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KR20230116944A - 고온 내성 Cas 단백질의 용도, 표적 핵산 분자의 검출방법 및 시약 키트 - Google Patents

고온 내성 Cas 단백질의 용도, 표적 핵산 분자의 검출방법 및 시약 키트 Download PDF

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KR20230116944A
KR20230116944A KR1020237024756A KR20237024756A KR20230116944A KR 20230116944 A KR20230116944 A KR 20230116944A KR 1020237024756 A KR1020237024756 A KR 1020237024756A KR 20237024756 A KR20237024756 A KR 20237024756A KR 20230116944 A KR20230116944 A KR 20230116944A
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KR
South Korea
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nucleic acid
dna
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reaction
artificial sequence
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Application number
KR1020237024756A
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Inventor
시유안 리
진 왕
Original Assignee
상하이 톨로 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 상하이 톨로 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드 filed Critical 상하이 톨로 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 고온 내성 Cas 단백질의 용도, 표적 핵산 분자의 검출 시스템 및 시약 키트를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 가이드 RNA, Cas12b(구칭 C2c1), 핵산 프로브를 포함하고, 반응 완료 후 표적 핵산 분자를 검출하는 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 반응 시스템을 제공한다. 이 밖에, 핵산 증폭 기술(예를 들어, LAMP 등)과 결합하여 상기 검출 방법의 감도를 크게 향상시킬 수 있으며, 본 발명에 의해 제공되는 검출 시스템은 병원성 미생물, 유전자 돌연변이, 단일 염기 다형성 및 특이성 표적 DNA 등을 신속하게 검출할 수 있고 또한 핵산 샘플을 정량화할 수 있다.

Description

고온 내성 Cas 단백질의 용도, 표적 핵산 분자의 검출 방법 및 시약 키트{USE OF HIGH-TEMPERATURE-RESISTANT CAS PROTEIN, AND METHOD AND REAGENT KIT FOR DETECTING TARGET NUCLEIC ACID MOLECULE}
본 발명은 생명 공학 분야에 속하는 것으로, 구체적으로 고온 내성 Cas 단백질의 용도, 표적 핵산 분자의 검출 방법 및 시약 키트에 관한 것이다.
핵산 분자의 신속한 검출은 공중 보건, 환경 검출, 범죄 수사 등 분야에 있어서 핵심 기술이다. 핵산 분자 검출은 인간, 동물, 식물 등이 병원체에 감염되었는지 여부를 검출할 수 있을뿐만 아니라 유전 질환 또는 암 위험을 검출하고, 개인 약물 사용에 보조적 참조를 제공하며 수역에 미생물 오염이 존재하는지 여부 등의 검출에도 사용될 수 있다. 현재에는 Realtime PCR, FISH 혼성화 기술(Fluorescence in situhybridization) 등 많은 핵산 검출 방법이 개발되었으나 빠르고 저렴하며 감도가 우수한 핵산 검출 기술 개발이 여전히 필요하다.
최근 CRISPR 기술은 게놈 편집 분야에서 큰 응용 가치를 보여주고 있다. 해당 임무는 주로 Cas9와 같은 DNA(또는 RNA) 표적 엔도뉴클레아제에 의해 수행되는 바, 사람들은 가이드 간단한 RNA 설계만으로도 Cas9 등 단백질을 PAM을 포함(예를 들어, Cas9의 PAM 서열은 NGG임)하는 임의의 핵산 표적 서열에 표적화하여 이중 가닥 DNA의 파단(또는 RNA의 절단)을 유발할 수 있다.
게놈 편집 외에도 CRISPR은 유전자 조절, 후성 유전학 편집, 기능적 유전자 선별, 게놈 이미징 등에도 사용될 수 있다. 최근에는 풍부한 툴박스인 CRISPR이 핵산 검출 분야에 등장하기 시작해 주목을 받고 있다.
최초의 CRISPR 관련 핵산 검출 기술은 dCas9(dead Cas9) 단백질을 기반으로 한 기술로서, dCas9는 Cas9의 2개의 촉매 절단 활성 부위를 돌연변이시켜 이중 가닥 절단 활성을 잃으나 dCas9는 여전히 가이드 RNA에 의해 유도되고 특정 DNA에 결합되는 능력을 유지한다. Chen 등은 dCas9를 이용하여 EGFP 형광 단백질과 융합되고, 특정 가이드 RNA를 이용하여 유도될 수 있으며, 표적 서열 위치의 형광을 현미경으로 관찰할 수 있다. Guk 등은 2017년에 dCas9/sgRNA-SG I 기반의 DNA-FISH 시스템이 메티실린 내성의 황색 포도상구균을 선택적으로 검출할 수 있다고 보고하였다.
2013년, Collins 팀은 종이에서 지카(Zika) 바이러스를 검출하는 방법을 구축하였다. 상기 방법은 RNA의 추출, 증폭 및 Toehold 반응 검출 과정에 관한 것으로, 설계 상 하나의 바이러스 균주와 다른 균주의 PAM 부위 서열 위치가 상이한 경우(즉 하나는 NGG이고, 다른 하나는 이와 상이함), Cas9 표적화를 통해 PAM을 포함하는 균주를 절단할 수 있어 증폭 과정과 Toehold 검출에 영향을 미친다.
최근 Cas9에 기반한 다른 핵산 검출 방법으로, 등온 증폭 방법의 원리는 CRISPR/Cas9에 의해 유발된다. 이는 부위 특이적 핵산 검출에도 사용될 수 있는 바, 해당 기술은 CRISPR/Cas9의 절단, 닉카제 및 DNA 중합 효소에 관한 것으로, 이러한 방법은 0.82 amol 의 표적 농도를 검출할 수 있을뿐만 아니라 핵산 분자의 단일 염기 간의 차이도 구분할 수 있으며, 상기 방법의 표적 구분은 이전 방법보다 더 보편적으로 적용된다.
또 다른 핵산 검출 방법의 원리는 일부 Cas 단백질이 갖는 "트랜스 절단"(또는 "우회 절단") 효과를 기반으로 한다. 2016년 Zhang Feng 등은 Cas13a(구칭 "C2c2") 가 우회 절단 활성을 갖고 있음을 발견하였는 바, 즉 Cas13a가 표적 RNA 서열에 결합하면 다른 RNA를 무질서하게 절단하는 특성을 나타내어 특이적 핵산 검출에 사용된다. 이는 SHERLOCK(Specifichigh Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) 기술로 지칭된다.
많은 CRISPR 관련 핵산 검출 방법이 존재하나 해당 분야에서 보다 빠르고 간편하며 저렴한 핵산 검출 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 CRISPR과 관련된 보다 빠르고 간편하며 저렴한 핵산 검출 방법을 개발하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에 있어서, 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출 시스템을 제공한다. 상기 시스템은,
(a) Cas12b 또는 Cas12b와 유사한 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성을 갖는 Cas 단백질인 Cas12b 단백질;
(b) Cas12b 단백질이 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 가이드 RNA; 및
(c) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브를 포함하고,
상기 표적 핵산 분자는 표적 DNA이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출은 정성 검출 또는 정량 검출을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시스템은 (d) 버퍼를 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시스템은 검출할 표적 핵산 분자를 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시스템은,
(e1) 표적 DNA를 증폭하기 위한 중합 효소;
(e2) 임의로 선택된, 역전사를 위한 역전사 효소; 및
(e3) 증폭 반응 및/또는 역전사 반응을 위한 dNTP를 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시스템은 LAMP 반응을 위한 시약을 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시스템에서 상기 검출할 표적 핵산 분자의 농도는 1x10-9 nM ~ 1x103 nM이고; 바람직하게는 1x10-8 nM ~ 1x102 nM이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시스템에서 상기 검출할 표적 핵산 분자의 농도는 1 ~ 100 카피/마이크로 리터 또는 1 ~ 1x1015 카피/마이크로 리터이고, 바람직하게는 1 ~ 10 카피/마이크로 리터이며, 더 바람직하게는 1 ~ 5 카피/마이크로 리터이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시스템에서 상기 핵산 프로브와 상기 표적 핵산 분자의 몰비는 103:1 내지 1014:1이고, 바람직하게는 104:1 내지 107:1이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 가이드 RNA의 길이는 16 ~ 25nt이고, 바람직하게는 16 ~ 22nt이며, 더 바람직하게는 16 ~ 20nt이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 가이드 RNA의 길이는 18 ~ 25nt이고, 바람직하게는 18 ~ 22nt이며, 더 바람직하게는 18 ~ 20nt이다.
다른 바람직한 예에서, 표적 핵산 분자가 ssDNA인 경우, 상기 표적 핵산 분자의 검출 부위는 상기 가이드 RNA의 PAM 서열 하류 9번째 위치 또는 10 ~ 16번째 위치, 바람직하게는 10 ~ 14번째 위치, 더 바람직하게는 10 ~ 12번째 위치에 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 부위가 상기 가이드 RNA의 PAM 서열 하류 9번째 위치에 있는 경우, 상기 검출 부위는 G이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 부위는 상기 가이드 RNA의 PAM 서열 하류 9 ~ 20번째 위치, 바람직하게는 10 ~ 18번째 위치, 더 바람직하게는 10 ~ 16번째 위치에 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 핵산 분자의 검출 부위는 상기 가이드 RNA의 PAM 서열 하류 1 ~ 12번째 위치, 더 바람직하게는 1, 3, 10번째 위치에 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 가이드 RNA의 길이는 15-30nt이고, 바람직하게는 15-18nt이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 DNA는 包括RNA 역전사를 기반으로 형성된 DNA를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 DNA는 cDNA를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 DNA는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 핵산 프로브는 형광 그룹 및 소광 그룹을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 형광 그룹 및 소광 그룹은 각각 독립적으로 상기 핵산 프로브의 5' 말단, 3' 말단 및 중심부에 위치한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 핵산 프로브의 길이는 3 ~ 300nt이고, 바람직하게는 5 ~ 100nt, 더 바람직하게는 6 ~ 50nt, 가장 바람직하게는 8 ~ 20nt이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 핵산 분자는 식물, 동물, 곤충, 미생물, 바이러스, 또는 이들의 조합에서 선택된 것으로부터 유래된 표적 핵산 분자를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 DNA는 인공적으로 합성되거나 자연적으로 존재하는 DNA이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 DNA는 야생형 또는 돌연변이형 DNA를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 DNA는cDNA와 같은 RNA의 역전사 또는 증폭에 의해 획득된 DNA를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 Cas12b 단백질은 AacCas12b(Alicyclobacillus acidoterrestris), Aac2Cas12b(Alicyclobacillus acidiphilus), AkaCas12b(Alicyclobacillus kakegawensis), AmaCas12b(Alicyclobacillus macrosporangiidus), AheCas12b(Alicyclobacillusherbarius), AcoCas12b(Alicyclobacillus conta minans)로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 핵산 프로브는 검출 가능한 라벨을 갖는 단일 가닥 DNA를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 단일 가닥 DNA는 형광 및 비오틴 라벨의 단일 가닥 DNA이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 단일 가닥 DNA는 형광 라벨의 단일 가닥 DNA이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 단일 가닥 DNA는 5' 말단에 형광 그룹HEX가 라벨링되고 3' 말단에 소광 그룹 BHQ1이 라벨링된 형광 프로브이다.
본 발명의 제2 양태에 있어서, SNP(단일 염기 다형성) 또는 뉴클레오티드 돌연변이(단일 염기 또는 다중 염기 돌연변이 포함)를 검출하기 위한 검출 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 제1 검출 시스템 및 제2 검출 시스템을 포함하고;
제1 검출 시스템은,
(a1) Cas12b 또는 Cas12b와 유사한 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성을 갖는 Cas 단백질인 Cas12b 단백질;
(b1) Cas12b 단백질이 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 제1 가이드 RNA; 및
(c1) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브를 포함하며,
제2 검출 시스템은,
(a2) Cas12b 또는 Cas12b와 유사한 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성을 갖는 Cas 단백질인 Cas12b 단백질;
(b2) Cas12b 단백질이 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 제2 가이드 RNA; 및
(c2) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브를 포함하고,
상기 표적 핵산 분자는 표적 DNA이며,
상기 제1 가이드 RNA 및 제2 가이드 RNA는 상기 SNP 부위를 포함하는 동일한 핵산 서열 영역으로 향하고, 제1 가이드 RNA는 상기 SNP 부위의 야생형(또는 돌연변이되지 않은) 핵산 서열로 향하며, 상기 제2 가이드 RNA는 상기 SNP 부위의 돌연변이형 핵산 서열로 향한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 시스템은 블랭크 대조 시스템을 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 블랭크 대조 시스템은,
(a3) Cas12b 또는 Cas12b와 유사한 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성을 갖는 Cas 단백질인 Cas12b 단백질; 및
(c3) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 SNP 부위는 상기 가이드 RNA의 PAM 서열 하류 9번째 위치 또는 10 ~ 16번째 위치, 바람직하게는 10 ~ 14번째 위치, 더 바람직하게는 10 ~ 12번째 위치에 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 SNP 부위는 상기 가이드 RNA의 PAM 서열 하류 9번째 위치에 있고, 상기 검출 부위는 G이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 SNP 부위는 상기 가이드 RNA의 PAM 서열 하류 9 ~ 20번째 위치, 바람직하게는 10 ~ 18번째 위치, 더 바람직하게는 10 ~ 16번째 위치에 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제1 또는 제2 가이드 RNA의 길이는 16 ~ 25nt이고, 바람직하게는 16 ~ 22nt, 더 바람직하게는 16 ~ 20nt이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제1 또는 제2 가이드 RNA의 길이는 18 ~ 25nt이고, 바람직하게는 18 ~ 22nt, 더 바람직하게는 18 ~ 20nt이다.
본 발명의 제3 양태에 있어서, 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 시약 키트를 제공한다. 상기 시약 키트는,
i) 제1 용기 및 제1 용기 내에 위치한, Cas12b 또는 Cas12b와 유사한 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성을 갖는 Cas 단백질인 Cas12b 단백질;
ii) 임의로 선택된 제2 용기 및 제2 용기 내에 위치한, 상기 Cas 단백질이 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 가이드 RNA;
iii) 제3 용기 및 제3 용기 내에 위치한 핵산 프로브; 및
iv) 임의로 선택된 제4 용기 및 제4 용기 내에 위치한 버퍼를 포함하고,
상기 표적 핵산 분자는 표적 DNA이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제1 용기, 제2 용기, 제3 용기 및 제4 용기 중 임의의 2개, 3개, 또는 4개(또는 전체)는 동일하거나 다른 용기일 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 핵산 프로브는 형광 그룹 및 소광 그룹을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 시약 키트는 버퍼를 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 시약 키트는,
v) 제5 용기 및 제5 용기 내에 위치한, 표적 DNA를 증폭하기 위한 중합 효소;
vi) 임의로 선택된 제6 용기 및 제6 용기 내에 위치한, 역전사를 위한 역전사 효소;
vii) 제7 용기 및 제7 용기 내에 위치한, 증폭 반응 및/또는 역전사 반응을 위한 dNTP를 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시스템은 LAMP 반응을 위한 시약을 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제5 용기, 제6 용기 및 제7 용기는 동일하거나 다른 용기일 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제1 용기 내지 제7 용기 중 2개, 복수개 또는 전체는 용기는 동일하거나 다른 용기일 수 있다.
본 발명의 제4 양태에 있어서, 샘플 내 표적 핵산 분자의 존재 여부 검출 방법을 제공한다. 상기 방법은,
(i) 본 발명의 제1 양태에 따른 상기 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출 시스템을 제공하되, 상기 검출 시스템은 검출할 샘플을 더 포함하는 단계; 및
(ii) 상기 검출 시스템 내의 핵산 프로브가 Cas12b 단백질에 의해 절단되고 상기 절단이 우회 단일 가닥 DNA의 트랜스 절단인지 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
상기 핵산 프로브가 Cas12b 단백질에 의해 절단되면, 이는 상기 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재함을 의미하고; 상기 핵산 프로브가 Cas12b 단백질에 의해 절단되지 않으면, 이는 상기 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재하지 않음을 의미한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 Cas12b 단백질은 Cas12b 또는 Cas12b와 유사한 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성을 갖는 Cas 단백질이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출할 샘플은 증폭되지 않은 샘플 및 증폭(또는 핵산 증폭)된 샘플을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출할 샘플은 증폭을 거쳐 획득된 샘플이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 핵산 증폭 방법은 PCR 증폭, LAMP 증폭, RPA 증폭, 리가제 연쇄 반응, 분지형 DNA 증폭, NASBA, SDA, 전사 매개 증폭, 회전환 증폭,HDA, SPIA, NEAR, TMA 및 SMAP2로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 PCR은 고온 PCR, 상온 PCR, 또는 저온 PCR을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 방법은 표적 부위의 핵산이 SNP, 점 돌연변이, 결실 및/또는 삽입에 있는지 여부를 검출하는데 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 부위의 상류 및 하류(-20nt 내지 ＋20nt 범위 내, 더 바람직하게는 -16nt 내지 ＋16nt 범위 내)에 PAM 서열이 없는 경우, PAM이 도입된 프라이머를 적용하여 핵산 증폭을 수행한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 PAM이 도입된 프라이머는 5' ~ 3'의 식 I 구조를 갖는다.
P1-P2-P3 (I)
식 (I)에서,
P1은 표적 핵산 분자의 서열에 상보적이거나 상보적이지 않은 5' 말단에 위치한 5' 세그먼트 서열이고;
P2는 PAM 서열이며;
P3은 표적 핵산 분자의 서열에 상보적인 3' 말단에 위치한 3' 세그먼트 서열이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 PAM프라이머는 표적 핵산 분자의 상류 또는 하류에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 예에서, P1의 길이는 0 ~ 20nt이다.
다른 바람직한 예에서, P3의 길이는 5 ~ 20nt이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 PAM프라이머의 길이는 16 ~ 50nt이고, 바람직하게는 20 ~ 35nt이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 상보에는 완전 상보 및 부분 상보가 포함된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 핵산 증폭에 사용되는 적어도 하나의 프라이머는 PAM 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 부위의 상류 및 하류 (-20nt 내지 ＋20nt 범위 내, 바람직하게는 -15nt 내지 ＋15nt 범위 내, 더 바람직하게는 -10nt 내지 ＋10nt 범위 내)에 PAM 서열이 포함되는 경우, PAM 서열을 포함하거나 포함하지 않는 프라이머를 사용할 수 있으며, 증폭된 증폭 산물은 상기 PAM 서열을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 단계(ii)에서의 검출은 형광 검출법을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 형광 검출법은 마이크로 플레이트 리더 또는 형광 분광 광도계를 적용하여 검출을 수행한다.
본 발명의 제5 양태에 있어서, 샘플 내 표적 핵산 분자의 존재 여부 검출 방법을 제공한다. 상기 방법은,
(i) 검출 시스템을 제공하는 단계;
(ii) 상기 검출 시스템을 역전사 및/또는 증폭 반응시켜 역전사 및/또는 증폭된 검출 시스템을 획득하는 단계; 및
(iii) 이전 단계의 상기 검출 시스템 내의 핵산 프로브가 Cas12b 단백질에 의해 절단되고 상기 절단이 우회 단일 가닥 DNA의 트랜스 절단인지 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
상기 검출 시스템은,
(a) Cas12b 또는 Cas12b와 유사한 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성을 갖는 Cas 단백질인 Cas12b 단백질;
(b) Cas12b 단백질이 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 가이드 RNA;
(c) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브;
(d) 버퍼;
(e1) 표적 DNA를 증폭하기 위한 중합 효소;
(e2) 임의로 선택된, 역전사를 위한 역전사 효소;
(e3) 증폭 반응 및/또는 역전사 반응을 위한 dNTP; 및
(f) 검출할 검출 샘플을 포함하며,
상기 표적 핵산 분자는 표적 DNA이고;
상기 핵산 프로브가 Cas12b 단백질에 의해 절단되면, 이는 상기 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재함을 의미하고; 상기 핵산 프로브가 Cas12b 단백질에 의해 절단되지 않으면, 이는 상기 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재하지 않음을 의미한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 단계(ii)에서, 상기 검출 시스템의 온도를 50 ~ 70 ℃, 바람직하게는 50 ~ 65 ℃, 더 바람직하게는 55 ~ 65 ℃로 유지한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 단계(iii)에서, 상기 검출 시스템의 온도를 25 ~ 70 ℃, 바람직하게는 48 ~ 65 ℃로 유지한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 핵산 증폭 방법은 PCR 증폭, LAMP 증폭, RPA 증폭, 리가제 연쇄 반응, 분지형 DNA 증폭, NASBA, SDA, 전사 매개 증폭, 회전환 증폭,hDA, SPIA, NEAR, TMA 및 SMAP2로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 핵산 증폭은 LAMP 증폭을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시스템에서, 검출할 검출 샘플의 핵산 농도는 1x10-11 ~ 1x10-5nM, 바람직하게는 1x10-9 ~ 1x10-6nM, 더 바람직하게는 1x10-8 ~ 1x10-7nM이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출은 정성 검출 또는 정량 검출을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 정량 검출은 절대 정량 검출이다(예를 들어, 디지털 PCR 기술과 결합하여 정량 검출을 수행함).
다른 바람직한 예에서, 상기 단계(ii) 및 (iii)의 총 시간은 ≤2시간, 바람직하게는 ≤1.5시간, 더 바람직하게는 ≤1시간(예를 들어, 30 ~ 60분)이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 핵산 분자는 메틸화 핵산 서열이거나 상기 메틸화 핵산 서열은 메틸화되지 않은 C→우라실 전환 후 획득된 핵산 서열이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 메틸화 핵산 서열은 바이설파이트로 처리되어 메틸화되지 않은 C를 우라실로 전환한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 표적 핵산 분자는 선형 또는 고리형 RNA분자가 역전사 반응을 거쳐 형성된 DNA 분자이거나 RT-PCR을 거쳐 형성된 DNA 분자이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 RT-PCR은 RT-LAMP를 포함한다.
본 발명의 제6 양태에 있어서, Cas12b 단백질의 용도를 제공한다. 상기 Cas12b 단백질은 우회 단일 가닥 DNA 절단을 기반으로 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출 시약 또는 시약 키트의 작성에 사용되며, 상기 Cas12b 단백질은 Cas12b 또는 Cas12b와 유사한 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성을 갖는 Cas 단백질이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 Cas12b 단백질은 AacCas12b(Alicyclobacillus acidoterrestris), Aac2Cas12b(Alicyclobacillus acidiphilus), AkaCas12b(Alicyclobacillus kakegawensis), AmaCas12b(Alicyclobacillus macrosporangiidus), AheCas12b(Alicyclobacillusherbarius), AcoCas12b(Alicyclobacillus conta minans)로부터 선택된다.
본 발명의 제7 양태에 있어서, 샘플 내 표적 핵산 분자의 존재 여부 검출 기기를 제공한다. 상기 기기는,
(a) 디지털 반응 시스템에 대해 핵산 증폭 반응 및 Cas12b 단백질에 의해 매개된 우회 절단인 우회 절단 반응을 수행하기 위한 증폭 반응-우회 절단 반응 모듈; 및
(b) 각 디지털 반응 시스템에서 Cas12b 단백질에 의해 매개된 우회 절단이 발생하는지 여부를 검출하기 위한 신호 검출 모듈을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 핵산 증폭 반응 및 우회 절단 반응은 동시에 진행된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 증폭 반응-우회 절단 반응 모듈은 상기 기기 중 디지털 반응 시스템의 온도를 예정된 온도로 증폭하기 위한 온도 제어 유닛을 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 예정 온도는 50 ~ 70 ℃이고, 바람직하게는 50 ~ 65 ℃, 더 바람직하게는 55 ~ 65 ℃이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 예정 온도는 25 ~ 70 ℃이고, 바람직하게는 48 ~ 65 ℃이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 전체 증폭 반응 및 우회 절단 반응 과정에서 예정 온도는 거의 동일하다.
다른 바람직한 예에서, 상기 예정 온도의 변동 범위는 ±5 ℃ 이내, 바람직하게는 ±3 ℃ 이내, 더 바람직하게는 ±1 ℃ 이내이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 핵산 증폭은 등온 증폭, 또는 변성-복원성-연장 온도 차이가 ≤10 ℃(바람직하게는 ≤5 ℃, 더 바람직하게는 ≤3 ℃)인 증폭이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 핵산 증폭은 LAMP 증폭을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 디지털 반응 시스템은 마이크로 액적형 디지털 PCR(ddPCR) 반응 시스템 또는 칩 디지털 PCR(cdPCR) 반응 시스템을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 디지털 반응 시스템은 복수의 독립적인 반응 시스템 유닛을 포함하고, 각각의 반응 시스템 유닛은 모두,
(a) Cas12b 또는 Cas12b와 유사한 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성을 갖는 Cas 단백질인 Cas12b 단백질;
(b) Cas12b 단백질이 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 가이드 RNA; 및
(c) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브;
(d) 버퍼;
(e1) 표적 DNA를 증폭하기 위한 중합 효소;
(e2) 임의로 선택된, 역전사를 위한 역전사 효소;
(e3) 증폭 반응 및/또는 역전사 반응을 위한 dNTP; 및
(f) 검출할 검출 샘플을 포함하며,
상기 표적 핵산 분자는 표적 DNA이고;
희석화 처리(즉 디지털화 처리)로 인해 각각의 독립적인 반응 시스템은 검출 샘플로부터의 핵산 사본 1개를 포함하거나 검출 샘플로부터의 핵산 사본 0개를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 각각의 반응 시스템 유닛이 검출 샘플로부터의 핵산 사본 1개 또는 0개를 포함하는 것을 제외하고 각각의 반응 시스템 유닛은 동일하다.
다른 바람직한 예에서, 상기 반응 시스템 유닛은 마이크로 액적이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 반응 시스템 유닛은 칩의 미세 기공에 위치하는 미세 반응 시스템이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 기기는 샘플 추가 모듈, 및/또는 제어 모듈을 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 신호 검출 모듈은 이미징 모듈을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 이미징 모듈은 형광 검출 유닛을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 형광 검출 유닛은 상기 디지털 반응 시스템을 조사하여 상기 반응 시스템을 여기시킴으로써 형광 신호를 생성하고, 상기 형광 신호를 디지털 신호로 변환하며, 바람직하게는 이를 상기 제어 모듈로 전송한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제어 모듈은 상기 형광 신호(바람직하게는 상기 형광 신호가 변환된 디지털 신호)의 개수 및 상기 반응 시스템 유닛의 총 개수를 기반으로 연산 분석을 수행하여 표적 핵산의 정량 검출 결과(예를 들어, 농도 또는 카피 수)를 획득한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 기기는 디지털 PCR 검출 장치이다.
본 발명의 상술한 기술적 특징들과 아래(예를 들어, 실시예)에서 구체적으로 설명되는 기술특징들은 본 발명의 범위 내에서 서로 조합되어 신규 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있음을 이해해야 한다. 편폭의 제한으로 인해 여기서 더 이상 설명하지 않는다.
본 발명은 CRISPR과 관련된 보다 빠르고 간편하며 저렴한 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
도 1은 dsDNA와 ssDNA가 각각 표적 DNA로 사용되는 경우, 농도가 다른 Cas12b와 sgRNA가 trans 절단 프로브를 수행하여 발생된 형광 강도를 도시한다.
도 2는 dsDNA와 ssDNA가 각각 표적 DNA로 사용되는 경우, trans 절단 형광 검출 강도에 대한 PAM 서열 위치의 다른 염기의 영향을 도시한다.
도 3은 ssDNA 또는 dsDNA가 표적으로 사용되는 경우, Cas12b의 trans 절단 속도를 도시한다.
도 4는 다양한 온도 조건에서 dsDNA 또는 ssDNA를 표적으로 하는 Cas12b의 trans 절단 형광 강도를 도시한다.
도 5는 표적 서열의 구배 희석을 통해 dsDNA 또는 ssDNA를 표적으로 하는 Cas12b의 검출 감도(즉 trans 절단의 형광 강도)를 도시한다.
도 6은 LAMP 증폭 반응(즉hOLMES v2.0 방법)과 결합된 Cas12b의 표적에 대한 검출 감도를 도시한다.
도 7은 가이드 서열의 길이가 다른 sgRNA를 사용하여 Cas12b trans 절단 형광 강도에 대한 ssDNA 표적 서열 위치 1 ~ 12에서 단일 염기 돌연변이의 영향을 각각 측정한 것이다.
도 8은 16nt sgRNA를 가이드 서열로 사용하여 Cas12b trans 절단 형광 강도에 대한 ssDNA 표적 서열 위치 1 ~ 16에서 단일 염기 돌연변이의 영향을 각각 측정한 것이다.
도 9는 16nt sgRNA를 가이드 서열로 사용하여 Cas12b trans 절단 형광 강도에 대한 ssDNA 표적 서열 위치 1 ~ 16에서 임의의 다른 3종 염기로의 단일 염기 돌연변이의 영향을 각각 측정한 것이다.
도 10은 16nt sgRNA를 가이드 서열로 사용하여 Cas12b trans 절단 형광 강도에 대한 3종 다른 ssDNA 표적 서열(rs5082, rs1467558, rs2952768) 위치 8 ~ 16에서 단일 염기 돌연변이의 영향을 각각 측정한 것이다.
도 11은 가이드 서열의 길이가 다른 sgRNA를 사용하여 Cas12b trans 절단 형광 강도에 대한 dsDNA 표적 서열 위치 1 ~ 16에서 임의의 단일 염기 돌연변이의 영향을 측정한 것이다.
도 12는 50 ℃, 55 ℃, 60 ℃, 65 ℃ 조건에서 LAMP와 Cas12b 검출이 원 스텝 반응을 구현하는 것을 도시한다.
도 13의 HOLMES v2.0(LAMP는 Cas12b와 결합됨)은 대장균의 gyrB 부위를 테스트하여 대장균의 존재 여부를 감별하고 구배 희석을 통해 검출 감도를 테스트한 것이다(코팅 테스트를 거쳐 0.005 OD의 대장균은 약 7000개로 확인됨).
도 14의 HOLMES v2.0(LAMP는 Cas12b와 결합됨)은 Y 염색체 sry 부위를 테스트하고, 타액 샘플을 사용하여 성별(DNMT1-3 부위는 염색체의 유전자 좌위이며 양성 대조군임)을 감별한 것이다.
도 15는 비대칭 또는 대칭 PCR 증폭에 Cas12b를 결합하여 SNP 부위(rs5082)를 검출한 것이다. 이로부터 rs5082 부위 근처에 PAM 서열이 없으므로 단일 가닥 DNA를 생성하는 비대칭 PCR이 SNP 부위를 보다 명확하게 구분할 수 있음을 알 수 있다.
도 16은 프라이머를 설계하고 LAMP 증폭을 통해 PAM 서열을 도입한 후, Cas12b와 결합하여 SNP 부위(rs5082)를 검출한 것이다. 이로부터 rs5082 부위 근처에 PAM 서열이 없으므로 PAM이 추가된 LAMP 증폭 방법(프라이머에 PAM 서열이 구비됨)을 생성하여 SNP 부위를 더 잘 구분할 수 있음을 알 수 있다.
도 17의 HOLMES v2.0(LAMP는 Cas12b와 결합됨)는 RNA 바이러스 JEV(Japanese encephalitis virus; 일본 뇌염 바이러스)를 검출한 것이다.
도 18의 HOLMES v2.0(LAMP는 Cas12b와 결합됨)는 미량 DNA를 원 스텝 정량화한 것으로, 농도가 다른 템플릿 DNA를 희석하고 LAMP-Cas12b 원 스텝 방법을 사용하여 형광계에서 형광값을 실시간으로 검출한 것이다(55 ℃ 반응).
도 19는 형광값이 600,000에 도달한 시점을 y축(도 18의 데이터 사용) 으로 사용하고 농도의 lg 절대값을 X축으로 하여 작도함으로써 대략적인 직선 추세선을 획득한 것으로, 해당 방정식을 사용하여 표적 서열의 정량화를 수행할 수 있다.
도 20은 핵산 샘플의 절대 정량 검출을 위한 디지털HOLMES(LAMP는 Cas12b 및 clarity 칩과 결합됨) 방법이다.
도 21은 표적 DNA 메틸화를 검출하는 HOLMESv2의 원리도로서, 바이설파이트 전환 처리 및 PCR 증폭을 거친 후, 메틸화되지 않은 CpG 부위 중 C 염기는 T로 전환되고; 메틸화 표적 부위와 완전히 매칭되는 sgRNA 가이드 서열을 설계하고HOLMESv2 반응(즉, Cas12b, sgRNA 및 일단은 형광 그룹, 타단은 소광 그룹으로 라벨된 단일 가닥 DNA프로브 추가)을 이용하여 시스템에서 메틸화 부위의 함량을 검출한다. 마찬가지로, 메틸화되지 않은 표적 부위와 완전히 매칭되는 sgRNA 가이드 서열을 설계하고HOLMESv2 반응을 이용하여 시스템에서 메틸화되지 않은 부위의 함량을 검출하며 나아가 메틸화 부위의 비율을 계산할 수 있다.
도 22는 sgRNA의 다른 부위, 다른 길이에서 표적 DNA 메틸화를 검출한 실험 결과이다. target-C, 이 부위는 C(메틸화를 나타냄)의 테스트 결과이고; target-T, 이 부위는 T(바이설파이트 전환 처리 이전의 염기가 메틸화되지 않음을 나타냄)의 테스트 결과이다. 동일한 sgRNA 서열이 target-C를 표적으로 하는 경우 신호값이 크고, target-T를 표적으로 하는 경우 신호값이 작아 상기 부위가 메틸화에 의해 변형되었는지 여부를 구분하는데 사용될 수 있다.
도 23은 sgRNA의 m3-C12-17 부위를 사용하여 표적 DNA 메틸화를 검출하는 원리도이다. 왼쪽 도면은 sgRNA 서열과 표적 서열이 완전히 매칭됨을 도시하고; 오른쪽 도면은 메틸화되지 않은 부위가 바이설파이트 전환 처리 및 PCR 증폭을 거친 후 M3 부위가 T로 변형되어 sgRNA 서열과 표적 서열이 완전히 매칭될 수 없음을 도시한다.
도 24는 4종 세포주 M3 CpG 부위(COL1A2)의 메틸화 수준의 테스트 결과이다. 0%, 10%, 30% 및 50%의 결과는 표준 곡선을 제작하기 위한 테스트 결과이고, 293T, SW480, NCI-N87 및 MCF-7은 4종 세포주에서 해당 부위의 실제 테스트값이며; 왼쪽으로부터 오른쪽으로는 3회 독립적인 반복 실험을 나타내고, 각 실험에서 3회의 반복 테스트를 수행하였다.
도 25는 M3 CpG 부위(COL1A2)의 메틸화 수준의 표준 곡선이다. 도 5의 표준 곡선 테스트 결과에 따라 표준 곡선도를 제도하였다.
도 26은 4종 세포주 (293T, SW480, NCI-N87, MCF-7) 중 M3 CpG 부위(COL1A2)의 메틸화율 테스트 결과이다. 도면으로부터HOLMESv2 시스템의 테스트 결과는 NGS 시퀀싱 결과(High-throughput sequencing)에 가장 근접됨을 알 수 있다.
도 27은 HOLMESv2 기술을 사용한 고리형 RNA의 결과이다. (위쪽 도면)은HOLMESv2을 사용한 RNA 검출 및 표적 부위 선택 모식도이고; (왼쪽 아래 도면)은hOLMESv2을 사용한 표적 GAPDH 검출 결과도이며; (오론쪽 아래 도면)은hOLMESv2를 사용한 표적 CDR1as 검출 결과도이다. target site, 표적 부위; NTC는 실험 대조군인 바, 즉 샘플은 멸균수이고; target는 실험군, 즉 샘플은 RNA 샘플이며; 왼쪽 아래 도면 및 오른쪽 아래 도면 중 형광값은 실험적 배경 형광이 공제된 형광값이다. NTC 및 target 반응군은 모두 LAMP 반응 증폭을 거치고 이의 증폭 산물은 Cas12b 반응 테스트에 사용되며; 배경 형광은 Cas12b 반응 시스템에서 멸균수를 직접 첨가하여 테스트를 수행한 형광값이다.
Cas12b의 절단 특성에 대한 광범위하고 심층적인 연구를 통해 본 발명인은 처음으로 표적 핵산 검출을 위한 기술적 해결수단을 개발하였다. 실험 결과는 본 발명의 기술적 해결수단은 미량 핵산을 검출함에 있어 신속하고 감도 및 정확도가 매우 높아 예를 들어 타액 샘플의 신속한 성별 감별, 대장균 오염 검출, SNP 유전자형의 신속한 감별, RNA 바이러스 검출 및 미량 DNA 샘플 농도 측정 등 다양한 분야에 적용될 수 있음을 나타낸다. 본 발명은 이를 기반으로 완성된 것이다.
용어
용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA" 또는 "sgRNA"는 Cas 단백질(예를 들어, Cas12b 단백질)이 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하도록 유도하는 RNA를 지칭한다.
용어 "CRISPR"은 많은 원핵 생물의 면역 시스템인 클러스터된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복 서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)을 지칭한다.
용어 "Cas 단백질"은 CRISPR 시스템의 관련 단백질인 CRISPR-associated단백질을 지칭한다.
용어 "Cas12a"(구칭 "Cpf1") 는 CRISPR 시스템 분류에서 V-A 유형 효소인 crRNA 의존적 엔도 뉴클레아제를 지칭한다.
용어 "Cas12b", "C2c1"는 상호 교환적으로 사용 가능하며, CRISPR 시스템 분류에서 V-B 유형 효소인 sgRNA 의존적 엔도 뉴클레아제를 지칭한다.
용어 "LAMP"는 루프 매개 등온 증폭 기술(Loop-mediated isothermal amplification)로서, 유전자 진단에 적합한 항온 핵산 증폭 기술이다.
용어 "PAM"은Cas12b가 이중 가닥 DNA를 절단하는 데 필요한 프로토 스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif)를 지칭하고, AacCas12b의 PAM은 TTN 서열이다.
용어 "PCR"은 다량의 관심 DNA 단편을 증폭하는데 사용되는 방법인 중합 효소 연쇄 반응을 지칭한다.
HOLMES v2.0은 Cas12b 기반 핵산 검출 방법인 1시간 저비용 다용도 고효율 시스템 버전 2.0(one-HOur Low-cost Multipurposehighly Efficient System version 2.0)을 지칭한다.
검출 방법
본 발명은 검출할 표적 핵산 분자의 반응 시스템에 가이드 RNA, Cas 단백질, 핵산 프로브, 버퍼를 포함시킨 후 이에 대해 형광 검출을 수행하는 표적 핵산 분자의 검출 방법을 개시한다.
본 발명은 표적 DNA(단일 가닥 또는 이중 가닥), sgRNA 및 Cas12b 단백질이 3원 복합체를 형성하는 경우, 상기 복합체가 시스템에서 다른 단일 가닥 DNA 분자를 절단하는, 표적 핵산 분자를 고 특이적으로 신속하게 검출하는 검출 방법을 개시한다.
표적 DNA(검출할 DNA 서열의 일부)를 표적으로 하는 sgRNA를 설계하고; 검출 시스템에 sgRNA 및 Cas12b 단백질을 추가함으로써 표적 DNA가 존재하는 경우(단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA), Cas12b, sgRNA 및 표적 DNA는 3원 복합체를 형성하는 동시에 상기 복합체는 우회 절단 활성을 행사하고 형광 신호 라벨을 갖는 핵산 프로브를 절단하여 형광을 방출한다.
대표적인 핵산 프로브는 단일 가닥 DNA로서, 그의 두 말단에는 각각 발광 그룹 및 소광 그룹이 연결되어 있으므로 상기 프로브가 절단되면 발광 그룹이 발광할 수 있다.
본 발명에서, 형광을 검출함으로써 검출할 시스템에 표적 DNA 분자가 포함되어 있는지 여부를 바로 알 수 있다.
본 발명에서, 적합한 Cas 단백질은 Cas12b이고, 상기 Cas12b는 바람직하게는 AacCas12b(Alicyclobacillus acidoterrestris), Aac2Cas12b(Alicyclobacillus acidiphilus), AkaCas12b(Alicyclobacillus kakegawensis), AmaCas12b(Alicyclobacillus macrosporangiidus), AheCas12b(Alicyclobacillusherbarius), AcoCas12b(Alicyclobacillus conta minans)이다.
검출할 표적 핵산 분자의 반응 시스템 중 검출할 표적 핵산 분자는 증폭되지 않았거나 증폭 후 획득되거나 및/또는 역전사 증폭을 거친 것일 수 있다.
본 발명의 검출 방법은 포유 동물, 식물, 또는 미생물, 바이러스와 같은 상이한 종의 핵산 분자를 검출할 수 있다. 본 발명의 방법은 병원성 미생물, 유전자 돌연변이 또는 특이성 표적 DNA 또는 RNA를 검출하는데 특히 적합하다.
본 발명의 방법을 사용하여 샘플이 특이성 DNA 서열을 포함하는지 여부를 신속하게 검출할 수 있다. 이 밖에, 증폭 기술(예를 들어, LAMP, PCR, 비대칭 PCR, RPA 등)과 결합하여 상기 검출 방법의 감도를 크게 향상시킬 수 있다.
바람직하게, Cas12b의 우회 절단과 핵산 증폭(예를 들어, 등온 증폭, LAMP 증폭) 및 다른 기술(예를 들어, 디지털 PCR) 등을 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일예에서, Cas12b를 기반으로 한 우회 절단 검출과 핵산 증폭을 결합하는 경우, 검출 감도를 10-8nM 또는 더 낮은 농도로 향상시킬 수 있다.
이 밖에, Cas12b를 기반으로 한 우회 절단 검출과 디지털 PCR을 결합하는 경우, 검출 감도를 1 카피/하나의 반응 시스템(예를 들어, 하나의 마이크로 액적)으로 향상시킬 수 있어 거의 검출 감도에 대한 모든 요구를 충족할 수 있다.
Cas12b 기반 핵산 검출 방법 및 HOLMES v2.0(one-HOur Low-cost Multipurposehighly Efficient System version 2.0)
핵산 탐지 방법 구축
본 발명은 Cas12b의 특성을 이용하여hOLMES v2.0(one-HOur Low-cost Multipurposehighly Efficient System version 2.0)으로 불리우는, 핵산 분자를 특이적으로 검출하는 방법을 개발하였는 바, 이는 해당 명칭과 마찬가지로 1시간, 저비용, 다용도, 고효율, 매우 간단한 테스트 방법을 특징으로 한다.
전체 반응 시스템에서, 템플릿 핵산을 증폭하는 단계 및 Cas12b 단백질의 특이적 핵산 검출 단계로 나뉘여 수행될 수 있거나; 또는 상기 두 단계를 한 단계로 결합할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 일예에서 핵산 증폭에는 LAMP 방법 또는 비대칭 PCR 방법이 적용되나 실제로 등온 증폭 방법(RPA)과 같은 임의의 증폭 방법을 모두 2단계의 핵산 검출과 결합시킬 수 있다.
초기 핵산은 이중 가닥 DNA에 한정되지 않고 단일 가닥 DNA 또는 RNA일 수도 있으므로 해당 방법은 다양한 유형의 핵산 분자에 적합하다.
핵산 검출 단계의 경우, Cas12b, sgRNA 및 핵산 프로브 이 3개 성분은 실험의 핵심이다. 실시예에 언급된 AacCas12b외에도 다른 Cas12b 단백질 역시 상기 방법에 적용되며, 이 밖에, 기타 유형의 Cas 단백질(예를 들어, Cas12c단백질) 역시 본 발명의 보호 범위에 적용된다.
유도 작용을 하는 sgRNA의 경우, 인공 변형 등 기타 개선을 거친 후 시스템에서 보다 안정적이다. 핵산 프로브의 선택에 있어서, 본 발명은hEX 및 BHQ1로 라벨링된 짧은 단일 가닥 DNA(FAM 및 Eclipse로도 라벨링됨)를 선택 사용하며, 상기 핵산 프로브가 절단된 후 검출 가능한 차이를 발생하는 한, 이론적으로 검출 가능한 다른 임의의 라벨링 방식을 적용할 수 있다. 또는, 핵산 프로브는 화합물과 결합한 후 형광을 방출하여 상기 프로브가 절단되었는지 여부를 탐지하도록 설계될 수도 있다.
이해의 편의를 위해, 본 발명의 Cas12b 기반 핵산 검출 방법(바람직한 "HOLMES"v2.0 방법)의 다양한 특성을 추가로 설명한다.
Cas12b trans 절단(트랜스 절단) 활성 감별: Cas12a와 Cas12b는 서열에서 큰 차이를 보이나 본 발명인의 실험 결과로부터 Cas12b 역시 trans 절단 활성을 가지고 있음을 알 수 있다.
우선, 우회 DNA는 형광 프로브로 설계되고, 그 구성은 12 nt의 랜덤 서열이며, 5' 말단에 형광 그룹hEX가 라벨링되고, 3 말단에 소광 그룹 BHQ1(HEX-N12-BHQ1)이 라벨링된다. 시스템에 표적 DNA 단편(dsDNA 또는 ssDNA)이 포함되는 경우, 즉 표적 DNA, sgRNA 및 Cas12b 단백질의 3원 복합체가 형성되면, 상기 프로브가 바로 절단되는 동시에 형광 검출기의 검출을 통해hEX 형광 그룹이 형광(여기광 535 nm, 방출광 556 nm)을 방출한다.
도 1에 도시된 바와 같이, Cas12b와 sgRNA의 농도가 250 nM 또는 500 nM인 경우, dsDNA와 ssDNA는 표적으로서 모두 높은 형광 강도를 가지며, Cas12b와 sgRNA의 농도가 50 nM 및 100 nM으로 감소된 경우, ssDNA의 표적 서열은 여전히 높은 형광 강도를 갖는다.
Cas12b trans 절단(트랜스 절단)의 PAM 특성: 연구에 따르면, Cas12b cis가 이중 가닥 DNA를 절단하는 경우(시스 절단), PAM이라는 서열이 필요하다. 즉, 5' 말단 바로 다음에 5'-TTN-3'이여야만 Cas12b에 의해 절단될 수 있다. 본 발명인은 Cas12b의 표적 서열이 trans 절단시 PAM의 특성을 필요로 하는지 여부를 테스트하기 위해, trans 절단(트랜스 절단)시 PAM이 필요한지 여부를 검출하도록 PAM 위치에 다른 서열(TTC, TAC, ATC, AAC, GGC 및 CCC 포함)을 설계하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, 이중 가닥 DNA가 표적으로 사용되는 경우에는 Cas12b의 trans 절단은 PAM 서열에 민감한 바, 즉 TTC의 경우에만 trans 절단 형광 강도가 높을 수 있고(TAC로 변경된 후 발생된 형광 강도는 TTC보다 약간 낮음), 단일 가닥 DNA가 표적으로 사용되는 경우에는 PAM 서열에 민감하지 않아 항상 높은 trans 절단 형광 강도를 나타낸다.
Cas12b trans 절단(트랜스 절단) 속도: ssDNA 및 dsDNA를 각각 표적 DNA로 사용하는 경우, Cas12b의 trans 절단 속도를 측정한다.
도 3에 도시된 바와 같이, ssDNA를 기질로 사용할 경우, Cas12b의 trans 절단 속도가 매우 빠르며 단 6분만에 최대값에 근접하는 반면, dsDNA를 기질로 사용할 경우, 절단 속도가 상대적으로 느리고 점차 상승되는 과정이 있음을 보아낼 수 있다. 이는 신속한 검출(예를 들어, ≤10분)이 필요한 일부 경우에 ssDNA를 Cas12 우회 절단을 위한 기질로 사용하기에 적합함을 시사한다.
Cas12b trans 절단(트랜스 절단)의 적용 온도 범위: Cas12b는 trans 절단을 위한 매우 넓은 온도 범위를 갖는데, 표적 서열로서 ssDNA를 사용하든 dsDNA를 사용하든 관계없이 모두 45 ~ 65 ℃ 온도의 우수한 반응값을 가지며, 특히 ssDNA 표적은 25 ~ 70 ℃의 더 넓은 온도 범위를 갖는다(도 4 참조).
Cas12b 검출 감도: 본 발명인은 표적 dsDNA 또는 ssDNA의 농도를 희석하여 Cas12b의 검출 감도를 희석하였다. 바람직한 일예에서, 표적 ssDNA(DNMT1-3(TTC PAM)-R) 또는 dsDNA(DNMT1-3(TTC PAM)-F, DNMT1-3(TTC PAM)-R이 두개의 올리고 뉴클레오티드는 어닐링(annealing)을 거쳐 생성됨)를 각각 농도 100 nM, 10 nM, 1 nM,?? 내지 10-4 nM로 희석한다.
결과는 DNA의 농도가 1 nM인 경우, 직접 Cas12b를 사용하여 여전히 표적 분자(도 5)를 검출할 수 있음을 보여준다.
HOLMES v2.0 감도 테스트: 일 실시예에서, Cas12b와 LAMP 반응을 결합시킬 경우(즉 HOLMES v2.0), 검출 감도는10-8 nM에 도달할 수 있는 바, 이는 표적 핵산 서열의 검출 감도를 크게 향상시킨다(도 6).
ssDNA 표적에 대한 SNP테스트: 본 발명의 방법은 SNP, 특히 ssDNA 표적의 SNP를 포함한 핵산 돌연변이를 검출하는데 매우 적합하다.
표적 단일 가닥 DNA의 SNP 검출은 sgRNA 가이드 서열이 18 nt 또는 20 nt인 경우, 위치 1 ~ 12의 염기 돌연변이 후 trans 절단에 의해 생성된 형광 신호에 거의 영향을 미치지 않음을 보여준다. sgRNA 가이드 서열이 14 nt 또는 15 nt인 경우, 야생형 대조군을 포함한 형광값은 모두 매우 낮고, sgRNA 가이드 서열이 16nt인 경우, 위치 10 ~ 12의 돌연변이 후, 그 형광값은 대조군에 비해 현저히 감소된다(도 7).
추가 연구에 따르면, 가이드 서열이 16 nt인 sgRNA의 경우, 10 ~ 16번째 위치의 염기 돌연변이가 형광값이 분명한 영향을 미침을 발견하였으며, 특히 위치 10 ~ 14에서 형광값은 거의 검출되지 않았다(도 8).
이 밖에, 표적 단일 가닥 DNA가 다른 위치에서 다른 유형의 염기로 돌연변이되는 경우에는 위치 9만 G로 돌연변이되어 형광값이 크게 변할 뿐, 형광값에 본질적인 영향을 미치지 않는다(도 9).
이 밖에, 본 발명인은 또한 3가지 다른 표적 서열을 테스트하였다. 다른 서열은 특정 부위 돌연변이에 대해 다른 형광 변화값을 갖지만 rs5082의 위치 8, 10, 11, 12, rs1467558의 위치 11, rs2952768의 위치 8 ~ 15와 같은 위치 8 ~ 16에서 모두 분명히 변화된 위치를 찾을 수 있다(도 10).
dsDNA 표적에 대한 SNP테스트: 본 발명의 방법은dsDNA 표적의 SNP를 포함하는 핵산 돌연변이를 검출하는데 적합하다.
표적 이중 가닥 DNA의 SNP 검출은 trans 절단을 위한 단일 염기 돌연변이에 의해 생성된 형광 신호가 ssDNA와 상이함을 보여준다. 예를 들어, 가이드 서열이 18 ~ 20nt인 sgRNA는 10 ~ 16번째 위치의 염기 돌연변이에 상이한 정도로 민감하다(위치 1 및 3의 염기 돌연변이 후 형광 신호 역시 상이한 정도로 감소됨) (도 11). 일반적으로 이러한 sgRNA는 10번째 및 16번째 위치에 가장 민감하다.
다양한 온도에서 원 스텝 검출: 본 발명은 또한 핵산 증폭과 Cas12b를 결합한 원 스텝 검출을 제공한다.
바람직하게, LAMP 증폭과Cas12b 검출을 결합하여 원 스텝 검출을 구현할 수 있다. 본 발명에서는 다양한 온도 조건(각각 50 ℃, 55 ℃, 60 ℃, 65 ℃)에서 Cas12b의 trans 절단 상황을 테스트하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 50 및 55 ℃에서, 원 스텝 검출이 가능하며, 특히 55 ℃에서 형광값이 보다 빠르게 상승한다.
RNA 표적 테스트: 본 발명의 방법은 표적 DNA의 검출에 적합할뿐만 아니라 표적 RNA의 검출에도 사용될 수 있다. 본 발명에서, 우선 RNA를 역전사하여 DNA를 형성한 후, 표적 서열 검출을 수행할 수 있다.
바람직한 방법은 반응 시스템에 역전사 효소를 추가하여 RNA의 역전사를 구현한 후, 예를 들어 Bst 2.0 DNA 중합 효소를 사용하여 증폭하고 Cas12b를 사용하여 trans 절단을 구현하는 것이다. 다른 방법은 Bst 3.0 DNA 중합 효소(해당 효소는 RNA 템플릿을 증폭하여 DNA를 생성할 수 이음)를 직접 사용하여 RNA의 역전사 및 증폭을 직접 구현하는 것이다(도 17).
미량 DNA 템플릿의 정량 테스트: 본 발명의 방법은 정량 검출에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 55 ℃에서 LAMP 증폭 및 Cas12b를 기반으로 한 원 스텝을 적용하여 미량 DNA의 정량 테스트를 수행한다. 다른 농도의 템플릿을 희석하고 trans 절단된 형광값을 실시간으로 검출하며, 표준 곡선을 작성하여 계산을 통해 타겟 템플릿 서열의 농도를 획득할 수 있다(도 18 및 19).
다른 정량 검출은 본 발명의 Cas12b를 기반으로 한 검출 방법과 디지털 PCR 기술을 결합하는 것이다(하기 "디지털HOLMES 방법" 참조).
프라이머 설계 및 sgRNA 설계
당업자는 본 발명의 Cas12b를 기반으로 한 핵산 검출을 수행하기 위해, 본 발명의 교시를 기반으로 실제 필요에 따라 해당 프라이머 및/또는 sgRNA를 합성할 수 있다. 본 발명에서, 일부 바람직한 프라이머 및 sgRNA 설계는 아래 제안을 참조할 수 있다.
프라이머의 경우, 그 설계는 하기 상황을 참조할 수 있다.
상황 1. 초기 증폭 반응에서 LAMP 방법을 선택하면, 일반적인 방법을 적용하여 프라이머를 설계할 수 있다(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html). 프라이머 영역 F2/F3과 B2/B3 사이에 LoopF 및 LoopB프라이머, 즉 6쌍의 프라이머를 추가할 것을 제안한다.
상황 2. 초기 증폭 반응에서 비대칭 PCR 방법을 선택하면 여러가지 프라이머를 미리 선택하여 단일 가닥 DNA를 생성하는데 가장 적합한 조합을 테스트해야 한다.
상황 3. SNP를 테스트할 경우, 부위 근처에 적합한 PAM 부위가 존재하면 상황 1의 경우를 적용하고; 적합한 PAM 부위가 없으면 프라이머에 PAM 부위를 도입하여 산물이 PAM 부위를 생성하도록 할 수 있다. 일반적으로SNP 부위가 PAM로부터 8 ~ 16개 염기 떨어져 있는 것이 적합하나 구체적인 표적 서열은 구체적으로 테스트해야 한다.
상황 4. SNP 부위 근처에서 적합한 LAMP 증폭 프라이머를 찾기 힘들거나 적합한 PAM을 도입할 수 없는 경우, 비대칭 PCR 증폭과 같은 단일 가닥 DNA 증폭 방법을 적용할 수 있다.
sgRNA 설계의 경우, 하기 상황을 참조할 수 있다.
상황 1. 표적 유전자의 검출은 일반적으로 20 bp의 상보적 쌍을 이루는 sgRNA를 선택하고, 또한 표적 서열에는 PAM 서열이 구비된다.
상황 2. SNP 검출에 있어서 증폭 단계로 LAMP와 같은 이중 가닥 증폭을 사용하는 경우, 우선 표적 서열에서 SNP의 위치를 테스트하는 것이 좋다. 우선적으로 10 ~ 16번째 위치에서 길이가 18nt인 가이드 서열의 sgRNA를 테스트한다.
상황 3. SNP 검출에 있어서 증폭 단계로 비대칭 PCR와 같은 단일 가닥 증폭을 사용하는 경우, 우선 표적 서열에서 SNP의 위치를 테스트하는 것이 좋다. 우선적으로 10 ~ 16번째 위치, 특히 10 ~ 12번째 위치에서 길이가 16nt인 가이드 서열의 sgRNA를 테스트한다.
디지털HOLMES 방법
본 발명은 또한 본 발명의 HOLMES 기술과 디지털 PCR(dPCR)을 결합한, "디지털hOLMES 방법"으로 약칭되는 기술을 제공한다.
디지털 PCR은 최근 급속도로 발전하는 핵산 분자의 절대 정량기술이다. 현재에는 주로 두가지 유형 즉 마이크로 액적형 디지털 PCR(ddPCR)과 칩 디지털 PCR(cdPCR)이 존재하는데, 기존의 PCR 증폭 전에 샘플을 마이크로 액적화 처리하거나 칩에 추가하고 핵산 분자를 포함하는 반응 시스템을 수천 수만개의 나노 스케일 반응 시스템으로 분할한다. 일반적인 PCR에 비해, 디지털 PCR에는 전처리 단계와 후속적인 형광 검출 단계가 더 포함된다. 현재 디지털 PCR 검출은 일반적인 PCR 기기를 사용하여 증폭 단계를 수행해야 하며, 또한 PCR 반응 조건이 엄격하고 소요 시간이 길다(약 3 ~ 4시간).
항온 조건에서 HOLMES 방법에 현재 칩 디지털 PCR의 형광 판독기(즉 디지털HOLMES 방법)를 결합하여 절대 정량 검출을 수행할 수 있다.
이 밖에, 디지털HOLMES가 LAMP와 같은 방법을 적용하여 증폭을 수행하는 경우, 일반적인 PCR 기기와 같이 정밀한 온도 제어 없이 넓은 온도 범위(50 ~ 70 ℃, 또는 약 50 ~ 55 ℃)에서 증폭이 가능하다. Cas12b가 상기 온도 범위 내에서도 우회 절단 활성을 가지므로 효과적으로 통합할 수 있을뿐만 아니라 증폭과 우회 절단을 동시에 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 디지털HOLMES 검출을 위한 기기, 특히 본 발명의 제7 양태에 따른 기기를 제공한다.
따라서, 디지털HOLMES 기술을 이용하여 전처리, 증폭 및 검출을 하나의 기기에 통합시킴으로써 수동 작업 오류를 줄일 수 있을뿐만 아니라 검출 속도를 더 향상시키고 기기 비용을 줄일 수 있다.
시약 키트
본 발명은 또한 가이드 RNA, Cas12b 단백질, 핵산 프로브를 포함하는 시약 키트를 제공한다. 이 밖에, 본 발명의 시약 키트는 예를 들어, 버퍼, 증폭에 필요한 시약, 역전사에 필요한 시약, 또는 이들의 조합과 같은 다른 시약을 더 포함할 수 있다.
대표적으로, 본 발명의 시약 키트는,
i) 제1 용기 및 제1 용기 내에 위치한, Cas12b 또는 Cas12b와 유사한 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성을 갖는 Cas 단백질인 Cas12b 단백질;
ii) 임의로 선택된 제2 용기 및 제2 용기 내에 위치한, 상기 Cas 단백질이 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 가이드 RNA;
iii) 제3 용기 및 제3 용기 내에 위치한 핵산 프로브(바람직하게는 형광 프로브); 및
iv) 임의로 선택된 제4 용기 및 제4 용기 내에 위치한 버퍼를 포함하고,
상기 표적 핵산 분자는 표적 DNA이다.
이 밖에, 본 발명의 시약 키트는,
v) 제5 용기 및 제5 용기 내에 위치한 표적 DNA를 증폭하기 위한 중합 효소;
vi) 임의로 선택된 제6 용기 및 제6 용기 내에 위치한, 역전사를 위한 역전사 효소;
vii) 제7 용기 및 제7 용기 내에 위치한, 증폭 반응 및/또는 역전사 반응을 위한 dNTP를 더 포함한다.
본 발명에서, 하나 또는 복수개 또는 모든 상기 용기는 동일하거나 다른 용기일 수 있다.
본 발명은 주로 하기와 같은 이점을 갖는다.
본 발명은 Cas12b의 특성을 이용하여 HOLMES v2.0(one-HOur Low-cost Multipurposehighly Efficient System version 2.0)으로 불리우는, 핵산 분자를 특이적으로 검출하는 방법을 개발하였는 바, 해당 방법은 신속성(1시간), 저비용, 다중 채널, 고효율, 간편성을 특징으로 하므로 신속한 병원균 검출, SNP 검출 등 분야에 사용될 수 있다. 고온 효소 Cas12b를 기반으로 한 2 세대 HOLMES는 Cas12a를 기반으로 한 1 세대 HOLMES에 비해 더 많은 이점을 갖는다.
(1) 신속성: 테스트 조건이 준비된 상황에서 샘플 획득으로부터 검출 결과 획득까지 약 1시간 밖에 걸리지 않는다.
(2) 저비용: 실험에 특별한 재료나 효소가 사용되지 않고 또한 적용되는 재료, 시약 등이 적어 미량화 테스트 분석을 수행할 수 있다.
(3) 고효율: 본 발명은 매우 높은 감도를 가지므로10 aM 농도의 DNA를 검출할 수 있다.
(4) 다용도: DNA 샘플 및 RNA샘플을 포함한 다양한 핵산 샘플을 검출할 수 있다.
(5) 간편성: 특별하고 복잡한 단계가 필요없이 시약 키트를 제조하고 프로그램을 설정한 후 샘플 추가와 같은 간단한 작업만 필요하다.
(6) 원 스텝 반응: 증폭 반응과 검출 반응을 동시에 반응시켜 원 스텝 테스트를 구현할 수 있다.
(7) 등온: LAMP 증폭과 Cas12b 검출이 모두 항온 조건에서 이루어지므로 기기에 대한 요구 사항이 더 낮다.
(8) 넓은 반응 온도 범위: Cas12b는 45 ~ 65 ℃에서 모두 검출을 수행할 수 있으므로 기기에 대한 요구 상항이 낮다.
(9) 두가지 효소로 DNA 또는 RNA의 증폭 및 검출을 구현할 수 있다. Bst 3.0 DNA 중합 효소는 DNA 또는 RNA를 템플릿으로 사용하는 DNA 중합 효소 활성을 갖고 있으므로 Bst 3.0 및 Cas12b 이 두가지 효소만으로 DNA 또는 RNA의 증폭 및 검출을 구현할 수 있어 생산 비용이 절감된다.
(10) 고감도 SNP 검출: 부위 및 sgRNA를 합리적으로 설계함으로써 단일 염기의 차이를 고감도적으로 구분할 수 있다.
(11) 정량 검출이 가능하다. 원 스텝hOLMES를 통해 형광을 실시간으로 검출하거나 디지털 PCR 기기의 칩 및 검출 시스템을 결합하여 샘플의 정량 검출을 구현할 수 있다.
아래 구체적인 실시예를 결부하여 본 발명을 추가로 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 아래 실시에에서 구체적인 조건이 명시되지 않은 실험 방법은 일반적으로 Sambrook 등에 의한 분자 클론: 실험실 메뉴얼(New York: Cold Springharbor Laboratory Press, 1989)에 설명된 통상의 조건 또는 제조업체가 제안한 조건에 따른다. 달리 명시되지 않은 한, 백분율 및 부는 중량 백분율 및 중량부이다.
본 발명에서, 달리 명시되지 않은 한, Cas12b트랜스 절단 활성 시스템은 sgRNA 및 Cas12b를 각각 250 nM 사용하고, 반응 조건은 48 ℃ 30 min이다.
재료
1. TaKaRa사로부터 RNA 효소 억제제를 구입하고, ToYoBo사로부터 고 충실도 DNA 중합 효소 KOD FX를 구입하였으며; Shanghai Shenggong에서 합성한 프라이머(올리고 뉴클레오티드)를 사용하고; Thermo사로부터 T7 RNA 중합 효소를 구입하였으며; Zymo Research로부터 RNA 정제 및 농축 시약 키트(RNA Clean＆ConcentratorTM-5)를 구입하고; Promega사로부터 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System을 구입하였으며; 배지(예를 들어, Tryptone, Yeast Extract 등)는 모두 OXOID사로부터 구입하엿다.
2. 배지 배합: 액체 LB(1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 1% NaCl), 고체 LB를 구성할 경우, 액체 LB에 2% 한천만 첨가하면 된다.
실시예1: Cas12b 단백질에 의한 이중 가닥 DNA(dsDNA) 또는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 표적 검출
단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA(target T1)를 표적 서열로 선택 사용하고, 농도가 다른 Cas12b 단백질 및 sgRNA의 검출 반응값을 테스트한다.
1. 가이드 RNA(sgRNA)의 제조
먼저 pUC18을 플라스미드 백본으로 사용하여 플라스미드 pUC18-sgRNA-T1을 구축하되, 상기 플라스미드는 pUC18에 T7 프로모터와 sgRNA의 전사를 위한 템플릿 DNA 서열이 삽입된 것이다(참고: 해당 템플릿에 의해 전사된 sgRNA는 본 연구에서 T1로 불리우는 서열을 표적으로 함). 해당 방법은 pUC18 플라스미드를 템플릿으로 사용하고 pUC18-1-F 및 pUC18-1-R을 프라이머로 사용하여, 우선 첫번째 PCR을 수행한다. T4 DNA Ligase는 PCR 산물을 연결하여 DH10b로 전환한 후 시퀀싱을 거쳐 pUC18-sgRNA-T1-pre로 불리우는 정확한 클론을 획득한다. 다음 pUC18-sgRNA-T1-pre를 템플릿으로 사용하고 pUC18-2-F 및 pUC18-2-R을 프라이머로 사용하여 두번째 PCR을 수행하고, 동일한 방법으로 PCR 산물을 연결하여 전환한 후 최종적으로 정확한 시퀀싱 플라스미드 pUC18-sgRNA-T1을 획득한다.
다음, 플라스미드 pUC18-sgRNA-T1을 템플릿으로 사용하고 T7-crRNA-F 및 sgRNA-T1-R을 프라이머로 사용하여 PCR을 통해 시험관 내 전사에 필요한 DNA 템플릿을 증폭한 후, 해당 PCR 산물에 DpnI를 첨가(50 μl PCR 시스템 당 1 μl DpnI(10 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후, 겔 및 PCR 산물 컬럼 회수 시약 키트(Promega)를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다. 해당 PCR 회수 산물을 템플릿으로 사용하고 T7 고수율 전사 시약 키트(Thermo)를 사용하여 sgRNA(sgRNA-T1로 명명됨)를 합성하였으며, 반응은 37 ℃에서 밤새(12 ~ 16h) 수행되었다.
마지막으로, 전사 시스템에 DNaseⅠ를 첨가(50 μl전사 시스템 당 2 μl DNaseⅠ(5 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후 RNA 정제 및 농축 시약 키트를 사용하여 RNA를 정제한 다음, NanoDrop 2000C로 정량화하고 -80 ℃ 냉장고에 보관하여 준비하였다.
2. 표적 DNA의 제조
(1) 표적 DNA가 단일 가닥인 경우, sgRNA가 인식하는 표적 서열(T1)을 포함하는 길이 20 bp인 올리고 뉴클레오티드 target DNA(T1-R)를 직접 합성한다.
(2) 표적 DNA가 이중 가닥인 경우, sgRNA가 인식하는 20 bp표적 서열(T1)을 포함하는 2개의 상보적 올리고 뉴클레오티드(T1-F; T1-R)를 직접 합성하고, 2개의 올리고 뉴클레오티드를 어닐링하여 이중 가닥 target DNA를 획득한다. 구체적으로, 쌍을 이루는 올리고 뉴클레오티드(2 μM)를1xPCR 버퍼(Transgen Biotech)에서 총 부피 20 μL가 되도록 혼한한 후, 어닐링 절차를 수행하였다. 처음에는 95 ℃에서 5분 동안 변성한 후 95 ℃로부터 20 ℃로 냉각시키되, 열 순환기를 사용하여 분 당 1 ℃씩 감소시켰다.
3. Cas12b 반응
(1) sgRNA 어닐링: sgRNA를 적절한 농도로 희석하여 PCR 기기에서 어닐링하였다. 어닐링 절차: 75 ℃에서 5 min 동안 변성한 후 75 ℃로부터 20 ℃로 냉각시키되, 분 당 1 ℃씩 감소시켰다.
(2) sgRNA와 Cas12b 배양: 어닐링된 sgRNA와 동일한 몰 농도의 Cas12b를 혼합하고 30 ℃에서 20 ~ 30 min 동안 방치하였다.
(3) Cas12b 반응: 20 μl 반응 시스템에 단계 (2)에서 배양된 sgRNA와 Cas12b의 혼합물(양자의 최종 농도는 모두 50, 100, 250 또는 500 nM임), 형광 소광 프로브(HEX-N12-BHQ1, 최종 농도 500 nM), 2 μl의 10xNEB Buffer 3.1 및 0.5 μl의 RNA 효소 억제제(40 U/μl)를 첨가하고 균일하게 혼합한 후, 48 ℃에서 30 min 동안 반응시켰다. 다음, 98 ℃에서 5 min 동안 가열하여 비활성화시켰다.
4. 형광 마이크로 플레이트 리더 방법을 통한 Cas12b의 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성 검출
비활성화된 20μL 반응액을 96 웰 플레이트에 첨가하고 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 검출하였다(여기광 535 nm, 방출광 556 nm).
그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, Cas12b와 sgRNA의 농도가 250 nM 또는 500 nM인 경우, dsDNA와 ssDNA는 표적으로서 모두 높은 형광 강도를 가지며, Cas12b와 sgRNA의 농도가 50 nM 및 100 nM으로 감소된 경우, ssDNA는 표적 서열로서 여전히 높은 형광 강도를 갖는다.
실시예2: HOLMES v2.0(LAMP는 Cas12b와 결합됨)를 통한 응답 감도 테스트
형광 프로브(HEX-N12-BHQ1)의 여기된 형광 강도를 검출하여 Cas12b가 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성을 우회하는데 필요한 표적 DNA의 농도, 즉 단일 가닥 DNA 절단 반응을 우회하는 Cas12b의 감도를 결정하였다.
1. sgRNA의 제조
먼저, 사전에 구축된 플라스미드 pUC18-sgRNA-T1을 템플릿으로 사용하고, 명칭이 sgRNA-DNMT1-3-F 및 sgRNA-DNMT1-3-R인 프라이머를 설계하였으며, PCR을 통해 sgRNA에서 T1을 표적으로 하는 target DNA의 20개 염기를 DNMT1-3을 표적으로 하는 sgRNA로 대체하여 다른 플라스미드 pUC18-sgRNA-DNMT1-3을 획득하였다.
다음 플라스미드 pUC18-sgRNA-DNMT1-3을 템플릿으로 사용하고 T7-crRNA-F 및 ZLsgRNA-DNMT1-3-R을 프라이머로 사용하여 PCR을 통해 시험관 내 전사에 필요한 DNA 템플릿을 증폭한 후, 해당 PCR 산물에 DpnⅠ를 첨가(50 μl PCR 시스템 당 1 μl Dpn(10 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후, 겔 및 PCR 산물 컬럼 회수 시약 키트(Promega)를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다. 해당 PCR 회수 산물을 템플릿으로 사용하고 T7 고수율 전사 시약 키트(Thermo)를 사용하여 sgRNA(sgRNA-DNMT1-3으로 명명됨)를 합성하였으며, 반응은 37 ℃에서 밤새(12 ~ 16h) 수행되었다.
마지막으로, 전사 시스템에 DNaseⅠ를 첨가(50 μl전사 시스템 당 2 μl DNaseⅠ(5 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA를 제거하였으며, RNA 정제 및 농축 시약 키트를 사용하여 RNA를 정제한 다음, NanoDrop 2000C로 정량화하고 -80 ℃ 냉장고에 보관하여 준비하였다.
2. 표적 DNA의 제조
표적 DNA의 경우, 첫번째 방법은 증폭 없이 Cas12b를 직접 첨가하는 반응 시스템으로서 그 방법은 하기와 같다.
(1) 표적 DNA가 단일 가닥인 경우, target DNA(DNMT1-3(TTC PAM)-R)로서, sgRNA가 인식하는 20bp 표적 서열(DNMT1-3)을 포함하는 길이 50 bp인 올리고 뉴클레오티드를 직접 합성한다.
(2) 표적 DNA가 이중 가닥인 경우, sgRNA가 인식하는 20 bp 표적 서열(DNMT1-3)을 포함하는 길이 50 bp인 2개의 상보적 올리고 뉴클레오티드(DNMT1-3(TTC PAM)-F; DNMT1-3(TTC PAM)-R)를 직접 합성하고, 2개의 올리고 뉴클레오티드를 어닐링하여 이중 가닥 target DNA를 획득한다. 구체적으로, 쌍을 이루는 올리고 뉴클레오티드(2 μM)를 1xPCR 버퍼(Transgen Biotech)에서 총 부피 20 μL가 되도록 혼한한 후, 어닐링 절차를 수행하였다. 처음에는 95 ℃에서 5분 동안 변성한 후 95 ℃로부터 20 ℃로 냉각시키되, 열 순환기를 사용하여 분 당 1 ℃씩 감소시켰다.
(3) 단일 가닥 또는 이중 가닥 표적 DNA 구배를 2 μM, 0.2 μM, 0.02 μM, 0.002 μM, 0.0002 μM로 희석하여 준비하였다.
두번째 방법은 표적 서열(DNMT1-3)이 포함된 단편을 플라스미드 벡터에 삽입하고 LAMP 반응을 통해 증폭하는 것이다.
(1) Transgen사의 pEasy-Blunt Zero Cloning Kit를 사용하여 표적 서열(DNMT1-3)이 포함된 단편을 pEasy-Blunt Zero Cloning Vector에 삽입하고 시퀀싱 검증을 거쳐 정확한 클론을 획득하였다.
(2) LAMP 확장 반응
상기 플라스미드를 템플릿으로 사용하여 LAMP 증폭 반응을 수행하고 템플릿에 각각 0, 1 nM, 0.1 nM 첨가한 후, 10배와 동일한 구배를 10-11 nM로 희석하였다. 각각의 반응 시스템의 총 부피는 25 μL이고, 프라이머로 1.6 μM의 LAMP-DNM-FIP와 LAMP-DNM-BIP, 0.2 μM의 LAMP-DNM-F3과 LAMP-DNM-B3, 0.4 μM의 LAMP-DNM-LoopF와 LAMP-DNM-LoopB를 사용하였으며, LAMP 반응에 사용된 시약 키트는 WarmStart® LAMP Kit(NEB)이다. LAMP 반응 절차는 65 ℃에서 30 min 동안 수행되고, LAMP 완료 후, 85 ℃에서 10 min 동안 비활성화시킨 후 Cas12b 반응에 직접 사용하였다.
3. Cas12b 반응
(1) sgRNA 어닐링: sgRNA를 적절한 농도(5 μM)로 희석하여 PCR 기기에서 어닐링하였다. 어닐링 절차: 75 ℃에서 5 min 동안 변성한 후 75 ℃로부터 20 ℃로 냉각시키되, 분 당 1 ℃씩 감소시켰다.
(2) sgRNA와 Cas12b 배양: 어닐링된 sgRNA와 동일한 몰 농도의 Cas12b를 혼합하고 30 ℃에서 20 ~ 30 min 동안 방치하였다.
(3) Cas12b 반응: 20 μl 반응 시스템에 단계 (2)에서 배양된 sgRNA와 Cas12b의 혼합물(양자의 최종 농도는 모두 250 nM), 1 μl의 target DNA 또는 1 μl의 LAMP산물, 형광 프로브(HEX-N12-BHQ1)(최종 농도 500 nM), 2 μl의 10xNEB Buffer 3.1 및 0.5μl의 RNA 효소 억제제(40 U/μl)를 첨가하고 균일하게 혼합한 후, 48 ℃에서 30 min 동안 반응시켰다. 다음, 98 ℃에서 5 min 동안 가열하여 비활성화시켰다.
4. 형광 마이크로 플레이트 리더 방법을 통한 Cas12b의 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성 검출
비활성화된 20 μL 반응액을 96 웰 플레이트에 첨가하고 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 검출하였다(여기광 535 nm, 방출광 556 nm).
도 5에 도시된 바와 같이, Cas12b는 1nM 농도의 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA를 검출할 수 있고; LAMP 증폭을 결합한 후 Cas12b(즉 HOLMES v2.0 방법)은 10 ~ 8nM 농도의 DNA를 검출할 수 있음을 보아낼 수 있다(도 6).
실시예3: Cas12b를 통한 단일 염기 돌연변이 표적 검출
단일 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA를 표적 서열로 선택 사용하고, 표적 DNA에 단일 염기 돌연변이가 존재하는 경우에 Cas12b trans 절단 형광 신호의 변화를 테스트하여 단일 염기 돌연변이를 검출하였다.
1. 가이드 RNA(sgRNA)의 제조
플라스미드 pUC18-sgRNA-DNMT1-3을 템플릿으로 사용하고 T7-crRNA-F를 상류 프라이머로 사용하였으며, 다른 표적에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 하류 프라이머로 사용하고, PCR을 통해 시험관 내 전사에 필요한 DNA 템플릿을 증폭한 후, 해당 PCR 산물에 DpnⅠ(50μl PCR 시스템 당 1μl DpnⅠ(10 U/μl) 첨가)를 첨가하고 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후, 겔 및 PCR 산물 컬럼 회수 시약 키트(Promega)를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다. 해당 PCR 회수 산물을 템플릿으로 사용하고 T7 고수율 전사 시약 키트(Thermo)를 사용하여 전체 길이 sgRNA(그 중 가이드 서열의 길이는 20 nt임) 또는 짧게 절단된 sgRNA(그 중 가이드 서열의 길이는 20 nt 미만임)를 합성하였으며, 반응은 37 ℃에서 밤새(12 ~ 16h) 수행되었다.
다음, 전사 시스템에 DNaseⅠ를 첨가(50 μl전사 시스템 당 2 μl DNaseⅠ(5 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 DNA 템플릿을 제거하였으며, RNA 정제 및 농축 시약 키트를 사용하여 RNA를 정제한 다음, NanoDrop 2000C로 정량화하고 -80 ℃ 냉장고에 보관하여 준비하였다.
2. 표적 DNA의 제조
(1) 표적 DNA가 단일 가닥인 경우, target DNA로서, sgRNA가 인식하는 표적 서열을 포함하는 길이 50 bp인 올리고 뉴클레오티드를 직접 합성한다.
(2) 표적 DNA가 이중 가닥인 경우, sgRNA가 인식하는 표적 서열을 포함하는 길이 50 bp인 2개의 상보적 올리고 뉴클레오티드를 직접 합성하고, 2개의 올리고 뉴클레오티드를 어닐링하여 이중 가닥 target DNA를 획득한다. 구체적으로, 쌍을 이루는 올리고 뉴클레오티드(1 μM)를 1xPCR 버퍼(Transgen Biotech)에서 총 부피 20 μL가 되도록 혼한한 후, 어닐링 절차를 수행하였다. 처음에는 95 ℃에서 5분 동안 변성한 후 95 ℃로부터 20 ℃로 냉각시키되, 열 순환기를 사용하여 분 당 1 ℃씩 감소시켰다.
3. Cas12b 반응
(1) sgRNA 어닐링: sgRNA를 적절한 농도(5 μM)로 희석하여 PCR 기기에서 어닐링하였다. 어닐링 절차: 75 ℃에서 5 min 동안 변성한 후 75 ℃로부터 20 ℃로 냉각시키되, 분 당 1 ℃씩 감소시켰다.
(2) sgRNA와 Cas12b 배양: 어닐링된 sgRNA와 동일한 몰 농도의 Cas12b를 혼합하고 30 ℃에서 20 ~ 30 min 동안 방치하였다.
(3) Cas12b 반응: 20 μl 반응 시스템에 단계 (2)에서 배양된 sgRNA와 Cas12b의 혼합물(양자의 최종 농도는 모두 250 nM), target DNA(최종 농도 50 nM), 형광 소광 프로브(HEX-N12-BHQ1, 최종 농도 500 nM), 2 μl의 10xNEB Buffer 3.1 및 0.5 μl의 RNA 효소 억제제(40 U/μl)를 첨가하고 균일하게 혼합한 후, 48 ℃에서 30 min 동안 반응시켰다. 다음, 98 ℃에서 5 min 동안 가열하여 비활성화시켰다.
4. 형광 마이크로 플레이트 리더 방법을 통한 Cas12b의 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성 검출
비활성화된 20 μL 반응액을 96 웰 플레이트에 첨가하고 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 검출하였다(여기광 535 nm, 방출광 556 nm).
먼저, 표적 서열 DNMT1-3의 경우, 표적 단일 가닥 DNA에 대해 도 7에 도시된 바와 같이, sgRNA 가이드 서열이 20 nt인 경우, 위치 1 ~ 12의 염기 돌연변이 후 trans 절단에 의해 생성된 형광 신호에 거의 영향을 미치지 않는다. sgRNA 가이드 서열이 14nt 또는 15nt인 경우, 대조군을 포함한 형광값은 모두 매우 작다. sgRNA 가이드 서열이 16 nt인 경우, 위치 10 ~ 12의 돌연변이 후 그 형광값은 현저히 감소된다.
추가 연구에 따르면(도 8), 10 ~ 16번째 위치의 염기 돌연변이가 형광값이 분명한 영향을 미쳤으며, 특히 위치 10 ~ 14에서 형광값은 거의 검출되지 않았다. 이어서, 표적 단일 가닥 DNA가 다른 위치에서 다른 유형의 염기로 돌연변이되는 경우에는 위치 9만 G로 돌연변이되어 형광값이 크게 변할 뿐, 형광값에 본질적인 영향을 미치지 않는다(도 9).
이어서, 또한 3가지 다른 표적 서열을 테스트하였다. 다른 서열은 특정 부위 돌연변이에 대해 다른 형광 변화값을 갖지만 rs5082의 위치 8, 10, 11, 12, rs1467558의 위치 11, rs2952768의 위치 8 ~ 15와 같은 위치 8 ~ 16에서 모두 분명히 변화된 위치를 찾을 수 있다(도 10).
표적 이중 가닥 DNA(도 11에 도시된 바와 같음)의 경우, 단일 염기 돌연변이 trans 절단에 의해 생성된 형광 신호의 영향은 ssDNA와 상이하다. 표적 서열 DNMT1-3을 예로 들면, 가이드 서열이 18 ~ 20 nt인 sgRNA는 10 ~ 16번째 위치의 염기 돌연변이에 민감하다. 이 밖에, 본 실시예에서, 다양한 sgRNA는 10번째 및 16번째 위치에 가장 민감하다.
이 밖에, 50 ℃, 55 ℃, 60 ℃, 65 ℃ 조건에서, LAMP와 Cas12b 검출은 원 스텝 반응을 구현한다(도 12).
실시예4: 환경 수체에서 대장균 등 미생물 테스트
대장균 gyrB 유전자를 검출 타겟으로 선택 사용하고, 수체에서 대장균 등 미생물을 간접적으로 테스트하였으며 검출 한계를 측정하였다.
1. 가이드 RNA(sgRNA)의 제조
플라스미드 pUC18-sgRNA-DNMT1-3을 템플릿으로 사용하고 T7-crRNA-F를 상류 프라이머로 사용하였으며, ZL-gyrB-crRNA2-R을 하류 프라이머로 사용하고, PCR을 통해 시험관 내 전사에 필요한 DNA 템플릿을 증폭한 후, 해당 PCR 산물에 DpnⅠ(50μl PCR 시스템 당 1μl DpnⅠ(10 U/μl) 첨가)를 첨가하고 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후, 겔 및 PCR 산물 컬럼 회수 시약 키트(Promega)를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다. 해당 PCR 회수 산물을 템플릿으로 사용하고 T7 고수율 전사 시약 키트(Thermo)를 사용하여 sgRNA를 합성하였으며, 반응은 37 ℃에서 밤새 수행되었다(12 ~ 16h).
다음, 전사 시스템에 DNaseⅠ를 첨가(50 μl전사 시스템 당 2 μl DNaseⅠ(5 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 DNA 템플릿을 제거하였으며, RNA 정제 및 농축 시약 키트를 사용하여 RNA를 정제한 다음, NanoDrop 2000C로 정량화하고 -80 ℃ 냉장고에 보관하여 준비하였다.
2. LAMP 증폭 반응
대장균 MG1655를 OD600가 1.0이 되도록 배양한 경우, 일부 박테리아 용액을 100 ℃에서 15 min 동안 처리하였다. 다음 LAMP 증폭 반응을 수행하고, 템플릿에 희석 정도가 다른 박테리아 용액을 각각 첨가한 후 OD600을 각각 0, 5x10-3, 5x10-4 내지 5x10-9로 희석하였다.
코팅 테스트 후, 5x10-3은 약 7000개의 박테리아이며, 반응 시스템의 총 부피는 25 μL이고, 프라이머로 1.6 μM의 LAMP-gyrB-FIP와 LAMP-gyrB-BIP, 0.2 μM의 LAMP-gyrB-F3과 LAMP-gyrB-B3, 0.4 μM의 LAMP-gyrB-LoopF와 LAMP-gyrB-LoopB를 사용하였으며, LAMP 반응에 사용된 시약 키트는 WarmStart® LAMP Kit(NEB)이다. LAMP 반응 절차는 65 ℃에서 30 min 동안 수행되고, LAMP 완료 후, 85 ℃에서 10 min 동안 비활성화시킨 후 Cas12b 반응에 직접 사용하였다.
3. Cas12b 반응
(1) sgRNA 어닐링: sgRNA를 적절한 농도(5 μM)로 희석하여 PCR 기기에서 어닐링하였다. 어닐링 절차: 75 ℃에서 5 min 동안 변성한 후 75 ℃로부터 20 ℃로 냉각시키되, 분 당 1 ℃씩 감소시켰다.
(2) sgRNA와 Cas12b 배양: 어닐링된 sgRNA와 동일한 몰 농도의 Cas12b를 혼합하고 30 ℃에서 20 ~ 30 min 동안 방치하였다.
(3) Cas12b 반응: 20 μl 반응 시스템에 단계 (2)에서 배양된 sgRNA와 Cas12b의 혼합물(양자의 최종 농도는 모두 250 nM), 1 μl의 LAMP산물, 형광 프로브(HEX-N12-BHQ1) (최종 농도 500nM), 및 2 μl의 10xNEB Buffer 3.1 및 0.5μl의 RNA 효소 억제제(40 U/μl)를 첨가하고 균일하게 혼합한 후, 48 ℃에서 30 min 동안 반응시켰다. 다음, 98 ℃에서 5 min 동안 가열하여 비활성화시켰다.
4. 형광 마이크로 플레이트 리더 방법을 통한 Cas12b의 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성 검출
비활성화된 20 μL 반응액을 96 웰 플레이트에 첨가하고 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 검출하였다(여기광 535 nm, 방출광 556 nm).
도 13에 도시된 바와 같이, LAMP 증폭과 결합한 후, Cas12b(즉hOLMES v2.0 방법)의 감도는 여러 대장균을 검출하는 정도에 도달할 수 있다(코팅 테스트 후, OD600=5x10-6은 약 7개 대장균임).
실시예5: 타액 성별 테스트
본 실시예에서는 Y 염색체 특정 sry 유전자 좌위를 테스트 표적으로 선택 사용하고,HOLMES v2.0을 통해 타액 유래 샘플의 성별을 감별하였다.
1. 가이드 RNA(sgRNA)의 제조
플라스미드 pUC18-sgRNA-DNMT1-3을 템플릿으로 사용하고 T7-crRNA-F를 상류 프라이머로 사용하였으며, ZL-sry-crRNA3-R 및 ZLsgRNA-DNMT1-3-R을 하류 프라이머로 사용하고, PCR을 통해 시험관 내 전사에 필요한 두가지 DNA 템플릿을 각각 증폭한 후 PCR 산물에 DpnⅠ(50 μl PCR 시스템 당 1μl DpnⅠ(10 U/μl) 첨가)을 첨가하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후, 겔 및 PCR 산물 컬럼 회수 시약 키트(Promega)를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다. 해당 PCR 회수 산물을 템플릿으로 사용하고 T7 고수율 전사 시약 키트(Thermo)를 사용하여 sgRNA를 합성하였으며, 반응은 37 ℃에서 밤새 수행되었다(12 ~ 16h).
다음, 전사 시스템에 DNaseⅠ를 첨가(50 μl전사 시스템 당 2 μl DNaseⅠ(5 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 DNA 템플릿을 제거하였으며, RNA 정제 및 농축 시약 키트를 사용하여 RNA를 정제한 다음, NanoDrop 2000C로 정량화하고 -80 ℃ 냉장고에 보관하여 준비하였다.
2. LAMP 증폭 반응
각각 남성과 여성의 타액을 템플릿으로 사용하여 LAMP 증폭 반응을 수행하였다. 각 반응 시스템의 총 부피는 25 μL이고, 프라이머로 1.6 μM의 LAMP-sry-FIP와 LAMP-sry-BIP, 0.2 μM의 LAMP-sry-F3과 LAMP-sry-B3, 0.4 μM의 LAMP-sry-LoopF와 LAMP-sry-LoopB를 사용하였으며, LAMP 반응에 사용된 시약 키트는 WarmStart® LAMP Kit(NEB)이다. LAMP 반응 절차는 65 ℃에서 30 min 동안 수행되고, LAMP 완료 후, 85 ℃에서 10 min 동안 비활성화시킨 후 Cas12b 반응에 직접 사용하였다.
3. Cas12b 반응
(1) sgRNA 어닐링: sgRNA를 적절한 농도(5 μM)로 희석하여 PCR 기기에서 어닐링하였다. 어닐링 절차: 75 ℃에서 5 min 동안 변성한 후 75 ℃로부터 20 ℃로 냉각시키되, 분 당 1 ℃씩 감소시켰다.
(2) sgRNA와 Cas12b 배양: 어닐링된 sgRNA와 동일한 몰 농도의 Cas12b를 혼합하고 30 ℃에서 20 ~ 30 min 동안 방치하였다.
(3) Cas12b 반응: 20 μl 반응 시스템에 단계 (2)에서 배양된 sgRNA와 Cas12b의 혼합물(양자의 최종 농도는 모두 250 nM), 1 μl의 LAMP산물, 형광 프로브(HEX-N12-BHQ1) (최종 농도 500 nM), 및 2 μl의 10xNEB Buffer 3.1 및 0.5 μl의 RNA 효소 억제제(40 U/μl)를 첨가하고 균일하게 혼합한 후, 48 ℃에서 30 min 동안 반응시켰다. 다음, 98 ℃에서 5 min 동안 가열하여 비활성화시켰다.
4. 형광 마이크로 플레이트 리더 방법을 통한 Cas12b의 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성 검출
비활성화된 20 μL 반응액을 96 웰 플레이트에 첨가하고 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 검출하였다(여기광 535 nm, 방출광 556 nm).
도 14에 도시된 바와 같이, LAMP 증폭과 결합한 후, Cas12b(즉hOLMES v2.0 방법)는 고효율적으로 타액 샘플에 대해 인간 성별 검출을 수행할 수 있다.
실시예6: 인간 SNP 테스트
본 실시예에서는 인간 rs5082 부위를 검출한다. 비대칭 PCR 또는 LAMP 등온 증폭 방법으로 표적 DNA를 제조하여 타액 유래 샘플의 SNP 유형을 감별하였다.
1. 가이드 RNA(sgRNA)의 제조
플라스미드 pUC18-sgRNA-DNMT1-3을 템플릿으로 사용하고 T7-crRNA-F를 상류 프라이머로 사용하였으며, rs5082 부위에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 다른 길이의 올리고 뉴클레오티드를 하류 프라이머로 사용하고, PCR을 통해 시험관 내 전사에 필요한 DNA 템플릿을 증폭한 후, PCR 산물에 DpnⅠ를 첨가(50 μl PCR 시스템 당 1 μl Dpn(10 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후, 겔 및 PCR 산물 컬럼 회수 시약 키트(Promega)를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다. 해당 PCR 회수 산물을 템플릿으로 사용하고 T7 고수율 전사 시약 키트(Thermo)를 사용하여 짧게 절단된 sgRNA를 합성하였으며, 반응은 37 ℃에서 밤새 수행되었다(12 ~ 16h). 비대칭 PCR에 의해 생성된 표적 DNA의 경우, Cas12b 반응시 가이드 서열이 16nt인 짧게 절단된 sgRNA를 사용하고; LAMP 증폭에 의해 생성된 표적 DNA의 경우, Cas12b 반응시 가이드 서열이 18nt인 짧게 절단된 sgRNA를 사용하였다.
다음, 전사 시스템에 DNaseⅠ를 첨가(50 μl전사 시스템 당 2 μl DNaseⅠ(5 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후 RNA 정제 및 농축 시약 키트를 사용하여 RNA를 정제한 다음, NanoDrop 2000C로 정량화하고 -80 ℃ 냉장고에 보관하여 준비하였다.
2. 증폭 반응(비대칭 PCR 또는 LAMP)
비대칭 PCR 증폭 반응: 인간 세포 게놈hEK293T를 템플릿으로 사용하고 프라이머로ASP-primer, ASP-rs5082-F, ASP-rs5082-R을 사용하여 비대칭 PCR 증폭(일반적인 PCR은 ASP-primer을 첨가하지 않음)을 수행하였으며, KOD FX 효소를 사용하여 증폭 반응을 수행하였다.
LAMP 증폭 반응: 인간 세포 게놈hEK293T를 템플릿으로 사용하여 LAMP 증폭 반응을 수행하였다. 각 반응 시스템의 총 부피는 25 μL이고, 프라이머로 1.6 μM의 LAMP-rs5082-FIP-10PAM(대조군은 LAMP-rs5082-FIP임)과 LAMP-rs5082-BIP, 0.2 μM의 LAMP-rs5082-F3과 LAMP-rs5082-B3, 0.4 μM의 LAMP-rs5082-LoopF와 LAMP-rs5082-LoopB를 사용하였으며, LAMP 반응에 사용된 시약 키트는 WarmStart® LAMP Kit(NEB)이다. LAMP 반응 절차는 65 ℃에서 30 min 동안 수행되고, LAMP 완료 후, 85 ℃에서 10 min 동안 비활성화시킨 후 Cas12b 반응에 직접 사용하였다. 프라이머 LAMP-rs5082-FIP-10PAM을 PAM 서열에 첨가했기 때문에 증폭된 DNA는 PAM 서열을 갖는다.
3. Cas12b 반응
(1) sgRNA 어닐링: sgRNA를 적절한 농도(5 μM)로 희석하여 PCR 기기에서 어닐링하였다. 어닐링 절차: 75 ℃에서 5 min 동안 변성한 후 75 ℃로부터 20 ℃로 냉각시키되, 분 당 1 ℃씩 감소시켰다.
(2) sgRNA와 Cas12b 배양: 어닐링된 sgRNA와 동일한 몰 농도의 Cas12b를 혼합하고 30 ℃에서 20 ~ 30 min 동안 방치하였다.
(3) Cas12b 반응: 20 μl 반응 시스템에 단계 (2)에서 배양된 sgRNA와 Cas12b의 혼합물(양자의 최종 농도는 모두 500 nM이고, LAMP 증폭 테스트 증 Cas12b는 250 nM임), 1 μl의 target DNA 또는 1 μl의 LAMP산물, 형광 프로브(HEX-N12-BHQ1) (최종 농도 500 nM), 및 2 μl의 10xNEB Buffer 3.1 및 0.5μl의 RNA 효소 억제제(40 U/μl)를 첨가하고 균일하게 혼합한 후, 48 ℃에서 60 min 동안 반응시켰다. 다음, PCR 기기에 방치하고 98 ℃에서 5 min 동안 가열하여 비활성화시켰다.
4. 형광 마이크로 플레이트 리더 방법을 통한 Cas12b의 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성 검출
비활성화된 20 μL 반응액을 96 웰 플레이트에 첨가하고 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 검출하였다(여기광 535 nm, 방출광 556 nm).
도 15에 도시된 바와 같이, rs5082 부위 근처에 PAM 서열이 없으므로 단일 가닥 DNA를 생성하는 비대칭 PCR이 SNP 부위를 보다 명확하게 구분할 수 있다.
LAMP 증폭과 결합하는 경우, rs5082 부위 근처에 PAM 서열이 없으므로 검출 부위를 PAM 서열에 도입함으로써SNP 부위를 더 잘 구분할 수 있다(도 16).
실시예7: RNA 바이러스 테스트
본 실시예에서는 RNA 바이러스 JEV(Japanese encephalitis virus; 일본 뇌염 바이러스)를 선택 사용하고, HOLMES v2.0을 통해 샘플의 바이러스 감염 여부를 감별하였으며, 부위 E453 및 NS170을 선택 사용하여 테스트하였다.
1. 가이드 RNA(sgRNA)의 제조
플라스미드 pUC18-sgRNA-DNMT1-3을 템플릿으로 사용하고 T7-crRNA-F를 상류 프라이머로 사용하였으며, 해당 표적에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 하류 프라이머로 사용하고, PCR을 통해 시험관 내 전사에 필요한 DNA 템플릿을 증폭한 후, 해당 PCR 산물에 DpnⅠ를 첨가(50 μl PCR 시스템 당 1 μl Dpn(10 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후, 겔 및 PCR 산물 컬럼 회수 시약 키트(Promega)를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다. 해당 PCR 회수 산물을 템플릿으로 사용하고 T7 고수율 전사 시약 키트(Thermo)를 사용하여 sgRNA를 합성하였으며, 반응은 37 ℃에서 밤새 수행되었다(12 ~ 16h).
다음, 전사 시스템에 DNaseⅠ를 첨가(50 μl전사 시스템 당 2 μl DNaseⅠ(5 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후 RNA 정제 및 농축 시약 키트를 사용하여 RNA를 정제한 다음, NanoDrop 2000C로 정량화하고 -80 ℃ 냉장고에 보관하여 준비하였다.
2. LAMP 증폭 반응
JEV 바이러스에 감염된 세포액을 템플릿으로 사용하여 LAMP 증폭 반응을 수행하였다. 각 반응 시스템의 총 부피는 25 μL이고, 프라이머로 1.6 μM의 LAMP-E453-FIP와 LAMP-E453-BIP, 0.2 μM의 LAMP-E453-F3과 LAMP-E453-B3, 0.4 μM의 LAMP-E453-LoopF와 LAMP-E453-LoopB(또는 1.6 μM의 LAMP-NS170-FIP와 LAMP-NS170-BIP, 0.2 μM의 LAMP-NS170-F3과 LAMP-NS170-B3, 0.4 μM의 LAMP-NS170-LoopF와 LAMP-NS170-LoopB)를 사용하였으며, LAMP 반응에 사용된 시약 키트는 WarmStart® LAMP Kit(NEB)이거나 Bst 3.0 DNA 중합 효소(NEB)를 사용하였다. LAMP 반응 절차는 65 ℃에서 30 min 동안 수행되고, LAMP 완료 후, 85 ℃에서 10 min 동안 비활성화시킨 후 Cas12b 반응에 직접 사용하였다.
3. Cas12b 반응
(1) sgRNA 어닐링: sgRNA를 적절한 농도(5 μM)로 희석하여 PCR 기기에서 어닐링하였다. 어닐링 절차: 75 ℃에서 5 min 동안 변성한 후 75 ℃로부터 20 ℃로 냉각시키되, 분 당 1 ℃씩 감소시켰다.
(2) sgRNA와 Cas12b 배양: 어닐링된 sgRNA와 동일한 몰 농도의 Cas12b를 혼합하고 30 ℃에서 20 ~ 30 min 동안 방치하였다.
(3) Cas12b 반응: 20 μl 반응 시스템에 단계 (2)에서 배양된 sgRNA와 Cas12b의 혼합물(양자의 최종 농도는 모두 250 nM), 1 μl의 LAMP산물, 형광 프로브(HEX-N12-BHQ1) (최종 농도 500 nM), 및 2 μl의 10xNEB Buffer 3.1 및 0.5μl의 RNA 효소 억제제(40 U/μl)를 첨가하고 균일하게 혼합한 후, 48 ℃에서 30 min 동안 반응시켰다. 다음, PCR 기기에 방치하고 98 ℃에서 5 min 동안 가열하여 비활성화시켰다.
4. 형광 마이크로 플레이트 리더 방법을 통한 Cas12b의 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성 검출
비활성화된 20 μL 반응액을 96 웰 플레이트에 첨가하고 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 검출하였다(여기광 535 nm, 방출광 556 nm).
도 17에 도시된 바와 같이, LAMP 증폭을 추가한 후, Cas12b(즉HOLMES v2.0 방법)는 JEV 바이러스 함유 여부를 매우 원활하게 검출할 수 있다.
실시예8: 미량 DNA의 상대 정량 검출(real-timeHOLMES 방법)
1. 가이드 RNA(sgRNA)의 제조
플라스미드 pUC18-sgRNA-DNMT1-3을 템플릿으로 사용하고 T7-crRNA-F를 상류 프라이머로 사용하였으며, 표적에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 하류 프라이머로 사용하고, PCR을 통해 시험관 내 전사에 필요한 DNA 템플릿을 증폭한 후, 해당 PCR 산물에 DpnⅠ(50 μl PCR 시스템 당 1μl DpnⅠ(10 U/μl) 첨가)를 첨가하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후, 겔 및 PCR 산물 컬럼 회수 시약 키트(Promega)를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다. 해당 PCR 회수 산물을 템플릿으로 사용하고 T7 고수율 전사 시약 키트(Thermo)를 사용하여 sgRNA를 합성하였으며, 반응은 37 ℃에서 밤새 수행되었다(12 ~ 16h).
다음, 전사 시스템에 DNaseⅠ를 첨가(50 μl전사 시스템 당 2 μl DNaseⅠ(5 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후 RNA 정제 및 농축 시약 키트를 사용하여 RNA를 정제한 다음, NanoDrop 2000C로 정량화하고 -80 ℃ 냉장고에 보관하여 준비하였다.
2. 원 스텝 LAMP 증폭-형광 검출 반응(real-time PCR 기기 사용)
희석 농도가 다른 DNMT1-3플라스미드를 템플릿으로 사용하여 LAMP 증폭 반응을 수행하였다. 각 반응 시스템의 총 부피는 20 μL이고, 프라이머로 1.6 μM의 LAMP-DNM-FIP와 LAMP-DNM-BIP, 0.2 μM의 LAMP-DNM-F3과 LAMP-DNM-B3, 0.4 μM의 LAMP-DNM-LoopF와 LAMP-DNM-LoopB를 사용하였으며, LAMP 반응에 사용된 시약 키트는 WarmStart® LAMP Kit(NEB)이다. sgRNA와 Cas12b의 혼합물(양자의 최종 농도는 모두 500 nM임), 형광 프로브(FAM-N12-Eclipse) (최종 농도 500 nM), 및 0.5 μl의 RNA 효소 억제제(40 U/μl)를 첨가하고 균일하게 혼합한 후, 형광계에서 실시간으로 형광 검출을 수행하였으며, 반응 조건은 55 ℃에서 120 min 동안 반응시켰다.
3. 결과 분석
도 18에 도시된 바와 같이, 이는 희석 농도가 다른 표적 DNA의 실시간 형광 측정값을 도시한다.
형광값이 600000에 도달하는 시점을 y축으로 하고, 농도의 lg 절대값을 X축으로 하여 작도함으로써 직선에 근접하는 추세선을 얻을 수 있다(도 19).
상기 결과는 본 발명의 방법을 통해 45 min 내에 10-1 ~ 10-6 nM의 DNA를 정확히 정량화할 수 있음을 나타낸다.
실시예9: 미량 DNA의 절대 정량 검출(디지털HOLMES 방법)
본 실시예에서는 HOLMES 방법과 칩 디지털 PCR을 결합하여 하나의 반응 온도에 따라 절대 정량 검출을 수행하였다.
1. 가이드 RNA(sgRNA)의 제조
플라스미드 pUC18-sgRNA-DNMT1-3을 템플릿으로 사용하고 T7-crRNA-F를 상류 프라이머로 사용하였으며, rs5082 부위에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 다른 길이의 올리고 뉴클레오티드를 하류 프라이머로 사용하고, PCR을 통해 시험관 내 전사에 필요한 DNA 템플릿을 증폭한 후, 해당 PCR 산물에 DpnⅠ를 첨가(50 μl PCR 시스템 당 1μl DpnⅠ(10 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후, 겔 및 PCR 산물 컬럼 회수 시약 키트(Promega)를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다. 해당 PCR 회수 산물을 템플릿으로 사용하고 T7 고수율 전사 시약 키트(Thermo)를 사용하여 sgRNA를 합성하였으며, 반응은 37 ℃에서 밤새(12 ~ 16h) 수행되었다.
다음, 전사 시스템에 DNaseⅠ를 첨가(50 μl전사 시스템 당 2 μl DNaseⅠ(5 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후 RNA 정제 및 농축 시약 키트를 사용하여 RNA를 정제한 다음, NanoDrop 2000C로 정량화하고 -80 ℃ 냉장고에 보관하여 준비하였다.
2. 원 스텝 LAMP 증폭-형광 검출 반응(jnmedsys의 ddPCR 기기 사용)
희석 농도가 다른 인간 293T 세포 게놈을 템플릿으로 사용하여 절대 정량 검출을 수행하였다. 각 반응 시스템의 총 부피는 15 μL이고, 프라이머로 1.6 μM의 LAMP-rs5082-FIP-10PAM, LAMP-rs5082-BIP, 0.2 μM의 LAMP-rs5082-F3과 LAMP-rs5082-B3, 0.4 μM의 LAMP-rs5082-LoopF와 LAMP-rs5082-LoopB를 사용하였으며, LAMP 반응에 사용된 시약 키트는 WarmStart® LAMP Kit(NEB)이다. sgRNA와 Cas12b의 혼합물(양자의 최종 농도는 모두 500 nM임), 형광 프로브(HEX-N12-BHQ1 및 FAM-N12-Eclipse) (양자의 최종 농도는 모두 500 nM임), 0.375 μl의 RNA 효소 억제제(40 U/μl), 0.75 μl JN solution을 첨가하였다.
균일하게 혼합한 후, 슬라이더를 이용하여 샘플을 칩(칩은 PCR 튜브에 있음)에 전달하고, 시스템 분할을 수행한 후 Sealing Enhancer 기기로 옮겨 처리하였다.
이어서, 235ul의 밀폐액을 첨가하고 금속 욕에서 55 ℃에서 120 min 동안 반응시켰다. 0, 60, 90, 120 min에 View Jig 기기에 방치하여 형광을 검출하였다.
3. 결과 분석
도 20에 도시된 바와 같이, 120분 동안 반응 후, 계산을 통해 템플릿 1에서 51.75개의 카피가 검출되었고, 10배 희석된 템플릿 2는 계산을 통해 6.3개의 카피가 검출되었으며, 템플릿이 추가되지 않은 대조군에서는 카피 수가 검출되지 않았다.
그 결과, 본 발명의 디지털hOLMES 방법을 적용함으로써 정량 검출을 수행할 수 있을뿐만 아니라 마이크로 검출 시스템 중 단일 카피된 템플릿을 극히 원활하게 정확히 검출할 수 있으며, 시간 소모도 크게 단축됨을 나타낸다.
실시예10: 메틸화 부위 검출
본 실시예에서는 NCBI 검색 쿼리를 통해 13개의 CpG 부위(M1 ~ M13)를 포함하는 콜라겐 α2(I) 유전자(COL1A2)의 프로모터 영역(250bp)을 본 실시예의 타겟 유전자 검출 서열(NCBI 서열번호: AF004877.1)로 선택하였다. 콜라겐 α2(I) 유전자(COL1A2)는 콜라겐을 암호화하고 또한 종양 발생과 일정한 관련이 있다.
COL1A2(BSP)-C에서, CpG 부위는 모두 메틸화에 의해 변형되며, 바이설파이트 전환 처리(메틸화되지 않은 C를 우라실로 전환함) 및 PCR 증폭 후, CpG 중 메틸화된 C 염기는 여전히 C이다.
COL1A2(BSP)-T에서, CpG 부위는 모두 메틸화에 의해 변형되며, 바이설파이트 전환 처리 및 PCR 증폭 후, CpG 중 C 염기는 T로 변화된다.
본 발명의 메틸화 부위 검출 방법 원리는 도 21을 참조할 수 있다.
실험 방법:
1. 4종 암세포주 게놈(293T, SW480, NCI-N87, MCF-7)을 추출한다.
2. 게놈을 바이설파이트 전환 처리하고, M3 부위를 포함하는 COL1A2유전자 프로모터 영역을 선정하여 해당 BSP프라이머(primer COL1A2(BSP)-F/R)를 설계하며, 바이설파이트 전환된 세포 게놈을 템플릿으로 사용하여 PCR 증폭을 수행하고, 겔 회수 및 정제를 수행하여 산물을 획득한 후 이를 후속 검출을 위한 Target DNA로 사용한다.
3. 표준 곡선을 위한 표적 핵산의 준비
(1) 프라이머(primer COL1A2-F/R)를 사용하여 SW480-gDNA에서 유전자 단편 COL1A2를 증폭하고, 이를 pClone007S T 벡터(TSINGKE, TSV-007S)에 조립한 후 DH10b를 전환하였으며, 37 ℃ 조건에서, LB배지에 적합한 항생제를 첨가하여 배양한 후 플라스미드를 추출하고 시퀀싱하여 결과적으로 플라스미드 pClone007-COL1A2를 획득하였다.
(2) CpG 메틸 트랜스퍼 라제(M.SssⅠ)(M0226V, NEB)로 플라스미드 pClone007-COL1A2를 처리하여 이의 5'-CG-3' 서열 중 모든 시토산 잔기가 모두 메틸화되도록 한 후, 플라스미드 pClone007-COL1A2 및 CpG 메틸 트랜스퍼 라제로 처리된 pClone007-COL1A2를 바이설파이트 전환 처리하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 전환하였다. BSP프라이머 쌍(primer COL1A2(BSP)-F/R)을 설계하여 PCR 증폭을 수행하고, 증폭된 단편을 겔로 회수 및 정제 후 pClone007S T 벡터에 조립하여 플라스미드 pClone007-COL1A2(BSP)-C 및 pClone007-COL1A2(BSP)-T를 구축함으로써 단편 COL1A2(BSP)-C(Target C) 및 COL1A2(BSP)-T(Target T)를 획득하였다.
4. 메틸화 검출
4종 암세포주 gDNA(293T, SW480, NCI-N87, MCF-7)를 각각 EZ DNA methylation-directTM kit(D5021, Zymo Research)로 처리하여 바이설파이트 전환 처리한 후, BSP프라이머 쌍(primer COL1A2(BSP)-F/R)을 사용하여 4종 암세포주의 COL1A2(BSP) (250bp) 유전자 단편을 증폭하고 겔 회수 및 정제를 수행한다.
바이설파이트 클론 시퀀싱 방법
pClone007S T 벡터에 상기 4종 COL1A2(BSP) 유전자 단편을 연결한 후, DH10b로 전환하고, 플레이트에서 10개 이상의 양성 단일 클론을 선택하여 이송하여 시퀀싱 분석을 수행하였으며, 메틸화율 계산 도구 QUantification tool for Methylation Analysis(QUMA)를 사용하여 COL1A2유전자 중 13개 CpG 부위의 메틸화 정도를 계산하였다.
바이설파이트 직접 시퀀싱 방법
상기 4종 COL1A2(BSP) 유전자 단편을 Sanger 시퀀싱 방법으로 분석하고, COL1A2유전자 중 13개 CpG 부위에서 피크 비율C/(C+T)을 계산하여 메틸화율을 획득하였다.
바이설파이트 NGS 고 처리량 시퀀싱 방법
상기 4종 COL1A2(BSP) 유전자 단편에 대해 NGS 고 처리량 시퀀싱 라이브러리 구축 및 NGS 고 처리량 시퀀싱 및 분석(Zhongke Purui Biotechnology Co., Ltd. 완료)을 수행하여 COL1A2 유전자 중 13개 CpG 부위의 메틸화 정도를 분석하였다.
HOLMESv2 시스템 메틸화 검출
(1) CRISPR-Cas12b 단백질의 추출
Shanghai Toloharbor Biotechnology Co., Ltd.에서 코돈 최적화된 AacCas12b 전장 유전자를 합성하고, 이를 벡터 pET28a에 클로닝하고, 대장균 BL21(DE3)에서 발현시켜 N 말단his 라벨을 갖는 재조합 Cas12b 단백질을 생산하였다. 박테리아 용액 0D600이 0.6에 도달한 경우, 0.25 mM 아이소프로필티오가락토사이드(IPTG)를 첨가하여 16 ℃에서 14 ~ 18h 동안 유도 배양 후 원심 분리하여 박테리아를 수득하였다. 버퍼 A(50 mM Tris-HCl(pH 7.6), 150 mM NaCl, 20 mM 이미다졸 및 1/500 톨루엔설포닐플루오라이드(v/v))를 사용하여 박테리아 용액을 현탁하고, 고압 균질기(Avestin)로 이를 분해하고, 15000 rpm에서 30 min 동안 원심 분리한 후, 버퍼 A로 Ni 컬럼(GEhealthcare)을 사전 평형화하고 상층액을 Ni 컬럼으로 옮긴 후 버퍼 B(50 mM Tris-HCl(pH 7.6), 200 mM NaCl and 30 mM imidazole)를 사용하여 Ni 컬럼을 용출하고, 버퍼 B(그 중 이미다졸 농도를 300 mM으로 조정함)로 재조합 단백질을 용출하였다. 한외 여과 방법으로 AacCas12b 단백질을 함유하는 용출 성분를 수집하여 약 5 mL로 농축한 후, 버퍼 C(40 mM Tris-HCl(pH 7.6), 200 mM NaCl, 2 mM DTT 및 5% glycerol(v/v))로 평형화된 컬럼hiLoad 16/600 Superdex 200 pg column(GEhealthcare)에서 AacCas12b 단백질을 포함하는 용출 성분을 수집하여 4 mg/mL로 농축하고, 50% 글리세롤을 첨가하여 -20 ℃에서 보관하였다.
(2) sgRNA의 제조
플라스미드 pUC18-sgRNA-DNMT1-3을 템플릿으로 사용하고 T7-sgRNA-F를 상류 프라이머로 사용하였으며, 표적 특이적 하류 프라이머를 설계하고, PCR을 통해 sgRNA시험관 내 전사에 필요한 템플릿을 증폭하였다. 다음 해당 PCR 산물에 DpnⅠ를 첨가(50μL PCR 시스템 당 1μL DpnⅠ 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후, 겔 및 PCR 산물 컬럼 회수 시약 키트(Promega)를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다. 해당 PCR 회수 산물을 템플릿으로 사용하고 T7 고수율 전사 시약 키트(Thermo)를 사용하여 sgRNA를 합성하였으며, 반응은 37 ℃에서 밤새 수행되었다(12 ~ 16h). 마지막으로, 전사 시스템에 DNaseⅠ를 첨가(50μL전사 시스템 당 2μL DNaseⅠ 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 DNA 템플릿을 제거하였으며, RNA 정제 및 농축 시약 키트(Zymo Research)를 사용하여RNA를 정제하였다. 획득된 sgRNA는 sgRNA-DNMT1-3으로 명명되고, NanoDrop 2000C로 정량화하였으며 -80 ℃ 냉장고에 보관하여 준비하였다.
(3) sgRNA의 선별
COL1A2에서 각 CpG 부위의 상류 및 하류는 다른 길이, CpG 부위가 다른 위치에 대응되는 다양한 sgRNA와 매칭되도록 설계되었다. sgRNA(최종 농도 10 μM)를 PCR 기기에서 어닐링하되, 어닐링 절차는 75 ℃에서 5 min 동안 수행된 후 20 ℃까지 1 min 마다 1 ℃씩 감소시켰다. 어닐링 완료 후 sgRNA와 AacCas12b 단백질(최종 농도 5 μM)을 동일한 부피로 혼합하고 30 ℃에서 15 ~ 20 min 동안 배양시켜 결과적으로 20 μL Cas12b 반응 시스템을 조제하였다(얼음에서 작업).
Cas12b 250 nM
sgRNA 500 nM
표적 DNA(COL1A2(BSP)-C/T) 100 nM
HEX-N12-BHQ1(형광 라벨) 500 nM
10 x NEB Buffer3.1 2 μL
RRI(RNase 억제제) 0.5 μL
Rnase-freeH2O 20 μL로 될때까지 넣음
48 ℃ 중탕 냄비에서 1h 반응시킨 후, 20μL 시스템을 96 웰 플레이트에 옮기고, 마이크로 플레이트 리더에서 여기광 파장을 535nm, 방출광 파장을 556nm로 설정하여 형광값을 측정하였으며, 표적 DNA(COL1A2(BSP)-C/T) 형광값 차이가 가장 큰 반응에 사용되는 sgRNA를 가장 적합한 sgRNA로 선별하였다.
(4) HOLMESv2 시스템에 기반한 메틸화 검출
단편COL1A2(BSP)-C 및 COL1A2(BSP)-T를 COL1A2(BSP)-C 비율에 따라 각각 0%, 10%, 30%, 50%로 균일하게 혼합하여 메틸화 검출 표준 곡선의 표적 DNA로 사용하였다. 4종 암세포주(293T, SW480, NCI-N87, MCF-7) 중 바이설파이트 처리된 샘플 단편COL1A2(BSP)을 각각 단편COL1A2(BSP)-T와 동일한 몰 농도로 혼합하여 실제 샘플 메틸화 비율을 검출하는 표적 DNA로 사용하였다. 다음 다시 HOLMESv2 시스템에서 sgRNA-COL1A2m3-C12-17을 적용하여 COL1A2 프로모터 영역 M3 부위의 메틸화 표준 곡선 및 4종 암세포주(293T, SW480, NCI-N87, MCF-7) 중 M3 부위 메틸화 비율을 각각 검출하였다.
sgRNA(최종 농도 10 μM)를 PCR 기기에서 어닐링하되, 어닐링 절차는 75 ℃에서 5 min 동안 수행된 후 20 ℃까지 1 min 마다 1 ℃씩 감소시켰다. 어닐링 완료 후 sgRNA와 AacCas12b 단백질(최종 농도 5 μM)을 동일한 부피로 혼합하고 30 ℃에서 15 ~ 20 min 동안 배양시켜 결과적으로 20 μL Cas12b 반응 시스템을 조제하였다(얼음에서 작업).
Cas12b 250 nM
sgRNA 500 nM
표적 DNA(M3) 5 nM
FAM-N12-Eclipse(형광 라벨) 500 nM
sheared salmon sperm DNA 500 ng
10 x NEB Buffer 3.1 2 μL
RRI(RNase 억제제) 0.25 μL
Rnase-freeH2O 20 μL로 될때까지 넣음
20μL 시스템을 96 웰 플레이트에 옮기고 real-time PCR 기기에 첨가하되, 절차는 48 ℃에서 1h 동안 반응하도록 설정하고, 2 min 마다 형광값을 한번씩 측정하였다.
M3 부위의 메틸화 표준 곡선은 각각 30 min, 10 min 동안 반응시 형광값을 세로 좌표 Y로 하고, COL1A2(BSP)-C가 점하는 비율 0%, 10%, 30%, 50%를 가로 좌표 X로 한 방정식 모델은 Y=aX+b이다. 4종 암세포주에서 COL1A2(BSP)의 농도는 표준 곡선 중 표적 DNA의 1/2이므로 그 메틸화 비율 계산 모델은 Xunknown=2(Yunknown-b)/a이다.
실험 결과:
1. 검출 모드 다이어그램
메틸화된 CpG 부위를 포함하는 유전자가 바이설파이트 전환 처리를 거친 후, 유전자 중 모든 메틸화되지 않은 부위 CG는 UG로 전환되고, 모든 메틸화된 부위 CG는 변하지 않는다. 이처럼 전환된 유전자는 표적 DNA로서 AacCas12b 단백질, sgRNA와 3원 복합체를 형성하고, 형광 그룹 및 소광 그룹을 구비한 단일 가닥 DNA 프로브 시스템(즉hOLMESv2 시스템)에서 48 ℃에서 일정 시간 동안 반응하여 형광값을 검출한다. 검출 부위가 메틸화되면, DNA 프로브가 발광하고 또한 형광값이 높으며; 검출 부위가 메틸화되지 않으면, DNA 프로브가 발광하지 않고 또한 형광값은 매우 낮거나 0이다.
2. sgRNA의 선별
도 22에 도시된 바와 같이, 각 유형의 sgRNA 및 두가지 표적(target-C, target-T, 모든 CpG 부위의 메틸화 정도가 100% 및 0%이고 바이설파이트 처리된 COL1A2 단편을 각각 나타냄)에 따라 HOLMESv2-Cas12b 반응 시스템에서 형광값을 비교하여 가장 적합한 sgRNA를 선택할 수 있다. 그 중 m3-C12-17, m4-C1-18, m4-C1-19, m4-C1-20, m5-C14-18, m6m7m8-C7-18, m6m7m8-19, m6m7m8-20, m9m10-C1-18 등 9개sgRNA의 형광값은 두가지 표적(target-C, target-T)에서 차이가 분명하여 모두 메틸화 검출에 사용될 수 있다. 본 연구에서는 하나의 단일 부위 sgRNA(m3-C12-17)를 선택하여 후속 메틸화 검출에 사용하였으며 상기 sgRNA는 도 23에 도시된 바와 같다.
3. M3 CpG 부위(COL1A2)의 메틸화 정량 검출
단편COL1A2(BSP)-C 및 COL1A2(BSP)-T를 COL1A2(BSP)-C 비율에 따라 각각 0%, 10%, 30%, 50%로 혼합하고, sgRNA-COL1A2m3-C12-17을 사용하여 HOLMESv2 시스템에서 30 min동안 반응시 형광값을 검출하였으며, 데이터 분석을 거쳐 0%의 형광값을 영점으로 사용하여 정규화하고, M3 CpG 부위(COL1A2)가 메틸화된 정량적 표준 곡선을 작도하였으며, 매회 검출마다 모두 하나의 표준 곡선을 작도하였다. 본 발명인은 회당 세번 반복하여 총 3회 검출을 수행하였는 바, 그 표준 곡선의 각 방정식은 y=758939x+9320.9(R2=0.9975); y=671675x+12415(R2=0.9943); y=645621x+8601.7(R2=0.997)이다. 3회 표준 곡선의 선형 관련성은 매우 우수하여 R2가 0.99 이상에 도달하였다. 따라서 HOLMESv2 시스템을 통해 실제 샘플 중 상기 유전자 좌위의 형광값을 검출하여 대응되는 메틸화 정도를 계산할 수 있다(도 25).
COL1A2는 상이한 암에서 상이한 메틸화 수준을 보여준다. HOLMESv2-Cas12b 메틸화 검출 방법의 실용성을 검증하기 위해 sgRNA-COL1A2m3-C12-17을 사용하여 HOLMESv2 시스템에서 4종 암세포(293T, SW480, NCI-N87, MCF-7) 중 M3 CpG 부위(COL1A2)가 30 min 동안 반응시 형광값을 검출하였다(도 24). 그 중 암세포의 검출 타겟 유전자 농도는 표준 곡선 검출 타겟 유전자 농도의 1/2이며, 상기 표준 곡선 방정식에 따라 이들의 메틸화 정도를 각각 63.3%, 81.3%, 54.8% 및 77.1%로 산출하였다.
이 밖에, 현재 널리 사용되고 있는 메틸화 검출 방법을 동시에 적용하여 상기 4종 암세포 중 COL1A2 유전자의 메틸화 수준을 검출하였으며, HOLMESv2-Cas12b 메틸화 검출 방법의 효과적인 실행 가능성을 검증하기 위해 본 발명의 방법과 비교하였다(도 26).
바이설파이트 NGS 고 처리량 시퀀싱 방법을 통해 메틸화를 정량적으로 검출할 수 있다. 검출된 4종 암세포(293T, SW480, NCI-N87, MCF-7) 중 M3 CpG 부위(COL1A2)의 메틸화율은 각각 65.26%, 81.06%, 48.27% 및 67.3%로서, 이는 HOLMESv2-Cas12b 검출 결과와 일치하였다.
바이설파이트 직접 시퀀싱 방법 및 바이설파이트 클론 시퀀싱 방법은 현재 반 정량적으로 메틸화를 검출할 수 있으며, 이 두가지 방법을 통해 상기 4종 암세포(293T, SW480, NCI-N87, MCF-7) 중 M3 CpG 부위(COL1A2)의 메틸화 검출 결과는 각각 63.2%, 63.6%, 30.4%, 20% 및 92.3%(12/13), 100%(15/15), 78.6%(11/14), 71.4%(10/14)로서, 이는 바이설파이트 NGS 고 처리량 시퀀싱 방법을 통한 결과에 비해 큰 차이가 있는 바, 전자는 너무 낮고, 후자는 너무 높다.
상기 결과는 본 발명의 HOLMESv2-Cas12b 검출 방법의 정량적 결과가 매우 정확하고 또한 신속하며 간편함을 나타낸다.
실시예11: 가변적 접합형 RNA, 고리형 RNA의 검출
Pre-mRNA 선택성 접합은 높은 진핵 생물의 전사 후 조절에 있어서 핵심 단계로서, 종양 진행과 같은 인간 질병에서 중요한 역할을 한다. 일부 pre-mRNA는 가공을 통해 고리형 RNA()으로 형성된다.
본 실시예에서, HOLMESv2를 사용하여 접합 부위를 특이적으로 표적화하여 mRNA 접합을 검출하고, RT-LAMP 증폭과 결합하여 GAPDH 유전자의 성숙 접합mRNA(도 27)을 검출한다. 이 밖에, crRNA 설계에 있어서 유사한 전략을 적용하였으며, 또한 본 실시예에서는 HEK293T 중 Cdr1as의 고리형 RNA를 성공적으로 검출하였다(도 27).
1. 가이드 RNA(sgRNA)의 제조
플라스미드 pUC18-sgRNA-DNMT1-3을 템플릿으로 사용하고 T7-sgRNA-F를 상류 프라이머로 사용하였으며, 해당 표적에 상보적인 가이드 서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 하류 프라이머로 사용하였다(표 2 참조). PCR을 통해 시험관 내 전사에 필요한 DNA 템플릿을 증폭한 후, 해당 PCR 산물에 DpnⅠ(50μl PCR 시스템 당 1μl DpnⅠ(10 U/μl) 첨가)를 첨가하고 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후, 겔 및 PCR 산물 컬럼 회수 시약 키트(Promega)를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다. 해당 PCR 회수 산물을 템플릿으로 사용하고 T7 고수율 전사 시약 키트(Thermo)를 사용하여 sgRNA를 합성하였으며, 반응은 37 ℃에서 밤새 수행되었다(12 ~ 16h).
다음, 전사 시스템에 DNaseⅠ를 첨가(50 μl전사 시스템 당 2 μl DNaseⅠ(5 U/μl) 첨가)하고, 37 ℃ 중탕에서 30 min 동안 플라스미드 DNA 템플릿을 제거한 후 RNA 정제 및 농축 시약 키트를 사용하여 RNA를 정제한 다음, NanoDrop 2000C로 정량화하고 -80 ℃ 냉장고에 보관하여 준비하였다.
2. LAMP 증폭 반응
293T 세포 게놈으로 LAMP 증폭 반응을 수행하였다. 각 반응 시스템의 총 부피는 25 μL이고, 프라이머로 1.6 μM의 LAMP-FIP와 LAMP-BIP, 0.2 μM의 LAMP-F3과 LAMP-B3, 0.4 μM의 LAMP-LoopF와 LAMP-LoopB를 사용하였으며, LAMP 반응에 사용된 시약 키트는 WarmStart® LAMP Kit(NEB)이거나 Bst 3.0 DNA 중합 효소(NEB)를 사용하였다. LAMP 반응 절차는 65 ℃에서 30 min 동안 수행되고, LAMP 완료 후, 85 ℃에서 10 min 동안 비활성화시킨 후 Cas12b 반응에 직접 사용하였다.
3. Cas12b 반응
(1) sgRNA 어닐링: sgRNA를 적절한 농도(5 μM)로 희석하여 PCR 기기에서 어닐링하였다. 어닐링 절차: 75 ℃에서 5 min 동안 변성한 후 75 ℃로부터 20 ℃로 냉각시키되, 분 당 1 ℃씩 감소시켰다.
(2) sgRNA와 Cas12b 배양: 어닐링된 sgRNA와 동일한 몰 농도의 Cas12b를 혼합하고 30 ℃에서 20 ~ 30 min 동안 방치하였다.
(3) Cas12b 반응: 20μL 반응 시스템에서, 단계(2)에서 배양된 sgRNA와 Cas12b의 혼합물(양자의 최종 농도는 모두 250 nM), 1μl의 LAMP산물, 형광 프로브(HEX-N12-BHQ1)(최종 농도 500nM), 2μl의 10xNEB Buffer 3.1 및 0.5μl의 RNA 효소 억제제(40U/μL)를 첨가하고, 균일하게 혼합한 후, 48 ℃에서 30 min 동안 반응하였다. 다음 PCR 기기에 방치하고 98 ℃에서 5 min 동안 가열하여 비활성화시켰다.
4. 형광 마이크로 플레이트 리더 방법을 통한 Cas12b의 우회 단일 가닥 DNA 절단 활성 검출
비활성화된 20 μL 반응액을 96 웰 플레이트에 첨가하고 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 검출하였다(여기광 535nm, 방출광 556nm). 도 27에 도시된 바와 같이, 이로부터 LAMP 증폭 후, Cas12b(즉HOLMES v2.0 방법)는 RNA가 예상된 접합 상황에 부합되는지 또는 고리형 RNA인지 여부를 검출 및 감정할 수 있다.
기질인 올리고 뉴클레오티드
명칭 서열(5'-3') SEQ ID No.:
target-T1-F tttctgtttgttatcgcaactttctactgaattcaagctttactctagaaagaggagaaaggatcc 1
target-T1-R ggatcctttctcctctttctagagtaaagcttgaattcagtagaaagttgcgataacaaacagaaa 2
target-T1-FAM-5'-R fam-ggatcctttctcctctttctagagtaaagcttgaattcagtagaaagttgcgataacaaacagaaa 3
target-T1-R-FAM ggatcctttctcctctttctagagtaaagcttgaattcagtagaaagttgcgataacaaacagaaa-fam 4
DNMT1-3(TTC PAM)-F aatgttccctgatggtccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 5
DNMT1-3(TTC PAM)-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcagggaacatt 6
DNMT1-3(AAC PAM)-F aatgaaccctgatggtccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 7
DNMT1-3(AAC PAM)-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcagggttcatt 8
DNMT1-3(ATC PAM)-F aatgatccctgatggtccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 9
DNMT1-3(ATC PAM)-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcagggatcatt 10
DNMT1-3(TAC PAM)-F aatgtaccctgatggtccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 11
DNMT1-3(TAC PAM)-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcagggtacatt 12
DNMT1-3(GGC PAM)-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcagggcccatt 13
DNMT1-3(CCC PAM)-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcagggggcatt 14
DNMT1-3-C1G-F aatgttcgctgatggtccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 15
DNMT1-3-C1G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcagcgaacatt 16
DNMT1-3-C2G-F aatgttccgtgatggtccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 17
DNMT1-3-C2G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcacggaacatt 18
DNMT1-3-T3A-F aatgttcccagatggtccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 19
DNMT1-3-T3A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatctgggaacatt 20
DNMT1-3-G4C-F aatgttccctcatggtccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 21
DNMT1-3-G4C-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatgagggaacatt 22
DNMT1-3-A5T-F aatgttccctgttggtccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 23
DNMT1-3-A5T-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccaacagggaacatt 24
DNMT1-3-T6A-F aatgttccctgaaggtccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 25
DNMT1-3-T6A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccttcagggaacatt 26
DNMT1-3-G7C-F aatgttccctgatcgtccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 27
DNMT1-3-G7C-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggacgatcagggaacatt 28
DNMT1-3-G8C-F aatgttccctgatgctccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 29
DNMT1-3-G8C-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggagcatcagggaacatt 30
DNMT1-3-T9A-F aatgttccctgatggaccatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 31
DNMT1-3-T9A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggtccatcagggaacatt 32
DNMT1-3-C10G-F aatgttccctgatggtgcatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 33
DNMT1-3-C10G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatgcaccatcagggaacatt 34
DNMT1-3-C11G-F aatgttccctgatggtcgatgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 35
DNMT1-3-C11G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatcgaccatcagggaacatt 36
DNMT1-3-A12T-F aatgttccctgatggtccttgtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 37
DNMT1-3-A12T-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacaaggaccatcagggaacatt 38
DNMT1-3-T13A-F aatgttccctgatggtccaagtctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 39
DNMT1-3-T13A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacttggaccatcagggaacatt 40
DNMT1-3-G14C-F aatgttccctgatggtccatctctgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 41
DNMT1-3-G14C-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagagatggaccatcagggaacatt 42
DNMT1-3-T15A-F aatgttccctgatggtccatgactgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 43
DNMT1-3-T15A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagtcatggaccatcagggaacatt 44
DNMT1-3-C16G-F aatgttccctgatggtccatgtgtgttactcgcctgtcaagtggcgtgac 45
DNMT1-3-C16G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacacacatggaccatcagggaacatt 46
DNMT1-3-T17A-F aatgttccctgatggtccatgtcagttactcgcctgtcaagtggcgtgac 47
DNMT1-3-T17A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaactgacatggaccatcagggaacatt 48
target-01-rs-R agacttagatctgagccctccctcttcccagcacaggcaggggtagaagc 49
target-01-rs-12T-R agacttagatctgagccctccctcttcccagaacaggcaggggtagaagc 50
target-02-rs-R tgtgtttggatttgcagtaggctgaagcgttatactatgactggagtcca 51
target-02-rs-12C-R tgtgtttggatttgcagtaggctgaagcgttgtactatgactggagtcca 52
target-03-rs-R aaaatagtgctttttacttttatctgaatgattgaaatgtccttttccca 53
target-03-rs-12C-R aaaatagtgctttttacttttatctgaatgactgaaatgtccttttccca 54
DNMT1-3-C1A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcagtgaacatt 55
DNMT1-3-C1T-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcagagaacatt 56
DNMT1-3-C2T-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcaaggaacatt 57
DNMT1-3-C2A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcatggaacatt 58
DNMT1-3-T3G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatccgggaacatt 59
DNMT1-3-T3C-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccatcggggaacatt 60
DNMT1-3-G4T-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccataagggaacatt 61
DNMT1-3-G4A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccattagggaacatt 62
DNMT1-3-A5G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccaccagggaacatt 63
DNMT1-3-A5C-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccagcagggaacatt 64
DNMT1-3-T6G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccctcagggaacatt 65
DNMT1-3-T6C-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaccgtcagggaacatt 66
DNMT1-3-G7T-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggacaatcagggaacatt 67
DNMT1-3-G7A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggactatcagggaacatt 68
DNMT1-3-G8T-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggaacatcagggaacatt 69
DNMT1-3-G8A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggatcatcagggaacatt 70
DNMT1-3-T9G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatggcccatcagggaacatt 71
DNMT1-3-T9C-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatgggccatcagggaacatt 72
DNMT1-3-C10T-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatgaaccatcagggaacatt 73
DNMT1-3-C10A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatgtaccatcagggaacatt 74
DNMT1-3-C11T-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacatagaccatcagggaacatt 75
DNMT1-3-C11A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacattgaccatcagggaacatt 76
DNMT1-3-A12G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacacggaccatcagggaacatt 77
DNMT1-3-A12C-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacagggaccatcagggaacatt 78
DNMT1-3-T13G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacctggaccatcagggaacatt 79
DNMT1-3-T13C-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagacgtggaccatcagggaacatt 80
DNMT1-3-G14T-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagaaatggaccatcagggaacatt 81
DNMT1-3-G14A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagatatggaccatcagggaacatt 82
DNMT1-3-T15G-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacagccatggaccatcagggaacatt 83
DNMT1-3-T15C-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacaggcatggaccatcagggaacatt 84
DNMT1-3-C16T-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacaaacatggaccatcagggaacatt 85
DNMT1-3-C16A-R gtcacgccacttgacaggcgagtaacatacatggaccatcagggaacatt 86
target-01rs-C8G-R agacttagatctgagccctccctcttcccagcacacgcaggggtagaagc 87
target-01rs-T9A-R agacttagatctgagccctccctcttcccagcactggcaggggtagaagc 88
target-01rs-G10C-R agacttagatctgagccctccctcttcccagcagaggcaggggtagaagc 89
target-01rs-T11A-R agacttagatctgagccctccctcttcccagctcaggcaggggtagaagc 90
target-01rs-G12C-R agacttagatctgagccctccctcttcccaggacaggcaggggtagaagc 91
target-01rs-C13G-R agacttagatctgagccctccctcttcccaccacaggcaggggtagaagc 92
target-01rs-T14A-R agacttagatctgagccctccctcttccctgcacaggcaggggtagaagc 93
target-01rs-G15C-R agacttagatctgagccctccctcttccgagcacaggcaggggtagaagc 94
target-01rs-G16C-R agacttagatctgagccctccctcttcgcagcacaggcaggggtagaagc 95
target-02rs-A8T-R tgtgtttggatttgcagtaggctgaagcgttatacaatgactggagtcca 96
target-02rs-G9C-R tgtgtttggatttgcagtaggctgaagcgttatagtatgactggagtcca 97
target-02rs-T10A-R tgtgtttggatttgcagtaggctgaagcgttattctatgactggagtcca 98
target-02rs-A11T-R tgtgtttggatttgcagtaggctgaagcgttaaactatgactggagtcca 99
target-02rs-T12A-R tgtgtttggatttgcagtaggctgaagcgttttactatgactggagtcca 100
target-02rs-A13T-R tgtgtttggatttgcagtaggctgaagcgtaatactatgactggagtcca 101
target-02rs-A14T-R tgtgtttggatttgcagtaggctgaagcgatatactatgactggagtcca 102
target-02rs-C15G-R tgtgtttggatttgcagtaggctgaagccttatactatgactggagtcca 103
target-02rs-G16C-R tgtgtttggatttgcagtaggctgaagggttatactatgactggagtcca 104
target-03rs-T8A-R aaaatagtgctttttacttttatctgaatgattgatatgtccttttccca 105
target-03rs-T9A-R aaaatagtgctttttacttttatctgaatgattgtaatgtccttttccca 106
target-03rs-C10G-R aaaatagtgctttttacttttatctgaatgattcaaatgtccttttccca 107
target-03rs-A11T-R aaaatagtgctttttacttttatctgaatgatagaaatgtccttttccca 108
target-03rs-A12T-R aaaatagtgctttttacttttatctgaatgaatgaaatgtccttttccca 109
target-03rs-T13A-R aaaatagtgctttttacttttatctgaatgtttgaaatgtccttttccca 110
target-03rs-C14G-R aaaatagtgctttttacttttatctgaatcattgaaatgtccttttccca 111
target-03rs-A15T-R aaaatagtgctttttacttttatctgaaagattgaaatgtccttttccca 112
target-03rs-T16A-R aaaatagtgctttttacttttatctgattgattgaaatgtccttttccca 113
target-05rs-R ggatctcctggcggaggtggtggtagaaggtccaggagcaggggtagccg 114
target-05rs-G11A-R ggatctcctggcggaggtggtggtagaaggtctaggagcaggggtagccg 115
target-41rs-R agcacatgtttgttgaatgagtcagtggatgacgtagatcagtatcttgt 116
target-41rs-G11A-R agcacatgtttgttgaatgagtcagtggatgatgtagatcagtatcttgt 117
target-01rs-10SNP-F gcttctttccctgcctgtgctgggaagagggagggctcagatctaagtct 118
target-01rs-10SNP-R agacttagatctgagccctccctcttcccagcacaggcagggaaagaagc 119
target-01rs-10SNP-G10T-F gcttctttccctgcctgttctgggaagagggagggctcagatctaagtct 120
target-01rs-10SNP-G10T-R agacttagatctgagccctccctcttcccagaacaggcagggaaagaagc 121
target-01rs-12SNP-F gcttttacccctgcctgtgctgggaagagggagggctcagatctaagtct 122
target-01rs-12SNP-R agacttagatctgagccctccctcttcccagcacaggcaggggtaaaagc 123
target-01rs-12SNP-G12T-F gcttttacccctgcctgttctgggaagagggagggctcagatctaagtct 124
target-01rs-12SNP-G12T-R agacttagatctgagccctccctcttcccagaacaggcaggggtaaaagc 125
HEX-N12-BHQ1 Hex-nnnnnnnnnnnn-Bhq1 126
FAM-N12-Eclipse Fam-nnnnnnnnnnnn-Eclipse 126
sgRNA의 전사를 위한 템플릿 서열
Oligo 명칭 서열(5'-3') SEQ ID No.:
T7-sgRNA-F gaaattaatacgactcactataggg 128
T7-sgRNA-gyrB tcgcgcttgtcgcgcagacgaatgatctacaacagtagaaattccctatagtgagtcgtattaatttc 129
ZLsgRNA-DNMT1-3-R aacagacatggaccatcagggtg 130
ZLsgRNA-DNMT1-3-14 catggaccatcagggtgccac 131
ZLsgRNA-DNMT1-3-15 acatggaccatcagggtgccac 132
ZLsgRNA-DNMT1-3-16 gacatggaccatcagggtgcc 133
ZLsgRNA-DNMT1-3-17 agacatggaccatcagggtgc 134
ZLsgRNA-DNMT1-3-18 cagacatggaccatcagggtg 135
ZLsgRNA-DNMT1-3-19 acagacatggaccatcagggtg 136
ZL-01-rs-16-R ccagcacaggcagggggtgccacttctcagatttgagaag 137
ZL-02-rs-16-R cgttatactatgactggtgccacttctcagatttgagaag 138
ZL-03-rs-16-R atgattgaaatgtcctgtgccacttctcagatttgagaag 139
ZL-01rs-16-G12T-R ccagaacaggcagggggtgccacttctcagatttgagaag 140
ZL-02rs-16-T12C-R cgttgtactatgactggtgccacttctcagatttgagaag 141
ZL-03rs-16-T12C-R atgactgaaatgtcctgtgccacttctcagatttgagaag 142
ZL-sgRNA-05rs-16 aggtccaggagcaggggtgccacttctcagatttgagaag 143
ZL-sgRNA-05rs--G11A-16 aggtctaggagcaggggtgccacttctcagatttgagaag 144
ZL-sgRNA-41rs-16 gatgacgtagatcagtgtgccacttctcagatttgagaag 145
ZL-sgRNA-41rs-G11A-16 gatgatgtagatcagtgtgccacttctcagatttgagaag 146
ZL-gyrB-crRNA2-R atatcttctacttctccactgtgccacttctcagatttgagaag 147
ZL-sry-crRNA3-R tctagagaatcccagaatgcgtgccacttctcagatttgagaag 148
ZL-02rs-16-11SNP-R gcgttatactatgactgtgccacttctcagatttgagaag 149
ZL-02rs-16-(T12C) 11SNP-R gcgttgtactatgactgtgccacttctcagatttgagaag 150
ZL-01rs-10SNP-18-R cttcccagcacaggcagggtgccacttctcagatttgagaag 151
ZL-01rs-10SNPG10T-18-R cttcccagaacaggcagggtgccacttctcagatttgagaag 152
ZL-01rs-12SNP-18-R tcccagcacaggcagggggtgccacttctcagatttgagaag 153
ZL-01rs-12SNPG12T-18-R tcccagaacaggcagggggtgccacttctcagatttgagaag 154
ZL-sgRNA-JEV-E453-R tgtgatccaagacattccccgtgccacttctcagatttgagaag 155
ZL-sgRNA-JEV-NS170-R ctcgtcagtgctctcctctcgtgccacttctcagatttgagaag 156
ZL-01rs-10SNP-19-R tcttcccagcacaggcagggtgccacttctcagatttgagaag 157
ZL-01rs-10SNPG10T-19-R tcttcccagaacaggcagggtgccacttctcagatttgagaag 158
ZL-01rs-12SNP-19-R ttcccagcacaggcagggggtgccacttctcagatttgagaag 159
ZL-01rs-12SNPG12T-19-R ttcccagaacaggcagggggtgccacttctcagatttgagaag 160
증폭용 프라이머인 올리고 뉴클레오티드
Oligo 명칭 서열(5'-3') SEQ ID No.:
LAMP-DNM-F3 gtgaacgttcccttagcact 161
LAMP-DNM-B3 gggagggcagaactagtcc 162
LAMP-DNM-FIP cgccacttgacaggcgagtaactgccacttattgggtcagc 163
LAMP-DNM-BIP gcgtgttccccagagtgacttagcagcttcctcctcctt 164
LAMP-DNM-LoopF aggaaacattaacgtactgatg 165
LAMP-DNM-LoopB ttccttttatttcccttcagc 166
LAMP-gyrB-F3 cgacggcaaagaagacca 167
LAMP-gyrB-B3 agcctgccaggtgagtac 168
LAMP-gyrB-FIP cgggtggatcggcgttttgttcactatgaaggcggcatca 169
LAMP-gyrB-BIP gtattggcgtcgaagtggcgttcgctgcggaatgttgttg 170
LAMP-gyrB-LoopF ttgttcagatattcaacgaacg 171
LAMP-gyrB-LoopB gtggaacgatggcttccagg 172
LAMP-sry-F3 tctctgtgcatggcctgta 173
LAMP-sry-B3 aacagtaaaggcaacgtcca 174
LAMP-sry-FIP gcagctgggataccagtggaagtgcctcctggaagaatgg 175
LAMP-sry-BIP tctctagagccatcttgcgcctgaagcgacccatgaacgc 176
LAMP-sry-LoopF tgcttactgaagccgaaaaatg 177
LAMP-sry-LoopB tgatcgcgagaccacacgatg 178
ASP-primer ggtttcggatgttacagcgt 179
ASP-rs5082-F caagcaccccacccgctcacccacctcctcctttg 180
ASP-rs5082-R ggtttcggatgttacagcgtgtgctggaagacttagatctgag 181
LAMP-rs5082-F3 gctggaaaggtcaagggac 182
LAMP-rs5082-B3 ggggtttgttgcacagtcc 183
LAMP-rs5082-FIP ggtagaagcaaaggcaggaggtttgcccaaggtcacacag 184
LAMP-rs5082-FIP-10PAM gaaagaagcaaaggcaggaggtttgcccaaggtcacacag 185
LAMP-rs5082-BIP ctgggaagagggagggctcagtgttgccacactttcactgg 186
LAMP-rs5082-LoopF gtgagcgggtggggtgct 187
LAMP-rs5082-LoopB tctaagtcttccagcacgggatc 188
LAMP-E453-F3 tgacacagcctgggactt 189
LAMP-E453-B3 cacacctcctgtggctaag 190
LAMP-E453-FIP gagtgttctgaaggcaccaccagctccattggaggggtct 191
LAMP-E453-BIP acacaagggctaatgggtgccgccaaagcaattgatcggtc 192
LAMP-E453-LoopF ttggtgaacggcttttcctatg 193
LAMP-E453-LoopB tgctctggatgggcgtcaacg 194
LAMP-NS170-F3 gagacaaaggaatgccctga 195
LAMP-NS170-B3 gccctctcaagtttccatgt 196
LAMP-NS170-FIP cgggttgatgtgatgccaaagcgagcacagagcttggaaca 197
LAMP-NS170-BIP ggagcgatcataggtacggctggcgactctcaatccagtacg 198
LAMP-NS170-LoopF gaagtcttcgatttgcatg 199
LAMP-NS170-LoopB acatgtggcagtccatagtgac 200
GAPDH-LAMP-target3-FIP agggatctcgctcctggaagatcaccgtcaaggctgagaac 201
GAPDH-LAMP-target3-BIP cgatgctggcgctgagtacgaatgagccccagccttct 202
GAPDH-LAMP-target3-F3 tccacccatggcaaattcc 203
GAPDH-LAMP-target3-B3 agggggcagagatgatgac 204
GAPDH-LAMP-target3-LoopF tccattgatgacaagcttccc 205
GAPDH-LAMP-target3-LoopB tcgtggagtccactggcgtc 206
CDR1as-LAMP-FIP ccagatcttccaggaaaatccacatctgtatttgatggaagacctt 207
CDR1as-LAMP-BIP agaccagtaattgctggaagacttgtcttccaagaagctcc 208
CDR1as-LAMP-F3 agatttttctggaagacatgg 209
CDR1as-LAMP-B3 atgtcttccggacaatcc 210
CDR1as-LAMP-LoopB tgctggaagacttgatttactgg 211
COL1A2-F ggaggcaccctagggccagggaaa 212
COL1A2-R gttactgcaagcagcaacaaagtcc 213
COL1A2(BSP)-F ggaggtattttagggttagggaaa 214
COL1A2(BSP)-R attactacaaacaacaacaaaatcc 215
sgRNA-GAPDH-target3-7 ggcgtcttcaccaccatggagtgccacttctcagatttgagaag 216
sgRNA-CDR1as-target1-3 ctccaagtcttccagtaaatgtgccacttctcagatttgagaag 217
sgRNA-COL1A2m3-C12-17 ctaccgtaatactaaaagtgccacttctcagatttgagaag 127
본 발명에 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 별도로 참조 문헌으로 인용된 것처럼 본 발명에서 참조 문헌으로 인용된다. 또한 본 발명의 상술한 교시 내용을 열독한 후 당업자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 변형을 할 수 있으며 이러한 등가 형태 역시 본 발명에 첨부된 청구범위에 의해 한정된 범위 내에 속함을 이해해야 한다.
<110> SHANGHAI TOLO BIOTECHNOLOGY COMPANY LIMITED <120> Use of high-temperature-resistant Cas protein, and method and reagent kit for detecting target nucleic acid molecule <130> PIPB204386CNd01 <150> CN 201810560284.8 <151> 2018-06-03 <160> 217 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 1 tttctgtttg ttatcgcaac tttctactga attcaagctt tactctagaa agaggagaaa 60 ggatcc 66 <210> 2 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 2 ggatcctttc tcctctttct agagtaaagc ttgaattcag tagaaagttg cgataacaaa 60 cagaaa 66 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 3 ggatcctttc tcctctttct agagtaaagc ttgaattcag tagaaagttg cgataacaaa 60 cagaaa 66 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 4 ggatcctttc tcctctttct agagtaaagc ttgaattcag tagaaagttg cgataacaaa 60 cagaaa 66 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 5 aatgttccct gatggtccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 6 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 6 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatc agggaacatt 50 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 7 aatgaaccct gatggtccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 8 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatc agggttcatt 50 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 9 aatgatccct gatggtccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 10 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatc agggatcatt 50 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 11 aatgtaccct gatggtccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 12 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatc agggtacatt 50 <210> 13 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 13 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatc agggcccatt 50 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 14 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatc agggggcatt 50 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 15 aatgttcgct gatggtccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 16 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatc agcgaacatt 50 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 17 aatgttccgt gatggtccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 18 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatc acggaacatt 50 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 19 aatgttccca gatggtccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 20 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatc tgggaacatt 50 <210> 21 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 21 aatgttccct catggtccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 22 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 22 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatg agggaacatt 50 <210> 23 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 23 aatgttccct gttggtccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 24 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 24 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccaac agggaacatt 50 <210> 25 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 25 aatgttccct gaaggtccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 26 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 26 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccttc agggaacatt 50 <210> 27 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 27 aatgttccct gatcgtccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 28 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggacgatc agggaacatt 50 <210> 29 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 29 aatgttccct gatgctccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 30 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggagcatc agggaacatt 50 <210> 31 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 31 aatgttccct gatggaccat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 32 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 32 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggtccatc agggaacatt 50 <210> 33 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 33 aatgttccct gatggtgcat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 34 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 34 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atgcaccatc agggaacatt 50 <210> 35 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 35 aatgttccct gatggtcgat gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 36 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 36 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atcgaccatc agggaacatt 50 <210> 37 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 37 aatgttccct gatggtcctt gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 38 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 38 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac aaggaccatc agggaacatt 50 <210> 39 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 39 aatgttccct gatggtccaa gtctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 40 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 40 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac ttggaccatc agggaacatt 50 <210> 41 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 41 aatgttccct gatggtccat ctctgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 42 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 42 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagag atggaccatc agggaacatt 50 <210> 43 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 43 aatgttccct gatggtccat gactgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 44 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 44 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagtc atggaccatc agggaacatt 50 <210> 45 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 45 aatgttccct gatggtccat gtgtgttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 46 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 46 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacacac atggaccatc agggaacatt 50 <210> 47 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 47 aatgttccct gatggtccat gtcagttact cgcctgtcaa gtggcgtgac 50 <210> 48 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 48 gtcacgccac ttgacaggcg agtaactgac atggaccatc agggaacatt 50 <210> 49 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 49 agacttagat ctgagccctc cctcttccca gcacaggcag gggtagaagc 50 <210> 50 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 50 agacttagat ctgagccctc cctcttccca gaacaggcag gggtagaagc 50 <210> 51 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 51 tgtgtttgga tttgcagtag gctgaagcgt tatactatga ctggagtcca 50 <210> 52 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 52 tgtgtttgga tttgcagtag gctgaagcgt tgtactatga ctggagtcca 50 <210> 53 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 53 aaaatagtgc tttttacttt tatctgaatg attgaaatgt ccttttccca 50 <210> 54 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 54 aaaatagtgc tttttacttt tatctgaatg actgaaatgt ccttttccca 50 <210> 55 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 55 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatc agtgaacatt 50 <210> 56 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 56 gtcacgccac ttgacaggcg agtaacagac atggaccatc agagaacatt 50 <210> 57 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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<223> artificial sequence <400> 171 ttgttcagat attcaacgaa cg 22 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 172 gtggaacgat ggcttccagg 20 <210> 173 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 173 tctctgtgca tggcctgta 19 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 174 aacagtaaag gcaacgtcca 20 <210> 175 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 175 gcagctggga taccagtgga agtgcctcct ggaagaatgg 40 <210> 176 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 176 tctctagagc catcttgcgc ctgaagcgac ccatgaacgc 40 <210> 177 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 177 tgcttactga agccgaaaaa tg 22 <210> 178 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 178 tgatcgcgag accacacgat g 21 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 179 ggtttcggat gttacagcgt 20 <210> 180 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 180 caagcacccc acccgctcac ccacctcctc ctttg 35 <210> 181 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 181 ggtttcggat gttacagcgt gtgctggaag acttagatct gag 43 <210> 182 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 182 gctggaaagg tcaagggac 19 <210> 183 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 183 ggggtttgtt gcacagtcc 19 <210> 184 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 184 ggtagaagca aaggcaggag gtttgcccaa ggtcacacag 40 <210> 185 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 185 gaaagaagca aaggcaggag gtttgcccaa ggtcacacag 40 <210> 186 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 186 ctgggaagag ggagggctca gtgttgccac actttcactg g 41 <210> 187 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 187 gtgagcgggt ggggtgct 18 <210> 188 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 188 tctaagtctt ccagcacggg atc 23 <210> 189 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 189 tgacacagcc tgggactt 18 <210> 190 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 190 cacacctcct gtggctaag 19 <210> 191 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 191 gagtgttctg aaggcaccac cagctccatt ggaggggtct 40 <210> 192 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 192 acacaagggc taatgggtgc cgccaaagca attgatcggt c 41 <210> 193 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 193 ttggtgaacg gcttttccta tg 22 <210> 194 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 194 tgctctggat gggcgtcaac g 21 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 195 gagacaaagg aatgccctga 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 196 gccctctcaa gtttccatgt 20 <210> 197 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 197 cgggttgatg tgatgccaaa gcgagcacag agcttggaac a 41 <210> 198 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 198 ggagcgatca taggtacggc tggcgactct caatccagta cg 42 <210> 199 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 199 gaagtcttcg atttgcatg 19 <210> 200 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 200 acatgtggca gtccatagtg ac 22 <210> 201 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 201 agggatctcg ctcctggaag atcaccgtca 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 217 ctccaagtct tccagtaaat gtgccacttc tcagatttga gaag 44

Claims (19)

  1. 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출용 조성물로서,
    상기 조성물은,
    (a) Cas12b;
    (b) Cas12b가 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 가이드 RNA; 및
    (c) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브를 포함하고,
    상기 표적 핵산 분자는 표적 DNA이고, 상기 검출용 조성물은 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응을 수행하고, 상기 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응은 동시에 수행되며, 상기 검출용 조성물은 원스텝 반응에 사용되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    표적 핵산 분자가 ssDNA인 경우, 상기 표적 핵산 분자의 검출 부위는 상기 가이드 RNA의 PAM 서열 하류 9번째 위치 또는 10 ~ 16번째 위치에 있는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 검출 부위가 상기 가이드 RNA의 PAM 서열 하류 9번째 위치에 있는 경우, 상기 검출 부위는 G인 것을 특징으로 하는 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출용 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 표적 핵산 분자의 검출 부위는 상기 가이드 RNA의 PAM 서열 하류 1 ~ 12번째 위치에 있는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출용 조성물.
  5. SNP를 검출하기 위한 검출용 조성물로서,
    상기 조성물은 제1 검출용 조성물 및 제2 검출용 조성물을 포함하고;
    제1 검출용 조성물은,
    (a1) Cas12b;
    (b1) Cas12b가 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 제1 가이드 RNA; 및
    (c1) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브를 포함하며,
    제2 검출용 조성물은,
    (a2) Cas12b;
    (b2) Cas12b가 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 제2 가이드 RNA; 및
    (c2) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브를 포함하고,
    상기 표적 핵산 분자는 표적 DNA이며, 상기 검출용 조성물은 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응을 수행하고, 상기 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응은 동시에 수행되며, 상기 검출용 조성물은 원스텝 반응에 사용되고;
    상기 제1 가이드 RNA 및 제2 가이드 RNA는 상기 SNP 부위를 포함하는 동일한 핵산 서열 영역으로 향하고, 제1 가이드 RNA는 상기 SNP 부위의 야생형(또는 돌연변이되지 않은) 핵산 서열로 향하며, 상기 제2 가이드 RNA는 상기 SNP 부위의 돌연변이형 핵산 서열로 향하는 것을 특징으로 하는 SNP를 검출하기 위한 검출용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 블랭크 대조용 조성물을 더 포함하고, 상기 블랭크 대조용 조성물은,
    (a3) Cas12b; 및
    (c3) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 SNP를 검출하기 위한 검출용 조성물.
  7. 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 키트로서,
    상기 키트는,
    i) 제1 용기 및 제1 용기 내에 위치한, Cas12b;
    ii) 임의로 선택된 제2 용기 및 제2 용기 내에 위치한, 상기 Cas12b가 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 가이드 RNA;
    iii) 제3 용기 및 제3 용기 내에 위치한 핵산 프로브; 및
    iv) 임의로 선택된 제4 용기 및 제4 용기 내에 위치한 버퍼를 포함하고,
    상기 표적 핵산 분자는 표적 DNA이고, 상기 키트는 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응을 위한 시약을 포함하고, 상기 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응은 원스텝 반응으로 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 키트는,
    v) 제5 용기 및 제5 용기 내에 위치한, 표적 DNA를 증폭하기 위한 중합 효소;
    vi) 임의로 선택된 제6 용기 및 제6 용기 내에 위치한, 역전사를 위한 역전사 효소;
    vii) 제7 용기 및 제7 용기 내에 위치한, 증폭 반응, 역전사 반응 또는 이들의 조합 반응을 위한 dNTP를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 시약 키트.
  9. 샘플 내 표적 핵산 분자의 존재 여부 검출 방법으로서,
    (i) 제1항에 따른 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출용 조성물과 분석 대상 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 상기 검출용 조성물 내의 핵산 프로브가 Cas12b에 의해 절단되고 상기 절단이 주변 단일 가닥 DNA의 트랜스 절단인지 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 핵산 프로브가 Cas12b에 의해 절단되면, 이는 상기 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재함을 의미하고; 상기 핵산 프로브가 Cas12b에 의해 절단되지 않으면, 이는 상기 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재하지 않음을 의미하는 것을 특징으로 하는 샘플 내 표적 핵산 분자의 존재 여부 검출 방법.
  10. 샘플 내 표적 핵산 분자의 존재 여부 검출 방법으로서,
    (i) 검출용 조성물을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 검출용 조성물을 역전사, 증폭 반응 또는 이들의 조합 반응을 시켜 역전사, 증폭, 또는 이들의 조합 반응된 검출용 조성물을 획득하는 단계; 및
    (iii) 이전 단계의 상기 검출용 조성물 내의 핵산 프로브가 Cas12b에 의해 절단되고 상기 절단이 주변 단일 가닥 DNA의 트랜스 절단인지 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 검출용 조성물은,
    (a) Cas12b;
    (b) Cas12b가 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 가이드 RNA;
    (c) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브;
    (d) 버퍼;
    (e1) 표적 DNA를 증폭하기 위한 중합 효소;
    (e2) 임의로 선택된, 역전사를 위한 역전사 효소;
    (e3) 증폭 반응, 역전사 반응 또는 이들의 조합 반응을 위한 dNTP; 및
    (f) 검출할 검출 샘플을 포함하며,
    상기 표적 핵산 분자는 표적 DNA이고, 상기 검출용 조성물은 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응을 수행하고, 상기 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응은 동시에 수행되며, 상기 검출용 조성물은 원스텝 반응에 사용되고;
    상기 핵산 프로브가 Cas12b 단백질에 의해 절단되면, 이는 상기 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재함을 의미하고; 상기 핵산 프로브가 Cas12b 단백질에 의해 절단되지 않으면, 이는 상기 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재하지 않음을 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 검출은 정성 검출 또는 정량 검출을 포함하는 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 증폭 방법은 PCR 증폭, LAMP 증폭, RPA 증폭, 리가제 연쇄 반응, 분지형 DNA 증폭, NASBA, SDA, 전사 매개 증폭, 회전환 증폭, HDA, SPIA, NEAR, TMA 및 SMAP2로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 표적 핵산 분자는 메틸화 핵산 서열이거나, 상기 메틸화 핵산 서열은 메틸화되지 않은 C→우라실 전환 후 획득된 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. Cas12b를 포함하는 주변 단일 가닥 DNA 절단을 기반으로 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출 시약으로서,
    상기 검출 시약은 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응을 위한 시약을 포함하고, 상기 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응은 원스텝 반응으로 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 검출 시약.
  15. 샘플 내 표적 핵산 분자의 존재 여부 검출 기기로서,
    상기 기기는,
    (a) 디지털 반응 시스템에 대해 핵산 증폭 반응 및 Cas12b에 의해 매개된 우회 절단인 우회 절단 반응을 수행하기 위한 증폭 반응-우회 절단 반응 모듈; 및
    (b) 각 디지털 반응 시스템에서 Cas12b에 의해 매개된 우회 절단이 발생하는지 여부를 검출하기 위한 신호 검출 모듈을 포함하고,
    상기 디지털 반응 시스템은 복수의 독립적인 반응 시스템 유닛을 포함하며, 각각의 반응 시스템 유닛은 모두,
    (a) Cas12b;
    (b) Cas12b가 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 가이드 RNA;
    (c) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브;
    (d) 버퍼;
    (e1) 표적 DNA를 증폭하기 위한 중합 효소;
    (e2) 임의로 선택된, 역전사를 위한 역전사 효소;
    (e3) 증폭 반응 또는 역전사 반응을 위한 dNTP; 및
    (f) 검출할 검출 샘플을 포함하며,
    상기 표적 핵산분자는 표적 DNA인 것을 특징으로 하는;
    샘플 내 표적 핵산 분자의 존재 여부 검출 기기.
  16. 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출용 조성물로서,
    상기 조성물은,
    (a) 주변 단일 가닥 DNA 절단 활성(collateral single-strand DNA cleavage activity)을 갖는, CRISPR 시스템 분류에서 V-B 유형 효소;
    (b) V-B 유형 효소가 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하도록 유도하는 가이드 RNA; 및
    (c) 단일 가닥 DNA인 핵산 프로브를 포함하고;
    상기 표적 핵산 분자는 표적 DNA이고, 상기 검출용 조성물은 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응을 수행하고, 상기 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응은 동시에 수행되며, 상기 검출용 조성물은 원스텝 반응에 사용되는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출용 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 검출용 조성물은 Bst 3.0 DNA 중합효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 검출용 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 Cas12b는 AacCas12b(Alicyclobacillus acidoterrestris), Aac2Cas12b(Alicyclobacillus acidiphilus), AkaCas12b(Alicyclobacillus kakegawensis), AmaCas12b(Alicyclobacillus macrosporangiidus), AheCas12b(Alicyclobacillus herbarius) 및 AcoCas12b(Alicyclobacillus contaminans)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검출용 조성물.
  19. Cas12b를 포함하는, 표적 핵산 분자를 검출하기 위한 검출용 조성물로서,
    상기 검출용 조성물은 단일-가닥 DNA의 주변 절단반응을 이용하는 원스텝 반응에 사용되고; 상기 원스텝 반응은 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응을 포함하며; 상기 핵산 증폭 반응 및 주변 절단 반응은 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 검출용 조성물.
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