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CN113481217A - 用于精细化学品的改进生产的重组微生物 - Google Patents

用于精细化学品的改进生产的重组微生物 Download PDF

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CN113481217A
CN113481217A CN202110942456.XA CN202110942456A CN113481217A CN 113481217 A CN113481217 A CN 113481217A CN 202110942456 A CN202110942456 A CN 202110942456A CN 113481217 A CN113481217 A CN 113481217A
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polypeptide
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H·哈特曼
Q·王
S·拉塔尼
Z·郭
M·蓬佩尤斯
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Abstract

本申请提供了用于精细化学品的改进生产的重组微生物，以及重组核酸分子、重组微生物和生产丙氨酸的方法。还提供了所述重组核酸分子或重组微生物发酵生产丙氨酸的用途。

Description

用于精细化学品的改进生产的重组微生物
本申请为2014年12月8日提交的、发明名称为“用于精细化学品的改进生产的重组微生物”的PCT申请PCT/IB2014/066686的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2016年7月6日，申请号为201480072408.8。
本申请要求申请US 61/915517,US 61/915527,US 61/915518,US 61/915534和EP13197432.1的优先权，将所述申请完整并入本文作为参考。
发明领域
本申请涉及重组核酸分子、重组微生物，涉及生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的方法，并且涉及所述重组核酸分子或重组微生物发酵生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的用途。
发明描述
氨基酸是具有羧基和氨基的有机化合物。最重要的氨基酸是α-氨基酸，其中氨基与羧基相邻。蛋白质是基于α-氨基酸。
丙氨酸已经引起了很大兴趣，因为它已经在食品、饲料和制药工业中用作添加剂。此外，丙氨酸是工业生产N,N-二(羧甲基)丙氨酸三钠盐(MGDA，商品名Trilon M)的原料，MGDA是一种强螯合剂，在溶解有机和无机污垢中显示出优秀性能(WO94/29421,WO2012/150155)。M级Trilon根据标准OECD测试是容易生物降解的。由于极好的生态学和毒物学谱，M级Trilon尤其适合用于最终消费者的产品中并且对此类生物可降解的复杂增洁剂的需要不断上升。
丙氨酸可以通过用棒杆菌属细菌(Hermann,2003:Industrial production ofamino acids by Coryneform bacteria,J.of Biotechnol,104,155-172.)或大肠杆菌(WO2007/120198,WO2008/119009)发酵生产。
最近已经描述了ygaW基因的过表达提高了微生物的丙氨酸发酵生产力(WO2012/172822)。
大肠杆菌中的丙氨酸生产更有效并且广泛用于作为化学工业原料的丙氨酸的工业生产。由于对丙氨酸的化学工业的需求增加，需要提高丙氨酸的发酵生产的生产力。
本发明的一个目的是提供可用于以高产率和效率发酵生产丙氨酸的微生物。
发明详述
通过大肠杆菌(E.coli)家族的重组微生物提供了实现上述目的的贡献，所述重组微生物与各自的参比微生物相比，具有如下至少一种：i)brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或ii)argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或iii)gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或iv)gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或v)lpxD基因的改变的活性。术语―减少的、抑制的或缺失的酶表达和/或活性”意指显著减少、抑制或缺失的表达和/或活性并且也包括各自酶的检测不到的表达和/或活性。
例如，关于酶的表达和/或活性或产率或生产力的术语―更高”、―增加”或―增强的”意指显著更高的、增加的或增强的表达和/或活性或产率或生产力。
术语―改变的”酶表达和/或活性意指重组微生物中酶的表达和/或活性，其与野生型、非重组微生物中各自酶的表达和/或活性显著不同。
令人惊奇地，已经发现具有如下至少一种：i)brnQ基因编码的蛋白质的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或ii)argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或iii)gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或iv)gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或v)lpxD基因的改变的活性的微生物当与不包含brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或lpxD基因的改变的活性的相同微生物相比时具有更高产率和/或生产力。
因此，当前本发明的一个实施方案是与各自参比微生物相比包含如下至少一种：i)编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或ii)编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或iii)编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或iv)编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或v)编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性并且与各自参比微生物相比在发酵生产中具有丙氨酸的较高产率和/或生产力的微生物。
如本文所用的术语―参比微生物”意指重组微生物与之比较的对照微生物。该参比微生物具有与所述重组微生物基本相同的基因型，待分析的差异除外。优选地，参比微生物是重组微生物所来源的菌株。例如，将基因引入了野生型微生物，从而产生重组微生物，然后，野生型将是该重组微生物的合适的参比微生物。还可能的是向重组微生物A中引入另一突变，从而产生重组微生物B。重组微生物A将是重组微生物B的合适的参比微生物。如果将比较重组微生物和各自参比微生物的性能，那么两种微生物生长在基本相同的条件下。
对于本领域技术人员显而易见的是，具有增加的丙氨酸产率和/或生产力的微生物也可以用于生产与丙氨酸密切相关的其他代谢物，例如，为丙氨酸途径中间体的代谢物，与丙氨酸途径有共同中间体的代谢物或为使用丙氨酸作为其途径中中间体的代谢物的代谢物。通过增加或引入某些酶活性或通过敲除或降低某些酶活性，本发明的微生物也可以容易地适应于具有此类相关代谢物的增加的产率和/或生产力。
此类代谢物是例如丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和亮氨酸。
例如，为了使用本发明的重组微生物产生琥珀酸，必须在本发明微生物的基因组中敲除基因ldh,pfl,pta和adhE并且必须引入PEP羧化酶基因和/或丙酮酸羧化酶基因。例如在Zhang et al.(2009),PNAS(106)pp20180-20185中描述了各自途径和必要的突变。
因此，当前本发明的另一实施方案是与各自参比微生物相比包含如下至少一种：i)编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或ii)编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或iii)编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或iv)编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或v)编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性并且与各自参比微生物相比在发酵生产中具有丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸的较高产率和/或生产力的微生物。
在一些实施方案中，所述微生物是原核细胞。合适的原核细胞包括革兰氏阳性、革兰氏阴性和革兰氏可变细菌细胞，优选革兰氏阴性细胞。
从而，可用于本发明的微生物包括但不限于，氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)、浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacter asaii)、带马瓦无色杆菌(Achromobacterdelmarvae)、粘无色杆菌(Achromobacter viscosus)、乳无色杆菌(Achromobacterlacticum)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus)、肿胀节杆菌(Arthrobacter tumescens)、石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus)、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)、天牛短小杆菌(Aureobacterium saperdae)、印度固氮菌(Azotobacterindicus)、产氨棒杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、Brevibacterium divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、Brevibacterium globosum、暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)、Brevibacterium helcolum、Brevibacteriumpusillum、Brevibacterium testaceum、Brevibacterium roseum、Brevibacteriumimmariophilium、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、Brevibacteriumprotopharmiae、嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetophilum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、解淀粉杆菌(Erwiniaamylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、奇异稳杆菌(Flavobacteriumperegrinum)、染色假杆菌(Flavobacterium fucatum)、Flavobacterium aurantinum、莱茵黄杆菌(Flavobacterium rhenanum)、塞沃尼假杆菌(Flavobacterium sewanense)、短黄杆菌(Flavobacterium breve)、脑膜败血金黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum、微球菌属种(Micrococcus sp.)CCM825、摩氏变形菌(Morganella morganii)、红串红球菌(Nocardia opaca)、粗糙诺卡氏菌(Nocardia rugosa)、Planococcus eucinatus、Proteusrettgeri、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、成黄假单胞菌(Pseudomonassynxantha)、氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、Pseudomonas jluorescens、卵状假单胞菌(Pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、Pseudomonasacidovolans、霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)、睾丸酮丛毛单胞菌(Pseudomonastestosteroni)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红球菌属种(Rhodococcussp.)ATCC 15592)、红球菌属种ATCC 19070)、脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、Vibrio metschnikovii、Vibrio tyrogenes、马杜拉马杜拉放线菌(Actinomadura madurae)、Actinomyces violaceochromogenes)、Kitasatosporia parulosa、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、Streptomyces flavelus、浅灰链霉菌(Streptomycesgriseolus)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄链霉菌(Streptomycesolivaceus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、Streptomyces virginiae)、抗菌素链霉菌(Streptomyces antibioticus)、可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、杀鲑变形菌(Aeromonas salmonicida)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus thiaminolyticus)、弗氏埃希氏菌(Escherichia freundii)、Microbacterium ammoniaphilum、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)、Salmonella schottmulleri、柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)、集胞蓝细菌属种(Synechocystis sp.)、细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongatus)、Thermosynechococcus elongatus、铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa)、霉状串珠菌(属(Nostoc sp.)、N.commune、N.sphaericum、点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)、盘状螺旋蓝细菌(Spirulina platensis)、巨大鞘丝蓝细菌(Lyngbya majuscula)、L.lagerheimii、纤细席蓝细菌(Phormidium tenue)、假鱼腥蓝细菌属种(Anabaena sp.)、Leptolyngbya sp等。
在一些实施方案中，微生物是真核细胞。合适的真核细胞包括酵母细胞，例如，酵母属物种，如酿酒酵母，汉逊酵母属，如多形汉逊酵母,裂殖酵母属,如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，克鲁维酵母属，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，耶氏酵母属物种，如解脂耶氏酵母，毕赤酵母属物种，如甲醇毕赤酵母，树干毕赤酵母和巴斯德毕赤酵母，接合酵母属物种，如鲁氏接合酵母和拜耳接合酵母，假丝酵母属物种，如博伊丁假丝酵母，产朊假丝酵母，Candida freyschussii，光滑假丝酵母和Candida sonorensis，许旺酵母属物种，如西方许旺酵母，Arxula属物种，如Arxula adeninivorans，Ogataea属物种如Ogataea minuta，克雷伯菌属物种，如肺炎克雷伯菌。
许多细菌的工业菌株特别适合于在本文公开的方法使用。在一些实施方案中，所述微生物是棒杆菌属物种的，例如嗜乙酰棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、美棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌。在一些实施方案中，微生物是芽孢杆菌属物种，例如，苏云金芽孢杆菌，炭疽杆菌，巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌,环状芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,灿烂芽孢杆菌,凝固芽孢杆菌,短芽孢杆菌,坚强芽孢杆菌,B.alkaophius,地衣芽孢杆菌,克劳氏芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌,耐盐芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,和解淀粉芽孢杆菌。在一些实施方案中，微生物是欧文氏菌属的种，如,噬夏孢欧文氏菌,胡萝卜软腐欧文氏菌,E.ananas,草生欧文氏菌,E.punctata和E.terreus.在一些实施方案中，微生物是埃希氏菌属的种，例如，大肠杆菌。在其他实施方案中，微生物是泛菌属的种，例如，柠檬泛菌或成团泛菌。在其他实施方案中，微生物是链霉菌属的种，例如，产二素链霉菌、不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、生金色链霉菌、金色链霉菌、杀真菌素链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌。在其他实施方案中，所述微生物是发酵单胞菌属的种，例如，运动发酵单胞菌或解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica)。在其他实施方案中，所述微生物是红球菌属的种，例如，混浊红球菌。
优选所述微生物选自肠杆菌科，优选埃希氏菌属，例如大肠杆菌(E.coli)，优选菌株大肠杆菌W，其对应于DSMZ1116，其对应于ATCC9637。
除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(a)编码丙酮酸甲酸裂合酶I的pflB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中pflB基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。
除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(b)编码双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶)的adhE基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中adhE基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。
除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(c)编码依赖NAD的发酵性D-乳酸脱氢酶的ldhA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中ldhA基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。
除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(d)编码磷酸乙酰基转移酶的pta基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中pta基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。
除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(e)编码延胡索酸还原酶的frdA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，其中frdA基因的活性和/或表达的减少、抑制或缺失与各自参比微生物比较进行测定。
除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(f)编码丙氨酸脱氢酶的alaD基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，其中alaD基因的活性和/或表达的增加或增强与各自参比微生物比较进行测定。
除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(g)编码丙氨酸转运蛋白的ygaW基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，其中ygaW基因的活性和/或表达的增加或增强与各自参比微生物比较进行测定，如WO2012/172822和PCT/IB2014/064426中所述，将后者并入作为参考。
除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(h)编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，其中zipA基因的活性和/或表达的增加或增强与各自参比微生物比较进行测定，如PCT/IB2014/064426中所述，将其并入本文作为参考。
除了编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性之外，本发明的重组微生物可以进一步包含(j)编码硫辛酰胺脱氢酶的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，其中lpd基因的活性和/或表达的增加或增强与各自参比微生物比较确定，如WO2012/172822和PCT/IB2014/064426中所述。
优选地，包含编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性的重组微生物额外具有至少两种，优选至少三种，更优选至少四种，甚至更优选至少五种，甚至更优选至少六种，甚至更优选至少七种，甚至更优选至少八种，最优选所有选自以下组成的组的特征
(a)编码丙酮酸甲酸裂合酶I的pflB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和
(b)编码双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶)的adhE基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和
(c)编码依赖NAD的发酵性D-乳酸脱氢酶的ldhA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和
(d)编码磷酸乙酰基转移酶的pta基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和
(e)编码延胡索酸还原酶的frdA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和
(f)编码丙氨酸脱氢酶的alaD基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达,
(g)编码丙氨酸转运蛋白的ygaW基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和
(h)编码涉及Z环装配的细胞分裂蛋白的zipA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和
(j)编码硫辛酰胺脱氢酶的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达,
其中基因的活性和/或表达的减少、抑制、缺失、增加或增强与各自参比微生物比较进行测定。
alaD基因可以来自任何生物并且可以是由人设计的合成基因，例如，具有为在本发明的重组微生物中表达优化的密码子选择或者为酶活性进行优化，例如，具有改善的Vmax或Km。优选地，alaD基因来自芽孢杆菌属(Bacillus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)之一的微生物。在更优选的实施方案中，alaD基因来自土芽孢杆菌属。在最优选实施方案中，alaD基因来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilu)。
在优选实施方案中，所述alaD基因为在本发明的重组微生物中表达进行密码子优化。
本发明的微生物可以包含其他遗传修饰，如突变、敲除或增强的或引入的酶活性，其进一步改善丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸的产率和/或生产力。
在另一实施方案中，在本发明的重组微生物中具有减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达的编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因选自由以下组成的组
包含SEQ ID NO:1的序列的核酸分子，或
与SEQ ID NO:1的核酸分子有至少80％，优选至少85％，例如至少90％，更优选至少95％例如至少96％，甚至更优选至少97％例如至少98％，最优选至少99％同一性的核酸分子，或
核酸分子，其与具有SEQ ID NO:1的核酸分子在中等严格条件，更优选在高严格条件，最优选在极高严格条件下杂交，或
编码SEQ ID NO:2的多肽的核酸分子，或
核酸分子，其编码与SEQ ID NO:2的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽，
其中(ii),(iii)或(v)编码的多肽具有SEQ ID NO:2的多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％,并且
其中包含如上定义的突变基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
在一个实例中，在本发明的重组微生物中具有减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达的编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ蛋白的brnQ基因具有SEQ ID NO:3的序列，编码具有SEQ ID NO:4的蛋白质。
在另一实施方案中，在本发明的重组微生物中具有引入的、增加的或增强的活性和/或表达的编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因选自由以下组成的组
(i)包含SEQ ID NO:45的序列的核酸分子，或
(ii)与SEQ ID NO:45的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(iii)与具有SEQ ID NO:45的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(iv)编码SEQ ID NO:46的多肽的核酸分子,或
(v)编码与SEQ ID NO:46的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(ii),(iii)或(v)编码的多肽具有SEQ ID NO:46的多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％,和
其中包含如上定义的突变基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
在一个实例中，在本发明的重组微生物中具有引入的、增加的或增强的活性和/或表达的编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因具有SEQ ID NO:47的序列，编码具有SEQ ID NO:48的蛋白质。
在另一实施方案中，在本发明的重组微生物中具有引入的、增加的或增强的活性和/或表达的编码DNA结合蛋白的gcvA基因选自由以下组成的组
(i)包含SEQ ID NO:53的序列的核酸分子，或
(ii)与SEQ ID NO:53的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(iii)与具有SEQ ID NO:53的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(iv)编码SEQ ID NO:54的多肽的核酸分子,或
(v)编码与SEQ ID NO:54的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(ii),(iii)或(v)编码的多肽具有SEQ ID NO:54的多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％,和
其中包含如上定义的突变基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
在另一实施方案中，在本发明的重组微生物中具有减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达的编码非蛋白编码RNA的gcvB基因选自由以下组成的组
(i)包含SEQ ID NO:58的序列的核酸分子，或
(ii)与SEQ ID NO:58的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(iii)与具有SEQ ID NO:58的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
其中(ii),(iii)或(v)编码的非蛋白编码RNA具有SEQ ID NO:58的非蛋白编码RNA的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％,和
其中包含如上定义的突变基因的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
在另一实施方案中，在本发明的重组微生物中具有改变的活性和/或表达的编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因选自由以下组成的组
(i)包含SEQ ID NO:49的序列的核酸分子，或
(ii)与SEQ ID NO:49的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(iii)与具有SEQ ID NO:49的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(iv)编码SEQ ID NO:50的多肽的核酸分子,或
(v)编码与SEQ ID NO:50的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(i)到(v)项下的基因的对应于SEQ ID NO:49的43-45位的密码子不是编码氨基酸丙氨酸并且不是终止密码子或者(i)到(v)项下的基因编码的蛋白质的对应于SEQ IDNO:50的15位的氨基酸不是丙氨酸，并且
其中如(1)到(5)中上面定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:50的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且
其中包含如上定义的突变基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
在一个实例中，在本发明的重组微生物中具有改变的活性和/或表达的编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因具有SEQ ID NO:51的序列，编码具有SEQ ID NO:52的蛋白质。
包含编码具有支链氨基酸转运蛋白活性的brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码具有DNA结合/转录活化活性的argP蛋白的argP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码DNA结合蛋白的gcvA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达和/或编码非蛋白编码RNA的gcvB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达和/或编码UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰)-葡糖胺N-酰基转移酶蛋白的lpxD基因的改变的活性的重组微生物可以进一步包含在(a)到(j)下如上文定义的任意一个、两个、三个、四个、五个或全部特征，
其中pflB基因选自以下组成的组：
(A)包含SEQ ID NO:5的序列的核酸分子，或
(B)与SEQ ID NO:5的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(C)与具有SEQ ID NO:5的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(D)编码SEQ ID NO:6的多肽的核酸分子,或
(E)编码与SEQ ID NO:6的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(B),(C)或(E)编码的多肽具有具SEQ ID NO:6多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且
其中adhE基因选自以下组成的组：
(F)包含SEQ ID NO:7的序列的核酸分子，或
(G)与SEQ ID NO:7的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(H)与具有SEQ ID NO:7的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(I)编码SEQ ID NO:8的多肽的核酸分子,或
(J)编码与SEQ ID NO:8的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(G),(H)或(J)编码的多肽具有具SEQ ID NO:8多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且
其中ldhA基因选自以下组成的组：
(K)包含SEQ ID NO:9的序列的核酸分子，或
(L)与SEQ ID NO:9的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(M)与具有SEQ ID NO:9的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(N)编码SEQ ID NO:10的多肽的核酸分子,或
(O)编码与SEQ ID NO:10的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(L),(M)或(O)编码的多肽具有具SEQ ID NO:10多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且
其中pta基因选自以下组成的组：
(P)包含SEQ ID NO:11的序列的核酸分子，或
(Q)与SEQ ID NO:11的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(R)与具有SEQ ID NO:11的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(S)编码SEQ ID NO:12的多肽的核酸分子,或
(T)编码与SEQ ID NO:12的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(Q),(R)或(T)编码的多肽具有具SEQ ID NO:12多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且
其中frdA基因选自以下组成的组：
(U)包含SEQ ID NO:13的序列的核酸分子，或
(V)与SEQ ID NO:13的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(W)与具有SEQ ID NO:13的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(X)编码SEQ ID NO:14的多肽的核酸分子,或
(Y)编码与SEQ ID NO:14的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(V),(W)或(Y)编码的多肽具有具SEQ ID NO:14多肽的活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％并且
其中alaD基因选自以下组成的组：
(Z)包含SEQ ID NO:15的序列的核酸分子，或
(AA)与SEQ ID NO:15的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(BB)与具有SEQ ID NO:15的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(CC)编码SEQ ID NO:16的多肽的核酸分子,或
(DD)编码与SEQ ID NO:16的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，并且
其中ygaW基因选自由以下组成的组
(FF)包含SEQ ID NO:109的序列的核酸分子，或
(GG)与SEQ ID NO:109的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(HH)与具有SEQ ID NO:109的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(JJ)编码SEQ ID NO:110的多肽的核酸分子,或
(KK)编码与SEQ ID NO:110的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(GG),(HH)或(KK)编码的多肽具有SEQ ID NO:110的多肽活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％,并且
其中所述zipA基因选自由以下组成的组
(LL)包含SEQ ID NO:111的序列的核酸分子，或
(MM)与SEQ ID NO:111的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(NN)与具有SEQ ID NO:111的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(OO)编码SEQ ID NO:112的多肽的核酸分子,或
(PP)编码与SEQ ID NO:112的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(MM),(NN)或(PP)编码的多肽具有SEQ ID NO:112的多肽活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％,并且
其中所述lpd基因选自由以下组成的组
(QQ)包含SEQ ID NO:113的序列的核酸分子，或
(RR)与SEQ ID NO:113的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(SS)与具有SEQ ID NO:113的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(TT)编码SEQ ID NO:114的多肽的核酸分子,或
(UU)编码与SEQ ID NO:114的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(RR),(SS)或(UU)编码的多肽具有SEQ ID NO:114的多肽活性的至少10％,20％优选至少30％或50％,更优选至少60％或70％,甚至更优选至少75％,80％,85％或90％,最优选至少95％。
优选地，如(Z)到(DD)中定义的核酸分子在微生物中处于作为启动子发挥功能的序列的控制下，所述启动子具有序列：
(1)包含SEQ ID NO:115或116的序列的核酸分子，或
(2)与SEQ ID NO:115或116的核酸分子具有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(3)与具有SEQ ID NO:115或116的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子或
(4)具有SEQ ID NO:115或116的核酸分子的至少10个核苷酸，优选至少20个核苷酸,至少30个核苷酸或至少40个核苷酸的片段，更优选至少50个核苷酸,至少75个核苷酸或至少100个核苷酸,甚至更优选至少150或至少200个核苷酸的片段。优选地，SEQ ID NO:115或116的片段是包含SEQ ID NO:115或116的3’区的片段，因此，该片段在SEQ ID NO:115或116的5’末端包含缺失。
本发明的另一实施方案是包含如上文定义的一种或多种重组微生物的组合物。该组合物可以进一步包含允许本发明的重组微生物生长的培养基。该培养基可以额外包含碳源，如己糖、戊糖或多元醇，如蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、棉子糖、木糖、阿拉伯糖、木酮糖、甘油、甘露醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、淀粉、纤维素、木质纤维素或其组合。优选地，碳源是葡萄糖或蔗糖，更优选地，碳源是葡萄糖。
在优选实施方案中，组合物包含本发明的微生物和NBS培养基、AM1培养基或PPM01培养基。更优选地，组合物包含碳源，优选糖。这些培养基的成分是技术人员公知的。
优选NBS培养基每升包含
1-5g,优选3.5g KH2PO4和
1-10g,优选5.0g K2HPO4和
1-5g,优选3.5g(NH4)2HPO4和
0.1-1g,优选0.25g MgSO4–7H2O和
5-25mg,优选15mg CaCL2-2H2O和
0.1-1mg,优选0.5mg硫胺素和
0.1-5ml,优选1ml微量金属贮存液,
其中所述微量金属贮存液包含0.5-5g,优选1.6g FeCL3–6H2O；0.05-0.5g,优选0.2g CoCl2–6H2O；0.01-0.5g,优选0.1g CuCl2-2H2O；0.1-0.5g,优选0.2g ZnCl2；0.05-0.5g,优选0.2g NaMoO4–2H2O；0.001-0.1g,优选0.05g H3BO3每升0.01-1M,优选0.1M HCL。
NBS培养基中优选的碳源是葡萄糖或蔗糖，优选2％-18％葡萄糖或2％-16％蔗糖。
优选地，AM 1培养基包含每升0.1-10mM,优选1mM甜菜碱溶液
1-10g,优选2.6g(NH4)2HPO4和
0.1-5g,优选0.87g NH4H2PO4和
0.05-2.5g,优选0.15g KCl和
0.05-5g,优选0.37g MgSO4-7H2O和
0.1-5ml,优选1ml微量金属贮存液,
其中微量金属贮存液每升包含0.01-1M,优选0.12M HCL,1-5g,优选2.4g FeCL3-6H2O；0.1-1g,优选0.3g CoCl2-6H2O；0.1-1g,优选0.21g CuCl2-2H2O；0.1-1g,优选0.3gZnCl2；0.1-1g,优选0.27g NaMoO4–2H2O；0.01-0.5g,优选0.068g H3BO3和0.1-1g,优选0.5gMnCl2–4H2O,
和任选地1-30g,优选15g(NH4)2SO4。
NBS培养基中优选的碳源是葡萄糖或蔗糖,优选2％-18％葡萄糖或2％-16％蔗糖。
优选地，PPM01培养基每升包含
0.05-5g,优选0.37g MgSO4–7H2O和
0.1-10g,优选1g(NH4)2SO4和
0.05-5g,优选0.46g甜菜碱和
0.001-0.5g,优选0.05g氰钴胺(B12)和
1-10g,优选3.74g KH2PO4和
0.1-5ml,优选1ml微量金属贮存液,
其中微量金属贮存液每升包含10-100mM,优选60mM硫酸,1-10g,优选3.48g(NH4)2Fe(II)(SO4)2-7H2O；0.1-1g,优选0.35g CoSO4-7H2O；0.1-1g,优选0.31g CuSO4-5H2O；0.1-5g,优选0.63g ZnSO4-7H2O；0.1-1g,优选0.27g MnSO4-H2O；0.01-1g,优选0.07g NaMoO4-2H2O和0.1-5g,优选0.43g H3BO3。
PPM01培养基中优选的碳源是一水合葡萄糖，优选每升培养基10-500g,更优选140g一水合葡萄糖。
本发明的另一实施方案是产生具有增强的丙氨酸，丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸产率或生产力的重组微生物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)在微生物中减少、抑制或缺失如上面(i)到(v)定义的brnQ基因的一种或多种活性和/或表达和/或ii)引入、增加、增强如上面(i)到(v)定义的argP基因的一种或多种活性和/或表达和/或iii)引入、增加、增强如上面(i)到(v)定义的gcvA基因的一种或多种活性和/或表达和/或iv)减少、抑制或缺失如上面(i)到(v)定义的gcvB基因的一种或多种活性和/或表达和/或v)改变如上面(i)到(v)定义的lpxD基因的活性；和
产生、鉴定和分离重组微生物，其与没有如上文(I)项定义的修饰的相应微生物相比具有增强的丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸产率或生产力。
在优选实施方案中，具有减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达的brnQ基因具有SEQ ID NO:3的序列和/或编码SEQ ID NO:4的多肽。
在优选实施方案中，具有引入的,增加的,或增强的活性和/或表达的argP基因具有SEQ ID NO:47的序列和/或编码SEQ ID NO:48的多肽。
在优选实施方案中，具有引入的、增加的或增强的活性和/或表达的gcvA基因与具有SEQ ID NO:56或57的序列的启动子功能上连接。
在优选实施方案中，具有减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达的gcvB基因与具有SEQ ID NO:60或61的序列的启动子功能上连接。
在优选实施方案中，具有改变的活性和/或表达的lpxD基因具有SEQ ID NO:51的序列和/或编码SEQ ID NO:52的多肽。
在产生本发明的重组微生物的方法的优选实施方案中，该方法进一步包括减少,抑制或缺失如上文(A)到(Y)定义的pflB基因,adhE基因,ldhA基因,pta基因或frdA基因的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或全部的活性和/或表达的步骤和/或引入,增加或增强如上文(Z)到(UU)定义的alaD基因，ygaW基因，zipA基因或lpd基因的至少一种、至少两种、至少三种或全部的活性和/或表达的步骤。
在产生本发明重组微生物的方法的进一步优选的实施方案中，如(Z)到(DD)中定义的核酸分子处于作为启动子发挥功能的序列的控制下，所述启动子具有序列：
(1)包含SEQ ID NO:115或116的序列的核酸分子，或
(2)与SEQ ID NO:115或116的核酸分子具有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(3)与具有SEQ ID NO:115或116的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子或
(4)具有SEQ ID NO:115或116的核酸分子的至少10个核苷酸，优选至少20个核苷酸,至少30个核苷酸或至少40个核苷酸的片段，更优选至少50个核苷酸,至少75个核苷酸或至少100个核苷酸,甚至更优选至少150或至少200个核苷酸的片段。优选地，SEQ ID NO:115或116的片段是包含SEQ ID NO:115或116的3’区的片段，因此，该片段在SEQ ID NO:115或116的5’末端包含缺失。
用于产生本发明的重组微生物的最优选的方法包括减少、抑制或缺失全部brnQ基因,gcvB基因,pflB基因,adhE基因,ldhA基因,pta基因和frdA基因的活性和/或表达的步骤和引入、增加或增强全部alaD基因,ygaW基因,zipA基因,lpd基因,argP基因和gcvA基因的活性和/或表达的步骤和改变lpxD基因的活性和/或表达的步骤。
用于产生本发明的重组微生物的方法的一个实施方案中，所述微生物选自原核微生物，包括氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacterasaii)、带马瓦无色杆菌(Achromobacter delmarvae)、粘无色杆菌(Achromobacterviscosus)、乳无色杆菌(Achromobacter lacticum)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)、柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)、肿胀节杆菌(Arthrobactertumescens)、石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)、Arthrobacterhydrocarboglutamicus、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)、天牛短小杆菌(Aureobacterium saperdae)、印度固氮菌(Azotobacter indicus)、产氨棒杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、Brevibacterium divaricatum、Brevibacteriumlactofermentum、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、Brevibacterium globosum、暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)、Brevibacterium helcolum、Brevibacterium pusillum、Brevibacterium testaceum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌(Brevibacteriumlinens)、Brevibacterium protopharmiae、嗜乙酰棒杆菌(Corynebacteriumacetophilum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、解淀粉杆菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi)、奇异稳杆菌(Flavobacterium peregrinum)、染色假杆菌(Flavobacteriumfucatum)、Flavobacterium aurantinum、莱茵黄杆菌(Flavobacterium rhenanum)、塞沃尼假杆菌(Flavobacterium sewanense)、短黄杆菌(Flavobacterium breve)、脑膜败血金黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum、微球菌属种(Micrococcus sp.)CCM825、摩氏变形菌(Morganella morganii)、红串红球菌(Nocardia opaca)、粗糙诺卡氏菌(Nocardiarugosa)、Planococcus eucinatus、Proteus rettgeri、谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)、成黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans)、Pseudomonas jluorescens、卵状假单胞菌(Pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、Pseudomonas acidovolans、霉味假单胞菌(Pseudomonasmucidolens)、睾丸酮丛毛单胞菌(Pseudomonas testosteroni)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、玫瑰红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)、红球菌属种(Rhodococcus sp.)ATCC 15592)、红球菌属种ATCC 19070)、脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、Vibriometschnikovii、Vibrio tyrogenes、马杜拉马杜拉放线菌(Actinomadura madurae)、Actinomyces violaceochromogenes)、Kitasatosporia parulosa、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、Streptomycesflavelus、浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)、浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)、橄榄链霉菌(Streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(Streptomycestanashiensis)、Streptomyces virginiae)、抗菌素链霉菌(Streptomycesantibioticus)、可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)、淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、杀鲑变形菌(Aeromonas salmonicida)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus thiaminolyticus)、弗氏埃希氏菌(Escherichia freundii)、Microbacterium ammoniaphilum、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)、Salmonella schottmulleri、柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)、集胞蓝细菌属种(Synechocystis sp.)、细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongatus)、Thermosynechococcus elongatus、铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa)、霉状串珠菌(属(Nostoc sp.)、N.commune、N.sphaericum、点型念珠蓝细菌(Nostoc punctiforme)、盘状螺旋蓝细菌(Spirulina platensis)、巨大鞘丝蓝细菌(Lyngbya majuscula)、L.lagerheimii、纤细席蓝细菌(Phormidium tenue)、假鱼腥蓝细菌属种(Anabaena sp.)、Leptolyngbya sp等。
在一些实施方案中，微生物是真核细胞。合适的真核细胞包括酵母细胞，例如，酵母属物种，如酿酒酵母，汉逊酵母属，如多形汉逊酵母,裂殖酵母属,如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，克鲁维酵母属，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，耶氏酵母属物种，如解脂耶氏酵母，毕赤酵母属物种，如甲醇毕赤酵母，树干毕赤酵母和巴斯德毕赤酵母，接合酵母属物种，如鲁氏接合酵母和拜耳接合酵母，假丝酵母属物种，如博伊丁假丝酵母，产朊假丝酵母，Candida freyschussii，光滑假丝酵母和Candida sonorensis，许旺酵母属物种，如西方许旺酵母，Arxula属物种，如Arxula adeninivorans，Ogataea属物种如Ogataea minuta，克雷伯菌属物种，如肺炎克雷伯菌。
许多细菌工业菌株特别适合用于本文公开的方法中。在一些实施方案中，微生物是棒杆菌属的种，例如，嗜乙酰棒杆菌,谷氨酸棒杆菌,美棒杆菌,嗜乙酰乙酸棒杆菌,醋谷棒杆菌。在一些实施方案中，微生物是芽孢杆菌属物种，例如，苏云金芽孢杆菌，炭疽杆菌，巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌,环状芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,灿烂芽孢杆菌,凝固芽孢杆菌,短芽孢杆菌,坚强芽孢杆菌,B.alkaophius,地衣芽孢杆菌,克劳氏芽孢杆菌,嗜热脂肪芽孢杆菌,耐盐芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,短小芽孢杆菌,和解淀粉芽孢杆菌。在一些实施方案中，微生物是欧文氏菌属的种，例如,噬夏孢欧文氏菌,胡萝卜软腐欧文氏菌,E.ananas,草生欧文氏菌,E.punctata和E.Terreus。在一些实施方案中，微生物是埃希氏菌属的种，例如，大肠杆菌。在一些实施方案中，微生物是泛菌属的种，例如，柠檬泛菌或成团泛菌。在其他实施方案中，微生物是链霉菌属的种，例如，产二素链霉菌,不产色链霉菌,除虫链霉菌,天蓝色链霉菌,生金色链霉菌,金色链霉菌,杀真菌素链霉菌,灰色链霉菌，或浅青紫链霉菌。在其他实施方案中，微生物是发酵单胞菌属的种，例如，运动发酵单胞菌或解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica)。在其他实施方案中，微生物是红球菌属的种，例如，混浊红球菌。
微生物优选选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae),优选埃希氏菌属(Escherichia),例如大肠杆菌(E.coli),优选菌株大肠杆菌W,其对应于DSMZ 1116,其对应于ATCC9637。
本发明的另一实施方案是产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸,最优选L-丙氨酸的方法，包括在允许产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸,最优选L-丙氨酸的条件下培养如上文定义的一种或多种重组微生物。
在一些实施方案中，本发明包括的重组微生物在分批或连续发酵条件下生长。典型的分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不受到人工改变。分批系统的变型是补料分批发酵。在该变型中，随着发酵进行，底物作为增量加入。当分解代谢抑制可能抑制细胞的代谢和希望在培养基中具有有限量的底物时，补料分批系统是也有用的。分批发酵和补料分批发酵在本领域是常见和公知的。在本发明中也可使用的连续发酵是这样的系统，其中向生物反应器连续加入确定的发酵培养基并且通常取出等量的条件培养基(例如，含有希望的终产物)用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度，其中细胞主要在生长期，其中终产物的产生被增强。连续发酵系统努力保持稳态生长条件。调节连续发酵过程的营养物和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术是工业微生物领域公知的。
在一些实施方案中，在约10℃到约60℃,约15℃到约50℃,约20℃到约45℃,约25℃到约45℃,约30℃到约45℃和约25℃到约40℃范围内的温度下进行发酵。在优选实施方案中，温度是约34℃,35℃或36℃。在最优选实施方案中，温度是约37℃或38℃。
在一些其他实施方案中，发酵进行约8小时到240小时，约8小时到240小时,约8小时到约168小时,约10小时到约144小时,约15小时到约120小时,或约20小时到约72小时的时间。优选地，发酵进行约20小时到约40小时。
在一些其他实施方案中，发酵在约4到约9的范围内、约4.5到约8.5的范围内、约5到约8的范围内、约5.5到约7.5的范围内的pH下进行。发酵将优选在7的pH下进行。
在产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸的方法的一个实施方案中，微生物培养在包含1％和30％(w/v)之间的糖,5％和25％(w/v)之间的糖,10％和20％(w/v)之间的糖,11％和18％(w/v)之间的糖的培养基中。微生物优选培养在包含13％和15％(w/v)之间的糖的培养基中，最优选地，微生物优选培养在包含14％(w/v)的糖的培养基中。
在产生丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸的方法的另一实施方案中，丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸的产率是至少80％例如至少81％,至少82％,至少83％,至少84％或至少85％。产率优选是至少86％,至少87％,至少88％,至少89％或至少90％。产率更优选是至少90.5％,至少91％,至少91.5％,至少92％,至少92.5％,至少93％,至少93.5％,至少94％或至少94.5％。在甚至更优选的实施方案中，产率是至少95％或至少95.5％。在最优选的实施方案中，产率是至少96％。产率百分数计算为从培养基中葡萄糖克数产生的产物克数。所以，当培养基含有100g葡萄糖并且发酵产生98g丙氨酸时，产率将是98％。
在产生丙氨酸的方法的另一实施方案中，优选产生L-丙氨酸，其中L-丙氨酸的手性纯度是至少90％,至少91％,至少92％,至少93％或至少94％。在优选实施方案中，L-丙氨酸的手性纯度是至少95％或至少95.5％。在更优选实施方案中，L-丙氨酸的手性纯度是至少96％或至少96.5％或至少97％。在甚至更优选实施方案中，L-丙氨酸的手性纯度是至少97.5％,至少98％或至少98.5％例如至少99％。甚至更优选地，L-丙氨酸的手性纯度是至少99.5％或至少99.6％例如至少99.7％,至少99.8％,或至少99.9％。在最优选实施方案中，产生手性纯的L-丙氨酸。
本发明的另一实施方案是培养或生长如上文定义的遗传修饰的微生物的方法，该方法包括用一种或多种遗传修饰的微生物接种培养基并在如上文定义的条件下在培养基中培养或生长所述遗传修饰的微生物。
如上文定义的重组微生物或如上文定义的组合物用于发酵生产丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸,最优选L-丙氨酸的用途是本发明的额外实施方案。
根据本发明的重组微生物的特征在于，与各自的参比微生物，如野生型相比，由brnQ基因编码的酶和/或由gcvB基因编码的RNA的表达和/或活性降低的和/或由argP基因编码的酶和/或gcvA的表达和/或活性增加了和/或由lpxD编码的酶的活性改变了。
术语“降低的表达和/或活性”也包括野生型微生物，其没有brnQ和/或gcvB的可检测到的表达和/或活性。
在一个实施方案中，通过失活、突变或敲除基因实现该基因的表达和/或活性的减少。这可以如下进行：通过缺失该基因的编码区和/或启动子的部分或全部，通过突变该基因，如插入或缺失许多核苷酸，例如，一个或两个核苷酸，导致该基因编码区的移码，在编码区中引入终止密码子，通过例如缺失或突变启动子框，如核糖体进入位点，TATA框等失活该基因的启动子。减少也可以通过例如通过引入核酶、dsRNA、反义RNA或反义寡核苷酸降解基因的转录物来实现。基因活性的减少可以通过在细胞中表达特异结合靶标酶的抗体或适体来实现。减少基因的表达和/或活性的其他方法是技术人员已知的。
在优选实施方案中，通过在基因中引入突变，优选缺失实现brnQ基因的表达和/或活性的降低。在进一步优选的实施方案中，在SEQ ID NO:1的667位和764位之间引入缺失，从而从brnQ基因缺失97个核苷酸。所得的截短的核酸具有SEQ ID NO:3中描绘的序列并且编码如SEQ ID NO:4中描绘的截短的蛋白质。
在优选实施方案中，通过在基因中引入突变，优选点突变实现argP基因的表达和/或活性的增加。更优选地，其通过突变SEQ ID NO:45的argP基因的286到288位的密码子或功能同源基因的相应密码子实现。甚至更优选地，突变密码子从而其编码氨基酸谷氨酸或另一酸性氨基酸或其酰胺或与谷氨酸相似的氨基酸但不是丙氨酸。在最优选的实施方案中，突变各自的密码子从而其编码氨基酸谷氨酸。
优选地，通过在argP基因中引入突变实现argP基因的表达和/或活性的增加，其中所述突变的argP基因具有编码SEQ ID NO:48的蛋白质的SEQ ID NO:47的序列。
优选地，通过在gcvA基因的启动子中引入突变实现gcvA基因的表达和/或活性的增加，其中所述突变的启动子优选具有SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57的序列。
在优选实施方案中，通过在启动子中引入突变实现gcvB基因的表达和/或活性的减少。例如，通过在SEQ ID NO:59的62到68位中缺失一个或多个碱基T或通过在SEQ ID NO:59的60位引入点突变，使得在该位上的A成为G,C或T的任一个而突变启动子。优选地，突变的启动子具有SEQ ID NO:60或61的序列。
优选地，通过在gcvB基因的启动子中引入突变实现gcvB基因的表达和/或活性的减少。优选地，将具有SEQ ID NO:59的野生型启动子突变成具有SEQ ID NO:60或61的序列。
优选地，通过在lpxD基因中引入突变实现lpxD基因的改变的表达和/或活性，其中突变的lpxD基因具有SEQ ID NO:51的序列，编码SEQ ID NO:52的蛋白质。
本文公开的RNA或酶各自的减少的表达和/或活性，尤其乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸甲酸裂合酶I(pflB)、双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶(adhE)、磷酸乙酰基转移酶(pta)、延胡索酸还原酶(frdA)、gcvB和/或brnQ编码的RNA或酶的减少的表达和/或减少的活性可以是与各自参比微生物，如野生型微生物中所述RNA或酶的表达和/或活性相比，表达和/或活性减少至少50％，或表达和/或活性减少至少90％，或更优选表达和/或活性减少至少95％，或更优选表达和/或活性减少至少98％，或甚至更优选表达和/或活性减少至少99％，或甚至更优选表达和/或活性减少至少99.9％。在最优选的实施方案中，在本发明的微生物中检测不到RNA或酶的表达和/或活性。
gcvB基因和/或brnQ基因的表达和/或活性的丧失和argP基因和/或gvcA基因的引入的或增加的表达和/或活性和lpxD基因的改变的活性和/或表达导致与各自参比微生物相比在本发明的重组微生物中丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸的提高的产率和/或生产力。因此，brnQ基因和/或gcvB基因的表达和/或活性的丧失和argP基因和/或gvcA基因的引入的或增加的表达和/或活性和lpxD基因的活性和/或表达的改变可以如下测定：通过测量与各自参比微生物相比，本发明的重组微生物的丙氨酸,丙酮酸,琥珀酸,天冬氨酸,苹果酸,乳酸,缬氨酸和/或亮氨酸,优选琥珀酸或丙氨酸,更优选丙氨酸产率或生产力。发酵生产代谢物，例如丙氨酸的方法是技术人员已知的并且也在本文中描述。与各自参比微生物发酵中丙氨酸的产率相比，本发明微生物的发酵中例如丙氨酸的提高的产率是各自基因的表达和或活性的丧失、减少、引入或增加或改变的度量。
测定乳酸脱氢酶(ldhA)表达或活性的方法例如由Bunch et al.在―The ldhAgene encoding the fermentative lactate de hydrogenase of Escherichia Coli”,Microbiology(1997),Vol.143,pages 187-155；or Bergmeyer,H.U.,Bergmeyer J.andGrassl,M.(1983-1986)在―Methods of Enzymatic Analysis”,3rd Edition,VolumeIII,pages 126-133,Verlag Chemie,Weinheim；或Enzymes in Industry:Production andApplications,Second Edition(2004),Wolfgang Aehle,page 23中公开。优选最后一种方法。
测定丙酮酸甲酸裂合酶I(pflB)表达或活性的方法例如公开于Knappe J,Blaschkowski HP,Grobner P,Schmitt T(1974)."Pyruvate formate-lyase ofEscherichia coli:the acetyl-enzyme intermediate."Eur J Biochem1974；50(1)；253-63.PMID:4615902；KNAPPE,Joachim,et al."Pyruvate Formate-Lyase of Escherichiacoli:the Acetyl-Enzyme Intermediate."European Journal of Biochemistry 50.1(1974):253-263；in Wong,Kenny K.,et al."Molecular properties of pyruvateformate-lyase activating enzyme."Biochemistry 32.51(1993):14102-14110和Nnyepi,Mbako R.,Yi Peng,and Joan B.Broderick."Inactivation of E.coli pyruvateformate-lyase:Role of AdhE and small molecules."Archives of biochemistry andbiophysics 459.1(2007):1-9。
测定双功能乙醛-CoA脱氢酶/依赖铁的醇脱氢酶/丙酮酸－甲酸裂合酶失活酶(adhE)表达或活性的方法例如公开于Membrillo-Hernández,Jorge,et al."Evolution ofthe adhE Gene Product of Escherichia coli from a Functional Reductase to aDehydrogenase GENETIC AND BIOCHEMICAL STUDIES OF THE MUTANT PROTEINS."Journalof Biological Chemistry 275.43(2000):33869-33875和Mbako R.Nnyepi,Yi Peng,JoanB.Broderick,Inactivation of E.coli pyruvate formate-lyase:Role of AdhE andsmall molecules,Archives of Biochemistry and Biophysics,Volume 459,Issue 1,1March 2007,Pages 1-9。
测定磷酸乙酰基转移酶(pta)表达或活性的方法例如公开于Dittrich,CherylR.,George N.Bennett,and Ka-Yiu San."Characterization of the Acetate-ProducingPathways in Escherichia coli."Biotechnology progress 21.4(2005):1062-1067和Brown,T.D.K.,M.C.Jones-Mortimer,and H.L.Kornberg."The enzymic interconversionof acetate and acetyl-coenzyme A in Escherichia coli."Journal of generalmicrobiology102.2(1977):327-336。
测定延胡索酸还原酶(frdA)表达或活性的方法例如公开于Dickie,Peter,andJoel H.Weiner."Purification and characterization of membrane-bound fumaratereductase from anaerobically grown Escherichia coli."Canadian journal ofbiochemistry 57.6(1979):813-821；Cecchini,Gary,et al."Reconstitution ofquinone reduction and characterization of Escherichia coli fumarate reductaseactivity."Journal of Biological Chemistry 261.4(1986):1808-1814或
Figure BDA0003215623930000341
I.,et al."Identification of active site residues of Escherichia coli fumaratereductase by site-directed mutagenesis."Journal of Biological Chemistry266.21(1991):13572-13579。
测定丙氨酸脱氢酶(alaD)表达或活性的方法例如公开于Sakamoto,Y.,Nagata,S.,Esaki,N.,Tanaka,H.,Soda,K."Gene cloning,purification and characterizationof thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus"JFermen.Bioeng.69(1990):154-158。
术语―酶的减少的表达”包括例如所述遗传操作的(例如，基因工程化的)微生物对所述酶的表达处于比各自参比微生物例如所述微生物的野生型表达的水平更低的水平。用于酶的减少表达的遗传操作可以包括但不限于，缺失编码所述酶的基因或其部分，改变或修饰与编码所述酶的基因相关的调节序列或位点(例如，通过去除强启动子或抑制性启动子)，修饰涉及编码所述酶的基因的转录的蛋白质(例如，调节蛋白，抑制基因，增强子，转录激活子等)和/或基因产物的翻译，或本领域常规的减少特定基因表达的任何其他常规手段(包括但不限于，使用反义核酸分子或其他方法敲除或阻断靶蛋白的表达)。此外，可以在mRNA中引入去稳定元件或引入遗传修饰，导致RNA的核糖体结合位点(RBS)的恶化。还可能以降低翻译效率和速度的方式改变基因的密码子选择。
通过引入导致酶的减少的活性的一个或多个有害的基因突变也可以获得酶的减少的活性。此外，酶活性的减少也可以包括活化酶的失活(或减少的表达)，所述活化酶是活化待减少其活性的酶必要的。通过后一方法，待减少其活性的酶优选保持在失活状态。
根据本申请的有害突变是包含启动子和编码区的基因内的任何突变，所述突变导致该基因的编码区编码的蛋白质的减少的或缺失的蛋白质活性。此类有害突变包括例如，移码，编码区中终止密码子的引入，启动子元件如TATA框的阻止转录的突变，等。
具有brnQ基因编码的酶或gcvB基因编码的RNA的减少的表达和/或活性或argP基因或gcvA基因编码的蛋白质的增强的或增加的表达和/或活性或lpxD基因编码的蛋白质的改变的活性和/或表达的微生物可以例如由于自发突变而自然发生。可以通过多种技术，如化学处理或辐射修饰微生物以缺乏或具有所述基因的一种或多种编码的酶或RNA的显著减少的、增强的或改变的活性。为此，微生物将通过例如诱变化学剂、X射线或紫外线处理。在随后的步骤中，将选择具有所述基因的一种或多种编码的酶或RNA的减少的、增强的或改变的表达和/或活性的那些微生物。也可以通过同源重组技术获得重组微生物，所述技术旨在突变、破坏或切除微生物的基因组中一种或多种所述基因或者将一种或多种所述基因用编码酶或RNA的相应的基因取代，所述酶或RNA与野生型基因编码的所述酶或RNA相比具有减少的、增强的或改变的表达和/或活性。
根据本发明重组微生物的一个实施方案，通过brnQ-基因的修饰实现了brnQ-基因或gcvB基因编码的酶或RNA的表达和/或活性的减少，其中这个/这些基因修饰优选通过缺失一种或多种所述基因或至少其部分，缺失一种或多种所述基因的调节元件或其部分，如启动子序列，或在一种或多种所述基因中引入至少一个有害的突变来实现。
根据本发明重组微生物的一个实施方案，通过argP-基因和/或gcvA-基因的修饰实现了argP-基因和/或gcvA-基因编码的酶的表达和/或活性的增加，其中这个/这些基因修饰优选通过在所述微生物的基因组中增加argP-基因和/或gcvA-基因的拷贝数，通过在所述微生物中引入自主复制表达载体上的基因，通过将argP-基因和/或gcvA-基因的启动子与更强的启动子交换或通过将基因的内源启动子转化为更强的启动子，例如，通过在启动子序列中引入点突变来实现。
此外，argP-基因和/或gcvA-基因和/或lpxD基因的活性可以通过突变该基因以便在蛋白质中实现氨基酸交换而增强或改变，所述交换提高或改变了所述基因的活性。此类方法是技术人员公知的。
向上面基因的突变可以如下引入，例如通过定向或随机诱变，接着通过重组将经修饰的基因引入微生物的基因组中。通过PCR突变基因序列可以产生基因的变体。―Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit”(Stratagene)可以用于实施定向诱变。在整个编码序列或仅仅其部分上的随机诱变可以借助―GeneMorph II Random MutagenesisKit”(Stratagene)实施。通过使用的模板DNA的量将诱变率设置成所希望的突变量。通过各个突变的靶向组合或者通过几个诱变循环的顺序实施产生多个突变。
在下文中，描述了用于重组，尤其用于引入突变或缺失序列的合适技术。
该技术在本文有时也被称作―坎贝尔重组”(―Campbell recombination”)(Leenhouts et al.,Appl Env Microbiol.(1989),Vol.55,pages 394-400)。如本文所用的―坎贝尔进”(―Campbell in”)指原始宿主细胞的转化体，其中整个环状双链DNA分子(例如，质粒)已经通过单次同源重组事件(事件中一次杂交)整合到染色体中，并且有效导致所述环状DNA分子的线性化形式插入到染色体的第一个DNA序列中，所述第一个DNA序列与所述环状DNA分子的第一个DNA序列同源。―被坎贝尔进”(―Campbelled in”)指线性化DNA序列，其已经整合到―坎贝尔进”转化体的染色体中。―坎贝尔进”含有第一个同源DNA连续的副本，其每个拷贝包括并且围绕同源重组交换点的一个拷贝。
如本文所用的―坎贝尔出”(―Campbell out”)指―坎贝尔进”转化体的后代细胞，其中已经在―被坎贝尔进”DNA的线性化插入的DNA上含有的第二个DNA序列和与所述线性化插入序列的第二个DNA序列同源的染色体来源的第二个DNA序列之间发生了第二次同源重组事件(交换出事件)，所述第二次重组事件导致缺失(抛弃)一部分整合的DNA序列，但是重要的是也导致一部分(这可以小至单个碱基)整合的―被坎贝尔进”的DNA保留在染色体中，使得与最初的宿主细胞相比，―坎贝尔出”细胞在染色体中含有一个或多个有意的改变(例如，单碱基替代、多个碱基替代、插入异源基因或DNA序列、插入额外的一个或多个拷贝的同源基因或经修饰的同源基因，或者插入包含一个以上的上面列出的这些前述实例的DNA序列)。―坎贝尔出”细胞优选通过对一部分(希望被抛弃的部分)―被坎贝尔进”的DNA序列中所含的基因进行反选择得到，所述基因如枯草芽孢杆菌sacB基因，其当在约5％到10％蔗糖存在下生长的细胞中表达时是致死性的。使用或不使用反选择，可以通过使用任一种可筛选的表型，通过筛选希望的细胞得到或鉴定所希望的―坎贝尔出”细胞，所述表型为诸如但不限于，菌落形态、菌落颜色、抗生素抗性的存在或缺失、通过聚合酶链式反应检测的给定DNA序列的存在或缺失、辅源营养的存在或缺失、酶的存在或缺失、菌落核酸杂交、抗体筛选等等。术语―坎贝尔进”和―坎贝尔出”也可以在多种时态中用作动词指上述方法或过程。
可以理解导致―坎贝尔进”或―坎贝尔出”的同源重组事件可以在同源DNA序列的DNA碱基范围内发生，并且因为同源序列将对于该范围的至少部分是彼此相同的，所以通常不可能精确地指出交换事件发生的地方。换句话说，不可能精确地指出哪个序列最初来自所插入的DNA，哪个最初来自染色体DNA。此外，第一个同源DNA序列和第二个同源DNA序列通常通过部分非同源区域分隔，并且该非同源区域保留在―坎贝尔出”细胞的染色体中。
优选地，第一个和第二个同源DNA序列通常长为至少约200个碱基对，并且可以长达几千个碱基对。然而，该程序可以改变以用于更短或更长的序列。例如，第一个和第二个同源序列的长度可以为约500到2000个碱基，并且通过将第一个和第二个同源序列以大约相同的长度排列，优选具有小于200个碱基对的不同，最优选两个序列较短者为较长者长度(碱基对)的至少70％，方便从―坎贝尔进”得到―坎贝尔出”。
在一个实施方案中，通过失活分别编码支链氨基酸转运蛋白或非蛋白质编码RNA的brnQ-基因和/或gcvB基因实现brnQ-基因和/或gcvB基因的表达和/或活性的减少。
在一个实施方案中，基因的失活优选通过缺失所述基因或至少其部分，通过缺失基因的调节元件或至少其部分或通过在所述基因中引入至少一个有害的突变来实现。
在一个实施方案中，通过活化编码具有DNA结合/转录活化活性的蛋白质的argP基因实现argP的表达和/或活性的诱导。
在一个实施方案中，通过活化编码DNA结合蛋白的gcvA-基因实现gcvA的表达和/或活性的诱导。
如在本发明上下文中使用的术语―丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸”必须以它们最广的意义上理解并且也包括其盐，例如丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸的碱金属盐，像Na+和K+-盐，或碱土金属盐，像Mg2+和Ca2+-盐，或者铵盐或酐类。
优选地，丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸在微好氧条件下产生。也可以使用好氧或缺氧条件。
微好氧指氧气的浓度小于空气中氧气的浓度。根据一个实施方案，微好氧指5到27mm Hg，优选10到20Hg的氧张力(Megan Falsetta et al.(2011),The composition andmetabolic phenotype of Neisseria gonorrhoeae biofilms,Frontiers inMicrobiology,Vol 2,page 1to 11)。优选地，用0.1到1vvm通气量建立微好氧条件。
缺氧条件可以通过常规技术建立，例如通过对反应培养基中的成分脱气并通过例如以0.1到1或0.2到0.5vvm的流速导入二氧化碳或氮气或其混合物和任选地氢气维持缺氧条件。好氧条件可以通过常规技术建立，例如，通过以0.1到1或0.2到0.5vvm的流速导入空气或氧气。如果合适，可以在该过程中应用0.1到1.5巴的轻度超压。
根据本发明的方法的一个实施方案，可同化的碳源可以是葡萄糖、甘油、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、棉子糖和其组合。
在优选实施方案中，可同化的碳源是葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘油或其组合。优选的碳源是葡萄糖、蔗糖、葡萄糖和蔗糖、葡萄糖和木糖和/或葡萄糖、阿拉伯糖和木糖。根据本发明的方法的一个实施方案，可同化的碳源可以是蔗糖、甘油和/或葡萄糖。
可同化的碳源的初始浓度，优选初始浓度优选被调节到5到250g/l,优选50到200g/l并且更优选125到150g/l的范围，最优选约140g/l的值并且可以在培养期间保持在所述范围内。反应培养基的pH可以通过加入合适的碱来控制，例如气体氨，NH4OH,NH4HCO3,(NH4)2CO3,NaOH,Na2CO3,NaHCO3,KOH,K2CO3,KHCO3,Mg(OH)2,MgCO3,Mg(HCO3)2,Ca(OH)2,CaCO3,Ca(HCO3)2,CaO,CH6N2O2,C2H7N，和/或其混合物。
本发明的另一实施方案是发酵产生丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸，最优选L-丙氨酸的方法，包括步骤
在发酵罐中培养如上文定义的根据本发明的微生物和
从I)中含有的培养液回收丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸，最优选L-丙氨酸。
根据本发明的发酵步骤I)可以例如在搅拌发酵罐、鼓泡塔和环式反应器中进行。可能的方法类型包括搅拌器类型和几何设计的广泛综述可以见Chmiel:―Bioprozesstechnik:Einführung in die Bioverfahrenstechnik”,Volume 1。在本发明的方法中，可用的典型的变型是本领域技术人员已知的或在例如Chmiel,Hammes andBailey:―Biochemical Engineering”中解释的以下变型，如分批、补料分批、重复补料分批或其他连续发酵，使用和不用生物量的回收。取决于生产菌株，可以实现用空气、氧气、二氧化碳、氢气、氮气或合适的其他混合物进行喷射以便实现良好的产率(YP/S)。
方法步骤I)中用于产生丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸，优选琥珀酸或丙氨酸，更优选丙氨酸，最优选L-丙氨酸的尤其优选的条件是：
可同化的碳源： 葡萄糖
温度: 30到45℃
pH: 6.0到7.0
微好氧条件
在方法步骤II)中，从方法步骤I)中获得的发酵液回收产物。
通常，回收方法包括从发酵液分离重组微生物如所谓的―生物量”的步骤。去除生物量的方法是本领域技术人员已知的，并且包括过滤、沉降、浮选或其组合。因此，例如用离心机、分离器、倾板器、过滤器或在浮选装置中去除生物量。为了最大回收价值产物，通常建议例如，以渗滤的形式洗涤生物量。方法的选择取决于发酵液中的生物量含量和生物量的性质，以及生物量与有机化合物(即价值产物)的相互作用。在一个实施方案中，可以对发酵液灭菌或巴氏消毒。在另一实施方案中，浓缩发酵液。取决于需要，该浓缩可以分批进行或连续进行。应该选择压力和温度范围使得首先不发生产物损坏，其次装置和能量的最小使用是必要的。多级蒸发的压力和温度水平的有技巧的选择尤其使得能够节省能量。
回收方法可以进一步包含额外的纯化步骤，其中进一步纯化发酵产物。然而，发酵产物通过化学反应转化为次级有机产物，那么取决于反应类型和反应条件，发酵产物的进一步纯化不是必需的。对于纯化方法步骤II)中获得的发酵产物，可以使用本领域技术人员已知的方法，例如结晶、过滤、电渗析和层析。可以通过离子交换层析进一步纯化所得溶液以便去除不想要的残留离子。
在一个实施方案中，通过在野生型基因中引入缺失实现brnQ基因的减少的、抑制的或缺失的表达和/或活性。优选地，其通过在具有SEQ ID NO:1的野生型基因或其功能变体的667到764位之间引入特定突变实现。
因此，本发明的进一步实施方案是具有选自以下组成的组的序列的重组核酸分子
(6)包含SEQ ID NO:3的序列的核酸分子，或
(7)与SEQ ID NO:3的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(8)与具有SEQ ID NO:3的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(9)编码SEQ ID NO:4的多肽的核酸分子,或
(10)编码与SEQ ID NO:4的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中包含如定义的突变的基因和/或蛋白质但不是野生型基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
在一个实施方案中，通过在野生型基因中引入突变实现argP基因的增强的或增加的的表达和/或活性。优选地，其通过在具有SEQ ID NO:45的野生型基因或其功能变体的286－288位中引入特定突变实现。
因此，本发明的另一实施方案是重组核酸分子，其具有选自下组的序列
(1)包含SEQ ID NO:45的序列的核酸分子，或
(2)与SEQ ID NO:45的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(3)与具有SEQ ID NO:45的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(4)编码SEQ ID NO:46的多肽的核酸分子,或
(5)编码与SEQ ID NO:46的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，并且
其中在(1)到(5)项下基因的对应于SEQ ID NO:45的286-288位的密码子不编码氨基酸丙氨酸并且不是终止密码子或者在(1)到(5)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ IDNO:46的96位的氨基酸不是丙氨酸，并且
其中在上面(1)到(5)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:46的蛋白质相比具有增强的或增加的活性，并且
其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
优选地，重组核酸分子具有选自下组的序列
(6)包含SEQ ID NO:47的序列的核酸分子，或
(7)与SEQ ID NO:47的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(8)与具有SEQ ID NO:47的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(9)编码SEQ ID NO:48的多肽的核酸分子,或
(10)编码与SEQ ID NO:48的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中在(7)到(10)项下基因的对应于SEQ ID NO:47的286-288位的密码子编码氨基酸谷氨酸或相关氨基酸或者在(7)到(10)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ ID NO:48的96位的氨基酸是谷氨酸或相关氨基酸，并且
其中在上面(7)到(10)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:48的蛋白质相比具有增强的或增加的活性，并且
其中包含如定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
在一个实施方案中，通过在野生型基因的启动子中引入突变实现gcvA基因的增强的或增加的表达和/或活性。优选地，其通过在具有SEQ ID NO:53的野生型基因或其功能变体的启动子中引入特定突变实现，其中所述突变对应于引入SEQ ID NO:55中的突变，导致SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57。
因此，本发明的进一步的实施方案是重组核酸分子，其包含选自下组的序列：
(11)包含SEQ ID NO:53的序列的核酸分子，或
(12)与SEQ ID NO:53的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(13)与具有SEQ ID NO:53的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(14)编码SEQ ID NO:54的多肽的核酸分子,或
(15)编码与SEQ ID NO:54的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
所述核酸分子功能性连接到突变启动子或与所述核酸分子异源的在微生物中有活性的启动子并且
其中包含如上定义的过表达的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
在一个实施方案中，通过在lpxD野生型基因中引入突变实现丙氨酸或相关化合物的增强的或增加的产率和/或生产力。
因此，本发明的一个实施方案是重组核酸分子，其具有选自下组的序列
(16)包含SEQ ID NO:49的序列的核酸分子，或
(17)与SEQ ID NO:49的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(18)与具有SEQ ID NO:49的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(19)编码SEQ ID NO:50的多肽的核酸分子,或
(20)编码与SEQ ID NO:50的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，并且
其中在(16)到(20)项下基因的对应于SEQ ID NO:49的43-45位的密码子不编码氨基酸丙氨酸并且不是终止密码子或者在(6)到(10)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ IDNO:50的15位的氨基酸不是丙氨酸，并且
其中在上面(16)到(20)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:50的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且
其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
优选地，重组核酸分子具有选自下组的序列
(21)包含SEQ ID NO:51的序列的核酸分子，或
(22)与SEQ ID NO:51的核酸分子有至少80％,优选至少85％例如至少90％,更优选至少95％例如至少96％,甚至更优选至少97％例如至少98％,最优选至少99％同一性的核酸分子，或
(23)与具有SEQ ID NO:51的核酸分子在中等严格条件下，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格条件下杂交的核酸分子，或
(24)编码SEQ ID NO:52的多肽的核酸分子,或
(25)编码与SEQ ID NO:52的多肽有至少60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的多肽的核酸分子，
其中(21)到(25)项下基因的对应于SEQ ID NO:51的43到45位的密码子编码氨基酸苏氨酸或相关氨基酸或(21)到(25)项下基因编码的蛋白质的对应于SEQ ID NO:52的15位的氨基酸是苏氨酸或相关氨基酸，和
其中在上面(21)到(25)项下定义的基因编码的蛋白质与具有SEQ ID NO:50的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且
其中包含如上定义的突变的基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
术语―相关氨基酸”或―保守氨基酸取代”指氨基酸被具有相似侧链的氨基酸替代。相关氨基酸列表在下面的表2中给出。保守取代表是本领域公知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(Eds)和下面的表2)。
表2:保守氨基酸取代的实例
Figure BDA0003215623930000451
Figure BDA0003215623930000461
在优选实施方案中，重组核酸分子具有SEQ ID NO:3,47,51并且分别编码具有SEQID NO:4,48,52的蛋白质。
本发明的另一实施方案是具有选自下组的序列的重组氨基酸分子
(26)包含SEQ ID NO:4的序列的氨基酸分子，或
(27)与SEQ ID NO:4的多肽有60％优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的氨基酸分子，
其中包含如所定义的突变蛋白质但不是野生型蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
优选地，本发明的重组氨基酸分子具有SEQ ID NO:4。
本发明的另一实施方案是重组氨基酸分子，其具有选自以下组成的组的序列
(28)包含SEQ ID NO:48的序列的氨基酸分子，或
(29)与SEQ ID NO:48的多肽有60％，优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的氨基酸分子，
其中(29)项下蛋白质的对应于SEQ ID NO:48的96位的氨基酸是谷氨酸或相关氨基酸，并且
其中如上面在(29)项定义的蛋白质与具有SEQ ID NO:46的蛋白质相比具有增强的或增加的活性，并且
其中包含如所定义的突变蛋白质但不是野生型蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
优选地，本发明的重组氨基酸分子具有SEQ ID NO:48。
本发明的另一实施方案是重组氨基酸分子，其具有选自以下组成的组的序列
(30)包含SEQ ID NO:52的序列的氨基酸分子，或
(31)与SEQ ID NO:52的多肽有60％，优选至少70％例如至少75％,更优选至少80％例如至少85％,甚至更优选至少90％例如至少95％,最优选至少96％,至少97％,至少98％或至少99％同源性的氨基酸分子，
其中(31)项下蛋白质的对应于SEQ ID NO:52的15位的氨基酸是苏氨酸或相关氨基酸，并且
其中如上面在(31)项定义的蛋白质与具有SEQ ID NO:50的蛋白质相比具有改变的活性和/或表达，并且
其中包含如所定义的突变基因和/或蛋白质的微生物在发酵中具有提高的丙氨酸产率。
优选地，本发明的重组氨基酸分子具有SEQ ID NO:52。
定义
将理解本发明不限于具体的方法学或方案。还将理解本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意在限制本发明的范围，所述范围将仅受到所附权利要求的限定。必须指出如本文和所附权利要求书所用的，单数形式―一个”和―这个”包括其复数指代，除非上下文清楚地指出相反意思。从而，例如，对―一个载体”的指代是对一个或多个载体的指代并且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。术语―约”在本文中用于指大约、大概、大抵或在区域中。当术语―约”与数字范围连用时，其通过将所给出的数字值上面和下面的边界延伸而修饰该范围。通常，术语―约”在本文中用于将所述值上面和下面的数值修饰20％上下，优选10％上下的变化(更高或更低)。如本文所用的术语―或”指具体列表的任一成员并且也包括该列表中成员的任一组合。术语―包含”和―包括”当用于说明书中和下面的权利要求时，意在说明存在一个或多个所述特征、整数、成分或步骤，但是它们不排除存在或加入一个或多个其他特征，整数、成分、步骤或其组。为了清楚起见，说明书中使用的某些术语在下文中定义和使用：
编码区：如本文所用的术语―编码区”当参考结构基因使用时，指核苷酸序列，其编码由于mRNA分子翻译的结果在新生多肽中发现的氨基酸。编码区在真核生物中结合在编码起始氨基酸甲硫氨酸的核苷酸三联体"ATG"的5’侧，原核生物也使用三联体―GTG”和―TTG”作为起始密码子。在3’侧，其被指定终止密码子(即,TAA,TAG,TGA)的三个三联体之一结合。此外，基因可以包括存在于RNA转录物上的序列的5’和3’末端两者上的序列。这些序列被称作―侧翼”序列或区域(这些测序序列位于存在于mRNA转录物上的非翻译序列的5’或3’)。5’侧翼区可以含有调节序列，如启动子和增强子，其控制或影响基因的转录。3’侧翼区可以含有指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。
互补的：―互补的”或―互补性”指包含反向平行核苷酸序列的两个核苷酸序列，当反向平行核苷酸序列中的互补碱基残基之间形成氢键时，所述反向平行核苷酸序列能够彼此配对(通过碱基配对原则)。例如，序列5'-AGT-3'与序列5'-ACT-3'互补。互补性可以是―部分的”或―完全的”。―部分”互补性是其中根据碱基配对原则，一个或多个核酸碱基不匹配。核酸分子之间的―完全”或―全部”互补性是其中根据碱基配对原则，每个核酸碱基与另一个碱基匹配。核酸分子之间的互补性程度对核酸分子链之间杂交的有效性和强度有重要影响。如本文所用的核酸序列的―互补序列”指核苷酸序列，其核酸分子显示出与该核酸序列的核酸分子的完全互补性。
内源的：―内源”核苷酸序列指核苷酸序列，其存在于野生型微生物的基因组中。
增强的表达：―增强”或―增加”微生物中核酸分子的表达在本文等同使用并且意指与参比微生物，如野生型相比，在微生物中核酸分子的表达水平更高。如本文所用的术语―增强的”或―增加的”指待表达的核酸分子的更高，优选显著更高的表达。如本文所用的，试剂，如蛋白质、mRNA或RNA的水平的―增强”或―增加”指相对于在基本相同的条件下生长的基本相同的微生物，水平增加了。如本文所用的，试剂，如靶基因表达的preRNA,mRNA,rRNA,tRNA和/或其编码的蛋白质产物水平的―增强”或―增加”意指相对于合适的参比微生物，水平增加50％或以上，例如，100％或以上，优选200％或以上，更优选5倍或以上，甚至更优选10倍或以上，最优选20倍或以上，例如50倍。通过技术人员熟悉的方法可以确定增强或增加。从而，核酸或蛋白质量的增强或增加可以例如通过蛋白质的免疫学检测来测定。此外，诸如蛋白质测定法、荧光、Northern杂交、核酸酶保护测定法、反转录(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、蛋白质印迹、放射免疫测定法(RIA)或其他免疫测定法和荧光激活的细胞分析(FACS)的技术可以用于测量微生物中的特定蛋白质或RNA。取决于所诱导的蛋白质产物的类型，也可以测定其活性或对微生物表型的影响。测定蛋白质的量的方法是技术人员已知的。可以提及的实例是micro-Biuret方法(Goa J(1953)Scand JClin Lab Invest 5:218-222),Folin-Ciocalteau方法(Lowry OH et al.(1951)J BiolChem 193:265-275)或测量CBB G-250的吸收(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72:248-254)。
表达：―表达”指基因产物的生物合成，优选指核苷酸序列，例如内源基因或异源基因在细胞中的转录和/或翻译。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录成mRNA，并且任选地，mRNA随后翻译成一种或多种多肽。在其他情况下，表达可以仅仅指含有RNA分子的DNA的转录。
外来的：术语―外来的”指通过实验操作导入细胞的任何核酸分子(例如，基因序列)并且可以包括在细胞中发现的序列，只要所引入的序列含有一些修饰(例如，点突变、存在选择标记基因等)并且因此相对于天然存在的序列是不同的。
功能连接：术语―功能连接”或―功能连接的”等同于术语―有效连接”或―有效连接的”并且将被理解为指例如调节元件(例如，启动子)与待表达的核酸序列和如果合适，其他调节元件(例如，终止子)以这样的方式顺序排列，使得每个调节元件都可以完成其预期的功能以允许、修饰、促进或以其他方式影响所述核酸序列的表达。可以使用―有效连接”或―有效连接的”作为同义词。该表述可取决于核酸序列关于有义或反义RNA的排列。为此，化学意义上的直接连接不是必需的。遗传控制序列，如增强子序列，也可以从远处或实际上从其他DNA分子对靶序列发挥功能。优选的排列是这样的排列，其中待重组表达的核酸序列位于作为启动子的序列的后面，从而两个序列彼此共价连接。在优选实施方案中，待转录的核酸序列以这样的方式位于启动子后面，使得转录起始与本发明的嵌合RNA的期望起始相同。功能连接和表达构建体可以通过如所述的惯用重组和克隆技术产生(例如，在Maniatis T,Fritsch EF and Sambrook J(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Silhavyet al.(1984)Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor(NY)；Ausubel et al.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience；Gelvin et al.(Eds)(1990)PlantMolecular Biology Manual；Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,The Netherlands中)。然而，例如，作为具有限制酶的特定切割位点的接头或作为信号肽的其他序列也可以位于两个序列之间。序列的插入也可以导致融合蛋白的表达。优选地，由调节区如启动子与待表达的核酸序列的连接组成的表达构建体可以以载体整合的形式存在或者可以例如通过转化插入基因组中。
基因：术语―基因”指有效连接合适的调节序列的区域，所述调节序列能够以某种方式调节基因产物(例如，多肽或功能RNA)的表达。基因包括编码区(可读框，ORF)前面(上游)和后面(下游)的DNA的非翻译调节区(例如，启动子、增强子、抑制子，等)。如本文所用的术语―结构基因”意指这样的DNA序列，其被转录成mRNA，mRNA然后被翻译成特定多肽特征性的氨基酸序列。
基因组和基因组DNA：术语―基因组”或―基因组DNA”指宿主生物的可遗传的遗传信息。所述基因组DNA包括拟核的DNA以及自主复制质粒的DNA。
异源的：关于核酸分子或DNA的术语―异源的”指核酸分子，其有效连接或被操作而变得有效连接到第二个核酸分子，该第二个核酸分子天然不有效连接所述核酸分子，或者第二个核酸分子与所述核酸分子天然有效连接在不同的位置。包含核酸分子和与其连接的一个或多个调节核酸分子(如启动子或转录终止信号)的异源表达构建体例如是通过实验操作产生的构建体，其中a)所述核酸分子，或b)所述调节核酸分子或c)两者(即(a)和(b))不位于其天然(自然)遗传环境或已经通过实验操作进行修饰，修饰的例子是一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境指来源生物中天然的遗产基因座或者指在基因组文库中存在。在基因组文库的情况下，优选保留，至少部分保留核酸分子序列的天然遗传环境。所述环境在所述核酸分子的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1,000bp,非常特别优选至少5,000bp长度的序列。天然发生的表达构建体，例如启动子与对应基因的天然发生的组合当被非天然、合成的―人工”方法如诱变修饰时，变成转基因表达构建体。已经描述了此类方法(US 5,565,350；WO 00/15815)。例如，认为有效连接启动子(其不是该核酸分子的天然启动子)的编码蛋白质的核酸分子与该启动子是异源的。优选地，异源DNA与其所引入的细胞不是内源的或不天然结合，但是已经从另一细胞获得或已经合成。异源DNA也包括含有某种修饰的内源DNA序列，内源DNA序列的非天然发生的多拷贝，或与物理上与其连接的另一DNA序列不天然结合的DNA序列。通常，尽管不是必要的，异源DNA编码这样的RNA或蛋白质，所述RNA或蛋白质通常不是由所述异源DNA在其中表达的细胞产生的。
杂交：如本文所用的术语―杂交”包括―核酸分子的链通过碱基配对与互补链结合的任何过程”(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,Stockton Press,NewYork)。杂交和杂交的强度(即，核酸分子之间结合的强度)受到诸如核酸分子之间互补性程度，所涉及的条件的严格性，所形成的杂合体的Tm和核酸分子内G:C比例的因素的影响。如本文所用，术语―Tm”参考―解链温度”使用。解链温度是双链核酸分子群体变得半解离为单链时的温度。计算核酸分子的Tm的方程是本领域公知的。如标准参考书所指出，当核酸分子在1M NaCl的水溶液中时，Tm值的简单估计可以通过以下方程计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)[见例如，Anderson and Young,Quantitative Filter Hybridization,in NucleicAcid Hybridization(1985)]。其他参考文献包括更复杂的计算，其对于Tm的计算考虑结构以及序列特征。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以见Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。合适的杂交条件是在这样的条件下与包含序列的互补序列的至少50个，优选至少100个，更优选至少150个，甚至更优选至少200个，最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交，所述条件等同于在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4,1mM EDTA，50℃下在2X SSC,0.1％SDS,50℃(低严格性)下洗涤。其他合适的杂交条件是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5M NaPO4,1mM EDTA，50℃下与包含序列的互补序列的至少50个，优选至少100个，更优选至少150个，甚至更优选至少200个，最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交，在1X SSC,0.1％SDS 50℃(中等严格性)或65℃(高严格性)下洗涤。
同一性：当关于两个或多个核酸或氨基酸分子比较使用时，―同一性”指所述分子的序列共有某种程度的序列相似性，所述序列是部分相同的。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸分子的百分数同一性(如果提及核酸序列，同源性在本文可互换使用)，将序列一个写在另一个的下方用于最佳比较(例如，可以在蛋白质或核酸的序列中插入空位以便产生与另一蛋白质或另一核酸的最佳比对)。
然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上氨基酸残基或核酸分子。如果一条序列中的位置与另一条序列中相应位置被相同的氨基酸残基或相同的核酸分子占据，那么所述分子在该位置上是相同的。两条序列之间的百分数同一性是序列共有的相同位置数目的函数(即，％同一性＝相同位置数/位置总数x 100)。当提及核酸序列时，术语―同源性”和―同一性”从而被认为是同义词。当提及氨基酸序列时，术语同一性指序列中特定位置上相同氨基酸，术语同源性指序列中特定位置上的同源氨基酸。同源氨基酸是具有相似侧链的氨基酸。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。
编码与本发明的蛋白质同源的蛋白质的核酸分子可以如下来产生：在核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，从而在所编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术，如位点定向诱变或PCR介导的诱变向本发明的序列中引入突变。优选地，在一个或多个预期的非必需氨基酸残基进行保守氨基酸取代。―保守氨基酸取代”是这样的取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不带电极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β－分支侧链氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。从而，本发明蛋白质中预期的非必需氨基酸优选用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替换。
备选地，在另一实施方案中，可以沿着编码序列的全部或部分随机引入突变，如通过饱和诱变，并且可以筛选所得的突变体的本文所述的各自活性以鉴定保留其活性的突变体。在诱变本发明的序列之一后，可以重组表达所编码的蛋白质并且可以使用例如本文所述的测定法测定蛋白质的活性。
为了测定两个或多个氨基酸序列或两个或多个核苷酸序列的百分数同一性，已经开发了一些计算机软件程序。可以用例如软件fasta计算两个或多个序列的同一性，fasta当前以版本fasta 3使用(W.R.Pearson and D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988)；W.R.Pearson,Methods in Enzymology 183,63(1990)；W.R.Pearson and D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988)；W.R.Pearson,Enzymology 183,63(1990))。用于计算不同序列的同一性的另一有用的程序是标准blast程序，其包括在Biomax pedant软件(Biomax,Munich,Federal Republic of Germany)中。这有时不幸地导致次优结果，因为blast不总是包括主题和查询的完整序列。然而，因为该程序非常有效，其可用于比较巨大数目的序列。下面的设置通常用于这种序列的比较：
-p程序名称[字符串]；-d数据库[字符串]；默认值＝nr；-i查询文件[File In]；默认值＝stdin；-e期望值(E)[实数]；默认值＝10.0；-m比对视图选项:0＝逐对；1＝查询锚定的显示同一性；2＝查询锚定的无同一性；3＝平面查询锚定的,显示同一性；4＝平面查询锚定的,无同一性；5＝查询锚定的无同一性和平末端；6＝平面查询锚定的,无同一性和平末端；7＝XML Blast输出；8＝表格式；9表格式具有注释行[整数]；默认值＝0；-o BLAST报告输出文件[文件输出]任选的；默认值＝stdout；-F过滤器查询序列(DUST with blastn,SEGwith others)[字符串]；默认值＝T；-G打开空位的代价(0调用默认行为)[整数]；默认值＝0；-E延伸空位的代价(0调用默认行为)[整数]；默认值＝0；-X空位比对的X减少值(比特)(0调用默认行为)；blastn 30,megablast 20,tblastx 0,所有其他的15[整数]；默认值＝0；-I Show GI's in deflines[T/F]；默认值＝F；-q核苷酸错配的惩罚(仅blastn)[整数]；默认值＝-3；-r核苷酸匹配的奖励(仅blastn)[整数]；默认值＝1；-v对(V)显示一行描述的数据库序列的数目[整数]；默认值＝500；-b对(B)显示比对的数据库序列的数目[整数]；默认值＝250；-f延伸命中的阈值,如果0则为默认值；blastp 11,blastn 0,blastx 12,tblastn13；tblastx 13,megablast 0[整数]；默认值＝0；-g进行空位比对(用tblastx无效)[T/F]；默认值＝T；-Q待使用的查询遗传代码[整数]；默认值＝1；-D DB遗传代码(仅对tblast[nx])[整数]；默认值＝1；-a使用的处理器数目[整数]；默认值＝1；-O SeqAlign文件[文件输出]任选的；-J相信查询defline[T/F]；默认值＝F；-M矩阵[字符串]；默认值＝BLOSUM62；-W字长,如果0则为默认值(blastn 11,megablast 28,所有其他的3)[整数]；默认值＝0；-z数据库的有效长度(对于实际大小使用0)[实数]；默认值＝0；-K来自待保持区域的最佳命中的数目(如果推荐使用100的值，那么默认关)[整数]；默认值＝0；-P多次命中为0，单次命中为1[整数]；默认值＝0；-Y搜索空间的有效长度(对于实际大小使用0)[实数]；默认值＝0；-S对数据库搜索的查询链(对blast[nx],和tblastx)；3为两者，1为顶部，2为底部[整数]；默认值＝3；-T产生HTML输出[T/F]；默认值＝F；-l限制数据库的搜索到GI的列表[字符串]任选的；-U使用FASTA序列的小写体过滤[T/F]任选的；默认值＝F；-y无缺口延伸的X减少值比特(0.0调用默认行为)；blastn 20,megablast 10,所有其他的7[实数]；默认值＝0.0；-Z最后空位比对的X减少值(比特)(0.0调用默认行为)；blastn/megablast50,tblastx 0,所有其他的25[整数]；默认值＝0；-R PSI-TBLASTN限制点文件[文件输入]任选的；-n MegaBlast搜索[T/F]；默认值＝F；-L查询序列上的位置[字符串]任选的；-A多个命中窗口大小,如果0则为默认值(blastn/megablast 0,所有其他的40[整数]；默认值＝0；-w移码罚分(对于blastx，OOF算法)[整数]；默认值＝0；-t tblastn中用于连接HSP允许的最大内含子的长度(0使得不能连接)[整数]；默认值＝0。
通过使用Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法搜索高质量结果。因此，优选基于所述算法的程序。有利地，序列的比较可以用程序PileUp(J.Mol.Evolution.,25,351(1987),Higgins et al.,CABIOS 5,151(1989))或优选用程序―Gap”和―Needle”(它们均基于Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48；443(1970)),和―BestFit”(其基于Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.2；482(1981))进行。―Gap”和―BestFit”是GCG软件包的一部分(Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)；Altschul et al.,(Nucleic Acids Res.25,3389(1997)),―Needle”是TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS)(Trends in Genetics 16(6),276(2000))的一部分。因此，优选地，用程序―Gap”或―Needle”在序列的整个范围上进行计算以确定序列同一性百分比。下面用于比较核酸序列的标准调整用于―Needle”:矩阵:EDNAFULL,Gap_penalty:10.0,Extend_penalty:0.5。下面用于核酸序列比较的标准调整用于―Gap”:空位权重:50,长度权重:3,平均匹配:10.000,平均错配:0.000。
例如，在核酸水平上与SEQ ID NO:1的序列有80％同一性的序列被理解为指这样的序列，其当通过上面的程序―Needle”用上面的参数设置与SEQ ID NO:1代表的序列比较时，具有80％同一性。优选地，基于查询序列如SEQ ID NO:1.的完整长度计算同一性。
分离的：如本文所用的术语―分离的”意指物质已经通过人手取出并且与其最初的原始环境分开存在并且因此不是自然的产物。分离的物质或分子(如DNA分子或酶)可以以纯化形式存在或者可以存在于非天然环境如转基因宿主细胞中。例如，天然存在的核酸分子或存在于活细胞的多肽不是分离的，但与天然系统中一些或所有共存物质分离的同样的核酸分子或多肽是分离的。这种核酸分子可以是载体的一部分和/或这样的核酸分子或多肽可以是组合物的一部分，并且是分离的，因为这样的载体或组合物不是其原始环境的一部分。优选地，关于核酸分子使用时，如在―分离的核酸序列”中的术语―分离的”指已经鉴定且从至少一种污染性核酸分子分开的核酸序列，它在其天然来源中通常与所述污染性核酸分子结合。分离的核酸分子是这样的核酸分子，其存在的形式或背景与它在自然界中发现的不同。相比，非分离的核酸分子是核酸分子，例如DNA和RNA，其以它们在自然界中存在的状态被发现。例如，一个给定的DNA序列(例如，基因)在宿主细胞染色体上邻近基因附近被发现；RNA序列，如一个编码特定蛋白质的特定mRNA序列，在细胞中作为与许多其它的编码多种蛋白质的mRNA的混合物被发现。然而，包含例如SEQ ID NO：1的分离的核酸序列包括例如，在细胞中的此类核酸序列，所述序列通常包含SEQ ID NO：1，其中所述核酸序列是在不同于天然细胞的基因组或质粒位置，或侧翼是与自然界中发现的核酸序列不同的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸序列被用于表达蛋白质时，核酸序列将至少包含至少部分有义链或编码链(即，所述核酸序列可以是单链的)。或者，它可以含有有义和反义链(即，所述核酸序列可以是双链的)。
非编码：术语―非编码”指的是不编码表达的蛋白质的部分或全部的核酸分子的序列。非编码序列包括但不限于增强子，启动子区，3'非翻译区，和5'非翻译区。
核酸和核苷酸：术语―核酸”和―核苷酸”是指天然存在的或合成或人造的核酸或核苷酸。术语―核酸”和―核苷酸”包括单链或双链，有义或反义形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或任何核苷酸类似物和聚合物或其杂合体。除非另外指出，特定的核酸序列还暗示包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。术语―核酸”与―基因”、―cDNA―、”mRNA―、―寡核苷酸―和”核酸分子―在本文可互换使用。核苷酸类似物包括在碱基，糖和/或磷酸酯的化学结构中具有修饰的核苷酸，所述修饰包括但不限于，5-位嘧啶修饰，8-位嘌呤修饰，胞嘧啶环外胺修饰，5-溴尿嘧啶的取代，等；和2'-位糖修饰，包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中2'-OH被选自H，OR，R，卤素，SH，SR，NH 2，NHR，NR2或CN的基团取代。短发夹RNA(shRNA)也可以包括非天然的元素，如非天然的碱，例如，ionosin和黄嘌呤，非天然糖，例如，2'-甲氧基核糖，或非天然磷酸二酯键，例如，甲基膦酸酯，硫代磷酸酯和肽。
核酸序列：术语―核酸序列”指从5'-到3'-末端读取的脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。它包括染色体DNA，自我复制的质粒，DNA或RNA的感染性的聚合物和执行主要结构性角色的DNA或RNA。―核酸序列”还指缩写，字母，字符或词的连续的列表，它们代表核苷酸。在一个实施方案中，核酸可以是―探针”,其是一个相对短的核酸，通常在长度上小于100个核苷酸。通常核酸探针是从约50个核苷酸长度到约10个核苷酸长度。核酸的―靶区域”是被识别为所关注的核酸的一部分。核酸的―编码区”是核酸的一部分，它当置于适当调节序列的控制下时，以序列特异性方式转录和翻译以产生特定多肽或蛋白质。编码区编码这样的多肽或蛋白质。
寡核苷酸：术语―寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物，以及具有相似功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。这种经修饰的或取代的寡核苷酸通常因为期望的性质而优于天然形式，所述性质为例如，增强的细胞吸收，对核酸靶标的增强的亲和力和在核酸酶的存在下增加的稳定性。一个寡核苷酸优选包括通过连接(例如，磷酸二酯)或替代键共价偶联于彼此的两个或多个核单体。
突出端：―突出端―是在双链寡核苷酸分子的5'-或3'-羟基末端上相对短的单链核苷酸序列(也称作―延伸”、―突出端”或―粘性末端”)。
多肽：术语―多肽”，―肽”，―寡肽”，―多肽”，―基因产物”，―表达产物”和―蛋白质”在本文中可互换使用，指连续氨基酸残基的多聚体和低聚物。
启动子：术语―启动子”或―启动子序列”是等同的并且如本文中所使用，是指DNA序列，其当有效连接到目的核苷酸序列时能够控制目的核苷酸序列转录成RNA。启动子位于5'(即，上游)，邻近目的核苷酸序列的转录起点(启动子控制所述目的核苷酸序列转录成mRNA)，并提供了RNA聚合酶特异性结合和其它转录因子起始转录的位点。该启动子不包括编码区或5'非翻译区。启动子可以例如与各自细胞是异源或同源的。核酸分子序列如果来自外来物种，或者如果来自相同物种，从其原始形式修饰，那么与生物体或第二核酸分子序列是―异源的”。例如，有效连接到异源编码序列的启动子是指编码序列与启动子来自不同物种，或者，如果来自相同物种，编码序列与启动子天然不是结合的(例如，遗传改造的编码序列或来自不同的生态型或品种的等位基因)。合适的启动子可以来自那里应该发生表达的宿主细胞的基因或来自该宿主的病原体。
纯化的：如本文所使用的，术语―纯化的”是指从它们的天然环境中去除(分离的或分开)的分子(无论核酸或氨基酸序列)。―基本上纯化的”分子至少60％，优选至少75％，更优选至少90％没有与它们天然结合的其他成分。纯化的核酸序列可以是分离的核酸序列。
重组的：术语―重组的”就核酸分子而言是指通过重组DNA技术产生的核酸分子。该术语还包括其本身不存在于自然界中，但被修改，改变，突变或由人以其他方式操纵的核酸分子。优选地，―重组核酸分子”是非天然存在的核酸分子，其有至少一个核苷酸不同于天然存在的核酸分子。―重组核酸分子”还可以包含―重组构建体”，其包含，优选有效连接，以那个顺序不天然存在的核酸分子的序列。用于产生所述重组核酸分子的优选方法可包括克隆技术，定向或非定向诱变，合成或重组技术。
显著增加：例如，酶的活性、基因表达、某种产品的生产力或产率的增加，该增加比在测量技术的固有误差界限更大，优选比对照酶的活性，表达，生产力，产率或或对照细胞中的表达或对照细胞中的生产力或产率增加约10％或25％，优选50％或75％，更优选2倍或5倍或更大，甚至更优选增加约10倍或更大。
显著减少：例如，酶的活性、基因表达、某种产品的生产力或产率的减少，该减少比在测量技术的固有误差界限更大，优选减少至少约5％或10％，优选至少约20％或25％，更优选至少约50％或75％，甚至更优选至少约80％或85％，最优选至少约90％，95％，97％，98％或99％。
基本上互补：在其最广泛的意义上，术语―基本上互补”，关于相对于参比或目标核苷酸序列的核苷酸序列使用时，是指核苷酸序列具有所述参比或目标核苷酸序列的基本上互补的核苷酸序列和精确互补序列之间的同一性百分数为至少60％，更理想的是至少70％，更理想的是至少80％或85％，优选至少90％，更优选至少93％，还更优选至少95％或96％，还更优选至少97％或98％，还更优选至少99％或最优选100％(在这种情况下后者等同于术语―相同的”)。优选地，同一性在至少19个核苷酸的长度，优选至少50个核苷酸，更优选核酸序列的全长上与所述参比序列评估(如果下面没有另外规定)。序列比较用University of Wisconsin GCG,GAP的SEQWEB应用，以默认GAP分析，基于Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch(1970)J Mol.Biol.48:443-453；如上述所定义)进行。与参比核苷酸序列―基本上互补”的核苷酸序列在低严格条件下，优选中等严格条件，最优选高严格条件(如上述定义)下与参比核苷酸序列杂交。
转基因：如本文所使用的术语―转基因”是指任何核酸序列，其通过实验操作被引入细胞的基因组中。转基因可以是―内源DNA序列”，或―异源DNA序列”(即，―外源DNA”)。术语―内源DNA序列”指核苷酸序列，其天然存在于它被引入的细胞中，只要它相对于天然存在的序列不含有某种修饰(例如点突变，可选择标记基因的存在等)。
转基因的：提及生物体时术语转基因指用重组DNA分子转化的，优选稳定转化的，所述重组DNA分子优选地包含有效连接到目的DNA序列的合适启动子。
载体：如本文所使用的，术语―载体”指能够转运其已经连接的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合的载体或―整合载体”，它可以变成整合到宿主细胞的基因组DNA。另一类型的载体是附加型载体，即，能够染色体外复制的质粒或核酸分子。能够指导与它们有效连接的基因表达的载体在本文中称为―表达载体”。在本说明书中，―质粒”和―载体”可互换使用，除非从上下文清楚具有不同意思。
野生型：术语―野生型”，―天然的”或―天然来源”关于生物体时指所述生物体不被改变，突变，或由人以其他方式操纵。相对于多肽或核酸序列，该多肽或核酸序列是天然存在的或可在至少一个天然产生的生物体中获得，其没有被改变，突变，或由人以其他方式操纵。
野生型微生物是指一种微生物，其基因组存在的状态与引进某个基因的遗传修饰前一样。所述遗传修饰可以是例如基因或其部分的缺失或点突变或基因的引入。
术语―生产”或―生产力”是本领域公知的，并且包括在给定的时间和给定的发酵体积(例如千克产物每小时每升)内形成的发酵产物(例如，丙氨酸)的浓度。术语―生产效率”包括要完成的特定生产水平(例如，细胞需要多久达到精细化学品的输出的特定比率)所需的时间。生产力也可以指空间-时间-产率，其定义为所产生的产物的量除以反应器体积和时间。
术语―产率”或―产物/碳产率”是本领域公知的并包括碳源转化为产物(即，精细化学品)的效率。这通常写作，例如，kg产物每kg碳源。通过增加化合物的产率或生产，回收的分子或在给定的时间量内给定量的培养物中那种化合物的有用的回收分子的量增加了。
术语―重组微生物”包括微生物,其已被遗传修饰，使得它们与它们所来源的野生型微生物相比表现出改变的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。重组微生物包含至少一个重组DNA分子。
术语―重组的”关于DNA时指使用重组DNA技术通过人所产生的DNA分子。该术语包括其本身不存在于自然界的DNA分子或不存在于所述DNA所来源的生物体，但被修饰，改变，突变或由人以其他方式操纵的DNA分子。优选地，―重组DNA分子”是序列与天然存在核酸分子相差至少一个核苷酸的非天然存在核酸分子。―重组DNA分子”也可包括―重组构建体”，其包括，优选有效连接，以那个顺序不天然存在的核酸分子的序列。用于制备所述的重组DNA分子的优选的方法可包括克隆技术，定向或非定向诱变，基因合成或重组技术。
此类重组DNA的一个实例是质粒，其中已经插入了异源DNA序列或基因或启动子，所述基因或启动子与该重组DNA所来源的基因或启动子相比已经被突变。所述突变可以通过本领域已知的定向诱变技术或通过随机诱变技术如化学、紫外线或x射线诱变或定向进化技术来引入。
术语―定向进化”与术语―代谢进化”同义使用，并且涉及应用选择压力，其有利于具有目的性状的突变体生长。选择压力可以基于不同的培养条件，ATP和生长偶联的选择和氧化还原相关的选择。选择压力可用具有顺序转移接种的分批发酵或具有相同的压力的连续培养来进行。
术语―表达”或―基因表达”是指一个或多个特定的基因或特定的遗传载体构建体的转录。特别是，术语―表达”或―基因表达”尤其指基因或遗传载体构建体转录成mRNA。该过程包括DNA的转录并且可能包括所得的RNA产物的加工。术语―表达”或―基因表达”还可以包括mRNA的翻译和所编码的蛋白质的合成，即，蛋白质表达。
图1
ackA-pta基因失活后的克隆验证。
A：用引物P395-ackA-pta-check2和P395-ackA-pta-check5(338bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRT的基因组DNA中获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-ackA-pta-check2和P395-ackA-pta-check5测序PCR扩增子证实了ackA-pta基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。
图2
adhE基因的失活之后的克隆验证。
A：用引物P395—adhE-check2和P395-adhE-check5(569bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRT的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-adhE-check2和P395-adhE-check5对PCR扩增子的测序证实了adhE基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。
图3
frdABCD基因的失活之后的克隆验证。
A：用引物P395-frd-check1和P395-frd-check4(797bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRTΔfrdABCD::FRT的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-frd-check1和P395-frd-check4对PCR扩增子的测序证实了frd基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。
图4
pflB基因的失活之后的克隆验证。
A：用引物P395-pflB-check1和P395-pflB-check3(511bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRTΔfrdABCD::FRTΔpflB::FRT的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-pflB-check1和P395-pflB-check3对PCR扩增子的测序证实了pflB基因座的碱基对精确修饰。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。
图5
alaD-gstear基因的整合之后的克隆验证。
A：用引物P395-ldhA-check1和P395-ldhA-check2(1833bp)从大肠杆菌WΔackA-pta::FRTΔadhE::FRTΔfrdABCD::FRTΔpflB::FRTΔldhA::alaD-gstear的基因组DNA获得的PCR扩增子。M：DNA大小标记。B：用P395-ldhA-check1和P395-ldhA-check2对PCR扩增子的测序证实了ldhA基因座的碱基对精确修饰和alaD-gstear的整合。通过测序证实的核苷酸以斜体字显示。alaD-gstear ORF以青色显示，剩余的FRT位点以绿色显示，侧翼的引物结合位点用红色显示。大写：编码序列。小写：基因间区。
图6
本发明的微生物中丙氨酸合成的代谢图。
红色星形描绘了酶活性的敲除，
绿色箭头描绘引入的酶活性，
J7代表ldh-乳酸脱氢酶，
KO减少了乳酸盐的产生。
J6代表frdABCD–延胡索酸还原酶，KO减少了琥珀酸盐的产生。
J8代表pfl–丙酮酸甲酸裂解酶，KO减少了乙酸盐和乙醇的产生。
J10代表ack-pta-磷酸乙酰基转移酶-乙酸激酶,KO减少了乙酸盐的产生。
J11代表adhE-醇脱氢酶，KO减少了乙醇的产生。
图7
大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ48(ArgP A96E)在具有140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中的分批发酵。用5N NH4OH将发酵控制在37C,400rpm,pH 6.8，无通气。显示了从样品的丙氨酸浓度和NH4OH消耗率校正的丙氨酸的形成。
图8
在具有作为碳源的140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中46h的分批发酵后大肠杆菌QZ20和QZ48(ArgP A96E)的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为所产生的产物的量除以反应器体积和时间。
图9
在具有140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中大肠杆菌QZ20/pACYC184质粒对照和大肠杆菌QZ20/pACYC184-argP的分批发酵。用5N NH4OH将发酵控制在37C,400rpm,pH 6.8，无通气。显示了从样品的丙氨酸浓度和NH4OH消耗率校正的丙氨酸的形成。
图10
在具有作为碳源的140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中20h的分批发酵后大肠杆菌QZ20/pACYC184质粒对照和大肠杆菌QZ20/pACYC184-argP的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为所产生的产物的量除以反应器体积和时间。
图11
在具有140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ58(gcvA/B启动子SNP)的分批发酵。用5N NH4OH将发酵控制在37C,400rpm,pH 6.8，无通气。显示了从样品的丙氨酸浓度和NH4OH消耗率校正的丙氨酸的形成。
图12
在具有作为碳源的140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中46h的分批发酵后大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ58(gcvA/B启动子SNP)的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为所产生的产物的量除以反应器体积和时间。
图13
在具有140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中大肠杆菌QZ48(ArgP A96E)和大肠杆菌QZ66(Arg A96E,gcvA/B启动子SNP)的分批发酵。用5N NH4OH将发酵控制在37C,400rpm,pH 6.8，无通气。显示了从样品的丙氨酸浓度和NH4OH消耗率校正的丙氨酸的形成。
图14
在具有作为碳源的140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中46h的分批发酵后大肠杆菌QZ48(ArgP A96E)和大肠杆菌QZ66(ArgP A96E,gcvA/B启动子SNP)的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为所产生的产物的量除以反应器体积和时间。
图15
相对于大肠杆菌QZ20 8h，在大肠杆菌QZ20和QZ23中分批发酵期间8h,11h和28h时(A)gcvA和(B)gcvB的相对基因转录分析。所有qPCR来源的数据都对作为参考的rrsA基因归一化。
图16
在具有140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中大肠杆菌QZ20/pACYC184质粒对照,大肠杆菌QZ20/pACYC184-gcvA和大肠杆菌QZ20/pACYC184-gcvB的分批发酵。用5N NH4OH将发酵控制在37C,400rpm,pH 6.8，无通气。显示了从样品的丙氨酸浓度和NH4OH消耗率校正的丙氨酸的形成。
图17
在具有作为碳源的140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中46h的分批发酵后具有质粒对照pACYC184,pACYC184-gcvA和pACYC184-gcvB的大肠杆菌QZ20的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为所产生的产物的量除以反应器体积和时间。
图18
在具有140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ71(gcvB敲除)的分批发酵。用5N NH4OH将发酵控制在37C,400rpm,pH 6.8，无通气。显示了从样品的丙氨酸浓度和NH4OH消耗率校正的丙氨酸的形成。
图19
在具有作为碳源的140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中46h的分批发酵后大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ71(gcvB敲除)的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为所产生的产物的量除以反应器体积和时间。
图20
在具有140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中大肠杆菌QZ20，大肠杆菌QZ57(brnQΔ667-764)和大肠杆菌QZ69(brnQ KO)的分批发酵。用5N NH4OH将发酵控制在37C,400rpm,pH 6.8，无通气。显示了从样品的丙氨酸浓度和NH4OH消耗率校正的丙氨酸的形成。
图21
在具有作为碳源的140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中46h的分批发酵后大肠杆菌QZ20，大肠杆菌QZ57(brnQΔ667-764)和大肠杆菌QZ69(brnQ KO)的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为所产生的产物的量除以反应器体积和时间。
图22
在具有140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ56(LpxDA15T)的分批发酵。用5N NH4OH将发酵控制在37C,400rpm,pH 6.8，无通气。显示了从样品的丙氨酸浓度和NH4OH消耗率校正的丙氨酸的形成。
图23
在具有作为碳源的140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中46h的分批发酵后大肠杆菌QZ20和QZ56(LpxD A15T)的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为所产生的产物的量除以反应器体积和时间。
图24
在具有140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中大肠杆菌QZ68(argP A96E,gcvA/B启动子SNP,brnQΔ667-764)和大肠杆菌QZ70(argP A96E,gcvA/B启动子SNP,brnQΔ667-764,lpxD A15T)的分批发酵。用5N NH4OH将发酵控制在37C,400rpm,pH 6.8，无通气。显示了从样品的丙氨酸浓度和NH4OH消耗率校正的丙氨酸的形成。
图25
在具有作为碳源的140g/L葡萄糖的500mL AM 1培养基中46h的分批发酵后大肠杆菌QZ68(argP A96E,gcvA/B启动子SNP,brnQΔ667-764)和大肠杆菌QZ70(argP A96E,gcvA/B启动子SNP,brnQΔ667-764,lpxD A15T)的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，其定义为所产生的产物的量除以反应器体积和时间。
实施例
化学品和常用方法
除非另有说明，如(Sambrook et al.,1989)中所述进行用于实施本发明的目的的克隆步骤，包括限制性消化，琼脂糖凝胶电泳，核酸纯化，核酸的连接，转化，选择和培养细菌细胞。重组DNA的序列分析用激光荧光DNA测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)使用桑格技术执行(Sanger等人，1977)。除非另有说明，化学品和试剂购自SigmaAldrich公司(Sigma Aldrich,St.Louis,USA)，购自(Madison,WI,USA),Duchefa(Haarlem,The Netherlands)或Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。限制性内切酶来自New EnglandBiolabs公司(Ipswich,MA,USA)或Roche Diagnostics GmbH(Penzberg,Germany)。寡核苷酸是由Eurofins MWG Operon(Ebersberg,Germany)合成。
实施例1：
通过失活ackA-pta,adhE,frdABCD和pflB ORFs并通过alaD基因的密码子优化的变体(alaD-gstear)替换ldhA ORF，将大肠杆菌W(LU17032)工程化用于L-丙氨酸生产。
通过插入FRT-侧翼卡那霉素抗性盒，接着通过FLP重组去除抗生素抗性盒，失活ackA-pta,adhE,frdABCD和pflB ORFs。
所述的ldhA基因由alaD-gstear和下游FRT-侧翼zeocin抗性盒替换，其最后通过FLP重组去除。
材料和方法
细菌培养
大肠杆菌W(LU17032)在Luria-Bertani(LB)液体培养基中或Luria-Bertani固体培养基上培养。偶尔，克隆在含有10mM蔗糖的M9基本琼脂上传代培养以确认W菌株身份。将抗生素酌情加入到该液体和固体培养基至15μg/ml(卡那霉素，氯霉素)，25μg/ml(zeocin)或3μg/ml(四环素)的最终浓度。
Red/ET重组
使用Gene Bridges GmbH(www.genebridges.com)的标准协议进行Red/ET重组。简言之，将Red/ET-proficient大肠杆菌W好氧培养在30℃下至～0.3的OD600nm值。通过添加10％的50微升(重量/体积)L-阿拉伯糖，随后温度升高至37℃诱导红色基因的表达。从未诱导的对照培养物省略阿拉伯糖。在37℃下温育35分钟后，用冰冷的10％(体积/体积)甘油洗涤细胞两次，并在1.35千伏，10μF，600Ω用500纳克PCR产物电穿孔细胞。然后细胞再悬浮在1ml冰冷的LB培养基中，并在37℃下需氧生长大约1.5小时。然后培养物平板接种于含15微克/毫升卡那霉素(敲除)的LB琼脂或25微克/毫升的zeocin(敲入)。
FLP重组
侧翼FRT位点允许通过FLP重组接着大肠杆菌染色体的修饰而去除抗生素抗性标记物。FLP重组留下单个FRT位点(34碱基对)以及短的侧翼序列(各约20个碱基)，其被用作在盒的扩增中的引物结合位点。
为了进行FLP重组，将编码FLP重组酶的质粒708-FLPe(表1)通过电穿孔导入红色/ET重组体中。KanR CmR或ZeoR CmR转化体用于接种0.2毫升LB培养物，其在30℃下培养3小时。然后通过温度偏移至37℃，接着是在37℃三个小时的温育，诱导FLP活性。对从这些培养物获得的单个菌落随后筛选了CmS和KanS或ZeoS表型。
DNA制备和分析
大肠杆菌基因组DNA(gDNA)用Gentra Puregene Yeast/Bact.试剂盒B(Qiagen,Hilden,Germany)从过夜培养物中分离。用PRECISOR高保真DNA聚合酶(BioCat，海德堡)从模板质粒扩增含有敲除或敲入盒的PCR产物并用PCR Extender System(5PRIME GmbH,Hamburg,Germany)根据制造商的建议进行分析PCR反应。使用GeneJET PCR纯化试剂盒或GeneJET凝胶提取试剂盒(Fermentas,St.Leon-Rot,Germany)纯化PCR扩增子并通过BATCBioTech(Konstanz,Germany)或BioSpring(Frankfurt am Main,Germany)测序。
表1.质粒和引物
Figure BDA0003215623930000701
Figure BDA0003215623930000711
Figure BDA0003215623930000721
Figure BDA0003215623930000731
1.1.ackA-pta基因座-ackA-pta的靶定
将大约500纳克ΔackA-pta PCR构建体(1737bp)电穿孔到Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。三个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。
克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实ackA-pta基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图1)。
1.2adhE基因座-adhE的靶定
将大约500纳克ΔadhE PCR构建体(1093bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。两个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。
克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕证实adhE基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图2)。
1.3frd基因座-frdABCD的靶定
将大约500纳克ΔfrdABCD PCR构建体(1093bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT和ΔadhE::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。一个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。
克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实frd基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图3)。
1.4pflB基因座-pflB的靶定
将大约500纳克ΔpflB PCR构建体(1093bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT,ΔadhE::FRT和ΔfrdABCD::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特异的引物分析八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。四个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。
克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实pflB基因座的失活和卡那霉素抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图4)。
1.5ldhA基因座-alaD-gstear的敲入
将大约500纳克ΔldhA::alaD-gstear PCR构建体(1783bp)电穿孔到含有ΔackA-pta::FRT,ΔadhE::FRT,ΔfrdABCD::FRT和ΔpflB::FRT修饰的Red/ET-proficient大肠杆菌W细胞。通过PCR与基因组特定的引物分析四个ZeoR转化体的抗性标记盒的正确整合。一个克隆进行FLP重组，其如在材料和方法中所述进行(未示出数据)。
克隆验证。通过PCR在剩余FRT瘢痕间证实alaD-gstear的整合和zeocin抗性盒的去除。得到正确的PCR信号的一个克隆也通过测序证实(图5)。
实施例2丙氨酸的HPLC检测和定量
下列HPLC方法被用于在细胞培养基中丙氨酸的检测：
柱：Aminex HPX-87C柱(Bio-Rad公司)，300×7.8毫米，内径
粒度9微米
流动相：钙(NO 3)2在0.1mol/L90％，乙腈10％
流速：0.6毫升/分钟
柱温度：60℃
检测：折射率检测器
根据以上的方法，在细胞培养物样品基质中主要估计组分可以从丙氨酸很好地分离，而不干扰丙氨酸的定量。
样品中的丙氨酸的量由外部标准校准方法测定。注射含有0.5～10.0g/L丙氨酸的标准样品并将峰面积用于校准。校准曲线的线性回归系数为0.9995。
样品以20微升注射一次。峰面积用于由Waters LC Millennium软件计算样品中存在的量。
实施例3葡萄糖，琥珀酸，乳酸，甲酸，乙酸和乙醇的HPLC检测和定量
使用的HPLC方法
柱：Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad公司)，300×7.8毫米，内径
粒度9微米
流动相：H2SO4 4mM
流速：0.4毫升/分钟
柱温度：45℃
检测：折射率检测器
分析物的量通过外标校准法测定。注射含有0.1到38.0克/升葡萄糖，0.05至10.0g/L琥珀酸，乳酸，甲酸，乙酸和乙醇的标准样品并将峰面积用于校准。所有六个校准曲线的线性回归系数均好于0.999。
样品以20微升注射一次。峰面积用于由Waters LC Millenium软件计算样品中存在的量。
实施例4来自实施例1的用于改进丙氨酸产率的大肠杆菌W主干(stem)的代谢进化
包含如在实施例1中所述的所有突变的大肠杆菌主干(命名为大肠杆菌Ex1或QZ16)用于代谢进化过程，以提高大肠杆菌Ex1主干的丙氨酸产率。
如下进行代谢进化：在第一和第二进化轮中，在NBS培养基5％葡萄糖中进行连续进化500小时和750小时。
NBS培养基:
3.5g KH2PO4
5.0g K2HPO4
3.5g(NH4)2HPO4
0.25g MgSO4-7H2O
15mg CaCL2-2H2O
0.5mg硫胺素
1ml微量金属贮存液
以0.1M HCL,1.6g FeCL3-6H2O；0.2g CoCl2-6H2O；0.1g CuCl2-2H2O；0.2g ZnCl2；0.2g NaMoO4-2H2O；0.05g H3BO3制备微量金属贮存液。
细胞在LB平板上划线并测试丙氨酸产率。最好的大肠杆菌主干(大肠杆菌Ev1或QZ17)导致用包含5％葡萄糖的NBS培养基在37℃24及48小时发酵的丙氨酸产率在84％-86％之间，相比，起始干大肠杆菌Ex1的丙氨酸产率为80％-83％。
大肠杆菌Ev1用于进一步的进化步骤，其以批次进化进行20天。5％的细胞每24h，48h，72h等再次接种在新鲜培养基中，和包含14％葡萄糖的AM1培养基中37℃。
AM1培养基:
19.92mm(NH4)2HPO4＝2.6g/L MW:132.07
7.56mm NH4H2PO4＝0.87g/L MW:115
2.0mm KCl＝0.15g/L MW:74.55
1.5mm MgSO4-7H2O＝0.37g/L MW:246.5
15g/L硫酸铵在最后一步加入
1mm甜菜碱
1ml微量金属贮存液”
为了制备1L微量金属贮存液:
以0.12M HCL,2.4g FeCL3-6H2O；0.3g CoCl2-6H2O；0.21g CuCl2-2H2O；0.3gZnCl2；0.27g NaMoO4-2H2O；0.068g H3BO3；0.5g MnCl2-4H2O制备微量金属贮存液
从该进化，分离干大肠杆菌Ev2，又称QZ18。用发酵测试此主干，该发酵在具有14％葡萄糖的AM1培养基的发酵罐中进行。干大肠杆菌Ev2具有92％-94％的丙氨酸产率，相比，在相同条件下，大肠杆菌Ev1的丙氨酸产率是91％-92％。
另一分批进化步骤在包含12％葡萄糖的AM1培养基中进行300小时，随后在包含12％葡萄糖的AM1中进行10个分批进化步骤，分离干大肠杆菌Ev3，也命名QZ20。
丙氨酸产率测试揭示干大肠杆菌Ev3在包含12％葡萄糖的AM1培养基中具有94％-96％的丙氨酸产率，相比，在相同条件下大肠杆菌Ev2的丙氨酸产率是92％-93％。
用大肠杆菌Ev3在具有14％葡萄糖的AM1培养基中进行如前述的进一步的顺序批次进化1000小时，并分离干大肠杆菌Ev4，也称作QZ23。在具有14％葡萄糖的AM1培养基中与大肠杆菌Ev3相比测试了大肠杆菌Ev4。在46小时的发酵后，与干大肠杆菌Ev3的1.0-1.3g(/Lh)相比，干大肠杆菌Ev4显示出2.0-2.4g/(Lh)的增加的丙氨酸生产力(空间-时间-产率)，丙氨酸生产力定义为所产生的产物量除以反应器体积和时间。
实施例5确定与大肠杆菌Ev3相比干大肠杆菌Ev4中的突变
对大肠杆菌干大肠杆菌Ev4和大肠杆菌Ev3的基因组测序并比较结果以便确定导致干大肠杆菌Ev4的增加的丙氨酸生产力的突变。
鉴定了brnQ基因中的突变，其将干大肠杆菌Ev3中brnQ基因的序列从SEQ ID NO:1(编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质)改变为干大肠杆菌Ev4中编码具有SEQ ID NO:4的蛋白质的SEQ ID NO:3。
此外，鉴定了argP基因中的突变，其将干大肠杆菌Ev3中argP基因的序列从SEQ IDNO:45(编码具有SEQ ID NO:46的蛋白质)改变为干大肠杆菌Ev4中编码具有SEQ ID NO:48的蛋白质的SEQ ID NO:47。此外，鉴定了gcvA基因中启动子的突变，其将干大肠杆菌Ev3中gcvA基因的启动子序列从SEQ ID NO:55改变为干大肠杆菌Ev4中SEQ ID NO:56。在也显示出增强的丙氨酸产率的一个独立的菌株中，鉴定了另一个突变，其将gcvA基因的启动子序列从SEQ ID NO:55改变为SEQ ID NO:57。
此外，鉴定了gcvB基因中启动子的突变，其将干大肠杆菌Ex1中gcvB基因的启动子序列从SEQ ID NO:59改变为干大肠杆菌Ev1中SEQ ID NO:60。在显示出增加的丙氨酸产率的另一个独立的菌株中，鉴定了gcvB基因的启动子的另一个突变，其从SEQ ID NO:59的启动子序列改变为SEQ ID NO:61。
此外，鉴定了lpxD基因中的突变，其将干大肠杆菌Ev3中lpxD基因的序列从SEQ IDNO:49(编码具有SEQ ID NO:50的蛋白质)改变为干大肠杆菌Ev4中编码具有SEQ ID NO:52的蛋白质的SEQ ID NO:51。
为了确定所鉴定的突变对于丙氨酸产率和生产力的重要性，向大肠杆菌菌株中顺序引入突变，所述突变包括如实施例1中所述的突变和如PCT/IB2014/064426中所述的突变，包括ygaW基因、zipA基因和lpd基因中的突变，和也如上述的控制alaD基因的表达的启动子中的突变。评估这些突变对丙氨酸生产力的影响。通过qPCR监测了突变的基因或处于突变的启动子区的控制下的基因的表达水平。
实施例6证实argP(iciA)基因中SNP的影响
ArgP(或iciA)是转录调节子。它控制涉及精氨酸转运系统的基因和涉及DNA复制的基因。在大肠杆菌QZ23中鉴定了导致ArgP蛋白质中A96E突变的SNP并评估了其对丙氨酸生产力的影响。
大肠杆菌QZ48的菌株构建
用引物argP_1_F和argP_1_R(见表1)与Phusion Hot Start High-Fidelity DNAPolymerase(Thermo)从模板载体pQZ11(Genescript)扩增具有可选择的氯霉素抗药性标记物和反选择sacB标记物(赋予蔗糖敏感性)的argP-cat-sacB盒。将PCR产物在37C下用DpnI(NEB)消化1小时以降低质粒模板背景并用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)从1％琼脂糖凝胶凝胶提取。用引物argP_2_F和argP_2_R(见表1)与Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase(Thermo)从QZ23基因组DNA扩增argP SNP盒(543bp)并用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)纯化。
对于Red/ET重组，根据生产商的方案使用Genebridges Red/ET重组试剂盒。将大约200ng argP-cat-sacB电穿孔到Red/ET-proficient大肠杆菌QZ20细胞中。培养物平板接种在具有10ug/mL氯霉素的LB琼脂糖平板上，用于在电穿孔后选择阳性转化体。一些菌落用于通过PCR使用基因组特异性引物argP_seq_F和argP_seq_R(见表1)筛选标记物盒的整合。PCR证实的克隆用于第二次Red/ET重组，以argP SNP盒替换cat-sacB标记盒。将培养物平板接种在具有6％蔗糖没有NaCl的LB琼脂糖平板上用于选择电穿孔后的阳性转化体。用基因组特异性引物argP_seq_F和argP_seq_R(见表1)测试一些克隆的cat-sacB标记物盒的丧失。还通过测序(Genewiz)证实了至少一个产生正确大小的PCR产物的克隆。热敏感性重组质粒pRedET(amp)在LB平板上42C下从菌株熟化后在生物反应器中测试该菌株。将导致ArgPA96E突变的SNP引入菌株大肠杆菌QZ20中。所得的菌株被命名为QZ48。
与大肠杆菌QZ48相比大肠杆菌QZ20的发酵试验
在实验室级别的生物反应器中在发酵期间测试大肠杆菌菌株QZ48的性能。与大肠杆菌菌株QZ20相比监测细胞生长和丙氨酸形成。
在具有LB培养基的20％填充体积的摇瓶中，37C和200rpm下过夜培养预培养物。发酵在DASGIP 1.5L平行生物反应器系统(Eppendorf)中500mL AM 1培养基(2.6g/L(NH4)2HPO4,0.87g/L NH4H2PO4,0.15g/L Kill,0.37g/L MgSO4·7H2O,15g/L(NH4)2SO4,1mM甜菜碱,1ml/L微量金属储存液)中进行。微量金属储存液包含1.6g/L FeCL3·6H2O；0.2g/LCoCl2·6H2O；0.1g/L CuCl2·2H2O；0.2g/L ZnCl2；0.2g/L NaMoO4·2H2O；0.05g/LH3BO3,0.1M HCL。将葡萄糖用作发酵培养基中的碳源。将等同于7的OD600·mL的大肠杆菌细胞通过离心收获并重悬浮在5mL AM 1培养基中。#OD600·mL＝(OD600未稀释的培养物)x(mL表示的培养物体积)。5mL重悬浮的细胞用于接种1.5L DASGIP生物反应器中的500mL发酵培养基。每个菌株以一式两份在37C和400rpm搅拌器速度下运行。5N NH4OH用于控制pH到6.8并在整个发酵中为培养物提供铵盐作为丙氨酸前体。在发酵期间没有喷射空气并且不对容器加压从而在细胞对培养基中溶解氧的最初消耗后，发酵在微氧条件下运行。整个发酵中取出样品并通过HPLC分析丙氨酸和葡萄糖浓度。
QZ48中的ArgP A96E突变对丙氨酸形成有强烈影响(图7)。在46小时后的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)为1.15±0.06g/(Lh)，所述生产力定义为所产生的产物的量除以反应器体积和时间。在46小时后大肠杆菌QZ48显示出1.51±0.01g/(Lh)的增加的体积丙氨酸生产力(图8)。
pACYC184-argP质粒的构建
为了测试argP过表达的影响，通过商业InFusion克隆技术(Clontech,MountainView,CA,USA)构建了质粒pACYC184-argP(p15 ori,CmR,～15个拷贝/细胞)。首先，通过将载体pACYC184(表1)通过NEB(Ipswich,MA,USA)获得并用也来自NEB的HindIII和Sall限制性内切核酸酶线性化。该消化去除了多数四环素抗性基因。用引物argP-pACYC_F和argP-pACYC_R(表1)以Phusion聚合酶(Thermo Scientific,Waltham,MA)通过PCR从野生型大肠杆菌W DNA PCR扩增argP ORF。该引物含有与线性化载体末端同源的额外的15bp突出端以方便无缝克隆。然后根据生产商的方案用纯化的线性化的载体骨架和argP插入片段进行InFusion反应。然后将所得的InFusion产物用于通过电穿孔转化QZ20并在LB氯霉素平板上选择。PCR鉴定阳性克隆，通过DNA测序验证，并用于发酵中用于过表达研究。
QZ20/pACYC184和QZ20/pACYC184-argP之间的发酵比较
在具有LB培养基的20％填充体积的摇瓶中，37C和200rpm下过夜培养预培养物。发酵在DASGIP 1.5L平行生物反应器系统中进行，该系统具有AM1培养基中的14％葡萄糖。所有发酵条件如前述。
argP过表达导致在20小时发酵后加速的丙氨酸形成速率和更高的丙氨酸滴定度(图9)。20小时后QZ20/pACYC-arg的定义为产物量除以反应器体积和时间的体积丙氨酸生产力(空间-时间-产率)为0.69±0.04g/(Lh)，相比具有pACYC184质粒对照的菌株的为0.61±0.02g/(Lh)(图10)。
实施例7证实gcvA/gcvB启动子区中SNP的效果
QZ58和QZ66的菌株构建
用引物gcvA_1_F/R(表1)从载体pQZ11(Genescript)扩增gcvA-cat-sacB盒。用引物gcvA_2_F/R(表1)从菌株QZ23的基因组DNA扩增gcvA/B SNP盒(320bp)。如前述进行Red/ET。用gcvA_seq_F/R测序引物通过菌落PCR测试克隆。将gcvA/B启动子区中的SNP引入大肠杆菌QZ20中并将所得菌株命名为QZ58。将SNP引入QZ48(argP SNP)中并将所得菌株命名为QZ66。
QZ58和QZ66的发酵试验
如前述测试菌株QZ58(gcvA/B启动子SNP)在发酵期间其性能。与菌株QZ20相比监测丙氨酸形成。
gcvA/B启动子SNP对丙氨酸形成具有显著影响，导致46h后较高的丙氨酸形成速率和约76g/L丙氨酸的丙氨酸滴定度，相比QZ20产生约54g/L(图11)。与46小时后QZ20中1.15±0.06g/(Lh)，QZ58的体积丙氨酸生产力为1.66±0.02g/(Lh)(图12)。gcvA/B启动子SNP也被加入QZ48中argP SNP的上方并且在丙氨酸发酵期间与QZ48相比测试了所得的菌株QZ66。在QZ66中argP突变上方的额外的gcvA/B启动子突变导致与QZ48相比更快的丙氨酸形成速率和在46小时后约76g/L的更高的丙氨酸产率，相比在QZ48中约70g/L(图13)。46小时后与QZ48的1.51±0.01g/(Lh)相比，QZ66的体积丙氨酸生产力为1.65±0.08g/(Lh)(图14)。
gcvA和gcvB转录水平的RT-qPCR分析
通过定量逆转录PCR(RT-qPCR)测定gcvA和gcvB的转录水平。来自Biorad的iTaqUniversal One-Step Kit用于基于SYBR Green的一步逆转录(RT)-qPCR反应。从如前述进行的大肠杆菌QZ20和大肠杆菌QZ23的平行分批发酵，在8h,11h和28h采集培养物样品。样品立即用RNAprotect Bacteria Reagent(Qiagen)处理以稳定RNA。用AurumTotal RNA MiniKit(Biorad)根据生产商的手册从样品提取RNA。分离的RNA用无DNA的DNA Removal Kit(lifetechnologies)进一步处理以去除污染性基因组DNA并且在qPCR中降低背景。在λ＝260nm用分光光度法定量RNA。
用RT-qPCR引物(表1)测试100ng大肠杆菌QZ20 RNA的7步10倍稀释系列，对于gcvA基因使用引物gcvA_RT_F/R，对于gcvB调节RNA使用gcvB_RT_F/R，对于编码核糖体16S RNA的rrsA基因，使用特异的rrsA_RT_F和rrsA_RT_R，所述rrsA基因用作qPCR试验期间的参考基因。为每种RT-qPCR引物集合确定导致信号扩增效率90％<E<110％和线性回归因子R2>0.985的RNA稀释物的合适的线性动态范围。测试rrsA作为归一化的内部参考基因的合适性并发现在所有测试的样品中稳定表达(数据未显示)。用CFX96 Touch Real-Time PCRDetection System(Biorad)根据生产商的方案进行RT-qPCR反应。用大肠杆菌QZ208h RNA作为内部校准器根据ΔΔCt方法(Livak and Schmittgen 2001)计算基因表达的相对定量。
qPCR结果证实了在发酵8小时和11小时后指数期期间，与QZ20相比，QZ23中gcvA的过表达。当细胞密度下降时，观察到28小时样品中gcvA的下调(图15A)。在发酵8小时和11小时后指数期期间，与QZ20相比，QZ23中gcvB调节蛋白被下调。当细胞密度下降时，观察到28小时样品中gcvB转录的总体下调(图15B)。
pACYC184-gcvA和pACYC184-gcvB质粒的构建
因为gcvA/B启动子SNP导致gcvA的过表达，需要证实实际上gcvA过表达导致增加的丙氨酸生产力。因此，通过商业InFusion克隆技术(Clontech,Mountain View,CA,USA)构建了质粒pACYC184-gcvA。首先，通过NEB获得载体pACYC184(表1)(Ipswich,MA,USA)并将其用也来自NEB的HindIII和Sall限制性内切核酸酶线性化。该消化去除了多数四环素抗性基因。单独用引物gcvA-pACYC_F和gcvA-pACYC_R(表1)以Phusion聚合酶(ThermoScientific,Waltham,MA)从野生型大肠杆菌W DNA PCR扩增gcvA ORF。类似的，为了测试gcvB过表达的影响，构建了质粒pACYC184-gcvB。用引物gcvB-pACYC_F和gcvB-pACYC_R(表1)PCR扩增了gcvB转录单位。
该引物含有与线性化载体末端同源的额外的15bp突出端以方便无缝克隆。然后根据生产商的方案用纯化的线性化的载体骨架和分别gcvA和gcvB插入片段进行InFusion反应。然后将所得的InFusion产物用于通过电穿孔转化QZ20并在LB氯霉素平板上选择。PCR鉴定阳性克隆，通过DNA测序验证，并用于发酵中用于过表达研究。
QZ20/pACYC184,QZ20/pACYC184-gcvA和QZ20/pACYC-gcvB之间的发酵比较
在具有LB培养基的20％填充体积的摇瓶中，37C和200rpm下过夜培养预培养物。发酵在DASGIP 1.5L平行生物反应器系统中进行，该系统具有AM1培养基中的14％葡萄糖。所有发酵条件如前述。
发酵试验证实了gcvA从质粒pACYC184-gcvA的过表达导致与空的质粒对照相比更高的丙氨酸形成速率和滴定度(图16)。相比，gcvB小调节RNA从质粒pACYC184-gcvB的过表达导致丙氨酸形成速率和滴定度的显著减少。相比具有质粒对照的QZ20的1.18±0.08g/(Lh)，大肠杆菌QZ20/pACYC184-gcvA显示出1.50±0.09g/(Lh)的体积丙氨酸生产力。与质粒对照相比，大肠杆菌QZ20/pACYC184-gcvB显示出0.89±0.01g/(Lh)的减少的体积丙氨酸生产力(图17)。
QZ20 gcvB knock-out QZ71的菌株构建
由于调节性RNA gcvB从质粒pACYC184-gcvB的过表达导致显著减少的丙氨酸生产力，gcvB在QZ20中敲除并测试性能。该gcvB-cat-sacB盒从载体pQZ11(Genescript)用引物gcvB_1_F/R(表1)扩增。该gcvB缺失盒(400bp)被预订为来自IDT的dsDNA gBlock(SEQ IDNO：98)。如先前所述进行Red/ET。克隆通过菌落PCR用gcvB_seq_F/R测序引物进行测试。该gcvB缺失被引入到大肠杆菌QZ20，所得菌株命名为QZ71。
QZ71的发酵试验
如前所述测试菌株QZ71(gcvB knock-out)在发酵过程中的性能。与菌株QZ20比较监测丙氨酸形成。
从QZ20缺失gcvB调节性RNA导致相比QZ20丙氨酸滴度略有增加(图18)。46小时后QZ71的体积丙氨酸生产力是1.28±0.05g/(Lh)，相比QZ20的是1.15±0.06g/(Lh)(图19)。
实施例8确认在brnQ基因中缺失(Δ667-764)的影响
BrnQ是推定的439AA支链氨基酸转运蛋白，其转运亮氨酸，缬氨酸和异亮氨酸到细胞中作为钠/支链氨基酸共输送体。在QZ23中鉴定了97bp缺失(Δ667-764)，其导致可读框偏移。而439AA蛋白的前222个氨基酸是未改变的，31个AA由于移码被改变并且残留C末端链由于发生终止密码子被截断。因为认为在QZ23中brnQ基因中发现的97bp的部分缺失导致废除的BrnQ活性，除了部分brnQ缺失外，还测试了所述brnQ基因的完全缺失(敲除)。
QZ57和QZ69的菌株构建
从载体pQZ11(Genescript)用引物brnQ_1_F/R(表1)扩增brnQ-cat-sacB盒。从菌株QZ23的基因组DNA用引物brnQ_2_F/R(表1)扩增所述brnQ部分缺失盒(462bp)。该brnQ KO盒(500bp)从IDT预订为dsDNA gBlock(SEQ ID NO:117)。如先前所述进行Red/ET。通过菌落PCR用brnQ_seq_F/R测序引物测试克隆。将该brnQ部分缺失引入大肠杆菌QZ20，所得菌株命名为QZ57。将所述brnQ完全缺失引入到大肠杆菌QZ20，所得菌株命名为QZ69。
QZ57和QZ69的发酵试验
如前述测试菌株QZ57(brnQΔ667-764)和QZ69(brnQ KO)在发酵过程中的性能。与菌株QZ20比较监测丙氨酸形成。
QZ57中97bpbrnQ缺失和完整brnQ敲除相当地进行。两者均导致比QZ20更高的丙氨酸形成和丙氨酸滴度(图20)。在46小时后QZ57的体积丙氨酸生产力为1.30±0.04g/(Lh)并且QZ69的生产力为1.28g/(Lh)，相比QZ20中为1.15±0.06g/(Lh)(图21)。
实施例9确认在lpxD基因中SNP的影响
在QZ23中在lpxD基因中监测到一个SNP，其导致所编码的酶的A15T突变。由LpxD编码的UDP-3-O-(3-羟基肉豆蔻酰基)葡糖胺-N-乙酰转移酶是参与脂质A的生物合成的必需酶。脂质A是大肠杆菌外膜脂多糖(LPS)的组成部分。
QZ56和QZ70的菌株构建
从载体pQZ11(Genescript)用引物lpxD_1C_F/R(表1)扩增lpxD-cat-sacB盒。从菌株QZ23的基因组DNA用引物lpxD_fix_F/R(表1)扩增lpxD SNP盒(2588bp)。如先前所述进行Red/ET。克隆通过菌落PCR用lpxD_flank_F/R测序引物进行测试。将该lpxD SNP引入大肠杆菌QZ20，所得菌株命名为QZ56。该lpxD SNP也引入QZ68(argP SNP,gcvA/B启动子SNP,brnQΔ667-764)并且所得菌株命名为QZ70。
QZ56和QZ70的发酵试验
如前所述测试菌株QZ56(lpxD SNP)在发酵期间的性能。与菌株QZ20相比监测丙氨酸形成。在QZ56中的LpxD A15T突变导致相比QZ20增加的丙氨酸滴度(图22)。在46小时后QZ56的体积丙氨酸生产力是1.34±0.06g/(Lh)，相比QZ20中为1.15±0.06g/(Lh)(图23)。
该lpxD SNP也被导入QZ68(argP SNP,gcvA/B启动子SNP,brnQΔ667-764)，在丙氨酸发酵期间相比QZ68测试所得菌株QZ70。该LpxD A15T突变对丙氨酸形成有强烈的影响。QZ68和QZ70之间丙氨酸形成速度是相当的，然而QZ68的丙氨酸滴度稳定在约75g/L，而丙氨酸形成在QZ70中持续直到培养基中的所有葡萄糖被消耗并且在约37小时后达到102g/L的丙氨酸滴度(图24)。在46小时后QZ70的体积丙氨酸生产力是2.24±0.002g/(Lh)，相比QZ68中为1.64±0.03g/(Lh)(图25)。
序列表
<110> 巴斯夫欧洲公司
<120> 用于精细化学品的改进生产的重组微生物
<130> PN 212964
<150> US 61/915517
<151> 2013-12-13
<150> US 61/915527
<151> 2013-12-13
<150> US 61/915518
<151> 2013-12-13
<150> US 61/915534
<151> 2013-12-13
<150> EP 13197432.1
<151> 2013-12-16
<160> 117
<170> According WIPO Sd. 25
<210> 1
<211> 1320
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> brnQ
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<220>
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Thr Phe Ala Leu Phe Val Gly Ala Gly Asn Ile Ile Phe Pro Pro Met
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Val Gly Leu Gln Ala Gly Glu His Val Trp Thr Ala Ala Phe Gly Phe
35 40 45
Leu Ile Thr Ala Val Gly Leu Pro Val Leu Thr Val Val Ala Leu Ala
50 55 60
Lys Val Gly Gly Gly Val Asp Ser Leu Ser Thr Pro Ile Gly Lys Val
65 70 75 80
Ala Gly Val Leu Leu Ala Thr Val Cys Tyr Leu Ala Val Gly Pro Leu
85 90 95
Phe Ala Thr Pro Arg Thr Ala Thr Val Ser Phe Glu Val Gly Ile Ala
100 105 110
Pro Leu Thr Gly Asp Ser Ala Leu Pro Leu Phe Ile Tyr Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Phe Ala Ile Val Ile Leu Val Ser Leu Tyr Pro Gly Lys Leu Leu
130 135 140
Asp Thr Val Gly Asn Phe Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ile Ala Leu Val
145 150 155 160
Ile Leu Ser Val Ala Ala Ile Val Trp Pro Ala Gly Ser Ile Ser Thr
165 170 175
Ala Thr Glu Ala Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Ser Asn Gly Phe Val Asn
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Gly Tyr Leu Thr Met Asp Thr Leu Gly Ala Met Val Phe Gly Ile Val
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Ile Val Asn Ala Ala Arg Ser Arg Gly Val Thr Glu Ala Arg Leu Leu
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Thr Arg Tyr Thr Val Trp Ala Gly Leu Met Ala Gly Val Gly Leu Thr
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Leu Leu Tyr Leu Ala Leu Phe Arg Leu Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu
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Val Asp Gln Ser Ala Asn Gly Ala Ala Ile Leu His Ala Tyr Val Gln
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His Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Phe Leu Leu Ala Ala Leu Ile Phe
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Phe Phe Ala Gln Tyr Val Pro Leu Ser Tyr Arg Thr Leu Val Phe Ile
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Leu Gly Gly Phe Ser Met Val Val Ser Asn Leu Gly Leu Ser Gln Leu
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Ile Gln Ile Ser Val Pro Val Leu Thr Ala Ile Tyr Pro Pro Cys Ile
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Arg Val Ile Ala Pro Pro Met Phe Ile Ser Leu Leu Phe Gly Ile Leu
370 375 380
Asp Gly Ile Lys Ala Ser Ala Phe Ser Asp Ile Leu Pro Ser Trp Ala
385 390 395 400
Gln Arg Leu Pro Leu Ala Glu Gln Gly Leu Ala Trp Leu Met Pro Thr
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Val Val Met Val Val Leu Ala Ile Ile Trp Asp Arg Ala Ala Gly Arg
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Gln Val Thr Ser Ser Ala His
435
<210> 3
<211> 1223
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> brnQ Mut
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195 200 205
Glu Asn Gly Val Asn Leu Glu Gln Thr Ile Arg Leu Arg Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Glu Gln His Arg Ala Leu Gly Gln Met Lys Glu Met Ala Ala Lys
225 230 235 240
Tyr Gly Tyr Asp Ile Ser Gly Pro Ala Thr Asn Ala Gln Glu Ala Ile
245 250 255
Gln Trp Thr Tyr Phe Gly Tyr Leu Ala Ala Val Lys Ser Gln Asn Gly
260 265 270
Ala Ala Met Ser Phe Gly Arg Thr Ser Thr Phe Leu Asp Val Tyr Ile
275 280 285
Glu Arg Asp Leu Lys Ala Gly Lys Ile Thr Glu Gln Glu Ala Gln Glu
290 295 300
Met Val Asp His Leu Val Met Lys Leu Arg Met Val Arg Phe Leu Arg
305 310 315 320
Thr Pro Glu Tyr Asp Glu Leu Phe Ser Gly Asp Pro Ile Trp Ala Thr
325 330 335
Glu Ser Ile Gly Gly Met Gly Leu Asp Gly Arg Thr Leu Val Thr Lys
340 345 350
Asn Ser Phe Arg Phe Leu Asn Thr Leu Tyr Thr Met Gly Pro Ser Pro
355 360 365
Glu Pro Asn Met Thr Ile Leu Trp Ser Glu Lys Leu Pro Leu Asn Phe
370 375 380
Lys Lys Phe Ala Ala Lys Val Ser Ile Asp Thr Ser Ser Leu Gln Tyr
385 390 395 400
Glu Asn Asp Asp Leu Met Arg Pro Asp Phe Asn Asn Asp Asp Tyr Ala
405 410 415
Ile Ala Cys Cys Val Ser Pro Met Ile Val Gly Lys Gln Met Gln Phe
420 425 430
Phe Gly Ala Arg Ala Asn Leu Ala Lys Thr Met Leu Tyr Ala Ile Asn
435 440 445
Gly Gly Val Asp Glu Lys Leu Lys Met Gln Val Gly Pro Lys Ser Glu
450 455 460
Pro Ile Lys Gly Asp Val Leu Asn Tyr Asp Glu Val Met Glu Arg Met
465 470 475 480
Asp His Phe Met Asp Trp Leu Ala Lys Gln Tyr Ile Thr Ala Leu Asn
485 490 495
Ile Ile His Tyr Met His Asp Lys Tyr Ser Tyr Glu Ala Ser Leu Met
500 505 510
Ala Leu His Asp Arg Asp Val Ile Arg Thr Met Ala Cys Gly Ile Ala
515 520 525
Gly Leu Ser Val Ala Ala Asp Ser Leu Ser Ala Ile Lys Tyr Ala Lys
530 535 540
Val Lys Pro Ile Arg Asp Glu Asp Gly Leu Ala Ile Asp Phe Glu Ile
545 550 555 560
Glu Gly Glu Tyr Pro Gln Phe Gly Asn Asn Asp Pro Arg Val Asp Asp
565 570 575
Leu Ala Val Asp Leu Val Glu Arg Phe Met Lys Lys Ile Gln Lys Leu
580 585 590
His Thr Tyr Arg Asp Ala Ile Pro Thr Gln Ser Val Leu Thr Ile Thr
595 600 605
Ser Asn Val Val Tyr Gly Lys Lys Thr Gly Asn Thr Pro Asp Gly Arg
610 615 620
Arg Ala Gly Ala Pro Phe Gly Pro Gly Ala Asn Pro Met His Gly Arg
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Asp Gln Lys Gly Ala Val Ala Ser Leu Thr Ser Val Ala Lys Leu Pro
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Phe Ala Tyr Ala Lys Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Phe Ser Ile Val Pro
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Asn Ala Leu Gly Lys Asp Asp Glu Val Arg Lys Thr Asn Leu Ala Gly
675 680 685
Leu Met Asp Gly Tyr Phe His His Glu Ala Ser Ile Glu Gly Gly Gln
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Ala Val Arg Phe Asn Ser Leu Thr Lys Glu Gln Gln Gln Asp Val Ile
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Thr Arg Thr Phe Thr Gln Ser Met
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<211> 2676
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> adhE
<400> 7
atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag 60
cgtgaatatg ccagtttcac tcaagagcaa gtagacaaaa tcttccgcgc cgccgctctg 120
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<213> 大肠杆菌
<220>
<223> adhE
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Asp Asn Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Val Val Val Val Asp
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Ser Val Tyr Asp Ala Val Arg Glu Arg Phe Ala Thr His Gly Gly Tyr
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275 280 285
Asn Gly Ala Leu Asn Ala Ala Ile Val Gly Gln Pro Ala Tyr Lys Ile
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Gly Glu Val Thr Val Val Asp Glu Ser Glu Pro Phe Ala His Glu Lys
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Val Glu Lys Ala Glu Lys Leu Val Ala Met Gly Gly Ile Gly His Thr
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Phe Gly Gln Lys Met Lys Thr Ala Arg Ile Leu Ile Asn Thr Pro Ala
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Ser Gln Gly Gly Ile Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Lys Leu Ala Pro Ser
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450 455 460
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Arg Ala Leu Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Phe Asn Asn Gly Tyr Ala
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His Ala Met Glu Ala Tyr Val Ser Val Leu Ala Ser Glu Phe Ser Asp
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Gly Gln Ala Leu Gln Ala Leu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Leu Pro Ala
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Ser Tyr His Glu Gly Ser Lys Asn Pro Val Ala Arg Glu Arg Val His
690 695 700
Ser Ala Ala Thr Ile Ala Gly Ile Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> ldhA
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<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> ldhA
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Leu Leu Thr Glu Lys Thr Ala Lys Thr Ala Asn Gly Cys Glu Ala Val
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Lys Lys His Gly Val Lys Tyr Ile Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn
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Arg Ile Leu Lys Gly Phe Gly Met Arg Leu Leu Ala Phe Asp Pro Tyr
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Gln Ala Ala Ile Glu Ala Leu Lys Asn Gln Lys Ile Gly Ser Leu Gly
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<213> 大肠杆菌
<220>
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<220>
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Asp Asp His Glu Arg Ile Glu Lys Val Gln Glu Tyr Val Ala Asn Tyr
355 360 365
Ile Asn Ala Asp Trp Ile Glu Ser Leu Thr Ala Thr Ser Glu Arg Ser
370 375 380
Arg Arg Leu Ser Pro Pro Ala Phe Arg Tyr Gln Leu Thr Glu Leu Ala
385 390 395 400
Arg Lys Ala Gly Lys Arg Ile Val Leu Pro Glu Gly Asp Glu Pro Arg
405 410 415
Thr Val Lys Ala Ala Ala Ile Cys Ala Glu Arg Gly Ile Ala Thr Cys
420 425 430
Val Leu Leu Gly Asn Pro Ala Glu Ile Asn Arg Val Ala Ala Ser Gln
435 440 445
Gly Val Glu Leu Gly Ala Gly Ile Glu Ile Val Asp Pro Glu Val Val
450 455 460
Arg Glu Ser Tyr Val Gly Arg Leu Val Glu Leu Arg Lys Asn Lys Gly
465 470 475 480
Met Thr Glu Thr Val Ala Arg Glu Gln Leu Glu Asp Asn Val Val Leu
485 490 495
Gly Thr Leu Met Leu Glu Gln Asp Glu Val Asp Gly Leu Val Ser Gly
500 505 510
Ala Val His Thr Thr Ala Asn Thr Ile Arg Pro Pro Leu Gln Leu Ile
515 520 525
Lys Thr Ala Pro Gly Ser Ser Leu Val Ser Ser Val Phe Phe Met Leu
530 535 540
Leu Pro Glu Gln Val Tyr Val Tyr Gly Asp Cys Ala Ile Asn Pro Asp
545 550 555 560
Pro Thr Ala Glu Gln Leu Ala Glu Ile Ala Ile Gln Ser Ala Asp Ser
565 570 575
Ala Ala Ala Phe Gly Ile Glu Pro Arg Val Ala Met Leu Ser Tyr Ser
580 585 590
Thr Gly Thr Ser Gly Ala Gly Ser Asp Val Glu Lys Val Arg Glu Ala
595 600 605
Thr Arg Leu Ala Gln Glu Lys Arg Pro Asp Leu Met Ile Asp Gly Pro
610 615 620
Leu Gln Tyr Asp Ala Ala Val Met Ala Asp Val Ala Lys Ser Lys Ala
625 630 635 640
Pro Asn Ser Pro Val Ala Gly Arg Ala Thr Val Phe Ile Phe Pro Asp
645 650 655
Leu Asn Thr Gly Asn Thr Thr Tyr Lys Ala Val Gln Arg Ser Ala Asp
660 665 670
Leu Ile Ser Ile Gly Pro Met Leu Gln Gly Met Arg Lys Pro Val Asn
675 680 685
Asp Leu Ser Arg Gly Ala Leu Val Asp Asp Ile Val Tyr Thr Ile Ala
690 695 700
Leu Thr Ala Ile Gln Ser Ala Gln Gln Gln
705 710
<210> 13
<211> 1809
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> frdA
<400> 13
gtgcaaacct ttcaagccga tcttgccatt gtaggcgccg gtggcgcggg attacgtgct 60
gcaattgctg ccgcgcaggc aaatccgaat gcaaaaatcg cactaatctc aaaagtatac 120
ccgatgcgta gccataccgt tgctgcagaa gggggctccg ccgctgtcgc gcaggatcat 180
gacagcttcg aatatcactt tcacgataca gtagcgggtg gcgactggtt gtgtgagcag 240
gatgtcgtgg attatttcgt ccaccactgc ccaaccgaaa tgacccaact ggaactgtgg 300
ggatgcccat ggagccgtcg cccggatggt agcgtcaacg tacgtcgctt cggcggcatg 360
aaaatcgagc gcacctggtt cgccgccgat aagaccggct tccatatgct gcacacgctg 420
ttccagacct ctctgcaatt cccgcagatc cagcgttttg acgaacattt cgtgctggat 480
attctggttg atgatggtca tgttcgcggc ctggtagcaa tgaacatgat ggaaggcacg 540
ctggtgcaga tccgtgctaa cgcggtcgtt atggctactg gcggtgcggg tcgcgtttat 600
cgttacaaca ccaacggcgg catcgttacc ggtgacggta tgggtatggc gctaagccac 660
ggcgttccgc tgcgtgacat ggaattcgtt cagtatcacc caaccggtct gccaggttcc 720
ggtatcctga tgaccgaagg ctgccgcggt gaaggcggta ttctggtcaa caaaaatggc 780
taccgttatc tgcaagatta cggcatgggc ccggaaactc cgctgggcga gccgaaaaac 840
aaatatatgg aactgggtcc acgcgacaaa gtttctcagg ccttctggca cgaatggcgt 900
aaaggcaaca ccatctccac gccgcgtggc gatgtggttt atctcgacct gcgtcacctc 960
ggcgagaaaa aactgcatga acgtctgccg ttcatctgcg aactggcgaa agcgtacgtt 1020
ggcgtcgatc cggttaaaga accgattccg gtacgtccga ccgcacacta caccatgggc 1080
ggtatcgaaa ccgatcagaa ctgtgaaacc cgcattaaag gtctgttcgc cgtgggtgaa 1140
tgttcctctg ttggtctgca cggtgcaaac cgtctgggtt ctaactccct ggcggaactg 1200
gtggtcttcg gccgtctggc cggtgaacaa gcgacagagc gtgcagcaac tgccggtaat 1260
ggcaacgaag cggcaattga agcgcaggca gctggcgttg aacaacgtct gaaagatctg 1320
gttaaccagg atggcggcga aaactgggcg aagatccgcg acgaaatggg cctggcaatg 1380
gaagaaggtt gcggtatcta ccgtacgccg gaactgatgc agaaaaccat cgacaagctg 1440
gcagagctgc aggaacgctt caagcgcgtg cgcatcaccg acacctccag cgtgttcaac 1500
accgacctgc tctacaccat tgaactgggc cacggtctga acgttgctga atgtatggcg 1560
cactccgcaa tggcacgtaa agagtcccgc ggcgcacacc agcgtctgga cgaaggttgc 1620
accgagcgtg acgacgtcaa cttcctcaaa cacaccctcg ccttccgcga tgctgatggc 1680
acgactcgcc tggagtacag cgacgtgaag attactacgc tgccgccagc taaacgcgtt 1740
tacggtggcg aagcggatgc agccgataag gcggaagcag ccaataagaa ggagaaggcg 1800
aatggctga 1809
<210> 14
<211> 602
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> frdA
<400> 14
Met Gln Thr Phe Gln Ala Asp Leu Ala Ile Val Gly Ala Gly Gly Ala
1 5 10 15
Gly Leu Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Gln Ala Asn Pro Asn Ala Lys
20 25 30
Ile Ala Leu Ile Ser Lys Val Tyr Pro Met Arg Ser His Thr Val Ala
35 40 45
Ala Glu Gly Gly Ser Ala Ala Val Ala Gln Asp His Asp Ser Phe Glu
50 55 60
Tyr His Phe His Asp Thr Val Ala Gly Gly Asp Trp Leu Cys Glu Gln
65 70 75 80
Asp Val Val Asp Tyr Phe Val His His Cys Pro Thr Glu Met Thr Gln
85 90 95
Leu Glu Leu Trp Gly Cys Pro Trp Ser Arg Arg Pro Asp Gly Ser Val
100 105 110
Asn Val Arg Arg Phe Gly Gly Met Lys Ile Glu Arg Thr Trp Phe Ala
115 120 125
Ala Asp Lys Thr Gly Phe His Met Leu His Thr Leu Phe Gln Thr Ser
130 135 140
Leu Gln Phe Pro Gln Ile Gln Arg Phe Asp Glu His Phe Val Leu Asp
145 150 155 160
Ile Leu Val Asp Asp Gly His Val Arg Gly Leu Val Ala Met Asn Met
165 170 175
Met Glu Gly Thr Leu Val Gln Ile Arg Ala Asn Ala Val Val Met Ala
180 185 190
Thr Gly Gly Ala Gly Arg Val Tyr Arg Tyr Asn Thr Asn Gly Gly Ile
195 200 205
Val Thr Gly Asp Gly Met Gly Met Ala Leu Ser His Gly Val Pro Leu
210 215 220
Arg Asp Met Glu Phe Val Gln Tyr His Pro Thr Gly Leu Pro Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ile Leu Met Thr Glu Gly Cys Arg Gly Glu Gly Gly Ile Leu Val
245 250 255
Asn Lys Asn Gly Tyr Arg Tyr Leu Gln Asp Tyr Gly Met Gly Pro Glu
260 265 270
Thr Pro Leu Gly Glu Pro Lys Asn Lys Tyr Met Glu Leu Gly Pro Arg
275 280 285
Asp Lys Val Ser Gln Ala Phe Trp His Glu Trp Arg Lys Gly Asn Thr
290 295 300
Ile Ser Thr Pro Arg Gly Asp Val Val Tyr Leu Asp Leu Arg His Leu
305 310 315 320
Gly Glu Lys Lys Leu His Glu Arg Leu Pro Phe Ile Cys Glu Leu Ala
325 330 335
Lys Ala Tyr Val Gly Val Asp Pro Val Lys Glu Pro Ile Pro Val Arg
340 345 350
Pro Thr Ala His Tyr Thr Met Gly Gly Ile Glu Thr Asp Gln Asn Cys
355 360 365
Glu Thr Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ala Val Gly Glu Cys Ser Ser Val
370 375 380
Gly Leu His Gly Ala Asn Arg Leu Gly Ser Asn Ser Leu Ala Glu Leu
385 390 395 400
Val Val Phe Gly Arg Leu Ala Gly Glu Gln Ala Thr Glu Arg Ala Ala
405 410 415
Thr Ala Gly Asn Gly Asn Glu Ala Ala Ile Glu Ala Gln Ala Ala Gly
420 425 430
Val Glu Gln Arg Leu Lys Asp Leu Val Asn Gln Asp Gly Gly Glu Asn
435 440 445
Trp Ala Lys Ile Arg Asp Glu Met Gly Leu Ala Met Glu Glu Gly Cys
450 455 460
Gly Ile Tyr Arg Thr Pro Glu Leu Met Gln Lys Thr Ile Asp Lys Leu
465 470 475 480
Ala Glu Leu Gln Glu Arg Phe Lys Arg Val Arg Ile Thr Asp Thr Ser
485 490 495
Ser Val Phe Asn Thr Asp Leu Leu Tyr Thr Ile Glu Leu Gly His Gly
500 505 510
Leu Asn Val Ala Glu Cys Met Ala His Ser Ala Met Ala Arg Lys Glu
515 520 525
Ser Arg Gly Ala His Gln Arg Leu Asp Glu Gly Cys Thr Glu Arg Asp
530 535 540
Asp Val Asn Phe Leu Lys His Thr Leu Ala Phe Arg Asp Ala Asp Gly
545 550 555 560
Thr Thr Arg Leu Glu Tyr Ser Asp Val Lys Ile Thr Thr Leu Pro Pro
565 570 575
Ala Lys Arg Val Tyr Gly Gly Glu Ala Asp Ala Ala Asp Lys Ala Glu
580 585 590
Ala Ala Asn Lys Lys Glu Lys Ala Asn Gly
595 600
<210> 15
<211> 1119
<212> DNA
<213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌
<220>
<223> alaD
<400> 15
atgaaaattg gcatccctaa agagattaag aacaatgaaa accgtgtagc aatcaccccg 60
gcaggtgtta tgactctggt taaagcgggc cacgatgtgt acgtcgaaac cgaagcgggt 120
gccggcagcg gcttcagcga cagcgagtat gagaaggcgg gtgcggttat tgtgactaag 180
gcggaggacg cttgggcagc cgaaatggtt ctgaaggtga aagaaccgct ggcggaggag 240
tttcgctatt ttcgtccggg tctgattttg ttcacctacc tgcacctggc tgcggccgag 300
gcgctgacca aggcactggt ggagcagaag gttgttggca tcgcgtacga aacggttcaa 360
ctggcgaatg gttccctgcc gctgctgacc cctatgtctg aagttgcggg tcgcatgagc 420
gttcaagtcg gcgctcagtt tctggagaaa ccgcacggtg gcaagggcat tttgctgggt 480
ggtgttccgg gtgtccgccg tggtaaagtg acgatcattg gcggtggtac ggccggtacg 540
aacgcggcca agattgccgt aggtctgggt gcagatgtga ccattctgga catcaacgcg 600
gaacgtttgc gtgagctgga cgacctgttt ggcgaccaag tcaccaccct gatgagcaac 660
agctaccaca tcgcggagtg cgtccgtgaa agcgatttgg tcgttggtgc ggtgctgatc 720
ccgggtgcaa aagccccgaa actggtgacc gaggagatgg tccgtagcat gaccccgggt 780
tcggttctgg tcgacgtggc aattgaccag ggcggtatct tcgaaaccac cgaccgcgtc 840
acgacccatg atgacccgac ctatgtgaaa catggcgtgg ttcactatgc ggtcgcgaat 900
atgccgggtg cagtgccgcg cacgtccacg ttcgcgctga cgaacgtgac gattccatac 960
gctctgcaga tcgccaataa gggctatcgt gcggcgtgtc tggataatcc ggcattgctg 1020
aaaggcatca ataccctgga tggtcatatc gtttacgagg ctgtggctgc agcacacaac 1080
atgccgtaca ctgatgtcca tagcttgctg caaggctaa 1119
<210> 16
<211> 372
<212> PRT
<213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌
<220>
<223> alaD
<400> 16
Met Lys Ile Gly Ile Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val
1 5 10 15
Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Met Thr Leu Val Lys Ala Gly His Asp
20 25 30
Val Tyr Val Glu Thr Glu Ala Gly Ala Gly Ser Gly Phe Ser Asp Ser
35 40 45
Glu Tyr Glu Lys Ala Gly Ala Val Ile Val Thr Lys Ala Glu Asp Ala
50 55 60
Trp Ala Ala Glu Met Val Leu Lys Val Lys Glu Pro Leu Ala Glu Glu
65 70 75 80
Phe Arg Tyr Phe Arg Pro Gly Leu Ile Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu
85 90 95
Ala Ala Ala Glu Ala Leu Thr Lys Ala Leu Val Glu Gln Lys Val Val
100 105 110
Gly Ile Ala Tyr Glu Thr Val Gln Leu Ala Asn Gly Ser Leu Pro Leu
115 120 125
Leu Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ser Val Gln Val Gly
130 135 140
Ala Gln Phe Leu Glu Lys Pro His Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Gly
145 150 155 160
Gly Val Pro Gly Val Arg Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly
165 170 175
Thr Ala Gly Thr Asn Ala Ala Lys Ile Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp
180 185 190
Val Thr Ile Leu Asp Ile Asn Ala Glu Arg Leu Arg Glu Leu Asp Asp
195 200 205
Leu Phe Gly Asp Gln Val Thr Thr Leu Met Ser Asn Ser Tyr His Ile
210 215 220
Ala Glu Cys Val Arg Glu Ser Asp Leu Val Val Gly Ala Val Leu Ile
225 230 235 240
Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Glu Glu Met Val Arg Ser
245 250 255
Met Thr Pro Gly Ser Val Leu Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly Gly
260 265 270
Ile Phe Glu Thr Thr Asp Arg Val Thr Thr His Asp Asp Pro Thr Tyr
275 280 285
Val Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala
290 295 300
Val Pro Arg Thr Ser Thr Phe Ala Leu Thr Asn Val Thr Ile Pro Tyr
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Ala Leu Gln Ile Ala Asn Lys Gly Tyr Arg Ala Ala Cys Leu Asp Asn
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Pro Ala Leu Leu Lys Gly Ile Asn Thr Leu Asp Gly His Ile Val Tyr
340 345 350
Glu Ala Val Ala Ala Ala His Asn Met Pro Tyr Thr Asp Val His Ser
355 360 365
Leu Leu Gln Gly
370
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-ackA-pta-check1
<400> 17
actgcggtag ttcttcactg 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-ackA-pta-check2
<400> 18
agtacctttc tggtttagcc g 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-ackA-pta-check3
<400> 19
gatagcagaa acggaaccac 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-ackA-pta-check4
<400> 20
ggtgctgttc acactaccgc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-ackA-pta-check5
<400> 21
tgacgagatt actgctgctg 20
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-ackA-pta-check6
<400> 22
atttccggtt cagatatccg c 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-adhE-check1
<400> 23
gggttgacca gcgcaaataa c 21
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-adhE-check2
<400> 24
cagaagtgag taatcttgct tac 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-adhE-check3
<400> 25
gatcacttta tcttcgacga tac 23
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-adhE-check4
<400> 26
gcgaacgtgg ataaactgtc tg 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-adhE-check5
<400> 27
gctcttaagc accgacgttg ac 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-adhE-check6
<400> 28
gtcggctcat taacggctat tc 22
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-frd-check1
<400> 29
gacggatctc cgccataatc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-frd-check2
<400> 30
tcgccacccg ctactgtatc 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-frd-check3
<400> 31
caaagcgttc tgacgaaccg g 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-frd-check4
<400> 32
tgtgcgatgc acaatatcgt tg 22
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-pflB-check1
<400> 33
ttggttgggt tgacatactg g 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-pflB-check2
<400> 34
tgaacttcat cactgataac c 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-pflB-check3
<400> 35
ttcaaaggag tgaatgcgac c 21
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-pflB-check4
<400> 36
gtcgcggtta tgacaataca gg 22
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-ldhA-check1
<400> 37
taccgtgccg acgttcaata ac 22
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-ldhA-check2
<400> 38
catcagcagg cttagcgcaa c 21
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-ldhA-check3
<400> 39
acctttacgc gtaatgcgtg 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-ldhA-check4
<400> 40
accgtttacg ctttccagca c 21
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-csc-check1
<400> 41
cgaattatcg atctcgctca ac 22
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-csc-check2
<400> 42
cgtctatatt gctgaaggta cag 23
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-csc-check3
<400> 43
tcgaaggtcc attcacgcaa c 21
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物P395-csc-check4
<400> 44
gattcccacc gcaacgttag 20
<210> 45
<211> 894
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> argP
<400> 45
atgaaacgcc cggactacag aacattacag gcactggatg cggtgatacg tgaacgagga 60
tttgagcgcg cggcacaaaa gctgtgcatt acacaatcag ccgtctcaca gcgcattaag 120
caactggaaa atatgttcgg gcagccgctg ttggtgcgta ccgtaccgcc gcgcccgacg 180
gaacaagggc aaaaactgct ggcactgctg cgccaggtgg agttgctgga agaagagtgg 240
ctgggcgatg aacaaaccgg ttcgactccg ctgctgcttt cactggcggt caacgccgac 300
agtctggcga cgtggttgct tcctgcactg gctcctgtgt tggctgattc gcctatccgc 360
ctcaacttgc aggtagaaga tgaaacccgc actcaggaac gtctgcgccg cggcgaagtg 420
gtcggcgcgg tgagtattca acatcaggcg ctgccgagtt gtcttgtcga taaacttggt 480
gcgctcgact atctgttcgt cagctcaaaa ccctttgccg aaaaatattt ccctaacggc 540
gtaacgcgtt cggcattact gaaagcgcca gtggtcgcgt ttgaccatct tgacgatatg 600
caccaggcct ttttgcagca aaacttcgat ctgcctccag gcagcgtgcc ctgccatatc 660
gttaattctt cagaagcgtt cgtacaactt gctcgccagg gcaccacctg ctgtatgatc 720
ccgcacctgc aaatcgagaa agaactggcc agcggtgaac tgattgactt aacgccgggg 780
ctatttcaac gccggatgct ctactggcac cgctttgctc ctgaaagccg catgatgcgt 840
aaagtcactg atgcgttgct cgattatggt cacaaagtcc ttcgtcagga ttaa 894
<210> 46
<211> 297
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> argP
<400> 46
Met Lys Arg Pro Asp Tyr Arg Thr Leu Gln Ala Leu Asp Ala Val Ile
1 5 10 15
Arg Glu Arg Gly Phe Glu Arg Ala Ala Gln Lys Leu Cys Ile Thr Gln
20 25 30
Ser Ala Val Ser Gln Arg Ile Lys Gln Leu Glu Asn Met Phe Gly Gln
35 40 45
Pro Leu Leu Val Arg Thr Val Pro Pro Arg Pro Thr Glu Gln Gly Gln
50 55 60
Lys Leu Leu Ala Leu Leu Arg Gln Val Glu Leu Leu Glu Glu Glu Trp
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Leu Gly Asp Glu Gln Thr Gly Ser Thr Pro Leu Leu Leu Ser Leu Ala
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Val Asn Ala Asp Ser Leu Ala Thr Trp Leu Leu Pro Ala Leu Ala Pro
100 105 110
Val Leu Ala Asp Ser Pro Ile Arg Leu Asn Leu Gln Val Glu Asp Glu
115 120 125
Thr Arg Thr Gln Glu Arg Leu Arg Arg Gly Glu Val Val Gly Ala Val
130 135 140
Ser Ile Gln His Gln Ala Leu Pro Ser Cys Leu Val Asp Lys Leu Gly
145 150 155 160
Ala Leu Asp Tyr Leu Phe Val Ser Ser Lys Pro Phe Ala Glu Lys Tyr
165 170 175
Phe Pro Asn Gly Val Thr Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ala Pro Val Val
180 185 190
Ala Phe Asp His Leu Asp Asp Met His Gln Ala Phe Leu Gln Gln Asn
195 200 205
Phe Asp Leu Pro Pro Gly Ser Val Pro Cys His Ile Val Asn Ser Ser
210 215 220
Glu Ala Phe Val Gln Leu Ala Arg Gln Gly Thr Thr Cys Cys Met Ile
225 230 235 240
Pro His Leu Gln Ile Glu Lys Glu Leu Ala Ser Gly Glu Leu Ile Asp
245 250 255
Leu Thr Pro Gly Leu Phe Gln Arg Arg Met Leu Tyr Trp His Arg Phe
260 265 270
Ala Pro Glu Ser Arg Met Met Arg Lys Val Thr Asp Ala Leu Leu Asp
275 280 285
Tyr Gly His Lys Val Leu Arg Gln Asp
290 295
<210> 47
<211> 894
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> argP Mut
<400> 47
atgaaacgcc cggactacag aacattacag gcactggatg cggtgatacg tgaacgagga 60
tttgagcgcg cggcacaaaa gctgtgcatt acacaatcag ccgtctcaca gcgcattaag 120
caactggaaa atatgttcgg gcagccgctg ttggtgcgta ccgtaccgcc gcgcccgacg 180
gaacaagggc aaaaactgct ggcactgctg cgccaggtgg agttgctgga agaagagtgg 240
ctgggcgatg aacaaaccgg ttcgactccg ctgctgcttt cactggaggt caacgccgac 300
agtctggcga cgtggttgct tcctgcactg gctcctgtgt tggctgattc gcctatccgc 360
ctcaacttgc aggtagaaga tgaaacccgc actcaggaac gtctgcgccg cggcgaagtg 420
gtcggcgcgg tgagtattca acatcaggcg ctgccgagtt gtcttgtcga taaacttggt 480
gcgctcgact atctgttcgt cagctcaaaa ccctttgccg aaaaatattt ccctaacggc 540
gtaacgcgtt cggcattact gaaagcgcca gtggtcgcgt ttgaccatct tgacgatatg 600
caccaggcct ttttgcagca aaacttcgat ctgcctccag gcagcgtgcc ctgccatatc 660
gttaattctt cagaagcgtt cgtacaactt gctcgccagg gcaccacctg ctgtatgatc 720
ccgcacctgc aaatcgagaa agaactggcc agcggtgaac tgattgactt aacgccgggg 780
ctatttcaac gccggatgct ctactggcac cgctttgctc ctgaaagccg catgatgcgt 840
aaagtcactg atgcgttgct cgattatggt cacaaagtcc ttcgtcagga ttaa 894
<210> 48
<211> 297
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> argP Mut
<400> 48
Met Lys Arg Pro Asp Tyr Arg Thr Leu Gln Ala Leu Asp Ala Val Ile
1 5 10 15
Arg Glu Arg Gly Phe Glu Arg Ala Ala Gln Lys Leu Cys Ile Thr Gln
20 25 30
Ser Ala Val Ser Gln Arg Ile Lys Gln Leu Glu Asn Met Phe Gly Gln
35 40 45
Pro Leu Leu Val Arg Thr Val Pro Pro Arg Pro Thr Glu Gln Gly Gln
50 55 60
Lys Leu Leu Ala Leu Leu Arg Gln Val Glu Leu Leu Glu Glu Glu Trp
65 70 75 80
Leu Gly Asp Glu Gln Thr Gly Ser Thr Pro Leu Leu Leu Ser Leu Glu
85 90 95
Val Asn Ala Asp Ser Leu Ala Thr Trp Leu Leu Pro Ala Leu Ala Pro
100 105 110
Val Leu Ala Asp Ser Pro Ile Arg Leu Asn Leu Gln Val Glu Asp Glu
115 120 125
Thr Arg Thr Gln Glu Arg Leu Arg Arg Gly Glu Val Val Gly Ala Val
130 135 140
Ser Ile Gln His Gln Ala Leu Pro Ser Cys Leu Val Asp Lys Leu Gly
145 150 155 160
Ala Leu Asp Tyr Leu Phe Val Ser Ser Lys Pro Phe Ala Glu Lys Tyr
165 170 175
Phe Pro Asn Gly Val Thr Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ala Pro Val Val
180 185 190
Ala Phe Asp His Leu Asp Asp Met His Gln Ala Phe Leu Gln Gln Asn
195 200 205
Phe Asp Leu Pro Pro Gly Ser Val Pro Cys His Ile Val Asn Ser Ser
210 215 220
Glu Ala Phe Val Gln Leu Ala Arg Gln Gly Thr Thr Cys Cys Met Ile
225 230 235 240
Pro His Leu Gln Ile Glu Lys Glu Leu Ala Ser Gly Glu Leu Ile Asp
245 250 255
Leu Thr Pro Gly Leu Phe Gln Arg Arg Met Leu Tyr Trp His Arg Phe
260 265 270
Ala Pro Glu Ser Arg Met Met Arg Lys Val Thr Asp Ala Leu Leu Asp
275 280 285
Tyr Gly His Lys Val Leu Arg Gln Asp
290 295
<210> 49
<211> 1026
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> lpxD
<400> 49
atgccttcaa ttcgactggc tgatttagcg cagcagttgg atgcagaact acacggtgat 60
ggcgatatcg tcatcaccgg cgttgcgtcc atgcaatctg cacaaacagg tcacattacg 120
ttcatggtta acccaaaata ccgtgagcat ttaggcttgt gccaggcgtc cgcggttgtc 180
atgacccagg acgatcttcc tttcgcgaaa agtgccgcgc tggtagtgaa gaatccctac 240
ctgacttacg cgcgcatggc gcaaatttta gataccacgc cgcagcccgc gcagaacatt 300
gcacccagtg cggtgatcga cgcgacggcg aagctgggta acaacgtatc gattggcgct 360
aacgcggtga ttgagtccgg cgttgaactg ggcgataacg tgattatcgg tgccggttgc 420
ttcgtaggta aaaacagcaa aatcggtgca ggttcgcgtc tctgggcgaa cgtaaccatt 480
taccatgaga tccagatcgg tcagaattgc ctgatccagt ccggaacagt ggtaggcgca 540
gacggctttg gttatgccaa cgatcgtggt aactgggtga agatcccaca gattggtcgc 600
gtaattattg gcgatcgcgt ggagatcggt gcctgcacaa ccatcgatcg cggcgcgctg 660
gatgacacta ttattggcaa tggcgtgatc attgataacc agtgccagat tgcacataac 720
gtcgtgattg gcgacaatac ggcggttgcc ggtggcgtca ttatggcggg cagcctgaaa 780
attggtcgtt actgcatgat cggcggagcc agcgtaatca acgggcatat ggaaatatgc 840
gacaaagtga cggttacggg catgggtatg gtgatgcgtc ccatcactga accaggcgtc 900
tattcctcag gcattccgct gcaacccaac aaagtctggc gcaaaaccgc tgcactggtg 960
atgaacattg atgacatgag caagcgtctg aaatcgcttg agcgcaaggt taatcaacaa 1020
gactaa 1026
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<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> lpxD
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Met Pro Ser Ile Arg Leu Ala Asp Leu Ala Gln Gln Leu Asp Ala Glu
1 5 10 15
Leu His Gly Asp Gly Asp Ile Val Ile Thr Gly Val Ala Ser Met Gln
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Ser Ala Gln Thr Gly His Ile Thr Phe Met Val Asn Pro Lys Tyr Arg
35 40 45
Glu His Leu Gly Leu Cys Gln Ala Ser Ala Val Val Met Thr Gln Asp
50 55 60
Asp Leu Pro Phe Ala Lys Ser Ala Ala Leu Val Val Lys Asn Pro Tyr
65 70 75 80
Leu Thr Tyr Ala Arg Met Ala Gln Ile Leu Asp Thr Thr Pro Gln Pro
85 90 95
Ala Gln Asn Ile Ala Pro Ser Ala Val Ile Asp Ala Thr Ala Lys Leu
100 105 110
Gly Asn Asn Val Ser Ile Gly Ala Asn Ala Val Ile Glu Ser Gly Val
115 120 125
Glu Leu Gly Asp Asn Val Ile Ile Gly Ala Gly Cys Phe Val Gly Lys
130 135 140
Asn Ser Lys Ile Gly Ala Gly Ser Arg Leu Trp Ala Asn Val Thr Ile
145 150 155 160
Tyr His Glu Ile Gln Ile Gly Gln Asn Cys Leu Ile Gln Ser Gly Thr
165 170 175
Val Val Gly Ala Asp Gly Phe Gly Tyr Ala Asn Asp Arg Gly Asn Trp
180 185 190
Val Lys Ile Pro Gln Ile Gly Arg Val Ile Ile Gly Asp Arg Val Glu
195 200 205
Ile Gly Ala Cys Thr Thr Ile Asp Arg Gly Ala Leu Asp Asp Thr Ile
210 215 220
Ile Gly Asn Gly Val Ile Ile Asp Asn Gln Cys Gln Ile Ala His Asn
225 230 235 240
Val Val Ile Gly Asp Asn Thr Ala Val Ala Gly Gly Val Ile Met Ala
245 250 255
Gly Ser Leu Lys Ile Gly Arg Tyr Cys Met Ile Gly Gly Ala Ser Val
260 265 270
Ile Asn Gly His Met Glu Ile Cys Asp Lys Val Thr Val Thr Gly Met
275 280 285
Gly Met Val Met Arg Pro Ile Thr Glu Pro Gly Val Tyr Ser Ser Gly
290 295 300
Ile Pro Leu Gln Pro Asn Lys Val Trp Arg Lys Thr Ala Ala Leu Val
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Met Asn Ile Asp Asp Met Ser Lys Arg Leu Lys Ser Leu Glu Arg Lys
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Val Asn Gln Gln Asp
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> lpxD Mut
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atgccttcaa ttcgactggc tgatttagcg cagcagttgg atacagaact acacggtgat 60
ggcgatatcg tcatcaccgg cgttgcgtcc atgcaatctg cacaaacagg tcacattacg 120
ttcatggtta acccaaaata ccgtgagcat ttaggcttgt gccaggcgtc cgcggttgtc 180
atgacccagg acgatcttcc tttcgcgaaa agtgccgcgc tggtagtgaa gaatccctac 240
ctgacttacg cgcgcatggc gcaaatttta gataccacgc cgcagcccgc gcagaacatt 300
gcacccagtg cggtgatcga cgcgacggcg aagctgggta acaacgtatc gattggcgct 360
aacgcggtga ttgagtccgg cgttgaactg ggcgataacg tgattatcgg tgccggttgc 420
ttcgtaggta aaaacagcaa aatcggtgca ggttcgcgtc tctgggcgaa cgtaaccatt 480
taccatgaga tccagatcgg tcagaattgc ctgatccagt ccggaacagt ggtaggcgca 540
gacggctttg gttatgccaa cgatcgtggt aactgggtga agatcccaca gattggtcgc 600
gtaattattg gcgatcgcgt ggagatcggt gcctgcacaa ccatcgatcg cggcgcgctg 660
gatgacacta ttattggcaa tggcgtgatc attgataacc agtgccagat tgcacataac 720
gtcgtgattg gcgacaatac ggcggttgcc ggtggcgtca ttatggcggg cagcctgaaa 780
attggtcgtt actgcatgat cggcggagcc agcgtaatca acgggcatat ggaaatatgc 840
gacaaagtga cggttacggg catgggtatg gtgatgcgtc ccatcactga accaggcgtc 900
tattcctcag gcattccgct gcaacccaac aaagtctggc gcaaaaccgc tgcactggtg 960
atgaacattg atgacatgag caagcgtctg aaatcgcttg agcgcaaggt taatcaacaa 1020
gactaa 1026
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<211> 341
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> lpxD Mut
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Met Pro Ser Ile Arg Leu Ala Asp Leu Ala Gln Gln Leu Asp Thr Glu
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Leu His Gly Asp Gly Asp Ile Val Ile Thr Gly Val Ala Ser Met Gln
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Ser Ala Gln Thr Gly His Ile Thr Phe Met Val Asn Pro Lys Tyr Arg
35 40 45
Glu His Leu Gly Leu Cys Gln Ala Ser Ala Val Val Met Thr Gln Asp
50 55 60
Asp Leu Pro Phe Ala Lys Ser Ala Ala Leu Val Val Lys Asn Pro Tyr
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Leu Thr Tyr Ala Arg Met Ala Gln Ile Leu Asp Thr Thr Pro Gln Pro
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Gly Asn Asn Val Ser Ile Gly Ala Asn Ala Val Ile Glu Ser Gly Val
115 120 125
Glu Leu Gly Asp Asn Val Ile Ile Gly Ala Gly Cys Phe Val Gly Lys
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Tyr His Glu Ile Gln Ile Gly Gln Asn Cys Leu Ile Gln Ser Gly Thr
165 170 175
Val Val Gly Ala Asp Gly Phe Gly Tyr Ala Asn Asp Arg Gly Asn Trp
180 185 190
Val Lys Ile Pro Gln Ile Gly Arg Val Ile Ile Gly Asp Arg Val Glu
195 200 205
Ile Gly Ala Cys Thr Thr Ile Asp Arg Gly Ala Leu Asp Asp Thr Ile
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Ile Gly Asn Gly Val Ile Ile Asp Asn Gln Cys Gln Ile Ala His Asn
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Val Val Ile Gly Asp Asn Thr Ala Val Ala Gly Gly Val Ile Met Ala
245 250 255
Gly Ser Leu Lys Ile Gly Arg Tyr Cys Met Ile Gly Gly Ala Ser Val
260 265 270
Ile Asn Gly His Met Glu Ile Cys Asp Lys Val Thr Val Thr Gly Met
275 280 285
Gly Met Val Met Arg Pro Ile Thr Glu Pro Gly Val Tyr Ser Ser Gly
290 295 300
Ile Pro Leu Gln Pro Asn Lys Val Trp Arg Lys Thr Ala Ala Leu Val
305 310 315 320
Met Asn Ile Asp Asp Met Ser Lys Arg Leu Lys Ser Leu Glu Arg Lys
325 330 335
Val Asn Gln Gln Asp
340
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
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<223> gcvA
<400> 53
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tacgccgaat atttattgcc ggtgtgttcg ccgctactgc tgacaggcga aaaacccttg 540
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<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> gcvA
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Met Ser Lys Arg Leu Pro Pro Leu Asn Ala Leu Arg Val Phe Asp Ala
1 5 10 15
Ala Ala Arg His Leu Ser Phe Thr Arg Ala Ala Glu Glu Leu Phe Val
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Gly Leu Lys Leu Phe Arg Arg Arg Asn Arg Ser Leu Leu Leu Thr Glu
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130 135 140
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Tyr Ala Glu Tyr Leu Leu Pro Val Cys Ser Pro Leu Leu Leu Thr Gly
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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260 265 270
Asp Ser Gln Ala Glu Leu Gly Lys Ile Ala Ala Phe Arg Gln Trp Ile
275 280 285
Leu Ala Lys Ala Ala Ala Glu Gln Glu Lys Phe Arg Phe Arg Tyr Glu
290 295 300
Gln
305
<210> 55
<211> 350
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> gcvA WT 启动子
<400> 55
ttcgcgatcg caaggtaaaa aaaagcaccg caattaggcg gtgctacatt aatcactatg 60
gacagacagg gtaaatgtac aggaagtgaa aaaaggtagc tttgctacca tggtctgaat 120
cgcagaccaa ttgcaaacac aacaacacaa catcacaacc gtaagccaaa agttcaccag 180
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tgctggtaga agctcaacgg acaatttata atggctcaga ttaaaaaaac taataggtta 300
cacagtgtga tctaattgtt aaattcattt aacatcaaag tttaaaagcc 350
<210> 56
<211> 349
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> gcvA Mut 启动子1
<400> 56
ttcgcgatcg caaggtaaaa aaaagcaccg caattaggcg gtgctacatt aatcactatg 60
gacagacagg gtaaatgtac aggaagtgaa aaaaggtagc tttgctacca tggtctgaat 120
cgcagaccaa ttgcaaacac aacaacacaa catcacaacc gtaagccaaa agttcaccag 180
aacacgcatt ccgataaaac ttttcgttcc ggctcaggaa gtgccgccac tataggtatt 240
tgctggtaga agctcaacgg acaatttata atggctcaga ttaaaaaact aataggttac 300
acagtgtgat ctaattgtta aattcattta acatcaaagt ttaaaagcc 349
<210> 57
<211> 350
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> gcvA Mut 启动子2
<400> 57
ttcgcgatcg caaggtaaaa aaaagcaccg caattaggcg gtgctacatt aatcactatg 60
gacagacagg gtaaatgtac aggaagtgaa aaaaggtagc tttgctacca tggtctgaat 120
cgcagaccaa ttgcaaacac aacaacacaa catcacaacc gtaagccaaa agttcaccag 180
aacacgcatt ccgataaaac ttttcgttcc ggctcaggaa gtgccgccac tataggtatt 240
tgctggtaga agctcaacgg acaatttata atggctcaga ttaaaaaaac aaataggtta 300
cacagtgtga tctaattgtt aaattcattt aacatcaaag tttaaaagcc 350
<210> 58
<211> 206
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> gcvB
<400> 58
acttcctgag ccggaacgaa aagttttatc ggaatgcgtg ttctggtgaa cttttggctt 60
acggttgtga tgttgtgttg ttgtgtttgc aattggtctg cgattcagac catggtagca 120
aagctacctt ttttcacttc ctgtacattt accctgtctg tccatagtga ttaatgtagc 180
accgcctaat tgcggtgctt tttttt 206
<210> 59
<211> 128
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> gcvB WT 启动子
<400> 59
ggcttttaaa ctttgatgtt aaatgaattt aacaattaga tcacactgtg taacctatta 60
gtttttttaa tctgagccat tataaattgt ccgttgagct tctaccagca aatacctata 120
gtggcggc 128
<210> 60
<211> 127
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> gcvB Mut1 启动子
<400> 60
ggcttttaaa ctttgatgtt aaatgaattt aacaattaga tcacactgtg taacctatta 60
gttttttaat ctgagccatt ataaattgtc cgttgagctt ctaccagcaa atacctatag 120
tggcggc 127
<210> 61
<211> 128
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> gcvB Mut2 启动子
<400> 61
ggcttttaaa ctttgatgtt aaatgaattt aacaattaga tcacactgtg taacctattt 60
gtttttttaa tctgagccat tataaattgt ccgttgagct tctaccagca aatacctata 120
gtggcggc 128
<210> 62
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物argP_1_F
<400> 62
ttgctggaag aagagtggct gggcgatgaa caaaccggtt cgactccgct gatatcggaa 60
gccctgggcc aac 73
<210> 63
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物argP_1_R
<400> 63
tcagccaaca caggagccag tgcaggaagc aaccacgtcg ccagactgtc cacctgagac 60
aacttgttac agctc 75
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物argP_2_F
<400> 64
actggatgcg gtgatacgtg aacg 24
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物argP_2_R
<400> 65
accactggcg ctttcagtaa tgcc 24
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物argP_seq_F
<400> 66
ttaccaggag cagacaacag c 21
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物argP_seq_R
<400> 67
ggcagatcga agttttgctg c 21
<210> 68
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物argP-pACYC_F
<400> 68
tatcatcgat aagcttatgt tacccgccga cggcttcg 38
<210> 69
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物argP-pACYC_R
<400> 69
aagggcatcg gtcgacgtga ggataacgcc tgatatgtgc 40
<210> 70
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvA_1_F
<400> 70
taataggtta cacagtgtga tctaattgtt aaattcattt aacatcaaag gatatcggaa 60
gccctgggcc aac 73
<210> 71
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvA_1_R
<400> 71
aaactcgtaa ggcatttagc ggtggtaatc gtttagacat ggcttttaaa cacctgagac 60
aacttgttac agctc 75
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvA_2_F
<400> 72
cgcagaccaa ttgcaaacac 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvA_2_R
<400> 73
ctcgcgcagc agaagagctt 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvA_seq_F
<400> 74
agcagatcaa ccgtactgac 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvA_seq_R
<400> 75
agtttacgcg tcgcttcggt 20
<210> 76
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvA-pACYC_F
<400> 76
tatcatcgat aagcttaagt gccgccacta taggtatttg c 41
<210> 77
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvA-pACYC_R
<400> 77
aagggcatcg gtcgactggt catggtcgta ccctacg 37
<210> 78
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvB_1_F
<400> 78
tgacgtgaaa gagatggtcg aactggatca gtaattcgcg atcgcaaggt gatatcggaa 60
gccctgggcc aac 73
<210> 79
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvB_1_R
<400> 79
attataaatt gtccgttgag cttctaccag caaataccta tagtggcggc cacctgagac 60
aacttgttac agctc 75
<210> 80
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvB_seq_F
<400> 80
gccgcaatta tttctgcctg tatgc 25
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvB_seq_R
<400> 81
cacaaaaagc tcttctgctg cgcg 24
<210> 82
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvB-pACYC_F
<400> 82
tatcatcgat aagcttggtc gaactggatc agtaattcgc 40
<210> 83
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvB-pACYC_R
<400> 83
aagggcatcg gtcgaccggt ggtaatcgtt tagacatggc 40
<210> 84
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物brnQ_1_F
<400> 84
tatcgttatt gttaacgcgg cgcgttctcg tggcgttacc gaagcgcgtc gatatcggaa 60
gccctgggcc aac 73
<210> 85
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物brnQ_1_R
<400> 85
gaacgtaagc atgcagaata gcagcgccgt ttgcagactg atcgaccagc cacctgagac 60
aacttgttac agctc 75
<210> 86
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物brnQ_2_F
<400> 86
ggataccgtg ggcaacttcc ttgc 24
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物brnQ_2_R
<400> 87
gttagaaacc accatcgaga agccg 25
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物brnQ_seq_F
<400> 88
cgctgtttat ctacagcctg g 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物brnQ_seq_R
<400> 88
ggataaatag cggtcagcac c 21
<210> 90
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物lpxD_1C_F
<400> 90
catcggtaaa acctggtaag tgttctccac aaaggaatgt agtggtagtg tagcgatatc 60
ggaagccctg ggccaac 77
<210> 91
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物lpxD_1C_R
<400> 91
ggtgcagttc tttgcgtggc ccggcgatct tatattgatc gcctaaagtc atccacctga 60
gacaacttgt tacagctc 78
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物lpxD_fix_F
<400> 92
cgatcaacga atataactcg ctgcg 25
<210> 93
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物lpxD_fix_R
<400> 93
ataataacac ggcctgccgc aatcg 25
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物lpxD_flank_F
<400> 94
atgctgtagg cggtaacgcc at 22
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物lpxD_flank_R
<400> 95
atacgttgtt acccagcttc gc 22
<210> 96
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物lpxD-pACYC_F
<400> 96
tatcatcgat aagcttaaat ccgttgccaa cagccagg 38
<210> 97
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物lpxD-pACYC_R
<400> 97
aagggcatcg gtcgacaaca cggcctgccg caatcg 36
<210> 98
<211> 400
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> gcvB_KO_Fix
<400> 98
tgccctgagc gcctgttccg gttcgaacta tgtgatgcac accaatgacg gacgtaccat 60
cgtctctgac ggcaaaccac agactgataa cgataccggt atgatttcgt ataaagacgc 120
taatggcaac aaacagcaga tcaaccgtac tgacgtgaaa gagatggtcg aactggatca 180
gtaattcgcg atcgcaaggt gccgccacta taggtatttg ctggtagaag ctcaacggac 240
aatttataat ggctcagatt aaaaaaacta ataggttaca cagtgtgatc taattgttaa 300
attcatttaa catcaaagtt taaaagccat gtctaaacga ttaccaccgc taaatgcctt 360
acgagttttt gatgccgcag cacgccattt aagtttcact 400
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物argP_RT_F
<400> 99
gcccggacta cagaacatta cagg 24
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物argP_RT_R
<400> 100
tgagacggct gattgtgtaa tgc 23
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvA_RT_F
<400> 101
ccatttaagt ttcactcgcg cagc 24
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvA_RT_R
<400> 102
ggcggcggaa cagttttagc 20
<210> 103
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvB_RT_F
<400> 103
taggcggtgc tacattaatc actatgg 27
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物gcvB_RT_R
<400> 104
tgttgtgttt gcaattggtc tgc 23
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物lpxD_RT_F
<400> 105
gatatcgtca tcaccggcgt tgc 23
<210> 106
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物lpxD_RT_R
<400> 106
gcacaagcct aaatgctcac gg 22
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物rrsA_RT_F
<400> 107
ctcttgccat cggatgtgcc cag 23
<210> 108
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物rrsA_RT_R
<400> 108
ccagtgtggc tggtcatcct ctca 24
<210> 109
<211> 450
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> ygaW
<400> 109
atgttctcac cgcagtcacg cttgcgtcat gcagttgcag atacgttcgc gatggttgtt 60
tactgttctg tcgtgaacat gtgtattgaa gttttcctct ccggaatgag cttcgaacag 120
tctttttatt ccagattggt agcgattccg gtgaacatct taattgcatg gccatacggt 180
atgtaccgtg atctgtttat gcgcgcggca cgcaaagtta gcccgtcggg ctggataaaa 240
aatctggctg atatcctggc ttatgtgacg ttccagtcac cggtgtatgt ggcgatcttg 300
ttagtggtgg gcgcagactg gcatcagatt atggcggcgg tcagttcaaa catcgttgtt 360
tcgatgttga tgggggcggt ttatggctac ttcctcgatt attgccgccg actgtttaaa 420
gtcagccgtt accagcaggt aaaagcctga 450
<210> 110
<211> 149
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> ygaW
<400> 110
Met Phe Ser Pro Gln Ser Arg Leu Arg His Ala Val Ala Asp Thr Phe
1 5 10 15
Ala Met Val Val Tyr Cys Ser Val Val Asn Met Cys Ile Glu Val Phe
20 25 30
Leu Ser Gly Met Ser Phe Glu Gln Ser Phe Tyr Ser Arg Leu Val Ala
35 40 45
Ile Pro Val Asn Ile Leu Ile Ala Trp Pro Tyr Gly Met Tyr Arg Asp
50 55 60
Leu Phe Met Arg Ala Ala Arg Lys Val Ser Pro Ser Gly Trp Ile Lys
65 70 75 80
Asn Leu Ala Asp Ile Leu Ala Tyr Val Thr Phe Gln Ser Pro Val Tyr
85 90 95
Val Ala Ile Leu Leu Val Val Gly Ala Asp Trp His Gln Ile Met Ala
100 105 110
Ala Val Ser Ser Asn Ile Val Val Ser Met Leu Met Gly Ala Val Tyr
115 120 125
Gly Tyr Phe Leu Asp Tyr Cys Arg Arg Leu Phe Lys Val Ser Arg Tyr
130 135 140
Gln Gln Val Lys Ala
145
<210> 111
<211> 987
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> zipA
<400> 111
atgatgcagg atttgcgtct gatattaatc attgttggcg cgatcgccat aatcgcttta 60
ctggtacatg gtttctggac cagccgtaaa gaacgatctt ctatgttccg cgatcggcca 120
ttaaaacgaa tgaagtcaaa acgtgacgac gattcttatg acgaggatgt cgaagatgat 180
gagggcgttg gtgaggttcg tgttcaccgc gtgaatcatg ccccggctaa cgctcaggag 240
catgaggctg ctcgtccgtc gccgcaacac cagtaccaac cgccttatgc gtctgcgcag 300
ccgcgtcaac cggtccagca gccgcctgaa gcgcaggtac cgccgcaaca tgctccgcgt 360
ccagcgcagc cggtgcagca gcctgcctat cagccgcagc ctgaacagcc gttgcagcag 420
ccagtttcgc cacaggtcgc gccagcgccg cagcctgtgc attcagcacc gcaaccggca 480
caacaggctt tccagcctgc agaacccgta gcggcaccac agcctgagcc tgtagcggaa 540
ccggctccag ttatggataa accgaagcgc aaagaagcgg tgattatcat gaacgtcgcg 600
gcgcatcacg gtagcgagct aaacggtgaa ctgcttctta acagcattca acaagcgggc 660
ttcatttttg gcgatatgaa tatttaccat cgtcatctta gcccggatgg cagcggcccg 720
gcgttattca gcctggcgaa tatggtgaaa ccgggaacct ttgatcctga aatgaaggat 780
ttcactactc cgggtgtcac catctttatg caggtaccgt cttacggtga cgagctgcag 840
aacttcaagc tgatgctgca atctgcgcag catattgccg atgaagtggg cggtgtcgtg 900
cttgacgatc agcgccgtat gatgactccg cagaaattgc gcgagtacca ggacatcatc 960
cgcgaagtca aagacgccaa cgcctga 987
<210> 112
<211> 328
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> zipA
<400> 112
Met Met Gln Asp Leu Arg Leu Ile Leu Ile Ile Val Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ile Ala Leu Leu Val His Gly Phe Trp Thr Ser Arg Lys Glu Arg
20 25 30
Ser Ser Met Phe Arg Asp Arg Pro Leu Lys Arg Met Lys Ser Lys Arg
35 40 45
Asp Asp Asp Ser Tyr Asp Glu Asp Val Glu Asp Asp Glu Gly Val Gly
50 55 60
Glu Val Arg Val His Arg Val Asn His Ala Pro Ala Asn Ala Gln Glu
65 70 75 80
His Glu Ala Ala Arg Pro Ser Pro Gln His Gln Tyr Gln Pro Pro Tyr
85 90 95
Ala Ser Ala Gln Pro Arg Gln Pro Val Gln Gln Pro Pro Glu Ala Gln
100 105 110
Val Pro Pro Gln His Ala Pro Arg Pro Ala Gln Pro Val Gln Gln Pro
115 120 125
Ala Tyr Gln Pro Gln Pro Glu Gln Pro Leu Gln Gln Pro Val Ser Pro
130 135 140
Gln Val Ala Pro Ala Pro Gln Pro Val His Ser Ala Pro Gln Pro Ala
145 150 155 160
Gln Gln Ala Phe Gln Pro Ala Glu Pro Val Ala Ala Pro Gln Pro Glu
165 170 175
Pro Val Ala Glu Pro Ala Pro Val Met Asp Lys Pro Lys Arg Lys Glu
180 185 190
Ala Val Ile Ile Met Asn Val Ala Ala His His Gly Ser Glu Leu Asn
195 200 205
Gly Glu Leu Leu Leu Asn Ser Ile Gln Gln Ala Gly Phe Ile Phe Gly
210 215 220
Asp Met Asn Ile Tyr His Arg His Leu Ser Pro Asp Gly Ser Gly Pro
225 230 235 240
Ala Leu Phe Ser Leu Ala Asn Met Val Lys Pro Gly Thr Phe Asp Pro
245 250 255
Glu Met Lys Asp Phe Thr Thr Pro Gly Val Thr Ile Phe Met Gln Val
260 265 270
Pro Ser Tyr Gly Asp Glu Leu Gln Asn Phe Lys Leu Met Leu Gln Ser
275 280 285
Ala Gln His Ile Ala Asp Glu Val Gly Gly Val Val Leu Asp Asp Gln
290 295 300
Arg Arg Met Met Thr Pro Gln Lys Leu Arg Glu Tyr Gln Asp Ile Ile
305 310 315 320
Arg Glu Val Lys Asp Ala Asn Ala
325
<210> 113
<211> 1425
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> lpd
<400> 113
atgagtactg aaatcaaaac tcaggtcgtg gtacttgggg caggccccgc aggttactcc 60
gctgccttcc gttgcgctga tttaggtctg gaaaccgtaa tcgtagaacg ttacaacacc 120
cttggcggtg tttgcctgaa cgtcggctgt atcccttcta aagcactgct gcacgtagca 180
aaagttatcg aagaagccaa agcgctggct gaacacggta tcgtcttcgg cgaaccgaaa 240
accgatattg acaagattcg tacctggaaa gagaaagtga tcaatcagct gaccggtggt 300
ctggctggta tggcgaaagg ccgcaaagtc aaagtggtca acggtctggg taaatttacc 360
ggggctaaca ccctggaagt tgaaggtgag aacggtaaaa ccgtgatcaa cttcgacaac 420
gcgatcattg cagcgggttc tcgcccgatc caactgccgt ttattccgca tgaagatccg 480
cgtatctggg actccactga cgcgctggaa ctgaaagaag taccagaacg cctgctggta 540
atgggtggcg gtatcatcgg tctggaaatg ggcaccgtat accacgcgct gggttcacag 600
attgacgtgg ttgaaatgtt cgaccaggtt atcccggcag ctgacaaaga catcgttaaa 660
gtcttcacca agcgtatcag caagaaattc aacctgatgc tggaaaccaa agttaccgcc 720
gttgaagcga aagaagacgg tatttatgtg acgatggaag gcaaaaaagc acccgctgaa 780
ccgcagcgtt acgacgccgt gctggtagcg attggtcgtg tgccgaacgg taaaaacctc 840
gacgcaggca aagctggcgt ggaagtggac gaccgtggtt tcatccgcgt tgacaaacag 900
ctgcgtacca acgtaccgca catctttgct atcggcgata tcgtcggtca gccgatgctg 960
gcacacaaag gtgttcacga aggtcacgtt gccgctgaag ttatcgccgg taagaaacac 1020
tacttcgatc cgaaagttat cccgtccatc gcctataccg aaccagaagt tgcatgggta 1080
ggtctgactg agaaagaagc gaaagagaaa ggcatcagct atgaaaccgc caccttcccg 1140
tgggctgctt ctggtcgtgc tatcgcttcc gactgcgcag acggtatgac caagctgatt 1200
ttcgacaaag aatctcaccg tgtgatcggt ggtgcgattg tcggtaccaa cggcggcgag 1260
ctgctgggtg aaatcggcct ggcaatcgaa atgggttgtg atgctgaaga catcgcactg 1320
accatccacg cgcacccgac tctgcacgag tctgtgggcc tggcggcaga agtgttcgaa 1380
ggtagcatta ccgacctgcc gaacccgaaa gcgaagaaga agtaa 1425
<210> 114
<211> 474
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> lpd
<400> 114
Met Ser Thr Glu Ile Lys Thr Gln Val Val Val Leu Gly Ala Gly Pro
1 5 10 15
Ala Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Arg Cys Ala Asp Leu Gly Leu Glu Thr
20 25 30
Val Ile Val Glu Arg Tyr Asn Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val
35 40 45
Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Val Ala Lys Val Ile Glu
50 55 60
Glu Ala Lys Ala Leu Ala Glu His Gly Ile Val Phe Gly Glu Pro Lys
65 70 75 80
Thr Asp Ile Asp Lys Ile Arg Thr Trp Lys Glu Lys Val Ile Asn Gln
85 90 95
Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Gly Arg Lys Val Lys Val
100 105 110
Val Asn Gly Leu Gly Lys Phe Thr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Val Glu
115 120 125
Gly Glu Asn Gly Lys Thr Val Ile Asn Phe Asp Asn Ala Ile Ile Ala
130 135 140
Ala Gly Ser Arg Pro Ile Gln Leu Pro Phe Ile Pro His Glu Asp Pro
145 150 155 160
Arg Ile Trp Asp Ser Thr Asp Ala Leu Glu Leu Lys Glu Val Pro Glu
165 170 175
Arg Leu Leu Val Met Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly Thr
180 185 190
Val Tyr His Ala Leu Gly Ser Gln Ile Asp Val Val Glu Met Phe Asp
195 200 205
Gln Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Asp Ile Val Lys Val Phe Thr Lys
210 215 220
Arg Ile Ser Lys Lys Phe Asn Leu Met Leu Glu Thr Lys Val Thr Ala
225 230 235 240
Val Glu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Tyr Val Thr Met Glu Gly Lys Lys
245 250 255
Ala Pro Ala Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ile Gly
260 265 270
Arg Val Pro Asn Gly Lys Asn Leu Asp Ala Gly Lys Ala Gly Val Glu
275 280 285
Val Asp Asp Arg Gly Phe Ile Arg Val Asp Lys Gln Leu Arg Thr Asn
290 295 300
Val Pro His Ile Phe Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met Leu
305 310 315 320
Ala His Lys Gly Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Val Ile Ala
325 330 335
Gly Lys Lys His Tyr Phe Asp Pro Lys Val Ile Pro Ser Ile Ala Tyr
340 345 350
Thr Glu Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Leu Thr Glu Lys Glu Ala Lys
355 360 365
Glu Lys Gly Ile Ser Tyr Glu Thr Ala Thr Phe Pro Trp Ala Ala Ser
370 375 380
Gly Arg Ala Ile Ala Ser Asp Cys Ala Asp Gly Met Thr Lys Leu Ile
385 390 395 400
Phe Asp Lys Glu Ser His Arg Val Ile Gly Gly Ala Ile Val Gly Thr
405 410 415
Asn Gly Gly Glu Leu Leu Gly Glu Ile Gly Leu Ala Ile Glu Met Gly
420 425 430
Cys Asp Ala Glu Asp Ile Ala Leu Thr Ile His Ala His Pro Thr Leu
435 440 445
His Glu Ser Val Gly Leu Ala Ala Glu Val Phe Glu Gly Ser Ile Thr
450 455 460
Asp Leu Pro Asn Pro Lys Ala Lys Lys Lys
465 470
<210> 115
<211> 269
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> ldhA mut 启动子
<400> 115
catagtaaat tcccccacca gtttaaccgg cggctgattt tcaaacgcga cgacatccag 60
ttcgctgact gtaagttgtt gccctttcag ctggccttga aatttaactt tttcgccctg 120
ataacgcagt tgctggatat cagaggttaa tgcgagagag agttttccct gccattcctg 180
ccagggagaa aaaatcagtt tatcgatatt gattttgtaa aatattttta gtagcttaaa 240
tgtgattcaa catcactgga gaaagtctt 269
<210> 116
<211> 50
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> ldhA mut 启动子片段
<400> 116
tattgatttt gtaaaatatt tttagtagct taaatgtgat tcaacatcac 50
<210> 117
<211> 500
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<223> brnQ_KO_fix
<400> 117
gtgatttctt atcgctatat acctctggtt tttagatccc tccttgcttt aaaacgttat 60
aagcgtttaa attgcgcttc aggtgctgtc atactgactg cattaacgcg gtaaatcgaa 120
aaactattct tcgccgcgcc tggttgggag tatttcccgc taaaattgtt taaatatacc 180
gctgtatcat ccccagggat tggcacaaaa atttaacgtt acaacaccac atccacaggc 240
agtatgattt atcactgaac atttgtttta accacggggc tgcgatgccc cgtggttttt 300
tattgtgttg atgggttagg aattgatgga aagtaagaac aagctaaagc gtgggctaag 360
tacccgccac atacgcttta tggcactggg ttcagcaatt ggcaccgggc tgttttacgg 420
ttcggcagac gccatcaaaa tggccggtcc gagcgtgttg ttggcctata ttatcggtgg 480
tatcgcggcg tatatcatta 500

Claims (47)

1.重组核酸分子，其具有选自由以下组成的组的序列：
(i)包含SEQ ID NO:3、45、49、56、57、60或61的序列的核酸分子，或
(ii)与SEQ ID NO:3、45、49、56、57、60或61的核酸分子有至少80％同一性的核酸分子，或
(iii)与具有SEQ ID NO:3、45、49、56、57、60或61的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(iv)编码SEQ ID NO:4、46或50的多肽的核酸分子,或
(v)编码与SEQ ID NO:4、46或50的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子，
其中(I)到(V)项下的基因的对应于SEQ ID NO:45的286到288位的密码子不编码氨基酸丙氨酸并且不是终止密码子或者(I)到(V)项下的基因编码的蛋白质的对应于SEQ IDNO:46的96位的氨基酸不是丙氨酸并且不是终止密码子，并且其中(I)到(V)项下基因的对应于SEQ ID NO:49的43到45位的密码子不编码氨基酸丙氨酸并且不是终止密码子或(I)到(V)项下的基因编码的蛋白质的对应于SEQ ID NO:50的15位的氨基酸不是丙氨酸并且不是终止密码子。
2.权利要求1的重组核酸分子，其具有SEQ ID NO:45的序列或如在(II)到(V)项定义的其同源物，其中对应于SEQ ID NO:45的286到288位的编码氨基酸丙氨酸的密码子已经被编码氨基酸谷氨酸或与谷氨酸相关的氨基酸的密码子替换。
3.权利要求1的重组核酸分子，其具有SEQ ID NO:49的序列或如在(II)到(V)项定义的其同源物，其中对应于43到45位的编码氨基酸丙氨酸的密码子已经被编码氨基酸苏氨酸或与苏氨酸相似的氨基酸的密码子替换。
4.重组氨基酸分子，其具有选自由以下组成的组的序列
(VI)包含SEQ ID NO:46的序列的氨基酸分子,或
(VII)与SEQ ID NO:46的核酸分子具有至少60％同一性的氨基酸分子，或
其中(VII)项蛋白质的对应于SEQ ID NO:46的96位的氨基酸不是丙氨酸。
5.重组氨基酸分子，其具有选自由以下组成的组的序列
(VI)包含SEQ ID NO:50的序列的氨基酸分子,或
(VII)与SEQ ID NO:50的核酸分子具有至少60％同一性的氨基酸分子，或
其中(VII)项蛋白质的对应于SEQ ID NO:50的15位的氨基酸不是丙氨酸。
6.权利要求4的重组氨基酸分子，其中在对应于SEQ ID NO:46的96位的位置上的氨基酸精氨酸已经被谷氨酸或与谷氨酸相关的氨基酸替换。
7.权利要求5的重组氨基酸分子，其中在对应于SEQ ID NO:50的15位的位置上的氨基酸丙氨酸已经被苏氨酸或与苏氨酸相似的氨基酸替换。
8.重组表达构建体，其包含在微生物中有功能的至少一种启动子，所述至少一种启动子与至少一种如在权利要求1-3任一项中定义的编码蛋白质的核酸分子有效连接。
9.重组载体，其包含至少一种如在权利要求1-3任一项中定义的核酸分子或如权利要求8中定义的重组表达构建体。
10.重组微生物，其包含如下至少一种
a)brnQ基因或其同源物或功能变体的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达，
b)argP基因或其同源物或功能变体的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达，
c)gcvA基因或其同源物或功能变体的引入的、增加的、增强的或改变的活性和/或表达，
d)gcvB基因或其同源物或功能变体的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达,
e)(I)包含SEQ ID NO:49的序列的核酸分子或
(II)与SEQ ID NO:49的核酸分子有至少80％同一性的核酸分子或
(III)与具有SEQ ID NO:49的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(IV)编码SEQ ID NO:50的多肽的核酸分子或
(V)编码与SEQ ID NO:50的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子
其中在(I)到(V)下的基因的对应于SEQ ID NO:49的43到45位的密码子不编码氨基酸丙氨酸并且不是终止密码子或(I)到(V)下的基因编码的蛋白质的对应于SEQ ID NO:50的15位的氨基酸不是丙氨酸并且不是终止密码子。
11.权利要求10的重组微生物，其中brnQ基因选自由以下组成的组
(i)包含SEQ ID NO:1的序列的核酸分子,或
(ii)与SEQ ID NO:1的核酸分子有至少80％同一性的核酸分子,或
(iii)与具有SEQ ID NO:1的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(iv)编码SEQ ID NO:2的多肽的核酸分子，或
(v)编码与SEQ ID NO:2的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
12.权利要求10的重组微生物，其中所述argP基因选自由以下组成的组
(i)包含SEQ ID NO:45的序列的核酸分子,或
(ii)与SEQ ID NO:45的核酸分子有至少80％同一性的核酸分子,或
(iii)与具有SEQ ID NO:45的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(iv)编码SEQ ID NO:46的多肽的核酸分子，或
(v)编码与SEQ ID NO:46的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
13.权利要求10的重组微生物，其中gcvA基因选自由以下组成的组
(i)包含SEQ ID NO:53的序列的核酸分子，或
(ii)与SEQ ID NO:53的核酸分子有至少80％同一性的核酸分子，或
(iii)与具有SEQ ID NO:53的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(iv)编码SEQ ID NO:54的多肽的核酸分子，或
(v)编码与SEQ ID NO:54的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
14.权利要求10的重组微生物，其中所述gcvB基因选自由以下组成的组
(i)包含SEQ ID NO:58的序列的核酸分子，或
(ii)与SEQ ID NO:58的核酸分子有至少80％同一性的核酸分子，或
(iii)与具有SEQ ID NO:58的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子。
15.重组微生物，其包含至少一种如在权利要求1-3任一项中定义的重组核酸分子或如权利要求8的重组表达构建体或权利要求9的重组载体。
16.权利要求10-15的重组微生物，其还包含alaD基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达。
17.权利要求10-16的重组微生物，其还包含pflB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。
18.权利要求10到17任一项的重组微生物，其进一步包含adhE基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。
19.权利要求10到18任一项的重组微生物，其进一步包含ldhA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。
20.权利要求10到19任一项的重组微生物，其进一步包含pta基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。
21.权利要求10到20任一项的重组微生物，其进一步包含frdA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。
22.权利要求10-21任一项的重组微生物，其进一步包含ygaW基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达。
23.权利要求10-22任一项的重组微生物，其进一步包含zipA基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达。
24.权利要求10-23任一项的重组微生物，其进一步包含lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达。
25.权利要求16到24任一项的重组微生物，其中所述alaD基因选自由以下组成的组
(AA)包含SEQ ID NO:15的序列的核酸分子，或
(BB)与SEQ ID NO:15的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子，或
(CC)与具有SEQ ID NO:15的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(DD)编码SEQ ID NO:16的多肽的核酸分子，或
(EE)编码与SEQ ID NO:16的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
26.权利要求16到25任一项的重组微生物，其中所述alaD基因有效连接到具有SEQ IDNO 115或116的启动子或
(I)与SEQ ID NO:115或116的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子，或
(II)与具有SEQ ID NO:115或116的核酸分子在中等严格条件下杂交的核酸分子，或
(III)具有SEQ ID NO:115的核酸分子的至少10个核苷酸的片段。
27.权利要求17到26任一项的重组微生物，其中所述pflB基因选自由以下组成的组
(A)包含SEQ ID NO:5的序列的核酸分子，或
(B)与SEQ ID NO:5的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子，或
(C)与具有SEQ ID NO:5的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(D)编码SEQ ID NO:6的多肽的核酸分子，或
(E)编码与SEQ ID NO:6的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
28.权利要求18到27任一项的重组微生物，其中所述adhE基因选自由以下组成的组
(F)包含SEQ ID NO:7的序列的核酸分子，或
(G)与SEQ ID NO:7的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子，或
(H)与具有SEQ ID NO:7的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(I)编码SEQ ID NO:8的多肽的核酸分子，或
(J)编码与SEQ ID NO:8的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
29.权利要求19到28任一项的重组微生物，其中所述ldhA基因选自由以下组成的组
(K)包含SEQ ID NO:9的序列的核酸分子，或
(L)与SEQ ID NO:9的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子，或
(M)与具有SEQ ID NO:9的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(N)编码SEQ ID NO:10的多肽的核酸分子，或
(O)编码与SEQ ID NO:10的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
30.权利要求20到29任一项的重组微生物，其中所述pta基因选自由以下组成的组
(P)包含SEQ ID NO:11的序列的核酸分子，或
(Q)与SEQ ID NO:11的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子，或
(R)与具有SEQ ID NO:11的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(S)编码SEQ ID NO:12的多肽的核酸分子，或
(T)编码与SEQ ID NO:12的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
31.权利要求21到30任一项的重组微生物，其中所述frdA基因选自由以下组成的组
(U)包含SEQ ID NO:13的序列的核酸分子，或
(V)与SEQ ID NO:13的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子，或
(W)与具有SEQ ID NO:13的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(X)编码SEQ ID NO:14的多肽的核酸分子，或
(Y)编码与SEQ ID NO:14的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
32.权利要求22到31任一项的重组微生物，其中所述ygaW基因选自由以下组成的组
(FF)包含SEQ ID NO:109的序列的核酸分子，或
(GG)与SEQ ID NO:109的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子，或
(HH)与具有SEQ ID NO:109的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(JJ)编码SEQ ID NO:110的多肽的核酸分子，或
(KK)编码与SEQ ID NO:110的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
33.权利要求23到32任一项的重组微生物，其中所述zipA基因选自由以下组成的组
(LL)包含SEQ ID NO:111的序列的核酸分子，或
(MM)与SEQ ID NO:111的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子，或
(NN)与具有SEQ ID NO:111的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(OO)编码SEQ ID NO:112的多肽的核酸分子，或
(PP)编码与SEQ ID NO:112的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
34.权利要求24到33任一项的重组微生物，其中所述lpd基因选自由以下组成的组
(QQ)包含SEQ ID NO:113的序列的核酸分子，或
(RR)与SEQ ID NO:113的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子，或
(SS)与具有SEQ ID NO:113的核酸分子的互补序列在严格条件下杂交的核酸分子，或
(TT)编码SEQ ID NO:114的多肽的核酸分子，或
(UU)编码与SEQ ID NO:114的多肽有至少60％同源性的多肽的核酸分子。
35.权利要求10至34中任一项的重组微生物，其中所述微生物选自由棒杆菌属、芽孢杆菌属、欧文氏菌属、埃希氏菌属、泛菌属、链霉菌属、发酵单胞菌属和红球菌属组成的属。
36.组合物，其包含根据权利要求10至35中任一项的一种或多种重组微生物。
37.权利要求36的组合物，其进一步包含培养基和碳源。
38.一种产生具有增强的丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸产率的重组微生物的方法，该方法包括以下步骤：
(I)将至少一种如在权利要求1至3任一项中定义的核酸分子或至少一种如在权利要求4到7任一项中定义的氨基酸分子或权利要求8的表达构建体或权利要求9的载体引入到微生物；和
(II)生成与不包含至少一种如在权利要求1至3任一项中定义的核酸分子或至少一种如在权利要求4到7任一项中定义的氨基酸分子或权利要求8的表达构建体或权利要求9的载体的相应微生物相比，具有增强的丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸产率的重组微生物。
39.权利要求38的方法，其中在所述方法中使用的重组微生物还包含如权利要求16、22到26和32到34中定义的至少一种基因的增加的或增强的活性和/或表达和/或如权利要求17至21和27至31任一项所定义的至少一种基因的降低的，抑制的或缺失的活性和/或表达。
40.权利要求38或39任一项的方法，其中所述微生物选自由棒杆菌属、芽孢杆菌属、欧文氏菌属、埃希氏菌属、泛菌属、链霉菌属、发酵单胞菌属和红球菌属组成的组的属。
41.生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的方法，包括在允许生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的条件下培养权利要求10到35任一项的一种或多种重组微生物。
42.根据权利要求41的方法，其中所述微生物培养在包含0.5％到30％(w/v)的糖的培养基中。
43.根据权利要求41或42的方法，其中丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的产率是至少80％。
44.根据权利要求41至43任一项的方法，其中L-丙氨酸的手性纯度是至少98％。
45.培养或生长遗传修饰的微生物的方法，其包括用根据权利要求10至35中任一项的一种或多种遗传修饰的微生物接种培养基并在所述培养基中培养或生长所述遗传修饰的微生物。
46.权利要求1至3任一项的重组核酸分子，权利要求4到7任一项的重组氨基酸分子，权利要求8的重组表达构建体，权利要求9的重组载体，权利要求10至35中任一项的重组微生物或权利要求36或37任一项的组合物用于发酵生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的用途。
47.发酵生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的方法，其包括步骤
I)在发酵罐中生长权利要求10至35中任一项的微生物和
II)从在I)中获得的发酵液回收丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸。
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