CN119403823A

CN119403823A - 具有增强的肌肉转导效率的肽修饰的aav衣壳

Info

Publication number: CN119403823A
Application number: CN202380048686.9A
Authority: CN
Inventors: I·里夏尔; A·V·泓
Original assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon
Current assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2023-06-09
Publication date: 2025-02-07
Also published as: WO2023237748A1

Abstract

本发明涉及具有增加的肌肉转导效率的肽修饰的AAV衣壳。本发明还涉及包装目标基因的衍生的重组AAV载体颗粒及其在基因治疗中的用途，特别是用于治疗肌肉疾病。

Description

具有增强的肌肉转导效率的肽修饰的AAV衣壳

技术领域

本发明涉及具有增强的肌肉转导效率的肽修饰的AAV衣壳。本发明还涉及包装目标基因的衍生的重组AAV载体颗粒及其在基因治疗中的用途，特别是用于治疗肌肉疾病。

背景技术

重组腺相关病毒(rAAV)载体广泛用于体内基因转移，并且目前正在进行使用AAV载体的临床试验来治疗许多疾病。

AAV是属于细小病毒(Parvoviridae)科的依赖性细小病毒(Dependoparvovirus)属的非致病性病毒。AAV是由直径约26nm的衣壳和4.7kb的单链DNA基因组组成的无包膜病毒。基因组携带两个基因，rep和cap，侧接两个命名为反向末端重复序列(ITR)的回文区域，其用作病毒复制起点和包装信号。cap基因编码三种结构蛋白VP1、VP2和VP3，它们通过从不同起始密码子的可变剪接和翻译组成二十面体AAV衣壳。VP1、VP2和VP3共享相同的C-末端，其是VP3的全部。使用AAV2作为参考，VP1具有735个氨基酸序列(GenBank登录号YP_680426.1，于2018年8月13日访问)；VP2(598个氨基酸)起始于苏氨酸138(T138)，以及VP3(533个氨基酸)起始于甲硫氨酸203(M203)。三种不同的VP对AAV2衣壳的贡献比例是1VP1:1VP2:10VP3。所有AAV血清型的衣壳由60个VP单体与约50个拷贝的VP3、5个拷贝的VP2和5个拷贝的VP1组装而成。rep基因编码病毒复制Rep78、Rep68、Rep52和Rep40所需的四种蛋白。重组AAV载体包裹ITR侧接的rAAV基因组，其中治疗性基因表达盒取代AAV蛋白质编码序列。

组织特异性由衣壳血清型决定，并且通常使用的分离自人和非人灵长类的AAV血清型可以比其它的(如肌肉组织中的AAV6、AAV8、AAV9和AAV-rh74)更有效地转导特定器官。

已经产生了在各种AAV血清型表面上展示短随机肽的AAV衣壳变体文库，以筛选具有改变的细胞特异性和/或转导效率的基因治疗载体(Review in Büning et al.,Molecular Therapy:Methods&Clinical Development,2019,12,248)。已报道包含插入含有RGD基序的肽的AAV衣壳可以改善全身施用后肌肉中的基因递送，已知RGD基序结合几种不同的细胞表面整联蛋白。在小鼠、非人灵长类和/或人原代肌管中用于肌肉转导的最有效的AAV衣壳展示肽RGDLGLS或P1(AAVMYO或AAV9P1)、RGDLTTP(MyoAAV 1A)、GPGRGDQTTL(MyoAAV 2A)、SNSRGDYNSL(MyoAAV 4A)、ENRRGDFNNT(MyoAAV 4E)、SAQRGDYVGL(MyoAAV3A)、QERRGDYTSM(MyoAAV 4C)插入可变区VIII(WO 2019/207132；Weinmann et al.,Naturecommunications,2020,11,5432；Tabebordbar et al.,Cell,2021,184,4919-4938)。

用全身递送的AAV载体有效地、选择性地和安全地转导肌肉的能力将有益于许多人类疾病的基因治疗。

发明简述

本发明人已经表明，包含插入与整合素异二聚体α-αVβ6(ITGAV-B6)结合的肽RGDLXXL/I(SEQ ID NO:1)(其中XX不同于GS和ST)的重组腺相关病毒(AAV)衣壳在肌肉中具有增加的转导效率，特别是在全身递送重组AAV载体之后。

因此，本发明涉及一种重组腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含插入至少一个拷贝的包含基序RGDLXXL/I(SEQ ID NO:1)的肽，其中XX不同于GS和ST，其中与未用所述肽修饰的重组AAV衣壳蛋白相比，用所述肽修饰的所述重组AAV衣壳蛋白在肌肉中具有增加的转导效率。

在一些实施方案中，插入是在可变区IV中。

在一些实施方案中，重组AAV衣壳蛋白是AAV血清型9和AAV血清型74衣壳蛋白的杂合体。

在一些优选的实施方案中，所述插入是在第452位中；优选地，其中肽插入取代了第453-459位的残基，所示位置通过与SEQ ID NO:20比对确定。

在一些实施方案中，所述基序是RGDLX₁X₂L/I，其中X₁是G、A、L、K或Q，并且X₂是R、K、E、D、A、L、T、I或V。在一些具体的实施方案中，所述基序具有选自下组的序列：RGDLGRL(SEQID NO:2)、RGDLGEL(SEQ ID NO:3)、RGDLATI(SEQ ID NO:4)、RGDLAEL(SEQ ID NO:5)、RGDLQVL(SEQ ID NO:6)和RGDLAEI(SEQ ID NO:7)；优选SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4；更优选SEQ ID NO:2。在一些具体实施方案中，所述肽包含选自下组的序列：TDGRGDLGRLGP(SEQID NO:14)、SEPRGDLGELNA(SEQ ID NO:15)、EPRRGDLATIGS(SEQ ID NO:16)、TDQRGDLAELHG(SEQ ID NO:17)、APVRGDLQVLAP(SEQ ID NO:18)和APVRGDLAEINP(SEQ ID NO:19)；优选SEQID NO:14或16；更优选SEQ ID NO:14。在一些更优选的实施方案中，重组AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:21至26中的任一个；优选SEQ ID NO:21或23；更优选SEQ ID NO:21具有至少85％同一性的序列。

本发明还涉及一种多核苷酸，其编码根据本公开的重组AAV衣壳蛋白。

本发明还涉及一种重组质粒，其包含根据本公开的多核苷酸。

本发明的另一方面涉及一种包装目标基因的AAV载体颗粒，其包含根据本公开的重组AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，目标基因选自下组：治疗性基因；编码治疗性蛋白质或肽(如治疗性抗体或抗体片段)和基因组编辑酶的基因；以及编码治疗性RNA(如干扰RNA、用于基因组编辑的指导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA)的基因。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据本公开的AAV载体颗粒或由根据本公开的AAV载体颗粒稳定转导的细胞。

本发明的另一方面涉及根据本公开的药物组合物，其用作基因治疗中的药物，优选用于治疗肌肉疾病。在一些优选的实施方案中，所述药物组合物靶向导致肌肉疾病的基因，所述肌肉疾病选自抗肌萎缩蛋白病和肢带型肌营养不良；优选地所述基因选自下组：DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、DNAJB6、ANO5、SGCA、SGCB和SGCG。

发明详述

经修饰的AAV衣壳蛋白

本发明涉及重组腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含插入至少一个拷贝的包含基序RGDLXXL/I(SEQ ID NO:1)的肽，其中XX不同于GS和ST，其中与未用所述肽修饰的重组AAV衣壳蛋白相比，用所述肽修饰的所述重组AAV衣壳蛋白在肌肉中具有增加的转导效率。

整联蛋白是一类粘附受体，其包含形成24个不同整联蛋白异二聚体的18个α亚基和8个β亚基(Hynes,Cell,2002,110,673-687)。基序RGDLXXL/I(SEQ ID NO:1)，其中XX可以是除GS和ST之外的任何氨基酸对，与整联蛋白异二聚体αVβ6(ITGAV-B6)以高亲和力结合，所述整联蛋白异二聚体αVβ6在骨骼肌组织中高度富集并且在营养不良肌肉中上调，如本申请的实施例中所示。在该基序中，LxxL/I形成与B6亚基中的疏水口袋结合的两亲性α-螺旋。该基序可在TGF-β1\TGF-β3和FMDV病毒衣壳的前结构域中发现，它们都特异性结合ITGAV-B6(DDong et al.,Nature Struct.Mol.Biol.,2014,21,1091-1096；Dong et al.,Nature,2017,542,55-59；Kotecha etal.,Nature communications,2017,8,15408；蛋白质数据库登录号5FFO、4UM9和5NEM)。因此，根据本发明的包含SEQ ID NO:1的基序RGDLXXL/I的肽与肌细胞结合，并在体内将携带该肽的衣壳经修饰的rAAV载体导向或靶向肌细胞和组织，特别是在患有肌肉疾病的受试者中。

本发明的经修饰的AAV衣壳蛋白是功能性AAV衣壳，其能够在体外或体内形成转导肌肉细胞、组织或器官的重组AAV载体颗粒。此外，与相应的由其衍生的未经修饰的AAV衣壳蛋白相比，根据本发明的经修饰的AAV衣壳蛋白在肌肉中具有增加的转导效率。

根据本发明的经修饰的AAV衣壳蛋白对肌肉的优异转导效率可以使用本领域熟知的标准测定法，如本申请实施例中公开的那些，通过测量包含经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV载体颗粒在体外或体内转导肌肉细胞、组织或器官的能力来测定。AAV载体转导可以在体外或体内通过测量载体基因组拷贝数或转基因表达来测定。每二倍体基因组的载体基因组拷贝数可通过本领域熟知的标准测定法来测量，如实时PCR测定法。转基因表达有利地使用报告基因如荧光素酶或荧光蛋白(GFP或其他)通过本领域熟知的标准测定法来测量，如体内或体外的定量生物发光或体内或体外的荧光测定。例如，肌肉转导水平可以通过在动物模型如小鼠模型中局部或全身施用携带经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV载体颗粒来测定，所述动物模型是本领域熟知的并在本申请的实施例中公开的。包含相应的未经修饰AAV衣壳蛋白的AAV载体用于比较。

肌肉水平中增加的转导效率是指肌肉中增加的转导水平(更高的水平或提高的水平)，特别是指与未经修饰的AAV衣壳蛋白相比，在至少一种肌肉细胞、组织或器官中转基因表达水平增加至少1.5倍，优选3、5、10、50、100倍或更多，或与未经修饰的AAV衣壳蛋白相比，在至少一种肌肉细胞、组织或器官中载体拷贝数增加至少1.1倍，优选1.5、2、2.5、3、3.5倍或更多。由于肌肉中更高的转导水平，本发明的经修饰的AAV衣壳蛋白具有改善的生物分布。这意味着其明显更好地靶向肌肉组织或器官而不增加其他(非靶向)组织，特别是肝脏的靶向(即改善的特异性)。

如本文所用，术语“肌肉”是指心肌(即心脏)和骨骼肌。术语“肌细胞”是指肌细胞、肌管、成肌细胞和/或卫星细胞。根据骨骼肌在身体中的解剖位置将其分为不同的组。可以在小鼠胫骨肌(TA)、趾长伸肌(EDL)、四头肌(Qua)、腓肠肌(Ga)、比目鱼肌(Sol)、三头肌、二头肌和/或膈膜中，特别是在小鼠胫骨肌(TA)、膈膜和/或四头肌(Qua)中测量根据本发明的经修饰的AAV衣壳在不同骨骼肌组中的转导效率或向性。表述“肌肉转导”是指体内存在的心脏和各种骨骼肌的向性。

在下面的描述中，氨基酸残基用标准的单字母氨基酸代码表示。

“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”或“至少一个”在本文中可互换使用；除非另外规定，“或”意指“和/或”。

本发明的经修饰的AAV衣壳蛋白是重组蛋白。

如本文所用，“序列”是指1个氨基酸或至少2个连续氨基酸。

在本说明书中，在AAV衣壳蛋白序列的给定位置插入是指在该位置的氨基酸残基之后插入。

术语“同一性”是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或相同的氨基酸残基占据时，则相应的分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比对应于两个序列共有的匹配位置的数目除以比较的位置的数目并乘以100。通常，当两个序列被比对以给出最大同一性时进行比较。可以通过比对来计算同一性，使用例如GCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCGPackage,Version 7,Madison,Wisconsin)堆积程序或任何序列比较算法如BLAST、FASTA或CLUSTALW。

在一些实施方案中，本发明的经修饰的AAV衣壳增加了AAV载体的全身递送后肌肉中的转导水平。

在一些实施方案中，根据本发明的RGDLXXL/I基序由RGDLX₁X₂L/I组成，其中X₁为G、A、L、K或Q且X₂为R、K、E、D、A、L、T、I或V。通过建模可以增强RGDLXXL/I基序与ITGAV-B6结合或保持衣壳蛋白稳定性的序列来鉴定该基序。在一些具体的实施方案中，根据本发明的RGDLXXL/I基序由选自下组的序列组成：RGDLGRL(SEQ ID NO:2)、RGDLGEL(SEQ ID NO:3)、RGDLATI(SEQ ID NO:4)、RGDLAEL(SEQ ID NO:5)、RGDLQVL(SEQ ID NO:6)和RGDLAEI(SEQID NO:7)；优选SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4；更优选SEQ ID NO:2。在一些具体实施方案中，所述肽包含根据本发明的Z-RGDLXXL/I基序，其中Z是G、P、Q、V或R；优选G或R。在具体的实施方案中，所述肽包含选自下组的序列：GRGDLGRL(SEQ ID NO:8)、PRGDLGEL(SEQ ID NO:9)、RRGDLATI(SEQ ID NO:10)、QRGDLAEL(SEQ ID NO:11)、VRGDLQVL(SEQ ID NO:12)和VRGDLAEI(SEQ ID NO:13)；优选SEQ ID NO:8或10；更优选SEQ ID NO:8。

在一些实施方案中，根据本发明的RGDLXXL/I或Z-RGDLXXL/I基序在N-末端和/或C-末端侧接至多5个氨基酸(1、2、3、4或5个)的序列，所述氨基酸可以相同或不同；优选侧接2个氨基酸的序列，所述氨基酸可以相同或不同。根据本发明，基序N-末端和C-末端的序列是与基序N-末端和C-末端直接相邻的侧接序列。N-末端和C-末端侧接序列有利地选自下组：TD、GP、EP和GS；优选地，在N-末端中选自TD或EP，或在C-末端中选自GP或GS。在一些具体实施方案中，所述肽包含选自下组的序列或由其组成：TDGRGDLGRLGP(SEQ ID NO:14)、SEPRGDLGELNA(SEQ ID NO:15)、EPRRGDLATIGS(SEQ ID NO:16)、TDQRGDLAELHG(SEQ ID NO:17)、APVRGDLQVLAP(SEQ ID NO:18)和APVRGDLAEINP(SEQ ID NO:19)；优选SEQ ID NO:14或16；更优选SEQ ID NO:14。根据本发明的包含RGDLXXL/I基序的肽通常由至多30个氨基酸的序列组成。所述肽可以由9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个氨基酸组成。在一些实施方案中，所述肽由至多25、20或15个氨基酸的序列组成。优选地，靶向肽由12、13、14或15个氨基酸的序列组成；更优选12个氨基酸。

在一些实施方案中，根据本发明的经修饰的AAV衣壳蛋白包含至多5个拷贝(1、2、3、4或5个)的根据本发明的包含RGDLXXL/I基序的肽。

将根据本发明的包含RGDLXXL/I基序的一个或多个肽插入AAV衣壳表面上暴露的位点。AAV衣壳表面上暴露于衣壳表面并耐受肽插入(即不影响病毒衣壳的组装和包装)的位点是本领域公知的，并且特别包括在突起顶部形成环的可变区(VR)，例如VR-IV、-V和-VIII(Review in Büning et al.,Molecular Therapy:Methods&Clinical Development,2019,12,248-)。根据AAV8衣壳蛋白序列中的编号，VR-IV对应于Y445至A476(广义定义)或Q451至L462(狭义定义)；VR-V对应于C485至G515(广义定义)或R490至T509(狭义定义)；VR-VIII对应于I581至L604(广义定义)或L586至I595(狭义定义)。根据AAV2衣壳蛋白序列中的编号，肽插入位点有利地位于AAV衣壳表面暴露的共同VP3区的位点，例如第587、588、589、453、520(与584结合)、584和585位。所述肽插入位点通过参考AAV2或AAV8衣壳氨基酸序列来指示。AAV2衣壳(VP1)蛋白序列对应于2018年8月13日访问的GenBank登录号YP_680426.1。AAV8衣壳(VP1)蛋白序列对应于2018年8月13日访问的GenBank登录号YP_077180.1。使用本领域熟知的标准蛋白质序列比对程序，例如BLAST、FASTA、CLUSTALW等，将任何其它AAV衣壳序列与AAV2或AAV8衣壳序列进行序列比对后，本领域技术人员可以容易地获得其它AAV衣壳序列中肽插入位点的相应位置。VR-VIII中的插入位点包括AAV1中的第590位；AAV2中的第587或588位；AAV3或AAV4中的第586位；AAV5中的第575位；AAV6中的第585位；AAV8中的第585或590位；AAV9中的第588或589位；AAV9.rh74中的第589位。

在一些优选的实施方案中，本发明的经修饰的AAV衣壳包含至少一个RGDLXXL/I肽插入可变区IV(VR-IV)或可变区VIII(VR-VIII)，优选插入VR-IV。优选地，VR-IV中的插入是在根据AAV2衣壳序列中的编号的第450位(T450)中；AAV9.rh74杂合衣壳蛋白序列(SEQ IDNO:8)中相应的位置是452(S452)。VR-VIII中的插入优选在根据AAV2衣壳蛋白中的编号的第587位(N587)；该位置是AAV9.rh74衣壳蛋白序列中的第589位(N589)。

RGDLXXL/I肽可插入AAV衣壳蛋白序列的2个连续氨基酸之间(无缺失)或可替换插入位点的部分或全部残基(缺失)。在一些实施方案中，RGDLXXL/I肽替换插入位点的残基，特别是AAV2衣壳蛋白序列的第451-457位的残基，对应于AAV9.rh74衣壳蛋白序列的第453-459位的残基。

经修饰的AAV衣壳蛋白可来源于任何天然或人工AAV衣壳血清型，包括杂合血清型和变异血清型。可衍生经修饰的AAV衣壳蛋白的AAV衣壳血清型的非限制性实例包括AAV1、AAV2、AAV3(包括3A和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV218、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAVrh74、AAV-LK03、AAV2G9、AAV.PHP、AAV-Anc80、AAV3B和AAV9与AAVrh74的杂合体。在一些实施方案中，经修饰的AAV衣壳蛋白来自选自下组的AAV血清型：AAV6，AAV8，AAV9，AAVrh74和AAV9与AAVrh74的杂合体。在一些优选的实施方案中，所述经修饰的AAV衣壳蛋白来自AAV8、AAV9或AAV9与AAVrh74的杂合体；或来自AAV9或AAV9与AAVrh74的杂合体，仍更优选、AAV9与AAVrh74的杂合体。AAV9衣壳特别对应于2004年6月24日访问的氨基酸序列GeneBank登录号AY530579.1。AAV9和AAVrh74的杂合体优选是如WO2019/193119中公开的AAV9.rh74；更优选具有氨基酸序列SEQ ID NO:20的AAV9.rh74衣壳。

在一些优选的实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白来自AAV9.rh74血清型，并且包含根据本发明的含有RGDLXXL/I基序的肽，所述RGDLXXL/I基序插入到AAV9.rh74衣壳蛋白序列的第452位并替换第453至459位的残基。在一些优选的实施方案中，所述肽包含选自下组的序列或由其组成：SEQ ID NO:2至19，优选SEQ ID NO:2、4、8、10、14或16；还更优选SEQ IDNO:2、8或14。

在一些更具体的实施方案中，经修饰的AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:21至26中的任一个；优选SEQ ID NO:21或23具有至少85％、87％、88％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列或由其组成；更优选地，其包含SEQ ID NO:21或23的序列或由SEQ ID NO:21或23的序列组成；还更优选包含SEQ ID NO:21的序列组成。根据本发明的变体在包含根据本发明的RGDLXXL/I基序或Z-RGDLXXL/I基序的肽中没有突变，且优选在插入位点前后的5个氨基酸序列中也没有突变；优选在插入位点前后的10个氨基酸序列中没有突变。

在一些实施方案中，经修饰的AAV衣壳蛋白是经修饰的VP1、VP2或VP3蛋白。在一些具体实施方案中，经修饰的VP1、VP2或VP3蛋白质衍生自SEQ ID NO:21至26中的任一个；优选SEQ ID NO:21或23；更优选SEQ ID NO:21。VP2对应于SEQ ID NO:21至26中任一个的从T138至末端的氨基酸序列。VP3对应于SEQ ID NO:21至26中任一个的从M204至末端的氨基酸序列。

在一些实施方案中，经修饰的AAV衣壳蛋白是嵌合VP1或VP2蛋白，其包含插入AAV血清型的共同VP3区和来自其它AAV血清型(例如不同于VP3区血清型的AAV血清型)的VP1特异性和/或VP2特异性N-末端区的肽。在一些具体实施方案中，嵌合VP1或VP2蛋白衍生自SEQID NO:9或10。

在本发明的各种实施方案中，使用本领域可用的方法，例如用于大分子建模和设计的Rosetta能量函数，可以有利地选择经修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列以使其具有最低的估计能量(review in Alford et al.,J.Chem.Theory Comput,2017,13,6,3031-3048)。例如，Rosetta能量函数用于穷尽地采样低能量结构-序列对。该方法确保设计的经修饰的AAV衣壳保持稳定，因此可以维持或甚至提高AAV载体的生产力。

AAV载体生产的多核苷酸、载体和用途

本发明的另一方面是一种多核苷酸，其编码可表达形式的重组经修饰的AAV衣壳蛋白。多核苷酸可以是DNA、RNA或合成或半合成核酸。

在一些实施方案中，多核苷酸编码根据本发明的经修饰的AAV9.rh74衣壳蛋白，特别是包含肽的经修饰的AAV9.rh74衣壳蛋白，所述肽包含选自下组的序列或由其组成：SEQID NO:2至19，优选SEQ ID NO:2、4、8、10、14或16；还更优选SEQ ID NO:2、8或14。

在一些优选的实施方案中，多核苷酸编码经修饰的AAV9.rh74衣壳蛋白，所述经修饰的AAV9.rh74衣壳蛋白包含与SEQ ID NO:21至26中的任一个；优选SEQ ID NO:21或23；还更优选SEQ ID NO:21具有至少85％、87％、88％、90％、95％、97％、98％或99％同一性的序列或由其组成。

在一些更优选的实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:27至32中的任一个；优选SEQ ID NO:27或29；更优选SEQ ID NO:27具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％或99％同一性的序列。核苷酸序列SEQ ID NO:27编码SEQ ID NO:21的经修饰的AAV9.rh74衣壳蛋白。核苷酸序列SEQ ID NO:29编码SEQ ID NO:23的经修饰的AAV9.rh74衣壳蛋白。多核苷酸是功能性多核苷酸序列，这意味着多核苷酸的序列编码根据本发明的修饰的AAV衣壳蛋白。

在一些实施方案中，多核苷酸还编码可表达形式的AAV复制酶(Rep)蛋白，优选来自AAV2的Rep。

有利地将多核苷酸插入重组载体中，所述重组载体以非限制性方式包括由染色体、非染色体、合成或半合成核酸组成的线性或环状DNA或RNA分子，例如特别是病毒载体、质粒或RNA载体。可以将目标核酸分子插入多种载体以便将其引入并维持在本身已知的真核宿主细胞中；合适载体的选择取决于该载体的预期用途(例如，目标序列的复制、该序列的表达、该序列以染色体外形式维持或其他整合到宿主的染色体材料中)，也取决于宿主细胞的性质。

在一些实施方案中，载体是质粒。

本发明的用于用途的重组载体是包含用于表达经修饰的AAV衣壳蛋白(AAV Cap)，也可以是AAV Rep蛋白的适当手段的表达载体。通常，将每个编码序列(经修饰的AAV Cap和AAV Rep)插入在同一载体中或单独载体中的单独表达盒中。每个表达盒包含与调节序列功能性连接的编码序列(开放阅读框或ORF)，所述调节序列允许相应蛋白在AAV生产细胞中表达，例如特别是启动子、启动子/增强子、起始密码子(ATG)、终止密码子、转录终止信号。或者，经修饰的AAV Cap和AAV Rep蛋白可以使用插入在两个编码序列或病毒2A肽之间的内部核糖体进入位点(IRES)从独特的表达盒表达。此外，编码经修饰的AAV Cap和AAV Rep(如果存在)的密码子序列被有利地优化用于在AAV生产细胞，特别是人生产细胞中表达。

本发明的另一方面是使用重组载体稳定转化的细胞，用于表达经修饰的AAV衣壳蛋白，优选也表达AAV Rep蛋白。细胞稳定表达经修饰的AAV衣壳和AAV Rep蛋白(生产细胞系)。生产细胞有利地为人细胞。

使用本领域熟知的标准AAV生产方法，载体，优选重组质粒，或细胞可用于生产包含本发明的杂合AAV衣壳蛋白的杂合AAV载体(Review in Aponte-Ubillus et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,2018,102:1045-1054)。

AAV载体通常通过用含有重组AAV载体基因组的质粒和表达AAV Rep和Cap蛋白的质粒共转染适于AAV生产的细胞来生产，所述重组AAV载体基因组包含插入表达盒的目标基因并侧接AAV ITR(AAV转移质粒)。或者，可以用AAV转移质粒转染根据本发明的生产细胞(其稳定表达AAV Rep和Cap蛋白)。

简言之，在存在足够的辅助功能以允许将rAAV载体基因组包装入AAV衣壳颗粒的情况下用上述质粒转染后，将细胞培养足够的时间以允许产生AAV载体颗粒，然后收获、裂解细胞，并通过标准纯化方法如亲和层析和碘克沙醇或氯化铯密度梯度超速离心来纯化AAV载体颗粒。

AAV颗粒、细胞

本发明的另一方面是一种AAV颗粒，其包含本发明的经修饰的重组AAV衣壳蛋白。

AAV颗粒包含根据本发明的经修饰的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV颗粒包含相同血清型的经修饰的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV颗粒进一步或可替代地包含根据本发明的嵌合VP1和/或VP2衣壳蛋白和经修饰的VP3蛋白。在一些实施方案中，AAV颗粒是镶嵌AAV颗粒，其进一步包含来自天然或人工AAV血清型(不同于包括嵌合的经修饰的AAV衣壳的经修饰的AAV衣壳的血清型)的另一种AAV衣壳蛋白，其中镶嵌AAV颗粒具有增加的肌肉转导效率或水平。人工AAV血清型可以是但不限于嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或人源化AAV衣壳。这样的人工衣壳可以通过任何合适的技术产生，使用选择的AAV序列(例如VP1衣壳蛋白的片段)与异源序列组合，所述异源序列可以从不同的选择的AAV血清型，相同AAV血清型的非连续部分，从非病毒AAV来源或非病毒来源获得。

优选地，AAV颗粒是重组AAV(rAAV)载体颗粒。AAV载体颗粒适用于针对个体中肌肉细胞、组织或器官的基因治疗。rAAV载体颗粒包装目标基因。rAAV载体的基因组可以是单链或自身互补的双链基因组(McCarty et al,Gene Therapy,2003,Dec.,10(26),2112-2118)。通过从AAV末端重复序列之一缺失末端断裂位点(trs)产生自身互补载体。这些经修饰的载体，其复制基因组是野生型AAV基因组长度的一半，具有包装DNA二聚体的倾向。AAV基因组侧接ITR。在具体实施方案中，AAV载体是假型载体，即其基因组和衣壳来自不同血清型的AAV。在一些优选的实施方案中，假型载体的基因组衍生自AAV2。rAAV载体颗粒可以使用如上所述的本领域公知的标准AAV生产方法获得。

“目标基因”是指可用于特定应用的基因，例如但不限于诊断、报告、修饰、治疗和基因组编辑。

例如，目标基因可以是治疗性基因、报告基因或基因组编辑酶。

“用于治疗的目标基因”、“目标治疗性基因”或“目标异源基因”是指治疗性基因或编码治疗性蛋白质、肽或RNA的基因。

目标基因是能够在靶器官(即肌肉)的细胞中修饰靶基因或靶细胞途径的任何核酸序列。例如，基因可以修饰靶基因或细胞途径的表达、序列或调节。在一些实施方案中，目标基因是基因或其片段的功能性形式。所述基因的功能性形式包括野生型基因、变体基因如属于同一家族和其它家族的变体，或截短形式，其至少部分地保留了所编码蛋白质的功能性。基因的功能性形式可用于替换或附加基因治疗以替换患者中缺陷或非功能性基因。在其它实施方案中，目标基因是使导致常染色体显性遗传疾病的显性等位基因失活的基因。基因片段可用作与基因组编辑酶组合使用的重组模板。

或者，目标基因可以编码特定应用的感兴趣蛋白(例如抗体或抗体片段、基因组编辑酶)或RNA。在一些实施方案中，蛋白质是治疗性蛋白质，包括治疗性抗体或抗体片段，或基因组编辑酶。在一些实施方案中，RNA是治疗性RNA。

在一些实施方案中，目标基因的序列被优化以在经治疗的个体，优选人个体中表达。序列优化可包括核酸序列中的许多变化，包括密码子优化、GC含量的增加、CpG岛数目的减少、交替开放阅读框(ARF)数目的减少和/或剪接供体和剪接受体位点数目的减少。

目标基因是能够在疾病的靶细胞(即肌细胞)中产生编码的蛋白质、肽或RNA的功能性基因。在一些实施方案中，目标基因是人基因。AAV病毒载体包含在靶器官的细胞(即肌细胞)，包括心肌和骨骼肌细胞中可表达形式的目标基因。特别地，目标基因与适当的调节序列可操作地连接，用于在个体的靶细胞、组织或器官中表达转基因。本领域熟知的这种序列尤其包括启动子和能够进一步控制转基因表达的其它调节序列，例如但不限于增强子、终止子、内含子、沉默子，尤其是组织特异性沉默子和micro RNA。目标基因与普遍存在的、组织特异性的或可诱导的启动子可操作地连接，所述启动子在靶器官(即肌肉)的细胞中有功能。可以将目标基因插入到进一步包含如上所述的其它调节序列的表达盒中。

普遍存在的启动子的实例包括CAG启动子、磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/启动子(CMV)、SV40早期启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子和EF1启动子。肌肉特异性启动子包括但不限于衍生自结蛋白(Des)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子、肌球蛋白轻链2(MLC-2)启动子、心肌肌钙蛋白C(cTnC)启动子、人骨骼肌动蛋白(HSA)启动子或合成的肌肉特异性启动子如SpC5-12启动子、CK6启动子的上游序列。

RNA有利地与靶DNA或RNA序列互补或与靶蛋白结合。例如，RNA是干扰RNA如shRNA、microRNA、用于与Cas酶或类似酶组合用于基因组编辑的指导RNA(gRNA)、能够外显子跳跃的反义RNA如经修饰的小核RNA(snRNA)或长非编码RNA。干扰RNA或microRNA可用于调节涉及肌肉疾病的靶基因的表达。指导RNA与Cas酶或类似酶复合用于基因组编辑可用于修饰靶基因的序列，特别是纠正突变/缺陷基因的序列或修饰参与疾病，特别是神经肌肉疾病的靶基因的表达。能够外显子跳跃的反义RNA特别用于校正阅读框并恢复具有破坏的阅读框的缺陷型基因的表达。在一些实施方案中，RNA是治疗性RNA。

根据本发明的基因组编辑酶是能够修饰靶基因或靶细胞途径，特别是肌细胞中的靶基因或靶细胞途径的任何酶或酶复合物。例如，基因组编辑酶可以修饰靶基因或细胞途径的表达、序列或调节。基因组编辑酶有利地是工程化核酸酶，例如但不限于大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活物样效应物的核酸酶(TALEN)、来自成簇的规则间隔的回文重复(CRISPR)-Cas系统的Cas酶和类似的酶。基因组编辑酶，特别是工程化核酸酶如Cas酶和类似的酶，可以是功能性核酸酶，其在靶基因组基因座中产生双链断裂(DSB)或单链DNA断裂(切口酶如Cas9(D10A))，并且用于位点特异性基因组编辑应用，包括但不限于：基因校正、基因置换、基因敲入、基因敲除、诱变、染色体易位、染色体缺失等。对于位点特异性基因组编辑应用，基因组编辑酶，特别是工程化核酸酶如Cas酶和类似的酶可以与同源重组(HR)基质或模板(也称为DNA供体模板)组合使用，所述同源重组(HR)基质或模板通过双链断裂(DSB)诱导的同源重组修饰靶基因组基因座。特别地，HR模板可以将目标转基因引入靶基因组基因座或修复靶基因组基因座中的突变，优选在引起肌肉病症如神经肌肉疾病的异常或缺陷基因中的突变。或者，可将基因组编辑酶(例如Cas酶和类似酶)工程化以变成核酸酶缺陷型并用作DNA结合蛋白用于各种基因组工程化应用，例如但不限于：转录激活、转录抑制、表观基因组修饰、基因组成像、DNA或RNA下拉等。

本发明还涉及分离的细胞，特别是来自个体的细胞，其用本发明的rAAV载体颗粒稳定转导。个体有利地为待治疗的患者。在一些实施方案中，细胞是根据本公开的肌细胞，所述细胞的祖细胞或多能干细胞如诱导多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞、胎儿干细胞和成体干细胞。

药物组合物和治疗用途

本发明的另一方面是药物组合物，其包含至少一种选自本公开的AAV载体颗粒或细胞的活性剂和药学上可接受的载体。

本发明的rAAV载体颗粒、细胞和衍生的药物组合物可用于通过基因治疗，特别是针对肌肉细胞或组织的靶向基因治疗来治疗疾病。本发明的细胞和衍生的药物组合物可以通过细胞疗法，特别是针对肌细胞的细胞疗法用于治疗疾病。

本文所用的“基因治疗”是指个体的治疗，其涉及将目标核酸递送到个体的细胞中，目的是治疗疾病。通常使用递送媒介物(delivery vehicle)(也称为载体(vector))实现核酸的递送。本发明的rAAV载体颗粒可用于将基因递送至患者细胞。

本文所用的“细胞治疗”是指这样的过程，其中通过任何合适的方法，例如通过静脉内注射(输注)或在目标组织中注射(植入或移植)，将由本发明的rAAV载体颗粒稳定转导的细胞递送至有此需要的个体。在具体的实施方案中，细胞治疗包括从个体收集细胞，用本发明的rAAV载体颗粒转导个体的细胞，并将稳定转导的细胞施用回患者。如本文所使用的“细胞”是指分离的细胞、天然或人工细胞聚集体、生物人工细胞支架和生物人工器官或组织。

基因治疗可以通过细胞中的任何编码或调节序列的基因转移、基因编辑、外显子跳跃、RNA干扰、反式剪接或任何其它遗传修饰来进行，所述细胞中的任何编码或调节序列包括那些包含在细胞核，线粒体中或作为共生核酸的序列，例如但不限于包含在细胞中的病毒序列。

基因治疗的两种主要类型如下：

-旨在为缺陷/异常基因提供功能性替换基因的疗法：这是替换或附加基因治疗；

-针对基因或基因组编辑的疗法：在这种情况下，目的是向细胞提供必要的工具以校正序列或修饰缺陷/异常基因的表达或调节，使得功能性基因被表达或异常基因被抑制(失活)：这是基因编辑疗法。

在附加基因治疗中，目标基因可以是基因的功能性形式，其在患者中是缺陷的或突变的，例如在遗传疾病中就是这种情况。在这种情况下，目标基因将恢复功能性基因的表达。因此，通过基因编辑或基因替换，在受影响患者的靶细胞(即肌细胞)中提供了该基因的正确版本，这可以有助于针对该疾病的有效治疗。

基因或基因组编辑使用一个或多个目标基因，如：

-编码如上定义的治疗性RNA的基因，所述治疗性RNA如干扰RNA如shRNA或microRNA、用于与Cas酶或类似酶组合使用的指导RNA(gRNA)，或能够外显子跳跃的反义RNA如修饰的小核RNA(snRNA)；以及

-编码如上定义的基因组编辑酶的基因或这些基因的组合，所述基因组编辑酶例如工程化核酸酶，如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活物样效应物的核酸酶(TALEN)、Cas酶或类似酶，并且也可以是用作如上定义的重组模板的基因的功能性形式的片段。

基因治疗用于治疗肌肉疾病。肌肉疾病包括影响肌肉(包括骨骼肌和心肌)的结构或功能的各种遗传性(遗传的)和获得性疾病或病症。所述疾病可由创伤、感染、变性、结构或代谢缺陷、肿瘤、炎性或自身免疫性病症或其它原因引起。可通过基因治疗治疗的肌肉疾病的非限制性实例包括神经肌肉遗传病，诸如肌肉遗传病；癌症和自身免疫性疾病。

在一些实施方案中，用于基因治疗(附加基因治疗或基因编辑)的靶基因是导致神经肌肉疾病的基因。神经肌肉遗传病尤其包括：肌营养不良、先天性肌营养不良、先天性肌病、远端肌病、其它肌病、肌强直综合征、离子通道肌病、恶性高热、代谢肌病、遗传性心肌病、先天性肌无力综合征、运动神经元疾病、遗传性截瘫、遗传性运动和感觉神经病和其它神经肌肉疾病。

可以使用根据本发明的衣壳经修饰的rAAV治疗的神经肌肉遗传疾病的具体实例列举如下：

-抗肌萎缩蛋白病是由编码蛋白抗肌萎缩蛋白的DMD基因中的致病变体引起的X-连锁的肌肉疾病谱系。抗肌萎缩蛋白病包括杜氏进行性肌营养不良(DMD)、贝克肌营养不良(BMD)和DMD相关的扩张型心肌病。

-肢带型肌营养不良(LGMD)是一组在临床上类似于DMD但由于常染色体隐性和常染色体显性遗传而在两种性别中发生的病症。肢带型肌营养不良是由与肌营养不良蛋白相互作用的编码肌聚糖和与肌细胞膜相关的其它蛋白质的基因的突变引起的。术语LGMD1是指显示显性遗传(常染色体显性)的遗传类型，而LGMD2是指具有常染色体隐性遗传的类型。已报道超过50个基因座的致病变体(LGMD1A至LGMD1G；LGMD2A至LGMD2W)。钙蛋白酶病(LGMD2A)由具有超过450个所述致病变体的基因CAPN3的突变引起。对LGMD表型起作用的基因包括：anoctamin 5(ANO5)、血管外膜物质(BVES)、钙蛋白酶3(CAPN3)、小窝蛋白3(CAV3)、CDP-L-核糖醇焦磷酸化酶A(CRPPA)、肌营养不良聚糖1(DAG1)、结蛋白(DES)、DnaJ热休克蛋白家族(Hsp40)同系物亚家族B成员6(DNAJB6)、dysferlin(DYSF)、fukutin相关蛋白(FKRP)、fukutin(FKT)、GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)、异质核核糖核蛋白D样(HNRNPDL)、含2的LIM锌指结构域(LIMS2)、lainA:C(LMNA)、肌钙蛋白(MYOT)、网蛋白(PLEC)、蛋白O-葡糖基转移酶1(PLOGLUT1)、蛋白O-连接的甘露糖N-乙酰氨基葡萄糖苷酶1(β1、2-)(POMGNT1)、蛋白O-甘露糖激酶(POMK)、蛋白O-甘露糖基转移酶1(POMT1)、蛋白O-甘露糖基转移酶2(POMT2)、肌聚糖α(SGCA)、肌聚糖β(SGCB)、肌聚糖δ(SGCD)、肌聚糖γ(SGCG)、肌联蛋白-帽(TCAP)、转运蛋白3(TNPO3)、扭转蛋白1A相互作用蛋白(TOR1AIP1)、运输蛋白颗粒复合物11(TRAPPC11)、含有32的三联基序(TRIM 32)和肌联蛋白(TTN)。LGMD表型的主要贡献基因包括CAPN3、DYSF、FKRP和ANO5(Babi Ramesh Reddy Nallamilli etal.,Annals of Clinical and Translational Neurology,2018,5,1574-1587)。

-由包括EMD基因(编码emerin)、FHL1基因和LMNA基因(编码核纤层蛋白A和C)的基因之一的缺陷引起的埃默里-德赖弗斯肌营养不良(EDMD)。

-分别由SYNE1和SYNE2基因的缺陷引起的Nesprin-1和Nesprin-2相关的肌营养不良；由TMEM43基因缺陷引起的LUMA相关的肌营养不良；由TOR1AIP1基因缺陷引起的LAP1B相关的肌营养不良。

-面肩肱型肌营养不良症，1型(FSHD1A)，如与DUX4基因(染色体4q35的亚端粒区域中的D4Z4大卫星重复的收缩)或FRG1基因的缺陷相关；由SMCHD1基因缺陷引起的面肩肱型肌营养不良症，2型(FSHD1B)。

-脊髓性肌萎缩是由运动神经元存活1(SMN1)基因的突变引起的遗传病，其特征在于用于运动的肌肉的虚弱和消瘦(萎缩)。

-X-连锁的肌管肌病是由肌管蛋白(MTM1)基因突变引起的遗传病，其影响用于运动的肌肉(骨骼肌)并且几乎仅在男性中发生。这种病症的特征在于肌无力(肌病)和肌张力下降(肌张力减退)。

-肌联蛋白病(Titinopathies)是由肌联蛋白(TTN)基因突变引起的遗传病。据报道，显性和隐性TTN突变都引起广谱的心肌和骨骼肌疾病。显性肌联蛋白病包括由外显子344中的突变引起的具有早期呼吸衰竭(HMERF)的遗传性肌病和迟发性胫骨肌营养不良(TMD)。隐性肌联蛋白病包括肢带型肌营养不良2J、年轻或早期成人发作的远端肌联蛋白病、无心肌病的Emery-Dreifuss型肌病以及有或无心脏病的先天性肌病。

-庞贝氏症是由酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因的突变引起的遗传病。GAA基因中的突变防止酸性α-葡糖苷酶有效地分解糖原，这允许该糖在溶酶体中积累至毒性水平。这种累积损害全身的器官和组织，特别是肌肉，导致庞贝氏症的进行性体征和症状。

-糖原贮积病III(GSD3)是由淀粉-α-1，6-葡糖苷酶、4-α-葡聚糖转移酶(AGL)基因中的纯合或复合杂合突变引起的常染色体隐性代谢病，所述AGL基因编码糖原脱支酶并且与具有短外链的异常糖原累积相关。临床上，GSD III患者在婴儿期或幼儿期出现肝肿大、低血糖和生长迟缓。患有IIIa的患者的肌肉无力在儿童中是最小的，但在成人中可以变得更严重；一些患者发生心肌病。

在一些实施方案中，用于基因治疗(附加基因治疗或基因编辑)的靶基因是导致神经肌肉疾病的基因，其选自包含抗肌萎缩蛋白病(DMD基因)和肢带型肌营养不良(LGMD)的组(CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5、DNAJB6基因和其它例如SGCA、SGCB、SGCG)。在一些优选的实施方案中，用于基因治疗的靶基因选自下组：DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、DNAJB6、ANO5、SGCA、SGCB和SGCG。

基因编辑的具体实例是治疗由钙蛋白酶-3基因(CAPN3)突变引起的肢带型肌营养不良2A(LGMD2A)。其它非限制性实例是治疗DMD或TNT基因的突变。

因此，通过基因编辑或基因替换，在受影响患者的肌细胞中提供了该基因的正确版本，这可有助于针对该疾病的有效治疗。可以使用相同的原理通过基因替换或基因编辑来治疗如上列出的肌肉的其它遗传疾病。

替换或附加基因治疗可用于治疗癌症，特别是横纹肌肉瘤。癌症中的目标基因可以调节肿瘤细胞的细胞周期或代谢和迁移，或诱导肿瘤细胞死亡。例如，可诱导的caspase-9可在肌细胞中表达以引发细胞死亡，优选在联合疗法中引发持久的抗肿瘤免疫应答。

在自身免疫或癌症的情况下，基因编辑可用于修饰靶细胞(即肌肉细胞)中的基因表达，或干扰这种细胞中的病毒循环。在这种情况下，优选地，目标基因选自编码指导RNA(gRNA)、位点特异性核酸内切酶(TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、Cas核酸酶)、DNA模板和RNAi组分(如shRNA和microRNA)的那些。诸如CRISPR/Cas9的工具可用于此目的。

在一些实施方案中，通过在肌肉组织中表达治疗性基因，将基因治疗用于治疗影响其它组织的疾病。这对于避免治疗性基因在肝脏中的表达是有用的，特别是在患有并发肝脏疾病如肝炎，包括病毒性或毒性肝炎的患者中。治疗性基因优选编码治疗性蛋白质、肽或抗体，其从肌细胞分泌到血流中，在血流中它可以被递送到其它靶组织例如肝脏。治疗性基因的实例包括但不限于：因子VIII、因子VIII和GAA基因。

在本发明的各种实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的rAAV载体颗粒或细胞。在本发明的上下文中，治疗有效量是指足以逆转、减轻或抑制该术语适用的障碍或病症的进展，或逆转、减轻或抑制该术语适用的障碍或病症的一种或多种症状的进展的剂量。术语“有效剂量”(effective dose或effective dosage)定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。

取决于例如使用的组合物、施用途径、所考虑的个体的身体特征(例如性别，年龄和体重)、联合用药和医学领域技术人员将认识到的其它因素等因素来确定和调整有效剂量。

在本发明的各种实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和/或媒介物。

“药学上可接受的载体”是指当适当地施用于哺乳动物，尤其是人时不产生不利的、过敏的或其它不适当的反应的媒介物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。

优选地，药物组合物含有媒介物，其对于能够注射的制剂是药学上可接受的。这些可以特别是等渗的、无菌的盐水溶液(磷酸一钠或二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的，特别是冻干的组合物，根据情况添加无菌水或生理盐水后，可以重构可注射溶液。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或混悬液。溶液或悬浮液可包含与病毒载体相容且不阻止病毒载体颗粒进入靶细胞的添加剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是达到容易注射能力存在的程度的流体。它在生产和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。合适溶液的实例是缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或乳酸林格氏液。

本发明还提供了通过在靶组织(即肌肉组织)中表达治疗性基因来治疗疾病的方法，其包括：向患者施用治疗有效量的如上所述的药物组合物。

本发明还提供了治疗肌肉病症的方法，其包括：向患者施用治疗有效量的如上所述的药物组合物。

本发明的另一方面涉及根据本公开的rAAV载体颗粒、细胞、药物组合物在制备用于治疗根据本公开的肌肉病症，特别是神经肌肉遗传疾病的药物中的用途。

本发明的另一方面涉及根据本公开的rAAV载体颗粒、细胞、药物组合物，其用作药物和/或用于基因治疗，特别是用于治疗根据本公开的肌肉病症，特别是神经肌肉遗传疾病。

本发明的另一方面涉及根据本公开的rAAV载体颗粒、细胞、药物组合物用于治疗根据本公开的肌肉病症，特别是神经肌肉遗传疾病的用途。

本发明的另一方面涉及用于治疗根据本公开的肌肉病症，特别是神经肌肉遗传疾病的药物组合物，其包含根据本公开的rAAV载体颗粒、细胞作为活性组分。

本发明的另一方面涉及包含根据本公开的rAAV载体颗粒、细胞的药物组合物，其用于治疗根据本公开的肌肉病症，特别是神经肌肉遗传疾病。

本文所用的术语“患者”或“个体”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。优选地，根据本发明的患者或个体是人。

本文所用的“治疗(treatment或treating)”定义为向患者应用或施用治疗剂或治疗剂的组合，或向来自患者的分离的组织或细胞系应用或施用所述治疗剂，所述患者患有疾病，特别是肌肉病症，其目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、提高或影响疾病或疾病的任何症状。特别地，术语“治疗(treat或treatment)”是指减少或减轻与疾病相关的至少一种不良临床症状。

术语“治疗(treatment或treating)”在本文中也用于预防性地施用治疗剂的情况。

本发明的药物组合物通常根据已知的方法，以有效诱导患者治疗效果的剂量和时间段施用。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如以非限制性方式通过输注或推注，通过上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收。所述施用可以是全身性的、局部的或全身性结合局部的；全身性包括肠胃外和口服，局部包括局部和局部区域。全身施用，优选肠胃外施用如皮下(SC)、肌内(IM)、血管内施用如静脉内(IV)或动脉内施用；腹膜内(IP)；皮内(ID)、硬膜外或其他。施用可以是例如通过注射或灌注。在一些优选的实施方案中，施用是肠胃外的，优选血管内的，例如静脉内(IV)或动脉内的。肠胃外施用有利地是通过注射或灌注。

本公开的各种实施方案可以彼此组合，并且本公开涵盖本公开的实施方案的各种组合。

除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员已知的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释。

现在将参考附图通过以下实施例举例说明本发明，这些实施例不是限制性的，其中：

附图说明

图1：ITGAV和ITGB6的表达水平

A-B。不同人组织的总RNA-seq中ITGAV和ITGB6的标准化读数(每百万计数-CPM)。从GTEx数据库(https://gtexportal.org/home/)提取并重新分析数据。

图2：在人成肌细胞和肌管中Cap9rh74_VR4_经修饰的感染性

人成肌细胞和肌管中5种AAV变体的感染后48小时的荧光素酶活性。

图3：在WT小鼠中静脉注射后Cap9rh74_VR4_经修饰的分布。

不同AAV注射或对照组中不同组织(分别为TA、膈膜、四头肌、心脏、肝、肺和肾)中的荧光素酶活性(A)和载体拷贝数(B)。

实施例：衣壳经修饰的rAAV载体的构建和生物分布

1.材料和方法

1.1.质粒构建

使用标准克隆方法，从含有AAV2 Rep的质粒pRep2-Cap9rh74和WO2019/193119中公开的杂合AAV9.rh74衣壳(Cap9rh74_WT)基因衍生出含有杂合AAV9.rh74衣壳的质粒，所述杂合AAV9.rh74衣壳由含有基序RGDLXXL/I(SEQ ID NO:1)(其中XX不同于GS和ST)的不同肽修饰。将肽4um9或4um9_天然(TDGRGDLGRLGP)、4um9_经修饰(SEPRGDLGELN)、5ffo或5ffo_天然(EPRRGDLATIGS)、5ffo_经修饰(TDQRGDLAELHG)、5nem_天然(APVRGDLQVLAP)和5nem_经修饰(APVRGDLAEINP)插入杂合AAV9.rh74衣壳蛋白序列的残基S452和Q460之间的可变区4(VR-IV)中，从而替代残基T453至T459。通过测序验证细菌克隆。所得肽修饰的杂合AAV9.rh74衣壳(VP1蛋白)命名为Cap9rh74_VR4-4um9或Cap9rh74_VR4-4um9.Nat(SEQ IDNO:21)、Cap9rh74_VR4-4um9.Mod(SEQ ID NO:22)、Cap9rh74_VR4-5ffo或Cap9rh74_VR4-5ffo.Nat(SEQ ID NO:23)、Cap9rh74_VR4-5ffo.Mod(SEQ ID NO:24)、Cap9rh74_VR4-5nem.Nat(SEQ ID NO:25)和Cap9rh74_VR4-5nem.Mod(SEQ ID NO:26)。相应的编码序列是SEQ ID NO:27至32。将包含肽P1(RGDLGLS)并侧接AAA和SG的经修饰的杂合AAV9.rh74衣壳(Cap9rh74-HB-P1)插入WO2022/053630中公开的杂合AAV9.rh74衣壳序列的第589位，用于比较。

1.2.rAAV的生产

如AyusoE等人(Hum.Gene Ther.2014,25,977–987)所述，在Généthon产生包含经修饰的和未修饰的AAV9rh74的重组AAV(rAAV)，其含有在CMV启动子控制下的GFP-荧光素酶转基因。病毒基因组如Rohr等人所述进行量化(J.Virol.Methods,2002,106,81–88)。rAAV滴度表示为病毒基因组拷贝数(vg)。

1.3体内实验

根据法国和欧洲法规处理动物。动物程序由当地伦理委员会和高等教育、研究和创新部(APAFIS#19736)批准。将表达GFP-荧光素酶的rAAV以1×10¹³vg/kg的剂量通过静脉内(IV)注射施用于6周龄的C57BL/6小鼠(每组n＝4)。在注射后14天采集体内生物发光图像。注射后3周，通过颈脱位处死小鼠，并取样若干肌肉和器官：胫骨前肌、膈肌、心脏、肝脏、肾脏和肺。

1.4体内生物发光

在注射后20天采集体内生物发光图像。通过吸入异氟烷麻醉小鼠并腹膜内注射100μl 50mg/ml的D-萤光素(LifeTechnologies,California,USA)。使用发光成像体系(PerkinElmer)进行体内成像。

1.5载体拷贝数定量化

使用NucleoMag Pathogen试剂盒(Macherey-Nagel)和KingFisher Flex仪器(ThermoFisher Scientific)从取样的不同肌肉和器官提取gDNA和病毒DNA。

使用Thermo Scientific Absolute qPCR ROX Mix，引物(正向：CATCAATGGGCGTGGATAGC(SEQ ID NO:35)；反向：GGAGTTGTTACGACATTTTGGAAA(SEQ ID NO:36))和探针(ATTTCCAAGTCTCCACCC，FAM(SEQ ID NO:37))检测来自载体的CMV启动子，以及引物(正向：CTCCAAGCAGATGCAGCAGA(SEQ ID NO:38)；反向ATAGCCTTGCGCATCATGGT(SEQ IDNO:39))和探针(CCGTGGTGCTGATGGGCAAGAA，VIC(SEQ ID NO:40))检测Rplp0(60S酸性核糖体蛋白P0)作为样品的内部对照，通过Light Cycler 480仪器(Roche)中的多重qPCR定量病毒基因组拷贝。

1.6.体外荧光素酶测定

使用FastPrep-24经典仪器(MP Biomedicals)(5m/s，40s)将样品在裂解缓冲液(25mM三磷酸、15％甘油、1mM DTT、1mM EDTA、8mM MgCl₂、0.2％TritonX-100)中与蛋白酶抑制剂混合物(cOmpleteTM ULTRA片剂，Mini无EDTA，EASYpack蛋白酶抑制剂混合物片剂REF：5892791001)均化。对样品进行3次冷冻/解冻循环。离心(5min，10000g，+4℃)后，将10μl上清液转移至白色不透明板。使用具有泵系统的EnSpire多模式平板读数器(PerkinElmer)测量来自样品匀浆的发光信号，所述泵系统允许分配100μl测定缓冲液(与不含TritonX-100和含2nMATP的裂解缓冲液相同，Sigma，REF：10519979001)和100μl 167μM的D-荧光素。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒进行蛋白质的定量，以通过样品的蛋白质的量使发光信号标准化。

2.结果

出于以下原因设计靶向整联蛋白异二聚体αVβ6(ITGAV-B6)的重组AAV载体。首先，ITGB6表达在人骨骼肌中高度上调(图1A-B)。尽管在肌肉组织中没有过表达，但ITGAV在肌肉中的表达显著高于在肝脏中的表达，这对于肝脏去靶向是有意义的。其次，先前通过小鼠肌肉组织中的单核测序观察到两种转录物在肌细胞核中的高表达水平和在营养不良模型-DMD^delta51中甚至更高的表达水平(Chemello et al.,PNAS,2020,117,29691-29701)。这些结果对于靶向肌肉组织，特别是在肌营养不良中特别有意义。机制上，ITGAV-B6以高亲和力结合RGDLxxL/I基序，其中LxxL/I形成两亲性α-螺旋并在B6亚基中的疏水口袋中结合。这些基序可以在TGF-β1、TGF-β3和FMDV病毒衣壳的前结构域中发现，它们都特异性结合ITGAV-B6(Dong et al.,Nature Struct.Mol.Biol.,2014,21,1091-1096；Dong et al.,Nature,2017,542,55-59；Kotecha et al.,Nature communications,2017,8,15408；Protein DataBank accession number5FFO,4UM9 and 5NEM)。

使用杂合衣壳Cap9rh74作为骨架设计衣壳经修饰的rAAV。VR-IV(VR4)区的整个环被获自蛋白质数据库的xRGDLxxL/I基序的8个氨基酸替代：4UM9、5FFO和5NEM。在肽的每个末端添加合适的接头(2个氨基酸)以允许VR4环中RGD基序的稳定构象。选择具有最佳能量得分的构建体用于使用Rosetta能量函数的实验验证。生产并纯化含有经修饰衣壳和CMV-GFP/Luc转基因表达盒的重组AAV载体。所有衣壳经修饰的rAAV均以良好的滴度产生( AAV_Cap9rh74_VR4-4um9.Nat： 8.1x10¹³VG/mL；AAV_Cap9rh74_VR4-4um9.Mod ： 1.2x10¹³VG/mL；AAV_Cap9rh74_VR4-5ffo.Nat ： 3x10¹³VG/mL ；AAV_Cap9rh74_VR4-5ffo.Mod ：3.5x10¹²VG/mL ；AAV_Cap9rh74_VR4-5nem.Nat ： 1.5x10¹²VG/mL ；AAV_Cap9rh74_VR4-5nem.Mod：3.1×10¹³VG/mL)，所述滴度与野生型AAV_Cap9rh74(AAV9.rh74：3.26×10¹³VG/mL)获得的大多数衣壳经修饰的rAAV相当。

接着，检测衣壳经修饰的rAAV与ITGAV-B6异二聚体的结合。首先，使用piggyBac^TM转座子系统构建同时过表达hITGAV和hITGB6的293细胞系。然后在293_WT或293_ITGAV-B6中以2种不同剂量，5E9和5E10 vg感染纯化的衣壳经修饰的rAAV。所有衣壳经修饰的rAAV显示剂量依赖性水平的荧光素酶活性，比野生型AAV_Cap9rh74高100-1000倍。

在生肌分化过程中，ITGB6仅在分化的肌管阶段高度表达，而不在卫星细胞或成肌细胞中高度表达。为了分析ITGAV-B6表达水平与生肌系统中rAAV感染性的相关性，在人成肌细胞和肌管中测试衣壳经修饰的rAAV(图2)。如所预期的，所有衣壳经修饰的rAAV的感染水平在成肌细胞阶段非常低。与野生型AAV_Cap9rh74相比，所有测试的衣壳经修饰的rAAV在肌管中显示增加的感染性。

接着，在野生型小鼠中静脉注射后测试衣壳经修饰的rAAV的生物分布，并测定载体拷贝数和荧光素酶活性。还包括AAV_Cap9rh74-HB-P1作为肌肉富含和肝脏去靶向载体的阳性对照。如生物发光图像所示，与Cap9rh74-WT相比，所有经修饰AAV的变体在肌肉中高度富含。此外，与Cap9rh74-WT相比，萤光素酶活性和VCN测定证实了在所有肌肉中更高的转导水平(图3A和B)。与野生型Cap9rh74相比，Cap9rh74_VR4-4um9使四头肌中的转导水平增加100倍，并且与Cap9rh74-HBP1相比增加约3倍(图3A和表1)。

表1：用RGDXXL/I-肽修饰的AAV_Cap9.rh74的肌肉转导效率

*从图3A中呈现的数据推导出的值

使用该方法，产生了至少2个有希望的候选物(Cap9rh74_VR4-4um9和Cap9rh74_VR4-5ffo)，其具有高滴度，与ITGAV-B6异二聚体的高亲和力，并且在人肌管中显示出高感染性以及肌肉的高转导效率。

序列列表

Claims

1.一种重组腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含插入至少一个拷贝的包含基序RGDLXXL/I(SEQ ID NO:1)的肽，其中XX不同于GS和ST，其中与未用所述肽修饰的重组AAV衣壳蛋白相比，用所述肽修饰的所述重组AAV衣壳蛋白在肌肉中具有增加的转导效率。

2.根据权利要求1所述的重组AAV衣壳蛋白，其中所述插入是在可变区IV中。

3.根据权利要求1或2所述的重组AAV衣壳蛋白，其是AAV血清型9(AAV9)和AAV血清型74(AAVrh74)衣壳蛋白的杂合体。

4.根据权利要求2或3所述的重组AAV衣壳蛋白，其中所述插入是在第452位中；优选地，其中所述肽插入取代第453-459位的残基，且所示位置通过与SEQ ID NO:20比对确定。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组AAV衣壳蛋白，其中所述基序是RGDLX₁X₂L/I，其中X₁是G、A、L、K或Q，并且X₂是R、K、E、D、A、L、T、I或V。

6.根据权利要求5所述的重组AAV衣壳蛋白，其中所述基序具有选自下组的序列：RGDLGRL(SEQ ID NO:2)、RGDLGEL(SEQ ID NO:3)、RGDLATI(SEQ ID NO:4)、RGDLAEL(SEQ IDNO:5)、RGDLQVL(SEQ ID NO:6)和RGDLAEI(SEQ ID NO:7)；优选SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4；更优选SEQ ID NO:2。

7.根据权利要求6所述的重组AAV衣壳蛋白，其中所述肽包含或由选自下组的序列组成：TDGRGDLGRLGP(SEQ ID NO:14)、SEPRGDLGELNA(SEQ ID NO:15)、EPRRGDLATIGS(SEQ IDNO:16)、TDQRGDLAELHG(SEQ ID NO:17)、APVRGDLQVLAP(SEQ ID NO:18)和APVRGDLAEINP(SEQ ID NO:19)；优选SEQ ID NO:14或16；更优选SEQ ID NO:14。

8.根据权利要求7所述的重组AAV衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO:21至26中任一个；优选SEQ ID NO:21或23；更优选SEQ ID NO:21具有至少85％同一性的序列。

9.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-8中任一项所述的重组AAV衣壳蛋白。

10.一种重组质粒，其包含根据权利要求9所述的多核苷酸。

11.一种包装目标基因的AAV载体颗粒，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的重组AAV衣壳蛋白。

12.根据权利要求11所述的AAV载体颗粒，其中所述目标基因选自下组：治疗性基因；编码治疗性蛋白质或肽(如治疗性抗体或抗体片段)和基因组编辑酶的基因；以及编码治疗性RNA(如干扰RNA、用于基因组编辑的指导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA)的基因。

13.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求11或12所述的AAV载体颗粒，或由根据权利要求11或12所述的AAV载体颗粒稳定转导的细胞。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其用作基因治疗中的药物。

15.根据权利要求13所述的药物组合物，其用于治疗肌肉疾病。

16.根据权利要求15所述的用于用途的药物组合物，其靶向导致肌肉疾病的基因，所述肌肉疾病选自抗肌萎缩蛋白病和肢带型肌营养不良；优选地所述基因选自下组：DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、DNAJB6、ANO5、SGCA、SGCB和SGCG。