9可以在肌肉细胞中表达以触发细胞死亡，优选在联合疗法中引起持久的抗肿瘤免疫应答。
在自身免疫或癌症的情况下，基因编辑可用于修饰肌肉细胞中的基因表达，或扰乱此类细胞中的病毒周期。在这种情况下，优选地，目标基因选自编码向导RNA(gRNA)、位点特异性核酸内切酶(TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、Cas核酸酶)、DNA模板和RNAi组分(如shRNA和microRNA)的那些。工具(如CRISPR/Cas9)可用于此目的。
在一些实施方案中，基因治疗用于通过在肌肉组织中表达治疗性基因来治疗影响其他组织的疾病。这可用于避免治疗性基因在肝脏中表达，特别是在患有并发性肝病(例如肝炎)的患者的肝脏中表达。治疗性基因优选编码治疗性蛋白质、肽或抗体，其从肌肉细胞分泌到血流中，在血流中其可被递送至其他靶组织(如肝脏)。治疗性基因的实例包括但不限于：因子VIII，因子IX和GAA基因。
包含具有降低的肝向性的AAV载体颗粒的本发明的药物组合物可以向患有并发肝变性(如纤维化)、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性或中毒性肝炎或诱导肝变性的潜在遗传疾病的患者施用。
在本发明的上下文中，治疗有效量是指足以逆转、减轻或抑制该术语所应用的疾病或病症的进展，或逆转、减轻或抑制该术语所应用的疾病或病症的一种或多种症状的发展的剂量。
根据各种因素确定和调整有效剂量，例如所用的组合物、施用途径、所考虑的个体的身体特征(例如性别、年龄和体重)、同时用药以及医学领域的技术人员将了解的其他因素。
在本发明的各种实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和/或介质。
“药学上可接受的载体”是指当酌情向哺乳动物，尤其是人施用时，不会产生不利、过敏或其他不良反应的载体。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何形式的制剂助剂。
优选地，药物组合物包含介质，其对于能够注射的制剂是药学上可接受的。这些可以特别是等渗的无菌盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或此类盐的混合物)，或干燥，尤其是冻干组合物，其视情况加入灭菌水或生理盐水后允许构建可注射溶液。
适用于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或悬浮液。溶液或悬浮液可包含与病毒载体相容且不阻止病毒载体颗粒进入靶细胞的添加剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须具有一定程度的流动性，以达到易于注射的能力。它必须在制备和储存条件下稳定，并且必须保存以防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。合适溶液的实例是缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或乳酸林格氏液。
本发明还提供了用于治疗影响肌肉组织(特别是骨骼肌组织和/或心脏组织)的疾病的方法，包括：向患者施用治疗有效量的如上所述的药物组合物。
本发明还提供了通过在肌肉组织中表达治疗性基因用于治疗疾病的方法，包括：向患者施用治疗有效量的如上所述的药物组合物。
如本文所用，术语“患者”或“个体”表示哺乳动物。优选地，根据本发明的患者或个体是人。
在本发明的上下文中，本文所用的术语“治疗”是指逆转、减轻或抑制该术语所应用的疾病或病症的进展，或逆转、减轻或抑制该术语所应用的疾病或病症的一种或多种症状的进展。
本发明的药物组合物通常根据已知程序以有效诱导患者中的治疗效果的剂量和时间段施用。
施用可以是肠胃外、口服、局部或限于局部的。肠胃外施用有利地通过注射或灌注，例如皮下(SC)、肌内(IM)、血管内(如静脉内)(IV)、腹膜内(IP)、皮内(ID)或其他。优选地，施用在全身(即患者的所有肌肉，包括隔膜和心脏)中产生全身作用。优选地，施用是全身性的，更优选肠胃外的。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的常规技术。文献中充分解释了这种技术。
现在将参考附图，通过以下非限制性实施例说明本发明，其中：
附图说明
-图1：AAV9和AAVrh74之间的杂合AAV血清型中的肽插入的设计。
A.AAV9、AAVrh74和AAV9-rh74杂合衣壳的Cap基因(VP1)的示意图，突出显示了可变区的序列。B.AAV-MT衣壳的VP1蛋白衍生自在AAV9-rh74衣壳的VP1的氨基酸586-593之间插入15个氨基酸(15-mer)。
-图2：AAV9-RH74和AAV-MT在GSDIII小鼠中的比较生物分布。
将GSDIII小鼠尾静脉注射2x1012个载体基因组/小鼠的指定的AAV载体。注射后三个月，收集组织。注射PBS的小鼠用作对照。(A-F)在肝脏(A)；心脏(B)；隔膜(C)；四头肌(D)；趾长伸肌(EDL)(E)和腓肠肌(F)中测量的每个细胞的载体基因组拷贝数(VGCN/细胞)。数据表示为平均值±标准偏差。通过ANOVA进行统计分析(*＝p<0.05vs.PBS；§＝p<0.05vs.ALL；n＝4-5个小鼠/组)。
具体实施方式
实施例：肽修饰的杂合AAV9-rh74血清型载体
1.材料和方法
新血清型的质粒构建
为了构建包含AAV2 Rep序列和杂合Cap 9-rh74的质粒，合成1029nt的片段，所述片段包含AAV-rh74 Cap的高度可变部分，其侧接AAV9 Cap序列片段和5'的限制位点BsiWI和3'的Eco47III(GENEWIZ)。然后，使用提及的限制位点将该片段插入包含AAV2Rep和AAV9Cap的质粒pAAV2-9中以取代AAV9 Cap对应序列。通过用GQSGRGDLGLSAQAA(SEQ ID NO：13)氨基酸序列替换AAV9-rh74衣壳中的QQNAAP六肽(SEQ ID NO：11)来进行肽植入。
AAV生产
使HEK293T细胞在250mL无血清培养基中悬浮生长。用3个质粒转染细胞：i)含有AAV2 ITR的转基因质粒，其侧翼是表达盒，ii)辅助质粒pXX6，其含有产生AAV所需的腺病毒序列，和iii)含有AAV Rep和Cap基因的质粒，其定义AAV的血清型。转染两天后，将细胞裂解以释放AAV颗粒。
通过亲和色谱法纯化病毒裂解物。使用对应于AAV载体基因组的ITR的引物和探针，通过TaqMan实时PCR分析定量病毒基因组(Rohr et al.,J.Virol.Methods,2002,106,81–88)。
体内研究
所有小鼠研究均根据法国和欧洲关于动物护理和实验的立法(2010/63/EU)进行，并经当地机构伦理委员会批准(协议号2016-002C)。将AAV载体通过尾静脉向三个月大的雄性GDE基因敲除小鼠静脉注射。注射PBS的同窝小鼠用作对照。注射载体三个月后，将组织收集并使用Fastprep管(6.5m/s；60秒)在不含DNAse/RNAse的水中匀浆。
载体基因组拷贝数(VGCN)定量
对于样品中的载体基因组拷贝数(VGCN)定量，使用MagNA Pure 96Instrument(Roche)从样品提取DNA。使用上述AAV载体滴定方案对1μL DNA进行实时PCR。肌联蛋白基因的外显子Mex5用作基因组DNA加载对照。
2.结果
通过在SEQ ID NO:3的第586位的Q和第593位的I之间的VP1、VP2和VP3之间的公共区域中插入肽来设计AAV9-rh74杂合衣壳(图1)。使用Michelfelder等公开的肽(PLoS ONE,2009,4,e5122)根据Kienle EC(Dissertation for the degree of Doctor of naturalSciences,Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics ofthe Ruperto-Carola University of Heidelberg,Germany,2014)进行AAV衣壳修饰。简言之，将杂合Cap9-rh74的VP1、VP2和VP3之间的公共区域(SEQ ID NO：3的第587-592位)中存在的六肽QQNAAP(SEQ ID NO：11)突变为八肽GQSGAQAA(SEQ ID NO：12)，并将肽P1(RGDLGLS；SEQ ID NO：8)插入4位的甘氨酸和5位的丙氨酸之间。具有插入肽P1的肽修饰的杂合Cap9-rh74具有氨基酸序列SEQ ID NO：5，并且相应的编码序列是SEQ ID NO：6。如实施例1所述，通过悬浮生长的HEK293细胞中三重转染产生载体，并通过亲和色谱法纯化。将称为AAV-肌肉传感器(AAV-MT)的由此产生的AAV载体与AAV9-rh74一起以2x 1012vg/小鼠的剂量同时注射到GDE敲除小鼠(GSDIII的动物模型)中。注射后三个月获得组织，并通过定量PCR测量载体基因组拷贝数(VGCN)以评估组织靶向(图2)。在肝脏中，与注射PBS的小鼠相比，注射AAV9-rh74导致载体基因组拷贝相助增加(p<0.05；图2A)，而与PBS组相比，用AAV-MT转导的肝脏未显示VGCN的显著增加。总体上，与亲本衣壳AAV9-rh74相比，AAV-MT在肌肉中显示更好的转导效率(图2B-F)。重要的是，在膈膜、四头肌和腓肠肌中，AAV-MT优于亲本衣壳(p<0.05vs.AAV9-rh74组)。最后，在心脏和趾长伸肌(EDL)中，与注射PBS的小鼠相比，注射AAV-MT衣壳后测得的VGCN显著更高，而注射AAV9-rh74则不然。这些数据表明，AAV-MT衣壳在肌肉转导方面优于AAV9-rh74，并且维持甚至改善了对亲本衣壳观察到的明显肝脏脱靶。
Claims (30)
1.重组腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其是包含至少一个拷贝的包含RGD基序的肽的AAV血清型9(AAV9)和AAV血清型74(AAVrh74)衣壳蛋白之间的肽修饰的杂合体，其中与不具有所述肽的杂合AAV衣壳蛋白相比，所述重组肽修饰的杂合AAV衣壳蛋白具有进一步降低的肝向性和增加的肌肉转导。
2.根据权利要求1所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其通过将AAV9或AAVrh74衣壳序列中的可变区替换为其他AAV血清型衣壳序列的相应可变区而产生，
其中所述AAV9衣壳的可变区对应于位于SEQ ID NO：1的AAV9衣壳中从第331-493位的任一个至第556-736位的任一个的序列，或位于SEQ ID NO：1的AAV9衣壳中第493-556位的序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个连续氨基酸的片段，和
所述AAVrh74衣壳的可变区对应于位于SEQ ID NO：2的AAVrh74衣壳中从第332-495位的任一个至第558-738位的任一个的序列，或位于SEQ ID NO：2的AAVrh74衣壳中第495-558位的序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个连续氨基酸的片段。
3.根据权利要求2所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其通过将对应于位于SEQ ID NO：1的AAV9衣壳中第449-609位或位于SEQ ID NO：2的AAVrh74衣壳中第450-611位的可变区替换为其他AAV血清型衣壳序列的相应可变区而产生。
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其衍生自包含选自下组的序列的杂合AAV衣壳蛋白：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4以及与所述序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。
5.根据权利要求4所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其衍生自包含选自下组的序列的杂合AAV衣壳蛋白：SEQ ID NO：3以及与所述序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。
6.根据权利要求5所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其衍生自包含序列SEQ ID NO：3的杂合AAV衣壳蛋白。
7.根据权利要求1-6任一项所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中所述包含RGD基序的肽至多30个氨基酸。
8.根据权利要求7所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中所述肽包含以下任一种或由以下任一种组成：RGDLGLS(SEQ ID NO:8)、LRGDGLS(SEQ ID NO:14)、LGRGDLS(SEQ ID NO:15)、LGLRGDS(SEQ ID NO:16)、LGLSRGD(SEQ ID NO:17)和RGDMSRE(SEQ ID NO:18)。
9.根据权利要求8所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:8或由SEQID NO:8组成。
10.根据权利要求8或9所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中所述序列SEQ ID NO：8和14-18在其N-和/或C-末端侧接至多五个氨基酸。
11.根据权利要求10所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中所述序列SEQ ID NO：8和14-18分别在所述肽的N-和C-末端侧接GQSG(SEQ ID NO:9)和AQAA(SEQ ID NO:10)。
12.根据权利要求11所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中所述肽包含SEQ ID NO:13或由SEQ ID NO:13组成。
13.根据权利要求1-12任一项所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其包含至多5个拷贝的包含RGD基序的肽。
14.根据权利要求1-13任一项所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中所述至少一个拷贝的包含RGD基序的肽被插入暴露于AAV衣壳表面上的位点中。
15.根据权利要求14所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中根据SEQ ID NO：3中的编号，所述至少一个拷贝的包含RGD基序的肽被插入第261、383、449、575或590位的任一个附近。
16.根据权利要求15所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中根据SEQ ID NO：3中的编号，所述至少一个拷贝的包含RGD基序的肽被插入第449或590位附近。
17.根据权利要求16所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中根据SEQ ID NO：3中的编号，所述至少一个拷贝的包含RGD基序的肽被插入第590位附近。
18.根据权利要求17所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中根据SEQ ID NO:3中的编号，所述至少一个拷贝的包含RGD基序的肽的插入位点从第587-592位。
19.根据权利要求18所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其中根据SEQ ID NO：3中的编号，所述包含RGD基序的肽替换所述AAV衣壳蛋白的第587-592位的所有残基。
20.根据权利要求1-19任一项所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其包含选自下组的序列：SEQ ID NO：5以及与所述序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列。
21.根据权利要求1-20任一项所述的重组杂合AAV衣壳蛋白，其是杂合VP1、VP2和VP3蛋白。
22.重组嵌合AAV衣壳蛋白，其选自下组：
-嵌合VP1蛋白，其包含：(i)VP1特异性N端区域，其具有来自除AAV9和AAVrh74以外的天然或人工AAV血清型的序列，(ii)VP2特异性N端区域，其具有来自AAV9、AAVrh74或除AAV9和AAVrh74以外的天然或人工AAV血清型的序列，和(iii)VP3 C-端区域，其具有根据权利要求21所述的杂合VP3蛋白的序列，和
-嵌合VP2蛋白，其包含：(i)VP2特异性N端区域，其具有来自除AAV9和AAVrh74以外的天然或人工AAV血清型的序列，和(ii)VP3 C-端区域，其具有根据权利要求21所述的杂合VP3蛋白的序列。
23.以可表达形式编码根据权利要求1-21任一项所述的重组杂合AAV衣壳蛋白或根据权利要求22所述的重组嵌合AAV衣壳蛋白，并最终进一步以可表达形式编码AAV复制酶蛋白的多核苷酸。
24.包含根据权利要求23所述的多核苷酸的重组质粒。
25.包装目标基因的AAV载体颗粒，其包含根据权利要求1-21任一项所述的杂合重组AAV衣壳蛋白和/或根据权利要求22所述的重组嵌合AAV衣壳蛋白，并最终还包含至少一个来自除AAV9和AAVrh74以外的天然或人工AAV血清型的AAV衣壳蛋白。
26.根据权利要求25所述的AAV载体颗粒，其中所述目标基因选自下组：
(i)治疗性基因；
(ii)编码治疗性蛋白或肽，如治疗性抗体或抗体片段和基因组编辑酶的基因；和
(iii)编码治疗性RNA，如干扰RNA、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA的基因。
27.药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求25或权利要求26所述的AAV载体颗粒。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其用作基因治疗的药物，优选用于治疗影响肌肉组织的遗传性疾病、癌症或自身免疫性疾病的用途。
29.根据权利要求28所述的用于其用途的药物组合物，其靶向负责选自下组的神经肌肉遗传疾病的基因：杜氏肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、脊髓性肌萎缩症、肌管肌病、庞贝病和糖原贮积病III。
30.根据权利要求29所述的用于其用途的药物组合物，其中所述靶基因选自下组：DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5、SMN1、MTM1、GAA和AGL基因。
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