CN113214422A

CN113214422A - 细胞内递送媒介物

Info

Publication number: CN113214422A
Application number: CN202110469355.5A
Authority: CN
Inventors: 辻俊一; 井门久美子; 山田小百合; 内山圣一; 河本恭子; 德山英利; 冈野健太郎
Original assignee: Tohoku University NUC; Kirin Holdings Co Ltd; University of Tokyo NUC
Current assignee: Tohoku University NUC; Kirin Holdings Co Ltd; University of Tokyo NUC
Priority date: 2015-09-07
Filing date: 2016-09-06
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2036-09-06
Also published as: KR20210008174A; US11452697B2; EP3348648A4; EP3760193A1; US20190137503A1; EP3348648B1; US10712346B2; JP6666673B2; KR20180040714A; CN108350479A; CN113214422B; KR102205918B1; US20200309782A1; SG11201801783VA; EP3760193B1; EP3348648A1; CN108350479B; EP3760193B9; WO2017043484A1; JP2017051113A

Abstract

本发明涉及细胞内递送媒介物。本申请公开了表面被正电荷覆盖的细胞内递送媒介物、将目标成分或化合物填充至所述细胞内递送媒介物而成的细胞内递送复合体、包含所述细胞内递送复合体而成的温度敏感性探针、及利用所述温度敏感性探针测定细胞内的温度的方法。该细胞内递送媒介物在能够容易地向细胞内递送期望的成分或化合物、且不阻碍细胞增殖的方面是有用的。

Description

细胞内递送媒介物

本申请是申请日为2016年9月6日、发明名称为“细胞内递送媒介物”的中国发明专利申请No.201680051805.6(PCT申请号为PCT/JP2016/076175)的分案申请。

相关申请参考

本专利申请基于在先提出的日本专利申请即日本特愿2015-176106号(申请日：2015年9月7日)主张优先权。该在先专利申请的全部公开内容通过引用而构成本说明书的一部分。

技术领域

本发明涉及能够在不阻碍细胞增殖的情况下向细胞内容易地递送期望的成分或化合物的细胞内递送媒介物、其制造方法或使用方法。

背景技术

向细胞内导入蛋白质等时，可以通过将蛋白质进行阳离子化从而高效地导入，这是已知的(专利文献1)。另外，将胰岛素等肽性药品与脱乙酰壳多糖等阳离子性高分子等一同使用时，能够在不对粘膜上皮细胞造成损害的情况下实现促进粘膜吸收是已知的(非专利文献1)。此外，针对通过向细胞导入siRNA(基于使用了聚阳离子的纳米颗粒)进行的RNAi治疗的副作用的问题和其解决手段进行了研究(非专利文献2)。此外，最近报道了用于作为温度敏感性荧光探针而导入细胞内的阳离子性聚合物(专利文献2)。但是，阳离子引起上述现象的机理、其对细胞造成的影响、以及其应用范围尚不能说是明确的。

除了上述以外，进行了大量着眼于阳离子的功能开发。例如，对于由作为阳离子系生物聚合物的脱乙酰壳多糖和γ谷氨酸形成的纳米胶囊，发现其具有对应于周围的pH而发生联动进行溶胀/收缩的性质，并针对其应用进行了研究(非专利文献3)。另外，报道了新型阳离子活性剂用于护发素的可能性(非专利文献4)、在保持带电量的同时低吸湿性也优异的阳离子性聚合物的应用(专利文献3)等。

然而，即使利用这些技术制备各种阳离子性聚合物，也仍然难以选出能够在不阻碍细胞增殖的情况下容易地导入细胞内、尤其不会阻碍所导入细胞的细胞分裂的聚合物。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：关俊畅药学杂志(日文：関俊暢薬学雑誌)，vol.130(9),pp.1115-1121,2010

非专利文献2：Borja Ballarin-Gonzalez等人，Advanced Drug DeliveryReviews vol.,64p.1717-1729,2012

非专利文献3：Takayuki Imoto等人，Macromol.Biosci.vol.10,pp.271-277,2010

非专利文献4：三田村让嗣等人，J.Soc.Cosmet.Chem.Jpn.vol.30(1),pp.84-93,1996

专利文献

专利文献1：日本特开2004-49214号公报

专利文献2：国际公开第2013/094748号

专利文献3：日本特开2011-157503号公报

发明内容

本发明的目的在于，提供能够在不阻碍细胞增殖的情况下容易地向细胞内递送期望的成分或化合物的媒介物、其制造方法及使用方法。

本申请发明人在开发向细胞内导入温度敏感性荧光探针的技术的过程中，发现了能够容易地导入细胞内、并且不会阻碍所导入细胞的细胞分裂的新型媒介物的制备方法。本发明是基于该发现而完成的。

即，本发明包括以下发明。

(1)细胞内递送媒介物，其表面被正电荷覆盖。

(2)细胞内递送复合体，其是将递送至细胞内的目标成分或化合物填充至上述(1)所述的细胞内递送媒介物而成的。

(3)如上述(2)所述的细胞内递送复合体，其中，递送至细胞内的目标成分或化合物与所述细胞内递送媒介物共价键合。

(4)如上述(2)或(3)所述的细胞内递送复合体，其中，所述化合物为热敏性单元及荧光性单元，所述热敏性单元的特性根据温度而变化，所述荧光性单元的荧光强度或荧光寿命伴随所述热敏性单元的特性变化而变化。

(5)温度敏感性探针，其包含上述(4)所述的细胞内递送复合体。

(6)测定细胞内温度的方法，其包括：

步骤(a)，将权利要求5所述的温度敏感性探针导入细胞内；及

步骤(b)，在激发光照射下，测定荧光强度或荧光寿命。

本发明在不需要显微注射等复杂操作、且能够容易地向细胞导入期望的成分或化合物的方面是有利的。另外，在导入后的媒介物不会阻碍细胞的细胞增殖的方面是有利的。此外，利用本发明的媒介物时，能够在不阻碍细胞增殖的情况下容易地向细胞内递送期望的成分或化合物的方面是有利的。此外，本说明书的实施例中，还确认到导入细胞后的本发明的媒介物具有不阻碍细胞分化的优点。

附图说明

[图1]示出了利用TEM观察化合物2b的结果的一例。

[图2]示出了利用TEM观察化合物3d的结果的一例。

[图3]示出了利用TEM观察化合物EF043的结果的一例。

[图4]为化合物Lin40和Lin41(黑色圆：Lin40，白色圆：Lin41)在150mM氯化钾水溶液中的荧光强度(Lin40：569nm，Lin41：571nm)的热敏响应性试验(heat-sensitiveresponse test)结果(0.005w/v％，激发波长450nm)的一例(n＝3)。

[图5]为分别将EF043、NN-AP4、Lin40、Lin41、k40与来源于人类宫颈癌的HeLa细胞在5％葡萄糖溶液中混合(37℃，10分钟)、并使用显微镜进行观察(激发光：473nm，荧光：500nm～600nm)而得到的照片的一例。

[图6]为使用导入EF043、NN-AP4、Lin40后的HeLa细胞，对24小时后的导入了探针的细胞数量进行计数，对增殖率进行评价的一例(n＝3)。

[图7]为在刚刚分化诱导为褐色脂肪细胞后导入阳离子性凝胶型温度探针EF043，然后继续培养3天，在显微镜下观察达到成熟状态的褐色脂肪细胞的结果的一例。

[图8]为将EF043与MOLT-4(人急性淋巴母细胞白血病T细胞)在5％葡萄糖溶液中混合(37℃，10分钟)，并使用显微镜进行观察(激发光：473nm，荧光：500nm～600nm)而得到的照片的一例(左)，以及，MOLT-4细胞中的EF043的荧光强度的热敏响应性试验结果的一例(右)(n＝3)。

[图9]为MOLT-4(人急性淋巴母细胞白血病T细胞)细胞中的EF043的荧光寿命(激发(Ex)：405nm，发射(Em)：565nm)的热敏响应性试验的结果(n＝3)的一例。

[图10]为由图9的图算出的温度分辨率的结果的一例。

[图11]为将PEG型阳离子性凝胶(其包含荧光素及罗丹明B)导入到HEK293T(人源胚胎肾细胞)细胞的导入效率与荧光分子单独的情况进行比较的结果(n＝3)的一例。

具体实施方式

1.定义

本发明中，所谓“媒介物”(vehicle)，是指将期望的成分或化合物递送至细胞内的介质或载体。

本发明的所谓“细胞”，包括通常的分类即原核细胞和真核细胞这二者，不受细胞的生物种类的特别限制。例如，原核细胞被划分为真细菌和古细菌，真细菌中又大致分为放线菌门这样的革兰氏阳性菌和变形菌门这样的革兰氏阴性菌，本发明的细胞内递送媒介物的可适用范围不受肽多糖层厚度等的限制。另外，真核细胞主要指属于真核生物(原生动物(protozoa)、真菌、植物、动物)的细胞。例如，通常应用于分子生物学等研究中、并且也在工业上利用的酵母属于真菌。另外，本发明的细胞内递送媒介物适用于游离细胞及黏附细胞这二者。

本说明书中，所谓“C_1-3烷基”，是指碳原子数1～3的直链状、支链状或环状的烷基，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基。

本说明书中，所谓“C_1-6烷基”，是指碳原子数1～6的直链状、支链状、环状或部分环状的烷基，包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、3-甲基丁基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、正己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3-乙基丁基、及2-乙基丁基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、及环丙基甲基等，也包括例如C_1-4烷基及C_1-3烷基等。

本说明书中，所谓“C_1-10烷基”，是指碳原子数1～10的直链状、支链状、环状或部分环状的烷基，包括例如已定义过的C_1-6烷基及C_1-3烷基等。

本说明书中，所谓“C_1-20烷基”，是指碳原子数1～20的直链状、支链状、环状或部分环状的烷基，包括例如已定义过的C_1-10烷基、C_1-6烷基及C_1-3烷基等。

本说明书中，所谓“C_1-6烷氧基”，是指含有已定义过的碳原子数1～6的烷基作为烷基部分的烷基氧基，包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、3-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、1-甲基丁氧基、1-乙基丙氧基、正己基氧基、4-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、1-甲基戊氧基、3-乙基丁氧基、环戊基氧基、环己基氧基、环丙基甲基氧基等，也包括例如C_1-4烷氧基及C_1-3烷氧基等。

本说明书中，所谓“芳基”，是指6～10元芳香族碳环基(membered aromaticcarbocyclic group)，包括例如苯基、1-萘基、2-萘基等。

本说明书中，所谓“C_7-14芳烷基”，是指包括芳基在内的碳原子数为7～14的芳基烷基，包括例如苄基、1-苯乙基、2-苯乙基、1-萘基甲基、2-萘基甲基等。

本说明书中，作为卤素原子，可举出例如氟原子、氯原子、溴原子及碘原子等。

本说明书中，所谓“C_1-20亚烷基”，是指碳原子数1～20的直链状、支链状、环状或部分环状的亚烷基，包括例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基等、以及C_1-10亚烷基及C_1-6亚烷基等。

本说明书中，所谓“C_3-20亚烯基”，是指碳原子数3～20的直链状、支链状、环状或部分环状的亚烯基，包括例如亚丙烯基、亚丁烯基等、以及C_3-10亚烯基及C_3-6亚烯基等。

本说明书中，所谓“C_3-20亚炔基”，是指碳原子数3～20的直链状、支链状、环状或部分环状的亚炔基，包括例如亚丙炔基、亚丁炔基等、以及C_3-10亚炔基及C_3-6亚炔基等。

本说明书中，所谓“C_1-6烷基硫基”，是指含有已定义过的碳原子数1～6的烷基作为烷基部分的烷基硫基，包括例如甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、仲丁硫基、异丁硫基、叔丁硫基等。

本说明书中，所谓“C_1-6烷基亚磺酰基”，是指含有已定义过的碳原子数1～6的烷基作为烷基部分的烷基亚磺酰基，包括例如甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基、正丙基亚磺酰基、异丙基亚磺酰基、正丁基亚磺酰基、仲丁基亚磺酰基、异丁基亚磺酰基、叔丁基亚磺酰基等。

本说明书中，所谓“C_1-6烷基磺酰基”，是指含有已定义过的碳原子数1～6的烷基作为烷基部分的烷基磺酰基，包括例如甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、异丙基磺酰基、正丁基磺酰基、仲丁基磺酰基、异丁基磺酰基、叔丁基磺酰基等。

本说明书中，所谓“6～18元芳香族碳环基”，包括例如苯基、萘基、蒽基、芘基、茚满基(indanyl group)、四氢萘基(tetralinyl group)等。

本说明书中，所谓“5～18元芳香族杂环基”，是指含有选自氧、氮及硫中的1个以上杂原子的芳香族杂环，包括例如吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、吲哚基、喹啉基、喹噁啉基、喹唑啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并吡喃基、苯并色烯基(benzochromenyl group)等。

本说明书中，所谓“C_2-6烯基磺酰基”，是指含有已定义过的C_2-6烯基作为烯基部分的烯基磺酰基，包括例如乙烯基磺酰基、烯丙基磺酰基等。

本说明书中，所谓“C_2-6烯基羰基”，是指含有已定义过的C_2-6烯基作为烯基部分的烯基羰基，包括例如丙烯酰基、甲基丙烯酰基等。

本说明书中，所谓“C_2-6炔基羰基”，是指含有已定义过的C_2-6炔基作为炔基部分的炔基羰基，包括例如乙炔基羰基等。

本说明书中，所谓“C_1-6烷基羰基”，表示基团-CO(C_1-6烷基)，其中，该C_1-6烷基与前文中的定义相同。

本说明书中，所谓“C_1-6烷氧基羰基”，表示基团-CO(C_1-6烷氧基)，其中，该C_1-6烷氧基与前文中的定义相同。

本说明书中，所谓“C_1-6烷基羰基氨基”，表示基团-NHCO(C_1-6烷基)，其中，该C_1-6烷基与前文中的定义相同。

本说明书中，所谓“C_1-6芳基羰基氨基”，表示基团-NHCO(芳基)，其中，该芳基与前文中的定义相同。

本说明书中的“5～7元含氮杂环”包括例如吡咯环、吡咯烷环、哌啶环、高哌啶环、哌嗪环、高哌嗪环、吗啉环、硫代吗啉环等饱和杂环。

本说明书中的“4～8元含氮杂环”包括例如吡咯环、氮杂环丁烷环、吡咯烷环、哌啶环、高哌啶环、哌嗪环、高哌嗪环、吗啉环、硫代吗啉环等、及5～7元含氮杂环。

本说明书中的“含有2个氮原子的5～7元杂环”包括例如咪唑烷、四氢嘧啶等。

本说明书中，在亚烷基的1个以上的位置插入O时，导致该亚烷基链在主链中含有醚键，为了使该插入形成稳定的结构，以不形成-O-O-及-O-CH₂-O-的结构的形式来进行上述插入，这是本领域技术人员可以容易理解的。以上情况也适用向亚烷基插入S的情况。

本说明书中，所谓共聚物，是指将对应于各单元的单体混合并进行聚合反应而形成的高分子链的聚集体。所谓聚合物，表示单体单元进行键合而连接形成的高分子链。

本说明书中，所谓“抗衡阴离子(counter anion)”，只要是有机化学技术领域中通常用作有机化合物的抗衡阴离子的阴离子即可，不受特别限制，包括例如卤化物阴离子(氯化物离子、溴化物离子、氟化物离子、碘化物离子)、有机酸的共轭碱(例如乙酸离子、三氟乙酸离子)、硝酸离子、硫酸离子、碳酸离子等。本发明中，作为优选的抗衡阴离子，可举出例如三氟甲磺酸离子、氯化物离子、硝酸离子等。

需要说明的是，本领域技术人员可以容易地理解，抗衡阴离子为二价以上时，其与相应个数的离子性官能团形成离子键。

2.细胞内递送媒介物

本发明的所谓细胞内递送媒介物，是指表面被正电荷覆盖的任意形状的凝胶颗粒：

[化学式1]

本发明的细胞内递送媒介物的形状优选为大致椭圆球形，进一步优选为大致球形。

该细胞内递送媒介物可以填充期望的成分或化合物而形成细胞内递送复合体。另外，可以使期望的成分或化合物与该细胞内递送媒介物进行共价键合而形成细胞内递送复合体。细胞内递送媒介物及上述细胞内递送复合体能够容易地导入细胞内，并且不会阻碍所导入细胞的存活及增殖。此外，本说明书的实施例中，也确认到导入细胞后的本发明的媒介物具有不阻碍细胞分化的优点。

根据一个优选实施方式，本发明的细胞内递送媒介物具有以下结构，

[化学式2]

3.细胞内递送媒介物的制造方法

本发明的细胞内递送媒介物例如可如下制造：制备两个末端中至少一个末端的单元或其附近的单元具有正电荷的聚合物，使该聚合物在分子间交联。根据一个优选实施方式，本发明的细胞内递送媒介物可以通过使用阳离子性聚合引发剂、含有碳-碳双键的单体和交联剂进行自由基聚合反应来制造。

(1)阳离子性聚合引发剂

本发明中使用的阳离子性聚合引发剂具有以下特征：(a)在常温下稳定，(b)为水溶性，(c)能产生引发自由基聚合反应的自由基，(d)在广泛的pH范围(至少中性附近)内，在自由基聚合反应后的聚合物的末端处也具有正电荷。

此处，阳离子性聚合引发剂优选在细胞内保持正电荷。多数细胞内的pH为2～9，并且常见的动物、植物及微生物的细胞的pH为4～8左右。因此，期望阳离子性聚合引发剂在上述pH的范围内保持正电荷。

本发明的阳离子性聚合引发剂具有例如通式(I)的化学结构，

[化学式3]

[式中，

Y表示单键或CR⁸⁵，

Z表示单键或CR⁸⁶，

R⁷²、R⁷³、R⁷⁵、R⁷⁶、R⁷⁷、R⁷⁸、R⁸⁵及R⁸⁶各自独立地选自由氢原子、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、苯基及羟基组成的组，其中，上述C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基及苯基可以进一步被选自由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、苯基及羟基组成的组中的1个或2个取代基取代，

R⁷²及R⁷³进而可以各自独立地表示被金刚烷基或Si(OCH₃)₂(CH₃)取代的C_1-6烷基，或者，R⁷⁵及R⁷⁶、或R⁷⁷及R⁷⁸可以一同形成-(CH₂)_3-5-，

R⁸¹、R⁸²、R⁸³及R⁸⁴为选自由C_1-4烷基、C_1-4烷基羰基及C_1-3烷氧基组成的组中的取代基，其中，上述C_1-4烷基可以被一个C_1-3烷氧基取代，并且，

R⁷¹及R⁷⁴各自独立地为C_1-3烷基，X_f ^-为抗衡阴离子]。

本发明的一个实施方式中，式(I)的Y及Z表示单键。

另一实施方式中，式(I)的R⁸¹、R⁸²、R⁸³及R⁸⁴各自独立地选自由甲基、乙基、甲基羰基、异丁基及2-甲基-2-甲氧基-丙基组成的组。

另一实施方式中，式(I)的R⁷¹及R⁷⁴为甲基。

另一实施方式中，式(I)的R⁷²、R⁷³、R⁷⁵、R⁷⁶、R⁷⁷、R⁷⁸、R⁸⁵及R⁸⁶各自独立地选自由氢原子、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、苯基及羟基组成的组。

另一实施方式中，式(I)的R⁷⁵及R⁷⁶、或R⁷⁷及R⁷⁸一同形成-(CH₂)₄-。

根据本发明的优选实施方式，式(I)的R⁷²及R⁷³、R⁷⁵及R⁷⁷、R⁷⁶及R⁷⁸、R⁸¹及R⁸⁴、R⁸²及R⁸³、以及R⁷¹及R⁷⁴分别表示相同的取代基，并且，Y及Z表示相同的取代基、或均表示单键。

根据本发明的阳离子性聚合引发剂的进一步优选的实施方式，式(I)的R⁷¹、R⁷²、R⁷³、R⁷⁴、R⁸¹、R⁸²、R⁸³及R⁸⁴为甲基，R⁷⁵、R⁷⁶、R⁷⁷及R⁷⁸为氢原子，Y及Z为单键。

式(I)的化合物的合成法不受特别限定，例如可以如下地进行合成。

首先，将α,α’-偶氮双异丁腈(AIBN)衍生物(化学式4)溶解于适当的溶剂中，在过量甲醇的存在下，于室温通入氯化氢气体，由此可以得到活性的亚氨基酯(iminoester)衍生物(化学式5)。需要说明的是，本说明书中，结构式中的Me表示甲基。接着，向该亚氨基酯衍生物添加过量的乙二胺等亚烷基二胺衍生物(化学式6)，通过搅拌可以得到形成环状结构的化合物(化学式7)。然后，将产物溶解于二氯甲烷中，在室温、脱氧条件下，与2.1当量的三氟乙磺酸酯R⁷¹OTf或R⁷⁴OTf反应，由此引发N烷基化反应，可以得到式(I)表示的目标化合物。

[化学式4]

[化学式5]

[化学式6]

[化学式7]

上述的式(I)的化合物为新型化合物，其构成本发明的方案之一。

(2)单体

作为用作自由基聚合反应原料的单体，只要是含有碳-碳双键的化合物，则可以使用任何化合物。另外，在填充所期望的成分、化合物，或者进行化学键合时，本领域技术人员可以从中适宜选择适合的物质。另外，从生物相容性、分解容易性等的观点考虑，本领域技术人员可以从中适宜选择适当的物质。此外，从自由基聚合反应的效率、经济性、安全性等的观点考虑，本领域技术人员可以从中适宜选择适当的物质。

本发明的一个实施方式中，例如，填充的成分或化合物是分子量为1000以下的小分子时，可以选择通过提高交联剂浓度、缩小孔径大小得到的媒介物。此外，小分子容易通过扩散而从其媒介物的网眼向外漏出，因此，期望如以下所述的那样利用小分子的疏水性、电荷等来促进与媒介物的相互作用，或者选择能够经由共价键而与媒介物直接键合的单体。另一方面，分子量较大的高分子的情况下，可举出通过适当选择交联剂的浓度来控制网眼的方案。

另一实施方式中，重视生物相容性时，可举出使用PEG等单体的方案。

另一实施方式中，填充的成分或化合物具有电荷的情况下，可以选择具有离子性基团(其抗衡所述电荷)的单体。例如，填充的成分或化合物具有负电荷时，可举出胺等含有具有正电荷的侧链的单体等，填充的成分或化合物具有正电荷时，可举出羧酸等含有具有负电荷的侧链的单体等。

另一实施方式中，可以根据填充的成分或化合物的疏水性·亲水性来选择单体。例如，填充的成分或化合物为疏水性高的分子时，可举出在侧链中不含有羟基、胺基及离子性基团、且碳原子数大的单体，进而，填充的成分或化合物为含有苯环的结构时，通过从前述单体中选择在侧链上含有苯基的单体，能够利用相互作用来维持填充成分在媒介物内的稳定性。另一方面，填充的成分或化合物是容易溶于水的亲水性高的分子时，可举出在侧链上含有羟基、胺基及离子性基团的单体。

另一实施方式中，使成分或化合物与细胞内递送媒介物进行共价键合的情况下，通过合成使丙烯酰胺系的单体等与目标小分子或高分子进行共价键合的化合物，从而可使用该化合物作为媒介物的单体。

另一实施方式中，考虑以响应pH的方式将填充的成分或化合物释放至媒介物外时，通过选择化学结构响应于pH而发生变化的单体，从而能够控制媒介物的孔径大小、与填充的成分或化合物的相互作用的强弱。作为这样的单体，可举出在侧链含有羧酸、胺的单体。

另一实施方式中，考虑以响应温度的方式将填充的成分或化合物释放至媒介物外时，通过选择聚合物结构响应于温度而发生变化的单体，从而能够控制媒介物的孔径大小、与填充的成分或化合物的相互作用的强弱。作为这样的单体，可举出丙烯酰胺系的单体。

另一实施方式中，考虑以响应紫外线等的光的方式将填充的成分或化合物释放至媒介物外时，通过选择单体的一部分结构响应于UV而发生解离的单体，从而能够大幅度改变媒介物的结构，将填充的成分或化合物释放至媒介物外。作为这样的单体，可举出PEG-photo-MA(Murayama、Shuhei等人，“NanoPARCEL:a method for controlling cellularbehavior with external light.”Chemical Communications 48.67(2012):8380-8382.)这样的光解离性单体。

(3)交联剂

作为用作自由基聚合反应原料的交联剂，只要是在分子中含有两个以上乙烯基、且通常被用作交联剂的单体则没有特别限制。作为该交联剂的具体例子，可举出N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、N,N’-亚乙基双丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双甲基丙烯酰胺、N,N’-亚乙基双甲基丙烯酰胺、乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯等。

使用的交联剂单体的量不受特别限定，例如，可以使用相对于后述的式(a)、(b)及(c)的单体而言为0.1～20摩尔％的量。

(4)反应条件

本发明的细胞内递送媒介物可以基于高分子合成技术领域的常识进行合成，可通过例如自由基聚合等而以聚合物的形式得到。

常见的细胞内递送媒介物的制造方法如下。

[化学式8]

相对于使用的单体而言，聚合引发剂的使用量为0.01摩尔％以上的量即可，可以在自由基合成进行的浓度范围内选择合适的量。例如，可以使用0.1摩尔％以上、优选1摩尔％以上的聚合引发剂。

用于聚合反应的反应溶剂不受特别限定，作为例子，可举出水、二氧杂环己烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等。自由基聚合不受特别限定，可以在例如0～100℃、优选50～70℃的反应温度、以及例如1～48小时、优选2～16小时的反应时间的条件下进行。

使用交联剂单体的情况下，可以利用该技术领域中惯用的手法来进行共聚反应。

作为用于该共聚反应的反应溶剂，不受特别限制，可以使用例如含有表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠、十二烷基苯硫酸钠、十五烷硫酸钠、N-十二烷基-N,N,N-三甲基溴化铵、N-十六烷基-N,N,N-三甲基溴化铵、Triton X-100等)的水。

使用交联剂单体得到的共聚物的纳米凝胶(纳米尺寸的凝胶微粒)的大小可以根据共聚反应中的搅拌效率、反应温度、表面活性剂的使用量、反应引发剂的使用量、交联剂单体的使用量进行调节。例如，通过增加表面活性剂及/或反应引发剂的使用量，可以得到尺寸较小的纳米凝胶，本领域技术人员可以对得到的纳米凝胶的大小进行适当调节，本发明的共聚物的纳米凝胶的大小为例如5～100nm。

该共聚反应不受特别限定，可举出例如0～100℃、优选50～70℃的反应温度、及例如1～48小时、优选2～16小时。

4.细胞内递送复合体

通过在上述细胞内递送媒介物中填充期望的成分或化合物、或使该成分或化合物与上述细胞内递送媒介物结合，从而可以制造细胞内递送复合体。

(1)将期望的成分或化合物填充至上述细胞内递送媒介物而成的细胞内递送复合体的制造方法

将期望的成分或化合物填充至细胞内递送媒介物而成的细胞内递送复合体可以按照常规方法如下地进行制备。

(i)在聚合反应环境下使填充的化合物·分子以其原本状态存在、引发自由基聚合反应的情况下，可以利用例如乳液聚合等而使化合物·分子成为能够溶解的状态，在不易损害化合物·分子的稳定性的温度、溶剂条件下进行聚合。然后，通过离心、透析及过滤等操作，使填充的化合物·分子与媒介物分离，由此可以制备目标媒介物。

(ii)将细胞内递送媒介物浸渍于含有应填充的化合物等的溶液中进行吸附的情况下，通过根据填充的成分或化合物的电荷、极性选择相互作用强的单体，从而能够促进吸附。也可以通过搅拌处理、温度控制来提高吸附量。另外，使用生物素这样的具有侧链的物质作为单体、或者填充的化合物与链霉亲和素形成融合蛋白等的情况下，与媒介物的结合力非常强，从而能够合成不易使应填充的化合物漏出的稳定的媒介物。

(iii)将细胞内递送媒介物浸渍于含有应填充的化合物等的溶液中而使其浸透的情况下，通过选择使媒介物的结构根据例如pH、温度等而发生变化的单体，由此可以在浸渍时扩大网眼结构(孔大小)，并在浸渍浸透后缩小网眼结构，从而将化合物(主要为高分子)封闭在媒介物内。然后，通过离心、透析及过滤等操作，使填充的化合物·分子与媒介物分离，由此可以制备目标媒介物。

(2)期望的成分或化合物与上述细胞内递送媒介物进行共价键合而成的细胞内递送复合体的制造方法

期望的成分或化合物与细胞内递送媒介物进行共价键合而成的细胞内递送复合体可以按照本领域技术人员已知的常规方法，如下所述地进行制备。

(i)使聚合前的单体与期望的成分或化合物结合、使制备得到的产物进行自由基聚合反应的情况下，在可以促进聚合的温度条件下，能够比较容易地得到作为聚合物的媒介物。然后，可以通过再沉淀、过滤、离心、盐析等来纯化媒介物。

(ii)在首先制造细胞内递送媒介物、然后使期望的成分或化合物与其结合的情况下，向聚合前的单体赋予特定的活性基团，并在聚合后使期望的成分或化合物(其具有与该活性基团特异性反应的结构)与媒介物反应，由此可以使化合物经由共价键与媒介物结合。例如，可以利用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯-氨基的反应、马来酰亚胺基-巯基的特异性键合反应。

(3)填充至细胞内递送媒介物的成分或化合物的例子

作为填充至本发明的细胞内递送媒介物的期望的成分或化合物的优选例，可举出以下例子。

·填充胰岛素，实现促进经皮吸收。

·填充美白成分、化妆成分，实现促进它们向皮肤外皮细胞内的转移。

·填充作为染发剂的染料，提高向毛发的渗透力。

·制备填充了有益于毛发的成分的洗发水、护发素，提高向毛发的渗透力。

·填充遗传物质，发挥不阻碍细胞分裂的特性从而实现该遗传物质向细胞内的高效导入。

·填充药物，实现向癌细胞等靶细胞内的高效的药物递送。

·填充墨水，实现墨水成分的分散稳定化。

(4)细胞内递送复合体的细胞内迁移方法

将本发明的细胞内递送媒介物导入细胞时，期望置换为离子强度低的溶液(溶剂)。作为这样的溶剂，可举出例如水(优选为纯水)及山梨糖醇水溶液、葡萄糖溶液等。根据细胞的种类，也可以适合地使用向上述葡萄糖溶液等中添加0.45mM氯化钙而成的溶液等。

根据本发明向细胞导入细胞内递送媒介物时，可以对细胞内递送媒介物聚合物的浓度进行调节，例如使共聚物的最终浓度为0.001～1％(w/v)、优选0.01～0.5％(w/v)，从而能够与菌体混合。该方案不限于微生物菌体这样的对象，也适用黏附细胞等其他细胞。

本发明的细胞内递送复合体也可以通过与上述同样的方法导入细胞内。

5.阳离子性凝胶型温度敏感性探针

本发明的细胞内递送复合体也可应用于温度敏感性探针。此时，可以通过使用了热敏性单元、荧光性单元、阳离子性聚合引发剂及交联剂的共聚反应来制造，从而能够以用作本发明的温度敏感性探针的共聚物的形式而得到。

对于热敏性单元和荧光性单元的组合而言，只要是某些特性根据周围的温度而发生变化的热敏性单元、与荧光强度或荧光寿命根据所述热敏性单元的特性变化而发生变化的荧光性单元的组合，则可以使用任何。本领域技术人员可以根据细胞的种类、期望测定的温度范围(temperature range)来选择适当的组合。根据本发明的优选实施方式，热敏性单元是在形成聚合物时，其形状、疏水性根据温度而变化的物质，例如，具有最低临界溶液温度、最高临界溶液温度(LCST、UCST)的分子。表现例如LCST行为的情况下，以某温度为临界，在高于所述温度的温度，该分子内、或分子之间的疏水结合增强，聚合物链凝聚；反之，在低于所述温度的温度，聚合物链与水分子进行结合而发生水合，引起相变行为。荧光性单元的荧光强度或荧光寿命根据热敏性单元的形状变化而变化。对于热敏性单元而言，对应于温度的形状变化会改变其在水中的溶解性，这是已知的，此时，可以使用具有溶剂化变色(Solvatochromic)性质(即，荧光性单元的荧光强度或荧光波长或荧光寿命根据溶剂的极性而变化)的荧光性单元。

(1)热敏性单元的优选例

用作本发明的温度敏感性探针的共聚物所含有的热敏性单元的优选例为来源于以下式(a)表示的1种或2种以上单体的1种或2种以上重复结构，

[化学式9]

[式中，R¹选自氢原子及C_1-3烷基；

R⁴及R⁵独立地选自氢原子及C_1-20烷基，其中，该烷基可以被选自羟基、C_1-6烷氧基、及芳基中的1种以上取代基取代；或者，R⁴及R⁵和与其键合的氮原子一同形成4～8元含氮杂环，其中，该杂环可以被选自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、硝基、卤素原子、C_1-10烷基羰基氨基及芳基羰基氨基中的1种以上取代基取代]。

(2)荧光性单元的优选例

用作本发明的温度敏感性探针的共聚物所含有的荧光性单元的优选例为来源于以下式(b)表示的1种或2种以上单体的1种或2种以上重复结构：

为来源于下式表示的单体的重复结构，

[化学式10]

[式中，R³选自氢原子及C_1-3烷基；

X²为O、S或N-R¹²；

X³为直接键合、O、S、SO、SO₂、N(-R¹³)、CON(-R¹⁶)、N(-R¹⁶)CO、N(-R¹⁷)CON(-R¹⁸)、SO₂N(-R¹⁹)或N(-R¹⁹)SO₂；

Q²选自C_1-20亚烷基、C_3-20亚烯基或C_3-20亚炔基，其中上述亚烷基可以在1个以上位置独立地插入O、S或亚苯基；

Ar选自6～18元芳香族碳环基或5～18元芳香族杂环基，其中，该芳香族碳环基及芳香族杂环基可以包含所含环中的1个以上为芳香族环的稠环，在该芳香族碳环基及芳香族杂环基中以环原子的形式而存在的-CH₂-可以被取代为-C(O)-，进而，该芳香族碳环基及芳香族杂环基可以被选自卤素原子、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基、C_1-6烷基磺酰基、硝基、氰基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、羧基、甲酰基、-NR⁶R⁷及-SO₂NR¹⁴R¹⁵中的1种以上取代基取代(其中上述C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基、C_1-6烷基磺酰基、C_1-6烷基羰基及C_1-6烷氧基羰基中所含有的烷基可以被选自卤素原子、C_1-6烷氧基、羟基、氨基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6烷基)氨基、芳基及羧基中的1种以上取代基取代)；

R⁶及R⁷独立地选自氢原子、C_1-10烷基、芳基、C_1-10烷基羰基、芳基羰基、C_1-10烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基甲酰基、N-(C_1-10烷基)氨基甲酰基及N,N-二(C_1-10烷基)氨基甲酰基，其中上述C_1-10烷基、C_1-10烷基羰基、C_1-10烷基磺酰基、N-(C_1-10烷基)氨基甲酰基及N,N-二(C_1-10烷基)氨基甲酰基中所含有的烷基可以被选自卤素原子、C_1-6烷氧基、羟基、氨基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6烷基)氨基、芳基及羧基中的1种以上取代基取代，进而，上述芳基、芳基羰基、及芳基磺酰基中所含有的芳基可以被选自卤素原子、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基及羧基中的1种以上取代基取代；或者，

R⁶及R⁷和与其键合的氮原子一同形成4～8元含氮杂环，其中，该杂环可以被选自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、硝基、卤素原子、C_1-10烷基羰基氨基及芳基羰基氨基中的1种以上取代基取代；

R¹²为氢原子、C_1-6烷基或-Q²-X³-Ar，其中，该烷基可以被选自羟基、卤素原子、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基及C_1-6烷基磺酰基中的1种以上取代基取代；

R¹³为氢原子或C_1-6烷基，其中，该烷基可以被选自羟基、卤素原子、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基及C_1-6烷基磺酰基中的1种以上取代基取代；

R¹⁴及R¹⁵独立地选自氢原子及C_1-6烷基；或者R¹⁴及R¹⁵和与其键合的氮原子一同形成4～8元含氮杂环；

R¹⁶、R¹⁷、R¹⁸及R¹⁹独立地选自氢原子、及C_1-6烷基，其中，该烷基可以被选自羟基、卤素原子、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基及C_1-6烷基磺酰基中的1种以上取代基取代]。

本发明的温度敏感性探针中，可以根据情况合用第二荧光性单元。与第二荧光性单元合用的情况下，将前文说明的荧光性单元称为“第一荧光性单元”。

第二荧光性单元具有与第一荧光性单元不同的最大荧光波长。使用第二荧光性单元的实施方式中，在使用了本发明的温度敏感性探针的温度测定中，通过算出来自第一荧光性单元的荧光强度与来自第二荧光性单元的荧光强度之比，将该比值与实际温度对应，从而能够以高精度且简便地在短时间内对温度进行测定。

期望第一荧光性单元及第二荧光性单元基于同一波长的激发光的照射而产生最大荧光波长彼此不同的荧光。另外，关于第一荧光性单元的最大荧光波长与第二荧光性单元的最大荧光波长之差，在同时测定2个波长处的荧光强度的情况下，以能够被测定器充分识别的程度分开即可，不受特别限制，优选为50nm以上。

根据本发明的优选实施方式，第一荧光性单元及第二荧光性单元中的任一者的荧光强度伴随温度的上升而上升，另一者的荧光强度则伴随温度的上升而不发生变化、或伴随温度的上升而下降，优选伴随温度的上升而下降。

可以与式(c)表示的第一荧光性单元组合的第二荧光性单元的优选例为来源于以下式(c)表示的单体的重复结构，

[化学式11]

[式中，R⁵⁵选自氢原子及C_1-3烷基；

R⁵¹、R⁵²、R⁵³及R⁵⁴独立地选自氢原子及C_1-6烷基；

X⁴为直接键合、亚苯基、-Q⁴-O-C(＝O)-(其中，Q⁴与硼二吡咯甲川(borondipyrromethene)骨架直接键合)、-Q⁴-N(-R⁶¹)-C(＝O)-(其中，Q⁴与硼二吡咯甲川骨架直接键合)；

R⁶¹选自氢原子及C_1-6烷基；

Q⁴选自C_1-20亚烷基、亚苯基及亚萘基，该亚苯基及亚萘基可以被选自卤素原子、C_1-6烷氧基、羟基、氨基及羧基中的1种以上取代基取代]。

(3)用作本发明的温度敏感性探针的共聚物

根据本发明的优选实施方式，本发明中使用的共聚物在主链的至少一个末端包含来源于式(I)表示的阳离子性聚合引发剂的结构，和接下来的分别来源于式(a)表示的单体及式(b)表示的单体的重复结构，并且包含由交联剂生成的交联结构。

根据本发明的进一步优选的实施方式，本发明中使用的共聚物包含式(I’)、式(A)、及式(B)表示的重复单元，还包含由交联剂M_K生成的交联结构。该共聚物中，a为100，b优选为0.05～2。另外，该共聚物中，以式(I’)的结构存在于末端作为条件，其他重复结构、即式(A)及式(B)的重复单元以及由交联剂M_K生成的交联结构可以按照任何顺序排列。此外，对于该共聚物而言，关于各重复单元，可以包含各式表示的一种或两种以上重复单元。该共聚物的物质本身构成本发明的方案之一。

[化学式12]

[式中，R⁷¹、R⁷²、R⁷⁵、R⁷⁶、R⁸¹、R⁸²及Y、R¹、R⁴及R⁵、以及R³、X²、X³、Q²及Ar与前文中的定义相同，a及b表示各重复单元之比，为大于0的数值。]

根据本发明的另一优选实施方式，本发明中使用的共聚物在主链的至少一个末端包含来源于式(I)表示的阳离子性聚合引发剂的结构，和接下来的分别来源于式(a)表示的单体、式(b)表示的单体及式(c)表示的单体的重复结构，并且包含由交联剂生成的交联结构。

根据本发明的进一步优选的实施方式，本发明中使用的共聚物包含式(I’)、式(A)、式(B)及式(C)表示的重复单元，还包含由交联剂M_K生成的交联结构。该共聚物中，a为100，b优选为0.05～2，c优选为0.005～1。另外，该共聚物中，以式(I’)的结构存在于末端作为条件，其他重复结构、即式(A)、式(B)及式(C)的重复单元以及由交联剂M_K生成的交联结构可以按照任何顺序排列。此外，对于该共聚物而言，关于各重复单元，可以包含各式表示的一种或两种以上重复单元。该共聚物的物质本身构成本发明的方案之一。

[化学式13]

[式中，R⁷¹、R⁷²、R⁷⁵、R⁷⁶、R⁸¹、R⁸²及Y、R¹、R⁴及R⁵、以及R³、X²、X³、Q²及Ar、以及R⁵⁵、X⁴、R⁵¹、R⁵²、R⁵³及R⁵⁴与前文中的定义相同，a、b及c表示各重复单元之比，为大于0的数值。]

根据本发明的优选实施方式，上述共聚物包含两种以上热敏性单元。热敏性单元存在许多种类，呈现最高的温度反应性的温度范围根据其种类的不同而不同。该实施方式中，可以通过将两种以上热敏性单元进行组合来进行调节，以使得共聚物的温度反应性在期望的温度范围内升高。根据本发明的更优选实施方式，上述共聚物包含上述式(a)表示的两种以上热敏性单元。另外，一个实施方式中，使用两种热敏性单元。例如，动物细胞的通常培养温度即35℃附近的测定中，优选使用N-正丙基丙烯酰胺(NNPAM)和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)的组合。另外，出于监控酵母等微生物的发酵等目的，而需要在25℃以下的温度区域进行测定时，优选使用N-叔丁基丙烯酰胺(NTBAM)和NNPAM的组合。

式(A)中的a表示热敏性单元整体的总和，使用两种以上热敏性单元时，表示全部热敏性单元的重复单元数的比率之和。

根据本发明的优选实施方式，上述的共聚物中，Ar为选自由下式表示的基团中的芳香族碳环基或芳香族杂环基，这些基团可以在该环上被选自卤素原子、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基、C_1-6烷基磺酰基、硝基、氰基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、羧基、甲酰基、-NR⁶R⁷及-SO₂NR¹⁴R¹⁵中的1种以上取代基取代(其中上述C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基、C_1-6烷基磺酰基、C_1-6烷基羰基及C_1-6烷氧基羰基中所含有的烷基可以被选自卤素原子、C_1-6烷氧基、羟基、氨基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6烷基)氨基、芳基及羧基中的1种以上取代基取代)；

X¹⁰选自O、S或Se；

R⁸选自氢原子、C_1-10烷基及芳基，该烷基可以被选自卤素原子、C_1-6烷氧基、羟基、氨基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6烷基)氨基、芳基及羧基中的1种以上取代基取代，此外，上述芳基可以被选自卤素原子、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基及羧基中的1种以上取代基取代，

[化学式14]

根据本发明的进一步优选的实施方式，Ar为选自由下式表示的基团中的芳香族碳环基或芳香族杂环基，这些基团可以在该环上被选自卤素原子、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基、C_1-6烷基磺酰基、硝基、C_1-6烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氰基、甲酰基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、羧基及-SO₂NR¹⁴R¹⁵中的1种以上取代基取代，

[化学式15]

本发明中，R¹、R²、R³及R⁵⁵优选选自氢原子及甲基。

式(a)及式(A)中的-NR⁴R⁵不受特别限定，例如，R⁴可以是氢原子，R⁵可以是C_2-10烷基。另外，R⁴及R⁵和与其键合的氮原子一同形成4～8元含氮杂环时，可以形成例如吡咯烷环、哌啶环、高哌啶环、哌嗪环、高哌嗪环、吗啉环、硫代吗啉环等。

对于式(b)及式(B)中的-X²-Q²-而言，优选的是：X²为O、NH或N(C_1-6烷基)，Q²为C_2-10亚烷基。

式(b)及式(B)中的-Ar优选为选自下式(V)～(XII)中的基团，

[化学式16]

[式中，R³¹选自氢原子、卤素原子、硝基、氰基及-SO₂NR¹⁴R¹⁵；R³²为C_1-6烷基；X¹¹为N-R³³、O或S；R³³为氢原子或C_1-6烷基；X¹⁰、R¹⁴及R¹⁵与前文中的定义相同]。

对于式(V)而言，作为优选的X³，可举出例如直接键合、CON(-R¹⁶)、N(-R¹⁶)CO、SO₂N(-R¹⁹)或N(-R¹⁹)SO₂。

对于式(VI)而言，作为优选的X³，可举出例如N-R¹³(此处，作为优选的R¹³可举出甲基等C_1-3烷基)或S。

对于式(VII)而言，作为优选的X³，可举出例如直接键合、CON(-R¹⁶)、N(-R¹⁶)CO、SO₂N(-R¹⁹)或N(-R¹⁹)SO₂。

对于式(VIII)而言，作为优选的X³，可举出例如直接键合、CON(-R¹⁶)、N(-R¹⁶)CO、SO₂N(-R¹⁹)或N(-R¹⁹)SO₂。

对于式(IX)而言，作为优选的X³，可举出例如直接键合。

对于式(X)而言，作为优选的X³，可举出例如直接键合。

对于式(XI)而言，作为优选的X³，可举出例如CO、SO₂、SO₂N(-R¹⁹)或CON(-R¹⁶)(其中，上述SO₂N(-R¹⁹)及CON(-R¹⁶)的硫原子及碳原子分别与Ar键合)。

对于式(XII)而言，作为优选的X³，可举出例如CO、SO₂、SO₂N(-R¹⁹)或CON(-R¹⁶)(其中，上述SO₂N(-R¹⁹)及CON(-R¹⁶)的硫原子及碳原子分别与Ar键合)。

本发明中，基团-X³-Ar作为环境响应性的荧光团(fluorophore)发挥作用，例如，使用式(V)或(VII)的荧光团的情况下，可以得到荧光强度伴随温度的上升而下降的温度传感器，使用式(VI)或(VIII)～(XII)的荧光团的情况下，可以得到荧光强度伴随温度的上升而上升的温度传感器。

式(c)及式(C)中的R⁵¹、R⁵²、R⁵³及R⁵⁴优选独立地选自氢原子及甲基。

式(c)及式(C)中的X⁴优选为例如直接键合、亚苯基、-Q⁴-O-C(＝O)-(其中，Q⁴与硼二吡咯甲川骨架直接键合)或-Q⁴-NH-C(＝O)-(其中，Q⁴与硼二吡咯甲川骨架直接键合)。

式(c)及式(C)中的Q⁴优选为亚苯基。

根据本发明的特别优选的实施方式，R¹选自氢原子、甲基及乙基；R⁴选自正丙基、异丙基及叔丁基，R⁵为氢原子；R³选自氢原子及C_1-3烷基；X²为O或N-R¹²；X³为直接键合、O、N(-R¹³)、CON(-R¹⁶)、N(-R¹⁶)CO或N(-R¹⁷)CON(-R¹⁸)；Q²选自C_1-20亚烷基、C_3-20亚烯基或C_3-20亚炔基，其中上述亚烷基可以在1个以上位置独立地插入O、S或亚苯基；Ar为选自由下式表示的基团中的芳香族碳环基或芳香族杂环基，这些基团可以在该环上被选自卤素原子、C_1-6烷氧基、硝基、氰基、-NR⁶R⁷及-SO₂NR¹⁴R¹⁵中的1种以上取代基取代，还可以被C_1-6烷基取代；X¹⁰选自O、S或Se；R⁸选自氢原子、C_1-10烷基及芳基；R⁶及R⁷独立地选自氢原子、C_1-10烷基、芳基、C_1-10烷基羰基、芳基羰基、C_1-10烷基磺酰基、芳基磺酰基及氨基甲酰基；或者，R⁶及R⁷和与其键合的氮原子一同形成5～7元含氮杂环，其中，该杂环可以被选自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、硝基及卤素原子中的1种以上取代基取代；R¹²为氢原子、C_1-6烷基或-Q²-X³-Ar，其中，该烷基可以被选自羟基及卤素原子中的1种以上取代基取代；R¹³为氢原子或C_1-6烷基，其中，该烷基可以被选自羟基及卤素原子中的1种以上取代基取代；R¹⁴及R¹⁵独立地选自氢原子及C_1-6烷基；或者，R¹⁴及R¹⁵和与其键合的氮原子一同形成5～7元含氮杂环；R¹⁶、R¹⁷及R¹⁸独立地选自氢原子及C_1-6烷基，其中，该烷基可以被选自羟基及卤素原子中的1种以上取代基取代；R⁵¹、R⁵²、R⁵³、R⁵⁴及R⁵⁵独立地选自氢原子及甲基；X⁴为直接键合、亚苯基、-Q⁴-O-C(＝O)-(其中，Q⁴与硼二吡咯甲川骨架直接键合)或-Q⁴-NH-C(＝O)-(此处，Q⁴与硼二吡咯甲川骨架直接键合)，Q⁴为亚苯基，

[化学式17]

式(A)、式(B)及式(C)中的a、b及c表示式中的各重复单元之比，为大于0的数值，不受特别限制，例如，a为100时，b为0.01～10，具体为0.02～5，优选为0.05～2，更优选为0.1～1.5。c为0.001～5，具体为0.002～2，优选为0.005～1，更优选为0.01～1。表示b与c之比的b/c不受特别限定，优选为0.1～30，更优选为1～20，进一步优选为3～10。如上述那样，a为热敏性单元的总和，例如，使用两种热敏性单元时，关于热敏性单元之比，采用某数值p，则表示为p:a-p。另外，本发明的共聚物的大小不受特别限定，例如为1～100000nm，优选为1～10000nm，更优选为1～1000nm。

本发明的共聚物非常迅速地响应周围的温度变化，其结构变化为数毫秒。即，本发明的温度敏感性荧光探针的荧光强度敏捷地响应细胞内的温度变化而发生变化，因此，使用显微镜等将细胞内的温度分布进行可视化时，可以根据其荧光强度比来对细胞内的各微小空间处的细胞内温度进行定量。

为了在不受含有本发明的共聚物的溶液中的pH、盐浓度影响的情况下实施温度测定，该共聚物中含有的阳离子性官能团期望能够在广范围的pH中维持离子性。然而，就测定细胞内温度的用途而言，细胞内的pH为2～9，进而，通常状态下的一般动物、植物、微生物细胞的情况下，pH为4～8左右。

(4)测定方法

本发明中使用的共聚物的由热敏响应性导致的荧光强度变化可以利用通常的荧光强度测定方法进行测定。测定中的激发波长及测定的荧光波长不受特别限定，例如，可以使用对测定试样的激发光谱进行测定时的最大激发波长或其附近的波长。另外，测定的荧光波长不受特别限定，例如，可以使用于某温度对测定试样的荧光光谱进行测定时的最大荧光波长或其附近的波长。

本发明中，可以采用下述方法：对某独立的2个荧光波长处的荧光强度进行测定并得到它们的比值，由该荧光强度比换算为温度。利用该手法，可以排除由共聚物发出的荧光强度是来源于微小空间内的共聚物的浓度、激发的激光强度的可能性，从而能够使温度与实验中得到的荧光强度比一一对应。由此，不仅可以进行同一细胞中的温度比较，也可以比较置于同一条件下的不同细胞的细胞内温度。例如，通过测定酵母群中的单个细胞温度的差异，从而能够把握各酵母细胞的生理状态。

荧光强度比的算出方法不受特别限制，可以由包含不同的波长的2个区域的荧光强度算出它们的比值。例如，一个区域设为包含呈现由第一荧光性单元所产生荧光的最大强度的波长在内为20nm左右的波长区域，其荧光强度的积分值设为S1，另一个区域设为包含呈现由第二荧光性单元所产生荧光的最大强度的波长在内为20nm左右的波长区域，其荧光强度的积分值设为S2，则荧光强度比为S1/S2。此外，S1及S2的区域可以是相同的宽度，也可以是不同的宽度。

例如，荧光强度呈现能够忽略噪声的充分的值时，可以使S1包含20nm宽的波长区域、同时S2为1nm宽的单独波长。波长的选择基准也不受特别限定，考虑得到的荧光强度时，期望基于对形成温度敏感性探针所含有的各荧光性单元的单体(例如，式(b)或式(c)所示的荧光单体)于常温(约25℃)在水中及接近水中的极性溶剂中的激发光谱进行测定时呈现最大荧光强度的波长，而从其周边的波长中选择。

由通过实验得到的荧光强度比求出温度时，可以使用自行制作的标准曲线。具体而言，使用在何种条件下测定得到的标准曲线不受限定，例如，可以使用：针对模仿细胞内的氯化钾溶液中的、共聚物的因热敏响应性所导致的荧光强度变化进行绘图得到的曲线；将已导入共聚物的细胞群供于荧光光度计，针对由热敏响应性所导致的荧光强度变化进行绘图得到的曲线；或者，将已导入共聚物的细胞群供于荧光显微镜，针对多个细胞中的由热敏响应性所导致的荧光强度变化的平均值进行绘图得到的曲线；等等。更具体而言，使用已导入共聚物的细胞群实施热敏响应性试验，针对荧光强度的变化进行绘图时，可举出下述方法：在细胞不积极进行代谢活动的状态(例如，将细胞悬浮于水中、含有无法同化的化合物的缓冲液中的状态)下于特定温度保持一定时间，在认为外部温度与细胞内部温度达到平衡状态的情况下，测定荧光强度，等等。

另外，就本发明中使用的共聚物的由热敏响应性导致的变化而言，可以使用荧光寿命作为指标。该变化可以利用通常的荧光寿命测定法进行测定。测定中的激发波长不受特别限制，例如，可以使用对测定试样的激发光谱进行测定时的最大激发波长或其附近的波长。利用通过实验得到的荧光衰减曲线、根据所测定试样的状态而使用单组分近似(onecomponent approximation)、双组分近似(two component approximation)等通常分析手法，由此可以得到荧光寿命值。

本发明中使用的共聚物的由热敏响应性导致的荧光寿命的变化可以利用通常的荧光寿命测定方法例如单光子计数法、相位调制法、脉冲采样法、激发探针法等手法进行测定。其中，单光子计数法是利用时间轴上的发光强度分布与单个光子的发光概率之间存在相关关系来测定荧光寿命的方法，以50ps～1ns左右的超短(脉冲)光激发荧光团后，测定检测到的光的发射时刻，将多次重复激发得到的直方图作为荧光衰减曲线，并以指数函数的和进行近似处理，确定荧光寿命。利用单光子计数法的荧光寿命的测定可以使用市售的时间相关单光子计数法荧光寿命测定装置及其附带的测定·分析程序进行。

(5)试剂盒

为了实施以上说明的方法，可以将必需的试剂等组装成试剂盒。因此，根据本发明的另一方式，提供用于使用上述方法测定温度的试剂盒，该试剂盒包含本发明的温度敏感性探针或本发明的共聚物。该温度测定用试剂盒可以适用于微小空间内的温度测定、尤其是细胞内的温度测定。该试剂盒可以在医学·生物学·生物工程等研究领域、诊断·治疗等医疗领域中使用。

(6)本发明的方法及试剂盒的用途

本发明的方法及温度测定用试剂盒可以应用于各种研究开发的领域。例如，生物工程的领域中，在使用微生物进行的有用物质的发酵生产中，通过在分析参数中增加迄今为止难以准确测定的细胞内温度，可以期待研究培养条件的高效化。

本发明的方法及温度测定用试剂盒可以应用于各种医疗用途。例如，通过将本发明的温度敏感性探针用于患者的一部分组织，可以辨别被认为产热量多的癌细胞和没有这种表现的正常细胞。此外，还可以用于通过对其进行使用来开发更有效的温热疗法等。或者，向产热量多的褐色脂肪细胞导入本发明的温度敏感性探针，并向该细胞中添加各种材料，测定由此导致的温度变化，从而可以对活化褐色脂肪细胞的材料进行筛选。

本发明的方法及温度测定用试剂盒也可以应用于各种生理现象的阐明。

例如，通过研究TRP通道(其是探测生物体外的温度而引起生物体反应的受体)与细胞内的温度具有怎样的相关关系，从而可以考虑利用与以往不同的途径来激活TRP通道。另外，通过研究细胞内温度分布与细胞内外发生的生物体反应之间的关系，可以调查局部性温度分布对于生物体反应造成的影响，也可以利用使用了红外线激光等的局部性加热来控制细胞。

本发明的温度测定法及温度敏感性探针的细胞导入法可以在体外(in vitro)及体内(in vivo)中的任一方实施。一个实施方式中，在体外实施这些方法。

6.总结

如上所述，根据本发明，可提供以下的发明。

(1)细胞内递送媒介物，其表面被正电荷覆盖。

(2)上述(1)所述的细胞内递送媒介物，其具有以下的化学结构，

[化学式18]

(3)细胞内递送媒介物的制造方法，所述细胞内递送媒介物的表面被正电荷覆盖，所述方法的特征在于，使阳离子性聚合引发剂、含有碳-碳双键的单体与交联剂进行自由基聚合反应。

(4)具有通式(I)的化学结构的化合物，

[化学式19]

[式中，

Y表示单键或CR⁸⁵，

Z表示单键或CR⁸⁶，

R⁷²、R⁷³、R⁷⁵、R⁷⁶、R⁷⁷、R⁷⁸、R⁸⁵及R⁸⁶各自独立地选自由氢原子、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、苯基及羟基组成的组，其中上述C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基及苯基可以进一步被选自由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、苯基及羟基组成的组中的1个或2个取代基取代，

R⁷²及R⁷³还可以各自独立地表示被金刚烷基或Si(OCH₃)₂(CH₃)取代的C_1-6烷基，或者，R⁷⁵及R⁷⁶、或R⁷⁷及R⁷⁸可以一同形成-(CH₂)3-5-，

R⁸¹、R⁸²、R⁸³、及R⁸⁴为选自由C_1-4烷基、C_1-4烷基羰基及C_1-3烷氧基组成的组中的取代基，其中上述C_1-4烷基可以被一个C_1-3烷氧基取代，以及，

R⁷¹及R⁷⁴各自独立地为C_1-3烷基，X_f ^-为抗衡阴离子]。

(5)如(4)所述的化合物，其中，所述Y及Z表示单键。

(6)如(4)或(5)所述的化合物，其中，所述R⁸¹、R⁸²、R⁸³、及R⁸⁴各自独立地选自由甲基、乙基、甲基羰基、异丁基、及2-甲基-2-甲氧基-丙基组成的组。

(7)如(4)～(6)中任一项所述的化合物，其中，所述R⁷¹及R⁷⁴为甲基。

(8)如(4)～(7)中任一项所述的化合物，其中，所述R⁷²及R⁷³、所述R⁷⁵及R⁷⁷、所述R⁷⁶及R⁷⁸、所述R⁸¹及R⁸⁴、所述R⁸²及R⁸³以及所述R⁷¹及R⁷⁴分别表示相同的取代基，并且，所述Y及Z表示相同的取代基、或均表示单键。

(9)如(4)所述的化合物，其中，R⁷¹、R⁷²、R⁷³、R⁷⁴、R⁸¹、R⁸²、R⁸³及R⁸⁴为甲基，R⁷⁵、R⁷⁶、R⁷⁷及R⁷⁸为氢原子，Y及Z为单键。

(10)阳离子性聚合引发剂，其包含上述(4)～(9)中任一项所述的化合物。

(11)细胞内递送媒介物的制造方法，其包括：使上述(10)所述的阳离子性聚合引发剂、含有碳-碳双键的单体与交联剂进行自由基聚合反应。

(12)细胞内递送媒介物，其是利用上述(11)的制造方法得到的。

(13)细胞内递送复合体，其是将递送至细胞内的目标成分或化合物填充至上述(1)所述的细胞内递送媒介物而成的。

(14)细胞内递送复合体的制造方法，其包括：向上述(1)所述的细胞内递送媒介物中填充递送至细胞内的目标成分或化合物。

(15)如上述(13)所述的细胞内递送复合体，其中，递送至细胞内的目标成分或化合物与所述细胞内递送媒介物共价键合。

(16)如上述(13)或(15)所述的细胞内递送复合体，其中，所述化合物为热敏性单元(其特性根据温度变化)及荧光性单元(其荧光强度或荧光寿命伴随所述热敏性单元的特性变化而变化)。

(17)共聚物，其在主链的至少一个末端包含来源于式(I’)表示的阳离子性聚合引发剂的结构，和接下来的分别来源于式(a)表示的单体及式(b)表示的单体的重复结构，并且包含由交联剂生成的交联结构。

(18)共聚物，其包含式(I’)、式(A)及式(B)表示的重复单元，并且包含由交联剂生成的交联结构。

(19)共聚物，其在主链的至少一个末端包含来源于式(I’)表示的阳离子性聚合引发剂的结构，和接下来的分别来源于式(a)表示的单体、式(b)表示的单体及式(c)表示的单体的重复结构，并且包含由交联剂生成的交联结构。

(20)共聚物，其包含式(I’)、式(A)、式(B)及式(C)表示的重复单元，并且包含由交联剂生成的交联结构。。

(21)温度敏感性探针，其包含上述(16)所述的细胞内递送复合体、或上述(17)～(20)中任一项所述的共聚物。

(22)测定细胞内的温度的方法，其包括：

步骤(a)，将上述(21)所述的温度敏感性探针导入细胞内；及

步骤(b)，在激发光照射下，测定荧光强度或荧光寿命。

(23)用于测定细胞内温度的试剂盒，其包含上述(16)所述的细胞内递送复合体、上述(17)～(20)中任一项所述的共聚物或上述(21)所述的温度敏感性探针。

(24)至少一个末端带有正电荷的线性聚合物(linear polymer)的制造方法，其包括：使上述(10)所述的阳离子性聚合引发剂与含有碳-碳双键的单体进行自由基聚合反应。

(25)至少一个末端带有正电荷的线性聚合物，其由下述共聚物形成：所述共聚物在主链的至少一个末端包含来源于式(I’)表示的阳离子性聚合引发剂的结构，和接下来的来源于含有碳-碳双键的单体的重复结构。

(26)至少一个末端带有正电荷的线性聚合物，其是利用上述(24)的制造方法得到的。

(27)复合体，其包含：至少一个末端带有正电荷的线性聚合物；和，带有负电荷的墨水颗粒(ink particles)。

实施例

以下，给出实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

试剂及数据测定

作为用于合成阳离子性聚合引发剂的原料的α,α’-偶氮双异丁腈(AIBN)通过利用甲醇的重结晶进行纯化，作为热敏性单元的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)通过利用正己烷的重结晶进行纯化。其他试剂使用购买的试剂，无需进一步纯化。

¹H-NMR使用BRUKER AVANCE400光谱仪(spectrometer)(400MHz)测定，化学位移以ppm表示。使用JASCO GPC system(JASCO PU-2080泵、JASCO RI-2031差示折射计、JASCOCO-2060柱温箱、Shodex GPC KD-806M柱)，使用利用聚苯乙烯标准试样得到的校正曲线算出数均分子量及重均分子量。硅胶柱色谱法使用了关东化学silica gel 60N(40-50μm)。吸光度的测定使用了JASCO V-650紫外可见光分光光度计。IR的测定使用了SHIMADZU FTIR-8300。质谱分析使用了JMS-700或Brucker micrOTOF II(ESI)。凝胶粒径基于动态光散射法(DLS)、使用Zetasizer Nano ZS(Malvern)进行测定。

实施例A-1：阳离子性聚合引发剂的合成

[化学式20]

将α,α’-偶氮双异丁腈(AIBN)(20.1g，0.12mol)悬浮于20mL甲醇(MeOH)和200mL甲苯(Tol)中。向该溶液吹入氯化氢(HCl)气体(该氯化氢气体是通过向氯化钠(NaCl)(200g)滴加浓硫酸(260mL)产生的)，于室温搅拌5小时。过滤析出的固体，用甲苯(Tol)洗涤，真空干燥，由此得到白色固体的化合物1a(28.3g，收率为77％)。

化合物1a的¹H NMR(400MHz,MeOD-d₄)如下。

δ3.35(s.6H),1.57(s,12H)

化合物1a的质谱分析的结果如下。

HRMS(EI⁺)：对于[C₅H₁₀NO]⁺，计算值为100.0757；实测值100.0761。

另外，化合物1a的元素分析的结果如下。

对于C₁₀H₂₂Cl₂N₄O₂，分析计算值为C,39.87；H,7.36；N,18.60；实测值为C,39.16；H,7.41；N.18.25

[化学式21]

向60mL甲醇(MeOH)添加N-甲基乙二胺(12.6mL，0.14mol)，在减压下经40分钟滴加悬浮于100mL甲苯(Tol)/6mL甲醇(MeOH)中的化合物1a(15.0g，49.7mmol)。在减压下(250托)于室温搅拌3小时后，进行过滤。减压蒸馏除去溶剂直到滤液量为1/2量左右，通过倾析(decantation)分离上清液。减压蒸馏除去该上清液，真空干燥，由此得到为黄色固体的化合物1b(13.2g，收率为95％)。

化合物1b的¹H NMR(400MHz,MeOD-d₄)如下。

δ3.66(t.4H,J＝10.0Hz),3.42(t,4H,J＝10.0Hz),2.75(s,6H),1.47(s,12H)。

化合物1b的¹³C NMR(100MHz,MeOH-d₄)如下。

δ171.0,72.7,55.1,52.3,36.0,25.0

化合物1b的质谱分析的结果如下。

HRMS(EI⁺):对于[C₇H₁₃N₂]⁺，计算值为125.1073；实测值为125.1092。

另外，化合物1b的元素分析的结果如下。

对于C₁₄H₂₆N₆，分析计算值为：C,60.40；H,9.41；N30.19；实测值为C,59.79；H9.45；N,29.68.

[化学式22]

在氩气环境下，将化合物1b(2.7g，9.7mmol)溶解于30mL二氯甲烷(CH₂Cl₂)中，滴加三氟甲磺酸甲酯(MeOTf)(2.3mL，20.3mmol)。于室温搅拌3.5小时后，减压蒸馏除去溶剂，由此得到作为目标物的阳离子性聚合引发剂化合物1c(5.6g，收率为95％)。

化合物1c的¹H NMR(400MHz,MeOD-d₄)如下。

δ4.00(s.8H),3.24(s,12H)1.73(s,12H)

化合物1c的¹³C NMR(100MHz,MeOH-d₄)如下。

δ169.0,74.5,53.3,38.4,24.7

化合物1c的质谱分析的结果如下。

HRMS(EI⁺)：对于[C₇H₁₃N₂]⁺，计算值为125.1073；实测值为125.1073。

另外，化合物1c的元素分析的结果如下。

对于C₁₈H₃₂N₆O₆N₆S₂，分析计算值为：C,35.64；H5.32；N,13.85；实测值为：C,35.37；H5.02；13.59。

实施例A-2：使用了阳离子性聚合引发剂1c的聚苯乙烯共聚物的制造

将苯乙烯、作为交联剂的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(以下为MBAM)和作为表面活性剂的十六烷基三甲基氯化铵(以下为CTAC)以表1所示的量溶解于25mL水中，通过通入氩气30分钟除去溶解氧。然后，添加表1的量的阳离子性聚合引发剂化合物1c，使用机械搅拌器，于70℃进行1小时乳液聚合。冷却至室温后，向反应液加入氯化钠进行盐析，通过透析进行纯化。得到的聚合物的收率示于表1。

[表1]

表1：用于制造聚苯乙烯共聚物的原料的量、及所得聚合物的收率

对于得到的聚合物，进行Zeta电位和基于DLS的凝胶粒径的测定(聚合物浓度为0.1％，20℃)，并利用透射电子显微镜(TEM)测定凝胶粒径(聚合物浓度为0.01％，风干后测定)，得到表2的结果，确认得到了阳离子性的凝胶。需要说明的是，利用透射电子显微镜(TEM)观察化合物2b的结果示于图1。由此可知，本次新合成的阳离子性聚合引发剂化合物1c作为聚合引发剂发挥作用，且有助于阳离子性颗粒的合成。另外，与2b相比，增加了聚合引发剂的量而得到的化合物2a的Zeta电位为正值，这表明，可以根据聚合引发剂的量来控制颗粒表面的阳离子电荷量。

[表2]

表2：得到的聚合物的粒径、及聚合引发剂添加量对于阳离子电荷量的效果

实施例A-3：使用了阳离子性聚合引发剂1c的PEG共聚物的制造

[化学式23]

使用化合物3a得到共聚物3c，使用化合物3b得到共聚物3d。合成法如下。将化合物3a(20mg/ml)或化合物3b(33mg/ml)溶解于水(150μL)中，加入四乙基甲二胺(17mM)和化合物1c(50mM)加入，搅拌20分钟。于室温静置15分钟，向反应物添加350μL水或磷酸缓冲生理盐水(PBS)，用水或磷酸缓冲生理盐水(PBS)进行透析，纯化，得到共聚物3c及3d。

将化合物3e(4.2mM)、对二乙烯基苯(2.8mM)、表面活性剂CTAC(1.82mM)溶解于45mL水中，通过通入氩气30分钟除去溶解氧。向其中添加5mL溶解有阳离子性聚合引发剂化合物1c(最终浓度为9.0mM)的水，使用机械搅拌器，于70℃进行1.5小时乳液聚合。冷却至室温后，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)进行透析，纯化，得到共聚物化合物3f(收率为4.2％)。

将化合物3b(33mg/ml)和荧光素(33μg/mL)及罗丹明B(33μg/mL)溶解于水(150μL)中，加入四乙基甲二胺(17mM)和化合物1c(50mM)，搅拌20分钟。于室温静置15分钟，向反应物中添加350μL水或磷酸缓冲生理盐水(PBS)，用水或磷酸缓冲生理盐水(PBS)进行透析，纯化，得到共聚物3G(含荧光素)及3h(含罗丹明B)。

对于得到的聚合物，测定Zeta电位和基于DLS的凝胶粒径(20℃)，并利用透射电子显微镜(以下为TEM)测定凝胶粒径(风干后拍摄)。作为例子，图2中示出了化合物3d的透射电子显微镜(TEM)图像。得到以下表3所示的结果，确认了在使用PEG系的单体的情况下也能够得到阳离子性的凝胶。

[表3]

表3：得到的聚合物的粒径及颗粒表面的阳离子电荷量

实施例A-4：使用了阳离子性聚合引发剂1c的温度敏感性共聚物的制造

[化学式24]

作为共聚物的合成所必需的单体(荧光性单元)之一的N-(2-{[7-(N,N-二甲基氨基磺酰基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基]-(甲基)氨基}乙基)-N-甲基丙烯酰胺(DBThD-AA)按照文献A(Chemistry A European Journal，2012年，第18卷，第9552～9563页)记载的方法制备。

将作为热敏性单元的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)(100mM)、交联剂MBAM(1mM)、表面活性剂CTAC(1.9mM)、作为荧光性单元的N-(2-{[7-(N,N-二甲基氨基磺酰基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基]-(甲基)氨基}乙基)-N-甲基丙烯酰胺(DBThD-AA)(1mM)、及N,N,N’,N’-丁二胺(2.9mM)溶解于水(19ml)中，通过通入氩气30分钟除去溶解氧。然后，加入溶解于水(1ml)中的化合物1c(28mM)，于70℃使用机械搅拌器进行1小时乳液聚合。冷却至室温后，向反应液加入氯化钠进行盐析，用水进行透析，纯化，得到75.3g共聚物化合物EF043(收率为31％)。使用透射电子显微镜(TEM)观察所得凝胶的结果示于图3。根据观察结果，可以清楚地确认到合成了球状的颗粒。

实施例B-1：具有与新型阳离子性聚合引发剂相同的阳离子结构的丙烯酰胺系阳离子性单元的合成

[化学式25]

于0℃向亚硫酰氯(SOCl₂)(2.65mL，36.5mmol)和三氯甲烷(CHCl₃)(15.0mL)的搅拌混合物中添加氨基醇(aminoalcohol)化合物6(2.27mL，29.7mmol)。加热回流3小时，直到化合物6完全消失。将混悬液冷却至室温，过滤，用三氯甲烷(CHCl₃)充分洗涤，得到褐色固体。然后向其中添加叠氮化钠(NaN₃)(2.91g，44.7mmol)和水(40mL)，于80℃加热24小时，直到褐色固体完全地反应。添加2M氢氧化钠(NaOH)终止反应，用二氯甲烷(CH₂Cl₂)萃取3次。用盐水洗涤萃取液，并用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩，由此得到叠氮化合物7。

将叠氮化合物7和三乙胺(Et₃N)(6.85mL，49.3mmol)溶解于二氯甲烷(CH₂Cl₂)(132mL)中，进而于0℃添加丙烯酰氯(2.69mL，32.9mmol)。将混合物加热至室温，搅拌45分钟，直到叠氮化合物7消失。添加水终止反应，用二氯甲烷(CH₂Cl₂)萃取3次。用盐水洗涤萃取液，并用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩，得到粗产物。然后，用硅胶色谱法(己烷/乙酸乙酯＝1/1)进行纯化，得到黄色晶体酰胺化合物8(2.87g，18.6mmol，收率为63％)。

化合物8的IR数据如下。

IR(纯品,cm-1)：3277,2932,2097,1657,1626,1550,1408,1245,985,957,772

化合物8的¹H NMR(400MHz,CDCl₃)数据如下。

δ6.29(dd,1H,J＝17.2,1.2Hz),6.09(dd,1H,J＝17.2,10.0Hz),5.73(brs,1H),5.66(dd,1H,J＝10.0,1.6Hz),3.48-3.35(m,4H),1.85(tt,2H,J＝6.8,6.8Hz)

化合物8的¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)数据如下。

δ165.7,130.7,126.6,49.4,37.2,28.7

化合物8的质谱分析的结果如下。

HRMS(FAB+)对于C₈H₁₃NO₂(M+H+)，计算值为155.0933；实测值155.0936.

[化学式26]

向Paar压力反应器中投入乙二胺(化合物9)(5.42mL，81.1mmol)、乙腈(8.47mL，162mmol)、甲醇(4.39mL)及氯化铵(270mg，4.06mmol)并密封。于200℃加热4小时后，过滤反应物，在减压下浓缩，得到咪唑啉化合物10。

将咪唑啉化合物10溶解于无水四氢呋喃(THF)(243mL)中，于0℃滴加正丁基锂(n-BuLi)(36.7mL正己烷中，2.65M，97.3mmol)，于室温搅拌1小时。然后，于0℃滴加碘甲烷(6.56mL，105mmol)，搅拌1小时，直到化合物10完全消失。添加水终止反应，用二氯甲烷(CH₂Cl₂)萃取3次。用盐水洗涤萃取液，并用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩，得到粗产物。基于纯化目的进行蒸馏(54℃/27hPa)，得到无色油状的二甲基咪唑啉化合物11(4.22g，43.0mmol，收率为53％)。

化合物11的分析数据如Ye,G；Henry,W.P；Chen,C；Zhou,A.；PittmanJr.,C.U.Tetrahedron Lett.2009,50,2135-2139中公开的那样，以下示出由TLC求出的R_f值。

R_f＝0.42(己烷/正丙基胺＝10/3)

[化学式27]

将4-戊炔-1-醇(4-pentyn-1-ol)(化合物12)(1.53mL，16.5mmol)溶解于干燥的四氢呋喃(THF)(30.0mL)中，于-78℃滴加正丁基锂(n-BuLi)(13.6mL正己烷中，2.66M，36.2mmol)，搅拌2小时。然后，于-78℃滴加三甲基氯硅烷(TMSCl)(4.80mL，37.9mmol)，加热至室温，搅拌10小时直到化合物12完全消失，进行反应。加入1M盐酸(5mL)终止反应，用二氯甲烷(CH₂Cl₂)萃取3次。用盐水洗涤萃取液，并用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩，由此得到粗产物醇化合物13。

向干燥乙醚(32.1mL)和乙腈(22.5mL)中添加化合物13、三苯基膦(PPh₃)(7.58g，28.9mmol)、咪唑(2.08g，30.5mmol)，进行搅拌。于0℃向混合物中添加碘(8.15g，32.1mmol)，搅拌2小时，直到化合物13完全地反应。添加饱和焦硫酸钠溶液终止反应，用乙醚萃取3次。用盐水洗涤萃取液，并用无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩，由此得到粗产物。将粗产物用硅胶色谱法(戊烷)纯化，得到无色油状的碘烷基化合物14(3.12g，11.6mmol，收率为71％)。

化合物14的分析数据如Braese,S.；Wertal,H.；Frank,D.；Vidovic,D.；deMeijere,A.Eur.J.Org.Chem.2005,4167-4178.中公开的那样，以下示出由TLC求出的R_f值。

R_f＝0.24(戊烷)

化合物14的IR数据如下。

IR(纯品,cm^-1):2958,2898,2176,1426,1250,1221,901,842,760,698,638

化合物14的¹H NMR(400MHz,CDCl₃)数据如下。

δ3.29(t,2H,J＝6.8Hz),2.36(t,2H,J＝6.8Hz),2.00(tt,2H,J＝6.8,6.8Hz),0.15(s,9H)

化合物14的¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)数据如下。

δ104.7,85.7,32.0,20.8,4.9,0.1

化合物14的质谱分析的结果如下。

HRMS(FAB⁺对于C₈H₁₆SiI(M+H⁺)，计算值为267.0066；实测值为267.0087.

[化学式28]

将咪唑啉化合物11(300mg，3.06mmol)溶解于干燥的四氢呋喃(THF)(1.8mL)和乙醚(2.7mL)中，于-23℃滴加正丁基锂(n-BuLi)(2.76mL正己烷中，1.55M，4.28mmol)，加热至室温，搅拌1小时。然后，经由插管于0℃向经搅拌的混合物添加溶解于干燥的四氢呋喃(THF)(3mL)中的碘烷基化合物14(901mg，3.38mmol)。加热至室温，搅拌1小时，直到化合物11完全消失，进行反应。加入水终止反应，用三氯甲烷(CHCl₃)萃取3次。在减压下除去溶剂，用硅胶色谱法(己烷/正丙基胺＝5/1)进行纯化，得到黄色油状的化合物15(370mg，1.57mmol，收率为51％)。

化合物15的IR数据如下。

IR(纯品,cm^-1):2955,2862,2172,1616,1453,1404,1249,843,760,640

化合物15的¹H NMR(400MHz,CDCl₃)数据如下。

δ3.63(t,2H,J＝9.2Hz),3.24(t,2H,J＝9.2Hz),2.78(s,3H),2.26(t,2H,J＝7.2Hz),2.21(t,2H,J＝7.6Hz),1.79-1.67(m,2H),1.60(tt,2H,J＝7.2,7.2Hz),0.14(s,9H)

化合物15的¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)数据如下。

δ167.9,107.1,84.6,53.3,51.9,33.9,28.4,27.1,25.4,19.5,0.1

化合物15的质谱分析的结果如下。

HRMS(ESI⁺)对于C₁₂H₂₅N₂Si(M+H⁺)，计算值为237.1782；实测值为237.1789.

[化学式29]

将咪唑啉化合物15(151mg，639μmol)溶解于二氯甲烷(3.19mL)中，于室温添加三氟甲磺酸甲酯(MeOTf)(145μL，1.28mmol)，搅拌3小时。在减压下除去溶剂，得到咪唑盐。将该盐溶解于二甲基甲酰胺(DMF)(3.0mL)中，添加酰胺化合物8(120mg，776μmol)、硫酸铜·五水合物(CuSO₄·5H₂O)(31.9mg，127μmol)、抗坏血酸(45.0mg，256μmol)，于65℃加热24小时。在减压下除去溶剂，得到目标化合物16。将残余物用ODS硅胶色谱法(甲醇/水＝1/5至1/2)纯化，向目标组分加入水，用二氯甲烷洗涤3次。回收水层部分，在减压下浓缩，得到作为丙烯酰胺系目标化合物的褐色固体化合物16(143mg，296μmol，收率为46％)。

化合物16的IR数据如下。

IR(纯品,cm^-1):

3352,2936,1660,1624,1553,1467,1281,1157,1031,638

化合物16的¹H NMR(400MHz,CDCl₃)数据如下。

δ7.93(s,1H),7.43(brs,1H),6.32(d,1H,J＝9.2Hz),6.30(d,1H,J＝2.8Hz),5.60(dd,1H,J＝9.2,2.8Hz),4.44(t,2H,J＝6.4Hz),3.95(s,4H),3.24(dt,2H,J＝6.4,6.4Hz),3.12(s,6H),2.83(t,2H,J＝6.4Hz),2.55(t,2H,J＝8.0Hz),2.20(tt,2H,J＝6.4,6.4Hz),1.85(tt,2H,J＝6.8,6.8Hz)

化合物16的¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)数据如下。

δ168.4,166.4,146.1,131.3,125.8,123.0,49.9,47.5,36.0,34.0,29.8,28.4,24.6,24.0,23.9

化合物16的质谱分析的结果如下。

HRMS(ESI⁺)关于C₁₇H₂₉N₆O(M⁺)，计算值为333.2397；实测值为333.2387.

实施例B-2：具有与新型阳离子性聚合引发剂相同的阳离子结构的线性聚合物的合成

将作为热敏性单元的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、阳离子单体单元化合物16、作为荧光性单元的N-(2-{[7-(N,N-二甲基氨基磺酰基)-2,1,3-苯并噻二唑-4-基]-(甲基)氨基}乙基)-N-甲基丙烯酰胺(DBThD-AA)、α,α’-偶氮双异丁腈(AIBN)以表4的量溶解于二甲基甲酰胺(DMF)(5ml)中，通过通入氩气30分钟除去溶解氧。然后，于60℃使其反应8小时，冷却至室温。一边搅拌一边将溶液注入到乙醚(100ml)中。过滤得到的晶体，减压干燥后，进一步溶解于甲醇(MeOH)(1mL)中，进行再沉淀，然后溶解于纯水中，使用直径28.6mm的透析管(Visking tubing)(透析用纤维素管)、1000ml透析外液，充分实施透析，进行纯化。将纯化品冷冻干燥，得到淡黄色粉末形态的标题共聚物Lin40和Lin41。收率示于表4。

[表4]

表4：用于合成线性聚合物的原料的量、及所得线性聚合物的收率

关于Lin40和Lin41的共聚物特性评价的结果示于表5。另外，由NMR算出的NIPAM：阳离子单体单元(化合物16)：DBThD-AA之比依次为：

Lin40 94.5:5.48:1.43

Lin41 93.0:7.03:1.43。

需要说明的是，使用0.5w/v％水溶液，于20℃实施Zeta电位测定。

[表5]

表5：所得直线状聚合物的特性

实施例B-3：Lin40、Lin41的温度响应性试验

Lin40、Lin41在150mM氯化钾(KCl)水溶液中的温度响应性试验按照以下步骤进行。使用JASCO FP-6500分光荧光光度计，并使用下述溶液作为溶剂：使用由Millipore公司的Milli-Q reagent system得到的超纯水溶解从和光纯药公司购买的氯化钾(KCl)，使得浓度为150mM。本实验中的化合物的初始浓度为0.005w/v％，激发波长为450nm。溶液的温度控制使用JASCO ETC-273T水冷珀尔帖型恒温样品池架(water-cooled Peltier typeconstant-temperature cell holder)，利用附属的热电偶测定温度。使溶液温度以1℃的幅度上升，测定各温度下的450～850nm的荧光光谱。

图4示出了针对Lin40及Lin41的569nm及571nm的荧光强度变化进行绘图得到的一例。根据该结果可知，使用新合成的阳离子性单元(化合物16)也能够合成响应于温度的探针。此外，还发现提高阳离子性单元比率时，荧光强度相对于温度变化而言的上升度变小。

实施例B-4：各种温度敏感性探针的合成

NN-AP4(线性丙烯酰胺型高分子)按照文献A(PloS One 2015年，第10(2)卷)中的AP4-FPT记载的方法进行合成。阴离子凝胶k40按照文献B(Chemistry A European Journal2012年，第18卷，第9552～9563页)中的DBThD nanogel记载的方法进行合成。

实施例5：温度探针向动物细胞(黏附细胞)的导入

将来源于人类宫颈癌的HeLa细胞接种于容纳有DMEM培养基(10％FBS，1％青霉素(penicillin)-链霉素(streptomycin))的塑料底培养皿(ibidi公司)，进行培养。1天后，将培养基置换为5％葡萄糖水溶液，以最终浓度为0.05％的方式分别添加EF043、NN-AP4、Lin40、Lin41、k40，于37℃静置10分钟。然后，除去探针，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)洗涤后，置换为无酚红(phenol red-free)的DMEM培养基，进行显微镜观察。对于显微镜观察而言，使用共聚焦激光显微镜(FV1000，Olympus)、40倍物镜(Uplan Apo40x NA0.85，Olympus)进行了观察。

向细胞照射473nm的激光(Multi Ar激光)，获得500～600nm的荧光图像。

拍摄细胞得到的结果例示于图5。另外，使用得到的显微镜照片，进行扣除背景(即，不存在细胞的某区域的荧光强度)的图像处理，针对观察到荧光信号比未处理的细胞所具有的自体荧光更强的细胞进行计数，由此算出探针向细胞的导入率。结果示于表6。使用以往的聚合引发剂制得的、表面带有负电荷的温度探针k40几乎观察不到导入，但可以确认到带有阳离子性的探针(以使用新型的阳离子性聚合引发剂合成的凝胶型温度探针EF043为代表)向细胞内的导入。此外，还确认到Lin41局部存在于细胞膜，向细胞内的导入量较少。

[表6]

表6：各温度探针向细胞内的导入率

探针

EF043

Lin40

Lin41

k40

NN-AP4

未处理

导入率(％)

91.8±8.7

100.0±0

45.4±2.4

39±3.9

98.7±0.3

0

注1)关于“未处理”，为不含有任一种温度探针的对照实验。

实施例6：探针的毒性评价

如实施例5那样，向HeLa细胞中导入EF043、NN-AP4、Lin40、Lin41，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)洗涤后，置换为无酚红(phenolred-free)的DMEM培养基。然后，向培养基中添加非膜透过性的荧光试剂即碘化丙啶(PI)，使最终浓度为0.67μg/ml，于37℃处理30分钟后，用显微镜进行观察。荧光探针以473nm的激光进行激发，碘化丙啶(PI)以559nm的激光进行激发，分别于490～550nm、655～755nm的荧光波长进行观察。需要说明的是，使用经甲醇处理的细胞作为死亡细胞对照，对观察时的相机的光倍增管灵敏度、激光强度进行了调节。

选择约100个在显微镜下观察到温度探针的荧光的细胞，计数观察到碘化丙啶(PI)的荧光的细胞作为死亡细胞，算出百分率。该结果如表7所示。关于EF043、Lin40、NN-AP4，几乎观察不到由碘化丙啶(PI)带来的细胞毒性，关于Lin41，发现细胞膜透过性提高，具有细胞毒性。即，发现使用了作为线性高分子的温度探针时，若增加阳离子性单元的导入量，则会产生细胞毒性。

[表7]

表7：向细胞导入各温度探针后的细胞存活率(％)

EF043	Lin40	Lin41	NN-AP4	对照
					100.0±0	95.2±1.9	87.5±10.5	94.1±3.1	99.6±0.5

注1)关于“对照”，为不含有任一种温度探针的对照实验。

实施例7：温度探针的结构对细胞分裂造成的影响的调查将来源于人类宫颈癌的HeLa细胞接种于容纳有DMEM培养基(10％FBS，1％青霉素-链霉素)的定位格子(grid)塑料底培养皿μ-Dish 35mm grid-500(ibidi公司)，进行培养。1天后，如实施例5那样地导入EF043、NN-AP4、Lin40这3种探针，置换为无酚红(phenolred-free)的DMEM培养基，进行显微镜观察。对于显微镜观察而言，使用共聚焦激光显微镜(FV1000，Olympus)、40倍物镜(UplanApo40x NA0.85，Olympus)进行观察。向细胞照射473nm的激光(Multi Ar激光)，获得500～600nm的荧光图像。

按照实施例5的方法，计数特定定位格子内所含的细胞之中导入了荧光探针的细胞，在37℃，5％CO₂的培养下，24小时后，再次计数导入了荧光探针的细胞，由此算出24小时后的细胞增殖率。

结果示于图6。需要说明的是，未处理的对照(Ctrl)中，计数未导入探针的所有细胞。结果发现，作为阳离子性凝胶的EF043与对照(Ctrl)相比，细胞增殖率几乎没有变化，而作为线性温度探针的NN-AP4、Lin40则阻碍了细胞增殖。该阻碍效果不取决于所含阳离子性单元的结构差异(NN-AP4为季铵骨架，Lin40中为1,3-二甲基-4,5-二氢-1H-咪唑-3-鎓盐骨架)。并且，EF043与Lin40的阳离子性分子的结构相同，因此，发现较之阳离子性结构带来的细胞增殖阻碍效果而言，高分子的结构为线性(Lin40)时对于细胞分裂造成的阻碍效果更大，为凝胶状(EF043)时则几乎没有阻碍效果。另外，导入探针后的细胞随着培养而增加，由此明确了探针伴随分裂而被分配至两个细胞中。

实施例8：对于褐色脂肪细胞的分化造成的影响的调查

从安乐死的大鼠(Wistar，雄性，3周龄)采集褐色脂肪组织，用剪刀切碎，使组织游离于胶原酶溶液中，一边使用搅拌器振荡一边于37℃孵育30分钟。使用100μm细胞筛网除去未消化组织片，离心分离滤液(400g，室温，5分钟)，将得到的沉淀悬浮于HBSS(-)中，离心并进行洗涤。悬浮于溶血缓冲液中，于室温放置10分钟后，添加HBSS(-)并离心分离，将沉淀悬浮于增殖培养基(表8)中，通过40μm细胞筛网后，制成SVF悬浮液。将SVF悬浮液接种于包被有胶原蛋白的玻璃底培养皿，于37℃进行培养。在18小时后除去培养基，用HBSS(-)洗涤2次，除去未黏附细胞，再次添加增殖培养基，培养4天(37℃，5％CO₂)。置换为分化培养基(表8)，培养48小时(37℃，5％CO₂)后，向细胞导入温度敏感性探针EF043。关于导入，用5％葡萄糖洗涤细胞，在5％葡萄糖中向细胞以最终浓度成为0.05w/v％的方式添加EF043，于37℃孵育15分钟。然后，用HBSS洗涤2次，进行显微镜观察。进而，将导入了EF043的细胞置换至促进诱导脂肪滴的维持培养基(表8)，培养3天(37℃，5％CO₂)后，进行显微镜观察。对于显微镜观察而言，利用共聚焦激光显微镜(FV1000，Olympus)，使用40倍物镜(Uplan Apo40xNA0.85，Olympus)进行观察。向细胞照射473nm的激光(Multi Ar激光)，获得500～600nm的荧光画像。

[表8]

表8：褐色脂肪细胞的增殖培养基、分化培养基及维持培养基的组成

结果示于图7。如图7左图所示，在用分化培养基培养后的细胞内观察到温度探针的荧光，由此可知，探针被自主摄入细胞内。此外，在维持培养基中培养该细胞、促进脂肪滴的形成后，如图7右图所示，可以在细胞内观察到探针的荧光，并且在褐色脂肪细胞中观察到特征性的多空泡性(multilocular)脂肪滴。根据该结果可知，阳离子性凝胶型温度探针EF043能够在不阻碍细胞的分化的情况下被维持在细胞内。

实施例9：EF043对于培养细胞(游离细胞)的荧光强度响应

使用RPMI1640培养基(10％FBS)，在100mm培养皿中培养MOLT-4(人急性淋巴母细胞白血病(T-细胞))(接种1×10⁴个细胞/ml)。2天后，离心分离3ml培养液(300g，2分钟)，移除培养基，用5％葡萄糖洗涤后，再次悬浮于1ml的5％葡萄糖中，以最终浓度为0.05％的方式分别添加EF043、NN-AP4、Lin40。于37℃静置10分钟后，离心分离(300g，2分钟)，移除上清液，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)洗涤后，再次悬浮于磷酸缓冲生理盐水(PBS)中，向磷酸缓冲生理盐水(PBS)中添加非膜透过性的荧光试剂即碘化丙啶(PI)，使最终浓度为0.67μg/ml，于37℃处理30分钟后，用显微镜进行观察。荧光探针以473nm的激光进行激发，碘化丙啶(PI)以559nm的激光激发，分别于490～550nm、655～755nm的荧光波长进行观察。通过显微镜观察来确认是否已导入探针。使用共聚焦激光显微镜(FV1000，Olympus)、40倍物镜(UplanSApo，Olympus)进行观察，向细胞照射473nm的激光(Multi Ar激光)，观察针对500nm至600nm的荧光波长得到的荧光图像。

另外，将导入探针EF043后的MOLT-4细胞(未用碘化丙啶(PI)处理)悬浮于磷酸缓冲生理盐水(PBS)中，在该状态下将其装入比色皿中，然后向比色皿内加入2mm直径的球状搅拌子。将比色皿设置于JASCO FP-6500分光荧光光度计，使其以约800rpm的速度旋转以防止细胞沉降，同时，对荧光光谱进行测定。激发波长为440nm。溶液的温度控制使用JASCOETC-273T水冷珀尔帖型恒温样品池架，利用附属的热电偶测定温度。使溶液温度以2℃的幅度上升，在升温使得细胞内部的温度与外部的温度恒定后，静置2分钟，测定各温度时的荧光强度。

对于探针向细胞的导入率，使用得到的显微镜照片，进行扣除背景(即，不存在细胞的某区域的荧光强度)的图像处理，针对观察到荧光信号比未处理的细胞所具有的自体荧光更强的细胞进行计数，由此算出导入率。另外，关于显示细胞膜的透过性的碘化丙啶(PI)毒性，选择约50～200个在显微镜下观察到温度探针的荧光的细胞，计数观察到碘化丙啶(PI)的荧光的细胞作为死亡细胞。

探针导入率及碘化丙啶(PI)毒性的结果示于表9，温度响应性的结果示于图8。根据显微镜的结果可知，仅通过将EF043混入MOLT-4细胞中即可向细胞内转移。另外，关于碘化丙啶(PI)毒性，在所使用的探针之间没有差异，整体而言未观察到大的毒性。

另外，细胞内的EF043敏锐地对外部的温度变化作出反应，荧光强度(荧光波长570nm)上升(图8)。确认到能够在常见哺乳类细胞的生长温度即25～40℃的宽泛温度区域中测量细胞内温度。

[表9]

表9：各温度探针的细胞内导入率和碘化丙啶(PI)毒性的评价

	EF043	Lin40	NN-AP4	对照
					导入率(％)	99.1±0.8	99.4±0.9	89.3±1.0	2.5±1.1
PI毒性(％)	1.2±0.9	1.5±0.8	1.9±1.9	2.0±0.1

注1)关于“对照”，为不含有任一种温度探针的对照实验。

实施例10：荧光寿命变化的热敏应答试验

使用实施例9中制备的已导入探针EF043的MOLT-4细胞悬浮液，实施荧光寿命变化的热敏性应答试验。使用FluoroCube 3000U(Horiba Jobin Yvon)时间相关单光子计数法荧光寿命测定装置，激发波长为405nm。溶液的激发使用LED(NanoLED-456，Horiba)、以1MHz的脉冲重复频率进行测定。溶液的温度控制使用JASCO ETC-273T水冷珀尔帖型恒温样品池架，利用附属的温度计测定样品池架内的温度。在测定前利用热电偶确认溶液的温度稳定，然后以荧光波长580nm±8nm测定各温度的荧光寿命。利用以下所示的数学式对所得荧光衰减曲线进行近似处理，得到双组分的荧光寿命。

[数式1]

I(t)＝B₁exp(-t/τ₁)+B₂exp(-t/τ₂)

根据得到的荧光寿命，利用以下所示的数学式算出各温度的平均荧光寿命。

[数式2]

试验结果示于图9。确认到平均荧光寿命随着温度升高而延长，并且平均荧光寿命敏锐地对温度变化作出反应而发生变化。

实施例11：温度分辨率的评价

设想如实施例10的结果那样，取温度(T)作为横轴，取荧光寿命(τ)作为纵轴。

为微量(minute amount)、δ为误差时，则以下关系成立。

[数式3]

即，表示能够检测出多少℃温度差的温度分辨率δT如下式所示。

[数式4]

[数式5]

其中，

表示微量，因此上式表示取温度(T)作为横轴、取荧光寿命(τ)作为纵轴得到的图中曲线的切线斜率。δ表示误差，因此δτ为荧光寿命的误差。此处使用标准偏差作为误差值。

即，可以以(温度分辨率)＝(取温度(T)作为横轴、取荧光寿命(τ)作为纵轴得到的图中曲线的切线斜率的倒数)×(荧光寿命的误差)的形式算出。

实施例10的结果即为针对图9评价温度分辨率的结果，示于图10。关于EF043，可知其温度分辨率为0.2℃左右，定量性非常高。

实施例12：PEG系凝胶对于细胞的应用

使用DMEM培养基(10％FBS，1％青霉素-链霉素)，在35mm玻璃底培养皿中培养人源胚胎肾细胞HEK293T(接种1×10³个细胞/cm²)。1天后，将培养基置换为5％葡萄糖，以使荧光色素的最终浓度一致的方式，添加化合物3G及荧光素(1μg/ml)、或化合物3G及罗丹明B(0.5μg/ml)，于37℃静置15分钟。然后，移除探针及荧光色素，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)洗涤后，置换为无酚红(phenolred-free)的DMEM培养基，进行显微镜观察。显微镜观察使用了共聚焦激光显微镜(FV1000，Olympus)进行观察。荧光素以473nm的激光(Multi Ar激光)激发，罗丹明B以559nm的激光激发，进行观察。从获得的图像中选择20个左右的细胞，算出细胞内的平均信号，进行比较。

结果示于图11。可知使荧光色素包埋于阳离子性凝胶的情况下，较之荧光色素单独的情况而言，导入至细胞的量更多。在作为分子的荧光素(其带有负电荷)和作为分子的罗丹明B(其带有正电荷)中均观察到上述现象，这表明促进向细胞内摄入不受包埋分子的性质影响。换言之，上述阳离子性凝胶也可以作为以小分子为代表的分子的细胞内递送技术进行利用。

Claims

1.凝胶颗粒的制造方法，其包括：使具有通式(I)的化学结构的阳离子性聚合引发剂、含有碳-碳双键的单体与交联剂进行自由基聚合反应，

式中，

Y表示单键或CR⁸⁵，

Z表示单键或CR⁸⁶，

R⁷²、R⁷³、R⁷⁵、R⁷⁶、R⁷⁷、R⁷⁸、R⁸⁵及R⁸⁶各自独立地选自由氢原子、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、苯基及羟基组成的组，其中所述C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基及苯基可以进一步被选自由C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基、苯基及羟基组成的组中的1个或2个取代基取代，

R⁷²及R⁷³还可以各自独立地表示金刚烷基或被Si(OCH₃)₂(CH₃)取代的C_1-6烷基，或者，R⁷⁵及R⁷⁶、或R⁷⁷及R⁷⁸可以一同形成-(CH₂)_3-5-，

R⁸¹、R⁸²、R⁸³、及R⁸⁴为选自由C_1-4烷基、C_1-4烷基羰基及C_1-3烷氧基组成的组中的取代基，其中所述C_1-4烷基可以被一个C_1-3烷氧基取代，以及，

R⁷¹及R⁷⁴各自独立地为C_1-3烷基，X_f ^-为抗衡阴离子。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述Y及Z表示单键。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述R⁸¹、R⁸²、R⁸³、及R⁸⁴各自独立地选自由甲基、乙基、甲基羰基、异丁基、及2-甲基-2-甲氧基-丙基组成的组。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述R⁷¹及R⁷⁴为甲基。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述R⁷²及R⁷³、所述R⁷⁵及R⁷⁷、所述R⁷⁶及R⁷⁸、所述R⁸¹及R⁸⁴、所述R⁸²及R⁸³以及所述R⁷¹及R⁷⁴分别表示相同的取代基，并且，所述Y及Z表示相同的取代基、或均表示单键。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述R⁷¹、R⁷²、R⁷³、R⁷⁴、R⁸¹、R⁸²、R⁸³及R⁸⁴为甲基，所述R⁷⁵、R⁷⁶、R⁷⁷及R⁷⁸为氢原子，所述Y及Z为单键。

7.凝胶颗粒，其是利用权利要求1～6中任一项所述的方法得到的。

8.至少一个末端带有正电荷的线性聚合物的制造方法，其包括：使具有通式(I)的化学结构的阳离子性聚合引发剂与含有碳-碳双键的单体进行自由基聚合反应，

式中，

Y、Z、R⁷²、R⁷³、R⁷⁵、R⁷⁶、R⁷⁷、R⁷⁸、R⁸¹、R⁸²、R⁸³、R⁸⁴、R⁷¹、R⁷⁴、及X_f ^-如权利要求1～6中任一项中所定义。

9.至少一个末端带有正电荷的线性聚合物，其是利用权利要求8所述的方法得到的。

10.至少一个末端带有正电荷的线性聚合物，其在主链的至少一个末端包含来源于式(I’)表示的阳离子性聚合引发剂的结构，和接下来的来源于含有碳-碳双键的单体的重复结构，

式(I’)中，Y、R⁷²、R⁷⁵、R⁷⁶、R⁸¹、R⁸²、及R⁷¹如权利要求1～6中任一项中所定义。

11.共聚物，其在主链的至少一个末端包含来源于式(I’)表示的阳离子性聚合引发剂的结构，和接下来的分别来源于式(a)表示的单体及式(b)表示的单体的重复结构，并且包含由交联剂生成的交联结构，

式(I’)中，Y、R⁷²、R⁷⁵、R⁷⁶、R⁸¹、R⁸²、及R⁷¹如权利要求1～6中任一项中所定义，

式(a)中，R¹选自氢原子及C_1-3烷基；

R⁴及R⁵独立地选自氢原子及C_1-20烷基，其中，该烷基可以被选自羟基、C_1-6烷氧基、及芳基中的1种以上取代基取代；或者，

R⁴及R⁵和与其键合的氮原子一同形成4～8元含氮杂环，其中，该杂环可以被选自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、硝基、卤素原子、C_1-10烷基羰基氨基及芳基羰基氨基中的1种以上取代基取代，

式(b)中，R³选自氢原子及C_1-3烷基；

X²为O、S或N-R¹²；

Q²选自C_1-20亚烷基、C_3-20亚烯基及C_3-20亚炔基，其中所述亚烷基可以在1个以上位置独立地插入O、S或亚苯基；

Ar选自6～18元芳香族碳环基或5～18元芳香族杂环基，其中，该芳香族碳环基及芳香族杂环基可以包含所含环中的1个以上为芳香族环的稠环，在该芳香族碳环基及芳香族杂环基中以环原子的形式而存在的-CH₂-可以被取代为-C(O)-，进而，该芳香族碳环基及芳香族杂环基可以被选自卤素原子、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基、C_1-6烷基磺酰基、硝基、氰基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、羧基、甲酰基、-NR⁶R⁷及-SO₂NR¹⁴R¹⁵中的1种以上取代基取代，其中所述C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基、C_1-6烷基磺酰基、C_1-6烷基羰基及C_1-6烷氧基羰基中所含有的烷基可以被选自卤素原子、C_1-6烷氧基、羟基、氨基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6烷基)氨基、芳基及羧基中的1种以上取代基取代；

R⁶及R⁷独立地选自氢原子、C_1-10烷基、芳基、C_1-10烷基羰基、芳基羰基、C_1-10烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基甲酰基、N-(C_1-10烷基)氨基甲酰基及N,N-二(C_1-10烷基)氨基甲酰基，其中所述C_1-10烷基、C_1-10烷基羰基、C_1-10烷基磺酰基、N-(C_1-10烷基)氨基甲酰基及N,N-二(C_1-10烷基)氨基甲酰基中所含有的烷基可以被选自卤素原子、C_1-6烷氧基、羟基、氨基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6烷基)氨基、芳基及羧基中的1种以上取代基取代，进而，所述芳基、芳基羰基、及芳基磺酰基中所含有的芳基可以被选自卤素原子、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基及羧基中的1种以上取代基取代；或者，