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CN112941051A - Fenm蛋白突变体及其应用和含该突变体的试剂盒 - Google Patents

Fenm蛋白突变体及其应用和含该突变体的试剂盒 Download PDF

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CN112941051A
CN112941051A CN202110211331.XA CN202110211331A CN112941051A CN 112941051 A CN112941051 A CN 112941051A CN 202110211331 A CN202110211331 A CN 202110211331A CN 112941051 A CN112941051 A CN 112941051A
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CN
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fenm
mutant
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ffc
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CN202110211331.XA
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舒敏
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Zhejiang Younuo Biotechnology Co ltd
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Zhejiang Younuo Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，本发明通过FENM或其突变体与目标序列的特异性结合，同时采用FENM突变体与FokI或Cas12等不同类型具有核酸内切酶活性的蛋白构建的融合蛋白提高检测特异性，系统在gDNA和crRNA的双重引导下特异性识别靶向靶序列后激活Cas12a的旁路切割活性，可从大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝链霉菌、枯草芽孢杆菌、结合分支杆菌、流感病毒DNA片段、COVID19基因片段、SARS病毒DNA片段等混合标本中高灵敏、特异性地检出其中任意一种微生物或DNA，无需昂贵的热循环仪。采用本发明试剂盒进行微生物检测，特异性、精准度高，无需特殊仪器和特殊实验环境，能够高效、精准检测复杂环境样本中的目标序列，对临床检测具有重要意义。

Description

FENM蛋白突变体及其应用和含该突变体的试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及FENM蛋白突变体及其应用和含该突变体的试剂盒。
背景技术
在生物学的基础研究、基因治疗和各类微生物的分析方面常常需要对目标基因或微生物进行“鉴定”，如对突变基因的检测，对环境中DNA分子的定性，确定环境中是否存在某一种微生物。具有内切酶(REases)活性的各类酶在裂解目标核酸的精确性使其成为这些实验中不可缺少的工具。这些有限的序列不足以满足DNA操作的各种要求。为了克服这一局限性，科学家们开发了几种方法：第一种是对现有的限制性核酸内切酶中的氨基酸序列进行突变，如Not I突变。第二种是通过结合目标识别域和DNA裂解域，构建一种新型IIS酶(也称为非正统酶)，如TstⅠ和BmrⅠ的报道。第三种涉及到通过将不同DNA序列特有的各种基序融合到所需的限制性核酸内切酶的切割区域来形成新的核酸酶，如ZFN、TALEN和CRISPR-Cas。
CRISPR/Cas系统(成簇的规律间隔的短回文重复序列)是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌胞内起到了一种获得性免疫的作用。CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对外源DNA进行序列特异性降解，尽管CRISPR/Cas系统具有较高的效率，但这一工具仍然具有“脱靶效应”。
目前对微生物鉴定的常用方法为涂片染色镜检、分离培养、免疫学诊断和分子生物学诊断等。针对部分致病微生物，分离培养法是目前的常用方法，但培养需要4～8周的时间，延误临床诊断与治疗。涂片染色镜检法操作简单，快速，但该法灵敏度低、特异性差。免疫学诊断则由于现有的抗原或抗体与其它微生物存在交叉，导致其特异性较差、假阳性率高。分子生物学诊断具有快速、灵敏的优势，且利用特异性的DNA片段还可以区分各类菌种。近年也出现诸如LAMP，RPA等多种恒等温扩增技术，可用于现场检测，但均存在缺乏较为有效的扩增产物检测手段等问题。因此，亟需建立一种可应用于现场、简易、快速、且高灵敏度的检测技术。
为了满足上述需求，出现了基于CRISPR/Cas系统的各类检测系统，如基于CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12、CRISPR-Cas13的检测方法，上述系统均依靠crRNA或sgRNA与靶标序列的识别。近年来的研究表明，不管是CRISPR-Cas9还是CRISPR-Cas12系统，其均存在碱基错配导致的非特异识别现象，这对上述工具在后续的应用带来了潜在的风险。
更为重要的是，在面对复杂样本的准确识别，如针对混合微生物样本中某一特定微生物的定性识别，对不同环境中核酸分子的确认，更需要准确度更高、特异性更强的方法。目前文献及专利中的报道方法大都针对单一样本的检测、确认，CRISPR/Cas系统的碱基错配现象增加了其结果不确定的风险。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种可用于核酸和微生物等复杂样本的检测、增强了目标序列识别的特异性的FENM蛋白突变体及其应用，以及一种基于CRISPR/Cas系统的靶向检测试剂盒。
具体地，本发明提供了一种FENM蛋白突变体，所述的FENM突变体蛋白由侧翼核酸内切酶的异亮氨酸位点突变为丙氨酸获得的。
本发明还提供了一种FENM蛋白突变体，所述的FENM突变体蛋白由FENM蛋白突变体与具有核酸内切酶活性的蛋白融合获得的。
优选地，所述的FENM突变体蛋白由侧翼核酸内切酶(Flap endonuclease)的143位异亮氨酸突变为丙氨酸获得的。
优选地，所述的FENM蛋白突变体，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供了一种FFC系统，所述FFC系统是由FENM蛋白突变体与具有核酸内切酶活性的蛋白融合，形成的融合蛋白。
优选地，所述核酸内切酶活性的蛋白为FokI蛋白或Cas12蛋白。
优选地，所述融合蛋白为FENM-FokI融合蛋白或FENM-Cas12融合蛋白。
优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。
优选地，所述的FFC系统是FENM蛋白与具有核酸内切酶活性的蛋白(如FokI蛋白或Cas12蛋白)融合，形成的融合蛋白FENM-FokI(FF)或FENM-Cas12(FC)。
第三方面本发明提供了一种检测试剂盒，其所述检测试剂盒包含FENM蛋白突变体或所述的FFC系统。
优选地，所述的FENM突变体蛋白由侧翼核酸内切酶的异亮氨酸位点突变为丙氨酸获得的。
优选地，所述的FENM突变体蛋白由侧翼核酸内切酶的143位异亮氨酸突变为丙氨酸获得的。
优选地，所述的FENM蛋白突变体，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
优选地，所述FFC系统是由FENM蛋白突变体与具有核酸内切酶活性的蛋白融合，形成的融合蛋白。
优选地，所述核酸内切酶活性的蛋白为FokI蛋白或Cas12蛋白。
优选地，所述融合蛋白为FENM-FokI融合蛋白或FENM-Cas12融合蛋白。
优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。
在一个具体的实施例中，本发明还提供了一种基于CRISPR/Cas系统的靶向检测试剂盒，所述试剂盒主要包括：(1)FENM蛋白突变体与具有内切酶活性的蛋白构建得到的融合蛋白；(2)特异扩增靶基因的引物；(4)gRNA和crRNA；(4)荧光报告分子ssDNA-FQ。
优选地，所述的试剂盒的主要成分、其他辅助成分，如扩增所用PCR试剂等、本领域普通技术人员可根据常识进行选择。
优选地，所述试剂盒为检测流感病毒、烟草花叶病毒、结合分枝杆菌、新冠病毒E基因及N基因、谷氨酸棒杆菌、假单胞菌、环境DNA等细菌、病毒或核酸的试剂盒。
优选地，所述试剂盒主要包括：(1)氨基酸序列如SEQ ID No.X所示的融合蛋白；(2)特异性扩增引物、gRNA、crRNA、荧光报告分子。
第四方面，本发明提供了所述的FENM蛋白突变体在制备微生物的检测试剂盒的应用。
优选地，所述的FENM蛋白突变体与具有内切酶活性的蛋白构建得到融合蛋白后，用于制备所述基于CRISPR/Cas系统的靶向检测试剂盒。
优选地，所述的FENM蛋白突变体用于检测流感病毒、烟草花叶病毒、结合分枝杆菌、新冠病毒E基因及N基因、谷氨酸棒杆菌、假单胞菌、环境DNA等细菌、病毒或核酸。
第五方面，本发明提供了所述的FFC系统在制备微生物的检测试剂盒的应用。
优选地，所述的FFC系统用于制备所述基于CRISPR/Cas系统的靶向检测试剂盒。
优选地，所述的FFC系统用于检测流感病毒、烟草花叶病毒、结合分枝杆菌、新冠病毒E基因及N基因、谷氨酸棒杆菌、假单胞菌、环境DNA等细菌、病毒或核酸。
第六方面，本发明提供了所述的检测试剂盒用于检测微生物。
所述的检测试剂盒用于检测流感病毒、烟草花叶病毒、结合分枝杆菌、新冠病毒E基因及N基因、谷氨酸棒杆菌、假单胞菌、环境DNA等细菌、病毒或核酸。
第七方面，本发明提供了检测试剂盒检测微生物的方法，包括以下步骤：(1)样本的核酸提取；(2)RT-LAMP扩增；(3)FFC系统反应检测；(4)结果判定。
在另一具体实施例中，所述的检测试剂盒进行微生物检测时，方法如下：
(1)样本核酸提取：取待测样本，提取样本核酸；
(2)RT-LAMP扩增：以靶基因扩增引物，通过RT-LAMP方法扩增步骤(1)提取得到的待测样本核酸，得到扩增产物；
RPA反应体系：总体积为12.5μL：其中包括RPA上游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，RPA下游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，1×Reaction Buffer，1×BasicEmix，1.2～2.4mM dNTP，0.625μL 20×Core Reaction Mix，14～28mM MgOAc，待测样本基因组DNA1μL，其余用DEPC水补足12.5μL。
扩增程序：恒温37℃反应30～60min。
(3)FFC系统反应检测：往步骤(2)反应管中加入荧光报告分子、FF蛋白或FC蛋白及gDNA或gRNA以及检测试剂，进行FFC系统反应；
FFC系统体系反应：每20uL终体系中包含1×buffer(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/ml BSA，pH 7.9，25℃)，36nM gRNA或20nm gDNA，50nM ssDNA-FQ，50nMFENM-FokI或FENM-Cas12a。
(4)结果判定：将步骤(3)反应后的反应液放入反应管中，添加无菌水，混合并置于试管架上，将一次性核酸检测试纸条放入反应管中，等待反应液流过试纸条(MileniaHybriDetect 1,TwistDx)，阳性对照样品应该仅显示右侧检测线，而阴性对照样品显示左侧检测线。
优选地，所述的试纸条具有亲水性。
优选地，所述的试纸条购买市场上的商用化的试纸条。
优选地，所述的检测步骤均在恒温条件完成，无需复杂的温度改变，从而摆脱了对qPCR仪等精密仪器的依赖，具有较为广阔的应用前景。
本发明通过FENM或其突变体FENM与目标序列的特异性结合，同时采用FENM突变体与FokI或Cas12等不同类型具有核酸内切酶活性的蛋白构建的融合蛋白提高检测特异性，系统在gDNA和crRNA的双重引导下特异性识别靶向靶序列后激活Cas12a的旁路切割活性，可从大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝链霉菌、枯草芽孢杆菌、结合分支杆菌、流感病毒DNA片段、COVID19基因片段、SARS病毒DNA片段等混合标本中高灵敏、特异性地检出其中任意一种微生物或DNA，无需昂贵的热循环仪。在FFC系统中(FF蛋白)，FENM在gDNA的结合下与目标序列结合，内切酶FokI在切割DNA过程中断裂荧光报告分子；在FFC系统中(FC蛋白)，FENM突变体在gDNA的结合下与目标序列结合，Cas蛋白在gRNA(guide RNA)(前面是crRNA，需核对无误)的引导下，识别目标序列后启动“旁路切割”活性。在体系中加入荧光报告分子，借用Cas12a酶旁路切割活性，实现待检序列信息向荧光信号的转化。通过RPA与FFC系统的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联”(FFC系统完成)的两级放大，从而超越qPCR这种单级扩增的灵敏度。
本发明通过构建基于DNA序列的核酸酶突变体与具有内切酶活性的蛋白构建的融合蛋白系统FFC(Flap endonuclease与FokI或Cas12等不同类型具有核酸内切酶活性的蛋白构建的融合蛋白)，在gDNA和crRNA同时存在的情况下可以切割带荧光信号标记的单链DNA，通过侧向流试剂条即可得知待测样品中是否含有目标核酸、细菌或病毒。本发明通过设计特异性的gDNA和crRNA，形成对目标序列识别的‘双保险’机制，其保真性比荧光定量PCR检测方法高10倍以上，碱基识别错配率大幅降低。采用本发明试剂盒进行微生物检测，特异性、精准度高，无需特殊仪器和特殊实验环境，能够高效、精准检测复杂环境样本中的目标序列，对临床检测具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为基于FFC系统的微生物及核酸检测过程示意图；
图2为突变体Flap endonucleaseI143A蛋白质与DNA的亲和力
图3FENM蛋白及其突变体SDS-PAGE图；
图4为基于FFC系统的COVID19病毒E基因及N基因检测结果；
图5为基于FFC系统的结核分枝杆菌测结果；
图6为基于FFC系统的流感病毒检测结果；
图7为基于FFC系统的环境样本中特定微生物(谷氨酸棒杆菌、假单胞菌)检测结果；
图8为基于FFC系统的环境样本核酸检测结果；
图9为基于FFC系统的烟草花叶病毒检测结果。
图10为基于突变体Flap endonucleaseI143A蛋白的FFC系统与基于原始Flapendonuclease蛋白的FFC系统对COVID19病毒E基因的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：FENM蛋白突变体、FENM-FokI融合蛋白、FENM-Cas12a融合蛋白的制备
FENM-FokI融合蛋白及其突变体、FENM-Cas12a融合蛋白基因均合成自擎科生物并克隆于pET28a中，后转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞进行蛋白质纯化。
通过FENM或其突变体FENM与目标序列的特异性结合，同时采用FENM突变体与FokI或Cas12等不同类型具有核酸内切酶活性的蛋白构建的融合蛋白提高检测特异性，系统在gDNA和crRNA的双重引导下特异性识别靶向靶序列后激活Cas12a的旁路切割活性，可从大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝链霉菌、枯草芽孢杆菌、结合分支杆菌、流感病毒DNA片段、COVID19基因片段、SARS病毒DNA片段等混合标本中高灵敏、特异性地检出其中任意一种微生物或DNA，无需昂贵的热循环仪。在FFC系统中(FF蛋白)，FENM在gDNA的结合下与目标序列结合，内切酶FokI在切割DNA过程中断裂荧光报告分子；在FFC系统中(FC蛋白)，FENM突变体在gDNA的结合下与目标序列结合，Cas蛋白在gRNA(guide RNA)的引导下，识别目标序列后启动“旁路切割”活性。在体系中加入荧光报告分子，借用Cas12a酶旁路切割活性，实现待检序列信息向荧光信号的转化。通过RPA与FFC系统的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联”(FFC系统完成)的两级放大，从而超越qPCR这种单级扩增的灵敏度(如图1所示)。
蛋白质纯化过程如下：
挑取大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-FENM-FokI、大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-FENMI143A-FokI或BL21(DE3)/pET28a-FENM-Cas12a单菌落至3ml Kan+LB液体小管中，37℃培养过夜。转接至100ml LB液体培养基中，37℃培养至OD600约0.4，30℃诱导表达。0.4mMIPTG诱导时间为分别5h。诱导结束后，收集菌体，用50mM Tris-HCl buffer pH7.5悬浮菌体，并使用JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机破碎细胞。探头Ф6，工作3s，停5s，超声50次，功率<400W。13,000rpm离心10min，取上清。用直径0.20μm的滤头过滤后，经His-Bind proteinpurification kit(Novagen,Madison,WI)纯化目的蛋白。
所需试剂：
8xCharge buffer：400mM NiSO4
8xBinding buffer：4M NaCl，160mM Tris-HCl；40mM咪唑，pH 7.9
8xWash buffer：4M NaCl，160mM Tris-HCl；480mM咪唑，pH 7.9
4xElute buffer：1M咪唑，2M NaCl，80mM Tris-HCl，pH 7.9
4xStrip buffer：2M NaCl，400mM EDTA，80mM Tris-HCl，pH 7.9
纯化过程：(树脂体积为800μl，为1V)
表1.Ni柱纯化蛋白质流程
Figure BDA0002951557200000091
洗脱后的蛋白进行SDS-PAGE，确认纯化到了蛋白，进行超滤浓缩(3000g)SDS-PAGE结果见图3，图3上为在不同温度及诱导条件下的全细胞破碎SDS-PAGE结果，图3下为经过纯化的蛋白SDS-PAGE结果。浓缩至约200-500μl时，加入50mM Tris-HCl buffer pH7.5 5-10ml置换Buffer。超滤至所需体积，将管内液体转移至1.5ml Eppendorf管，-20℃或-70℃保存。
FENM突变体蛋白由Flap endonuclease的143位异亮氨酸突变为丙氨酸获得，突变后其位点特异性增强10倍。突变体Flap endonucleaseI143A与原始蛋白Flap endonuclease比较，蛋白质与特异性DNA的亲和力提升了10-15倍(图2，左为原始蛋白与特异DNA结合的等温滴定量热法测定结果，右为突变体蛋白的等温滴定量热法测定结果)。
FENM蛋白突变体与具有内切酶活性的蛋白构建得到融合蛋白后，用于制备基于CRISPR/Cas系统的靶向检测试剂盒。将FENM蛋白与具有核酸内切酶活性的蛋白(如FokI蛋白或Cas12蛋白)融合，形成的融合蛋白FENM-FokI(FF)或FENM-Cas12(FC)大大增强了目标序列识别的特异性，增加了结果的可靠性，降低了假阳性的出现。所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。
FFC系统指融合蛋白FENM-FokI(FF)或FENM-Cas12(FC)。
基因合成方法：DNA化学合成法，合成原理步骤如下：
1、脱保护基用三氯乙酸脱去预先连接在CPG上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步合成反应。
2、活化将质子化的核苷3'-亚磷酰胺单体与四氮唑活化剂混合进入合成柱，形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体(其5'端仍受DMT保护，3'端被活化)。
3、连接2步中活化得到的中间体遇到一步中脱保护基的核苷酸，与核苷酸的5'-羟基发生亲核反应，缩合并且脱去四唑，此时合成的寡糖核苷酸链向前延长一个碱基。
4、氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酸酯键与连接在CPG上的寡糖核苷连接，而亚磷酸酯键不稳定、易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酸酰胺转化为磷酸三脂，得到稳定的寡糖核苷酸。经过上述几个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连接到CPG的核苷酸上，再采取上述同样的步骤，即可得到一DNA片段样品。最后对其进行切割和脱保护基(一般对A、C碱基使用苯甲酰基保护；G碱基采用异丁酰基保护；T碱基则不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)。具体则是用苯硫酚除去5'-OH上的保护剂DMT，用浓氢氧化铵将DNA片段与固相树脂断开，使DNA得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护剂除去，最后除去氢氧化铵，在真空中抽干。
实施例2：FFC系统检测COVID19病毒E基因及N基因
试剂盒组成：
(1)蛋白质氨基酸序列参照SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3；
(2)特异性扩增引物：
上游引物：
N-RPA-F TGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACAT
E-RPA-F CGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGC
下游引物：
N-RPA-R CAAGCAGCAGCAAAGCAAGAGCAGCATCAC
E-RPA-R AGACCAGAAGATCAGGAACTCTAGAAGAAT
(3)gDNA及gRNA，序列如下：
N-gene gRNA#1
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCCCCAGCGCUUCAGCGUUC
N-gene gRNA#2
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAAUGUUGUUCCUUGAGGA
E-gene gRNA#1
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUUGCUUUCGUGGUAUUCUUG
E-gene gRNA#2
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUGGUAUUCUUGCUAGUUAC
N-gene gDNA
TAATTTCTACTAAGTGTAGATCCCCCAGCGCTTCAGCGTTC
E-gene gDNA
TAATTTCTACTAAGTGTAGATTTGCTTTCGTGGTATTCTTG
crRNA，序列如下：
N-crRNA1 TTTCTTGAACTGTTGCGACTACGTGAT
N-crRNA2 TTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCA
E-crRNA1 TTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCT
E-crRNA2 TTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACT
(4)荧光报告分子ssDNA-FQ，序列如下：
/56-FAM/TTATTATT/3BHQ_1/
(5)检测方法：
通过RT-LAMP方法扩增步骤扩增提取得到的待测样本核酸，得到扩增产物；
RT-LAMP反应体系：总体积为12.5μL：其中包括RT-LAMP上游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，RT-LAMP下游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，1×ReactionBuffer，1×BasicEmix，1.2～2.4mM dNTP，0.625μL 20×Core Reaction Mix，14～28mMMgOAc，待测样本DNA 1μL，其余用DEPC水补足12.5μL。扩增程序：恒温37℃反应30～60min。
(6)FFC系统反应检测：往步骤(5)反应管中加入荧光报告分子、FF蛋白或FC蛋白及gDNA或gRNA以及检测试剂，进行FFC系统反应；
FFC系统体系反应：每20uL终体系中包含1×buffer(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/ml BSA，pH 7.9，25℃)，36nM gRNA或20nm gDNA，50nM ssDNA-FQ，50nMFENM-FokI或FENM-Cas12a。
(7)结果判定：将步骤(6)反应后的反应液放入反应管中，添加无菌水，混合并置于试管架上，将一次性核酸检测试纸条放入反应管中，等待反应液流过试纸条(MileniaHybriDetect 1,TwistDx)，阳性对照样品应该仅显示右侧检测线，而阴性对照样品显示左侧检测线。
基于FFC系统的COVID19病毒E基因及N基因检测结果见图4，图4A、B、C、D分别为不同样品的针对COVID19病毒E基因及N基因检测结果。
实施例3：FFC系统检测结核分枝杆菌
(1)氨基酸序列参照SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3
(2)特异性扩增引物：
上游引物：CCAAGCTGCGCCAGGGCAGCTATTTCCCGGAC
下游引物：CGAAACGCCTCTACGGCTTCGTCGAGCTC
(3)gDNA，序列如下：
TAATTTCTACTAAGTGTAGATGTCAACCCAGCACCTGCCAG
crRNA，序列如下：TTTACAAGACTCACGTTAACAATATTG
(4)荧光报告分子ssDNA-FQ，序列如下：
5’-FAM-TTTTT-BHQ1-3’
(5)检测方法：
通过RT-LAMP方法扩增提取得到的待测样本DNA。RT-LAMP反应体系：总体积为12.5μL：其中包括RPA上游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，RPA下游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，1×Reaction Buffer，1×BasicEmix，1.2～2.4mM dNTP，0.625μL 20×Core Reaction Mix，14～28mM MgOAc，待测样本DNA 1μL，其余用DEPC水补足12.5μL。
扩增程序：恒温37℃反应30～60min。
(5)FFC系统反应检测：往步骤(4)反应管中加入荧光报告分子、FF蛋白或FC蛋白及gDNA或gRNA以及检测试剂，进行FFC系统反应；
FFC系统体系反应：每20uL终体系中包含1×buffer(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/ml BSA，pH 7.9，25℃)，36nM gRNA或20nm gDNA，50nM ssDNA-FQ，50nMFENM-FokI或FENM-Cas12a。
(6)结果判定：将步骤(5)反应后的反应液放入反应管中，添加无菌水，混合并置于试管架上，将一次性核酸检测试纸条放入反应管中，等待反应液流过试纸条(MileniaHybriDetect 1,TwistDx)，阳性对照样品应该仅显示右侧检测线，而阴性对照样品显示左侧检测线。
基于FFC系统的结核分枝杆菌测结果见图5，图5为针对结核分枝杆菌16S rDNA基因检测结果。
实施例4：FFC系统检测流感病毒
(1)氨基酸序列参照SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3
(2)特异性扩增引物：
上游引物1：GGCTAYCATGCBAACAATTC
下游引物1：TGGGTTGCCMAGGATCCA
上游引物2：GAAATGGGAAAAGCTCAATAATGA
下游引物2：ATTTCTCATYCCTGTTGCCAA
(3)gDNA，序列如下：
AGCCTTTTGGCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTTG
crRNA，序列如下：TTTACAAGACTCACGTTAACAATATTG
荧光报告分子ssDNA-FQ，序列如下：/56-FAM/TTATTATT/3BHQ-1/
(4)检测方法：
通过RT-LAMP方法扩增提取得到的待测样本DNA。RT-LAMP反应体系：总体积为12.5μL：其中包括RPA上游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，RPA下游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，1×Reaction Buffer，1×BasicEmix，1.2～2.4mM dNTP，0.625μL 20×Core Reaction Mix，14～28mM MgOAc，待测样本DNA 1μL，其余用DEPC水补足12.5μL。扩增程序：恒温37℃反应30～60min。
(5)FFC系统反应检测：往步骤(4)反应管中加入荧光报告分子、FF蛋白或FC蛋白及gDNA或gRNA以及检测试剂，进行FFC系统反应；
FFC系统体系反应：每20uL终体系中包含1×buffer(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/ml BSA，pH 7.9，25℃)，36nM gRNA或20nm gDNA，50nM ssDNA-FQ，50nMFENM-FokI或FENM-Cas12a。
(6)结果判定：将步骤(3)反应后的反应液放入反应管中，添加无菌水，混合并置于试管架上，将一次性核酸检测试纸条放入反应管中，等待反应液流过试纸条(MileniaHybriDetect 1,TwistDx)，阳性对照样品应该仅显示右侧检测线，而阴性对照样品显示左侧检测线。
基于FFC系统的流感病毒检测结果见图6，图6为针对流感病毒的侧向流试剂条检测结果。
实施例5：FFC系统检测环境样本中特定微生物(谷氨酸棒杆菌、假单胞菌)
(1)试剂盒组成参照实施例3：
氨基酸序列参照SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3
(2)特异性扩增引物：
谷氨酸棒杆菌16S rDNA基因上游引物：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
谷氨酸棒杆菌16S rDNA基因下游引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
假单胞菌16S rDNA基因上游引物：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
假单胞菌16S rDNA基因下游引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
(3)gDNA序列如下：
AGCCTTTTGGCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTTG
crRNA序列如下：TTTACAAGACTCACGTTAACAATATTG
荧光报告分子ssDNA-FQ，序列如下：
/56-FAM/TTATTATT/3BHQ-1/
(4)检测方法：
通过RT-LAMP方法扩增步骤(1)提取得到的待测样本DNA，得到扩增产物；
RT-LAMP反应体系：总体积为12.5μL：其中包括RPA上游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，RPA下游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，1×Reaction Buffer，1×BasicEmix，1.2～2.4mM dNTP，0.625μL 20×Core Reaction Mix，14～28mM MgOAc，待测样本DNA 1μL，其余用DEPC水补足12.5μL。扩增程序：恒温37℃反应30～60min。
(5)FFC系统反应检测：往步骤(4)反应管中加入荧光报告分子、FF蛋白或FC蛋白及gDNA或gRNA以及检测试剂，进行FFC系统反应；
FFC系统体系反应：每20uL终体系中包含1×buffer(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/ml BSA，pH 7.9，25℃)，36nM gRNA或20nm gDNA，50nM ssDNA-FQ，50nMFENM-FokI或FENM-Cas12a。
(6)结果判定：将步骤(5)反应后的反应液放入反应管中，添加无菌水，混合并置于试管架上，将一次性核酸检测试纸条放入反应管中，等待反应液流过试纸条(TwistDx公司)，阳性对照样品应该仅显示右侧检测线，而阴性对照样品显示左侧检测线。
基于FFC系统的环境样本中特定微生物(谷氨酸棒杆菌、假单胞菌)检测结果见图7，图7上为针对谷氨酸棒杆菌16S rDNA基因的侧向流试剂条检测结果，下为针对假单胞菌16S rDNA基因的侧向流试剂条检测结果。
实施例6：FFC系统检测环境样本中特定DNA，以新冠病毒E基因及N基因为例
试剂盒组成参照实施例3：
(1)氨基酸序列参照SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3
(2)上游引物：
N-RPA-F TGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACAT
E-RPA-F CGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGC
下游引物：
N-RPA-R CAAGCAGCAGCAAAGCAAGAGCAGCATCAC
E-RPA-R AGACCAGAAGATCAGGAACTCTAGAAGAAT
(3)gDNA，序列如下：
N-gene gRNA#1
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCCCCAGCGCUUCAGCGUUC
N-gene gRNA#2
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAAUGUUGUUCCUUGAGGA
E-gene gRNA#1
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUUGCUUUCGUGGUAUUCUUG
E-gene gRNA#2
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUGGUAUUCUUGCUAGUUAC
crRNA，序列如下：
N-crRNA1 TTTCTTGAACTGTTGCGACTACGTGAT
N-crRNA2 TTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCA
E-crRNA1 TTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCT
E-crRNA2 TTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACT
(4)荧光报告分子ssDNA-FQ，序列如下：
/56-FAM/TTATTATT/3BHQ_1/
(5)检测方法：
通过RT-LAMP方法扩增含E基因或N基因的样本，得到扩增产物；RT-LAMP反应体系：总体积为12.5μL：其中包括RPA上游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，RPA下游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，1×Reaction Buffer，1×BasicEmix，1.2～2.4mM dNTP，0.625μL 20×Core Reaction Mix，14～28mM MgOAc，待测样本DNA 1μL，其余用DEPC水补足12.5μL。扩增程序：恒温37℃反应30～60min。
(6)FFC系统反应检测：往步骤(5)反应管中加入荧光报告分子、FF蛋白或FC蛋白及gDNA或gRNA以及检测试剂，进行FFC系统反应；
FFC系统体系反应：每20uL终体系中包含1×buffer(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/ml BSA，pH 7.9，25℃)，36nM gRNA或20nm gDNA，50nM ssDNA-FQ，50nMFENM-FokI或FENM-Cas12a。
(7)结果判定：将步骤(6)反应后的反应液放入反应管中，添加无菌水，混合并置于试管架上，将一次性核酸检测试纸条放入反应管中，等待反应液流过试纸条(MileniaHybriDetect 1,TwistDx)，阳性对照样品应该仅显示右侧检测线，而阴性对照样品显示左侧检测线。
基于FFC系统的环境样本核酸检测结果见图8，图8上为针对谷氨酸棒杆菌16SrDNA基因的侧向流试剂条检测结果，图8下为针对假单胞菌16S rDNA基因的侧向流试剂条检测结果。
实施例7：FFC系统检测烟草花叶病毒
试剂盒组成参照实施例3：
(1)氨基酸序列参照SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3
(2)上游引物：
5'-TCTACCGTGTGGGTGACA-3’
下游引物：
5'-GGTCTAATACTGCGTTGTACC-3
(3)gDNA，序列如下：
gRNA#1
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCCCCAGCGCUUCAGCGUUC
gRNA#2
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAAUGUUGUUCCUUGAGGA
crRNA，序列如下：
N-crRNA1 TTTCTTGAACTGTTGCGACTACGTGAT
E-crRNA1 TTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCT
(4)荧光报告分子ssDNA-FQ，序列如下：
/56-FAM/TTATTATT/3BHQ_1/
(5)检测方法：
提取烟草花叶病毒核酸样本，通过RT-LAMP方法扩增得到扩增产物；RT-LAMP反应体系：总体积为12.5μL：其中包括RPA上游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，RPA下游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，1×Reaction Buffer，1×BasicEmix，1.2～2.4mMdNTP，0.625μL 20×Core Reaction Mix，14～28mM MgOAc，待测样本DNA 1μL，其余用DEPC水补足12.5μL。扩增程序：恒温37℃反应30～60min。
(6)FFC系统反应检测：往步骤(12)反应管中加入荧光报告分子、FF蛋白或FC蛋白及gDNA或gRNA以及检测试剂，进行FFC系统反应；
FFC系统体系反应：每20uL终体系中包含1×buffer(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/ml BSA，pH 7.9，25℃)，36nM gRNA或20nm gDNA，50nM ssDNA-FQ，50nMFENM-FokI或FENM-Cas12a。
(7)结果判定：将步骤(13)反应后的反应液放入反应管中，添加无菌水，混合并置于试管架上，将一次性核酸检测试纸条放入反应管中，等待反应液流过试纸条(MileniaHybriDetect 1,TwistDx)，阳性对照样品应该仅显示右侧检测线，而阴性对照样品显示左侧检测线。
基于FFC系统的烟草花叶病毒检测结果见图9，图9为针对烟草花叶病毒的侧向流试剂条检测结果。
实施例10：基于突变体Flap endonucleaseI143A蛋白的FFC系统与基于原始Flapendonuclease蛋白的FFC系统对COVID19病毒E基因的检测
试剂盒组成参照实施例3：
(1)氨基酸序列参照SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3，
COVID19病毒E基因序列如下所示，
Figure BDA0002951557200000191
分别合成了E基因52、74、94、103、113、121、136、143、169、193位碱基发生突变的10条序列(突变位置已加粗显示)。用于测试基于突变体Flap endonucleaseI143A蛋白的FFC系统与基于原始Flap endonuclease蛋白的FFC系统的特异性。
(2)上游引物：
E-RPA-F CGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGC
下游引物：
E-RPA-R AGACCAGAAGATCAGGAACTCTAGAAGAAT
(3)gDNA，序列如下：
E-gene gRNA#1 AGCAAGAAUACCACGAAAGCAAGAAAA
E-gene gRNA#2 AGUGUAACUAGCAAGAAUACCACGAAA
E-gene gRNA#3 AAAAAGAAGUACGCUAUUAA
E-gene gRNA#4 AUCGAAGCGCAGUAAGGAUGGCU
E-gene gRNA#5 CGAGUAGACGUAAACC
E-gene gRNA#6 UCAGAUUUUUAACACG
crRNA，序列如下：
E-crRNA1 TTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCT(58-84)
E-crRNA2 TTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACT(66-92)
E-crRNA3 ttaatagcgtacttcttttt(41-60)
E-crRNA4 agccatccttactgcgcttcgat(93-115)
E-crRNA5 ggtttacgtctactcg(164-180)
E-crRNA6 cgtgttaaaaatctga(181-196)
(4)荧光报告分子ssDNA-FQ，序列如下：
/56-FAM/TTATTATT/3BHQ_1/
(5)检测方法：
通过RT-LAMP方法扩增含E基因或N基因的样本，得到扩增产物；RT-LAMP反应体系：总体积为12.5μL：其中包括RPA上游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，RPA下游扩增引物0.125～0.625μL(浓度10μM)，1×Reaction Buffer，1×BasicEmix，1.2～2.4mM dNTP，0.625μL 20×Core Reaction Mix，14～28mM MgOAc，待测样本DNA 1μL，其余用DEPC水补足12.5μL。扩增程序：恒温37℃反应30～60min。
(6)FFC系统反应检测：往步骤(5)反应管中加入荧光报告分子、FF蛋白或FC蛋白及gDNA或gRNA以及检测试剂，进行FFC系统反应；
FFC系统体系反应：每20uL终体系中包含1×buffer(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/ml BSA，pH 7.9，25℃)，36nM gRNA或20nm gDNA，50nM ssDNA-FQ，50nMFENM-FokI或FENM-Cas12a。
(7)结果判定：将步骤(6)反应后的反应液放入反应管中，添加无菌水，混合并置于试管架上，将一次性核酸检测试纸条放入反应管中，等待反应液流过试纸条(MileniaHybriDetect 1,TwistDx)，阳性对照样品应该仅显示右侧检测线，而阴性对照样品显示左侧检测线。
利用基于突变体Flap endonucleaseI143A蛋白的FFC系统及基于原始Flapendonuclease蛋白的FFC系统对包含COVID19病毒E基因及其点突变在内的11个核酸样本进行检测，检测结果见图10。结果表明在检测E基因时，基于突变体Flap endonucleaseI143A蛋白的FFC系统及基于原始Flap endonuclease蛋白的FFC系统结果均呈阳性；但针对10条E基因点突变的检测结果表明，基于突变体Flap endonucleaseI143A蛋白的FFC系统检测结果均呈阴性(因为存在非互补碱基，所以应该全部呈现阴性结果)，基于原始Flap endonuclease蛋白的FFC系统检测结果中有9个样本呈现阴性，1个样本呈现阳性。以上结果表明基于突变体Flap endonucleaseI143A蛋白的FFC系统可以有效区分单个碱基上的序列差别，其序列识别特异性更高，可以有效区分高度相似的不同序列。上述特征在对高度相似序列的鉴别上具有特殊意义。如针对不同病毒的快速进化，可以通过引物设计来区分不同病毒株系。在基于16S rDNA的微生物分子鉴定方面，部分微生物的16S rDNA高度相似，有的仅有个别碱基的差异，基于突变体Flap endonucleaseI143A蛋白的FFC系统可以有效区其差别，进而准确鉴定微生物的不同株系。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种FENM蛋白突变体，其特征在于，所述的FENM突变体蛋白(1)由FENM蛋白突变体与具有核酸内切酶活性的蛋白融合获得的；
或(2)由侧翼核酸内切酶的异亮氨酸位点突变为丙氨酸获得的。
2.根据权利要求1所述的FENM蛋白突变体，其特征在于，所述的FENM突变体蛋白由侧翼核酸内切酶的143位异亮氨酸突变为丙氨酸获得的。
3.根据权利要求1所述的FENM蛋白突变体，其特征在于，所述的FENM蛋白突变体具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
4.一种FFC系统，其特征在于，所述FFC系统是由权利要求1至3任一项所述的FENM蛋白突变体与具有核酸内切酶活性的蛋白融合，形成的融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的FFC系统，其特征在于，所述核酸内切酶活性的蛋白为FokI蛋白或Cas12蛋白。
6.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1至3任一项所述的FENM蛋白突变体或权利要求3所述的FFC系统。
7.权利要求1至3任一项所述的FENM蛋白突变体在制备微生物的检测试剂盒的应用。
8.权利要求4或5所述的FFC系统在制备微生物的检测试剂盒的应用。
9.权利要求6所述的检测试剂盒用于检测微生物。
10.权利要求6所述的检测试剂盒检测微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样本的核酸提取；
(2)RT-LAMP扩增；
(3)FFC系统反应检测；
(4)结果判定。
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