CN112898443B - 菌体中脂寡糖和寡糖的提取纯化方法 - Google Patents
菌体中脂寡糖和寡糖的提取纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112898443B CN112898443B CN202110119637.2A CN202110119637A CN112898443B CN 112898443 B CN112898443 B CN 112898443B CN 202110119637 A CN202110119637 A CN 202110119637A CN 112898443 B CN112898443 B CN 112898443B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- extracting
- purifying
- solution
- lipooligosaccharide
- los
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 41
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 title claims abstract description 41
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 75
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims abstract description 58
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 53
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 38
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 31
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims abstract description 22
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 17
- MDUBPQGQPBQGGN-UHFFFAOYSA-N azanium;2-methylpropanoate Chemical compound [NH4+].CC(C)C([O-])=O MDUBPQGQPBQGGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 69
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 18
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 17
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 10
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 7
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 claims description 3
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 3
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 3
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 32
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 25
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 23
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 15
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 12
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 6
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- KSSNXJHPEFVKHY-UHFFFAOYSA-N phenol;hydrate Chemical compound O.OC1=CC=CC=C1 KSSNXJHPEFVKHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- BPSNETAIJADFTO-UHFFFAOYSA-N 2-pyridinylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=N1 BPSNETAIJADFTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 3
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 3
- 229940124832 acellular pertussis vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000004043 trisaccharides Chemical group 0.000 description 2
- 208000018150 Bordetella infection Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- XGXHOKLJDUDZSQ-UHFFFAOYSA-N butyl 4-[4-(4-butoxycarbonylphenyl)phenyl]benzoate Chemical compound C1=CC(C(=O)OCCCC)=CC=C1C1=CC=C(C=2C=CC(=CC=2)C(=O)OCCCC)C=C1 XGXHOKLJDUDZSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000003808 methanol extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种菌体中脂寡糖的提取纯化方法，包括以下步骤：a、收集干菌泥；b、将所述干菌泥与异丁酸氨水溶液混合，离心，收集上清液，所述异丁酸氨水溶液为异丁酸和浓氨水的混合物；c、将步骤b得到的上清液与乙醇混合，静置，离心，收集沉淀物；d、使用氯仿甲醇溶液对步骤c得到的沉淀物进行萃取，收集有机相；e、对步骤d得到的有机相进行干燥。本发明还公开了一种菌体中寡糖的提取纯化方法，包括对步骤e得到产物进行水解并纯化。
Description
技术领域
本发明涉及寡糖提取纯化技术领域，特别是涉及菌体中脂寡糖和寡糖的提取纯化方法。
背景技术
百日咳(pertussis)是一种由百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis，简称百日咳杆菌)引起的急性呼吸道传染病，百日咳杆菌以人为唯一天然宿主，虽然有良好的疫苗接种覆盖率，但每年仍有大量患者并导致部分患者死亡。目前，有两种百日咳疫苗，一种为全细胞百日咳疫苗(wP)，另一种无细胞百日咳疫苗(aP)。aP虽然可以对鲍特菌感染提供保护，但不能完全阻止其传播，且aP预防感染的效果明显不如wP。很多研究已经证明，正在使用的无细胞百日咳疫苗与百日咳疾病重现有关。
百日咳杆菌菌体表面的脂寡糖(lipooligosaccharide，LOS)既是细菌的致病物质，其最外层的三糖结构也是百日咳杆菌的型特异性抗原(图1)。已经有学者证明百日咳杆菌LOS的末端三糖结构是特异性杀菌抗体作用的靶点。研究也初步证明，用O-SP-ABS制备的结合物，能使小鼠产生具有一定杀菌作用的功能性抗体。因此百日咳寡糖可能为开发新型百日咳抗原成分提供新的思路。传统的热酚水法提取LOS，提取周期长，有毒溶剂苯酚的使用会对操作人员造成伤害且终产品中会存在有毒物质的风险，去除后续产品中残留有毒物质的工艺繁琐。
发明内容
基于此，有必要针对传统热酚水法提取存在的问题，提供一种菌体中脂寡糖和寡糖的提取纯化方法。
一种菌体中脂寡糖的提取纯化方法，包括以下步骤：
a、收集干菌泥；
b、将所述干菌泥与异丁酸氨水溶液混合，离心，收集上清液，所述异丁酸氨水溶液为异丁酸和浓氨水的混合物；
c、将步骤b得到的上清液与乙醇混合，静置，离心，收集沉淀物；
d、使用氯仿甲醇溶液对步骤c得到的沉淀物进行萃取，收集有机相；
e、对步骤d得到的有机相进行干燥。
在其中一些实施例中，所述浓氨水的质量浓度为22％～28％。
在其中一些实施例中，所述异丁酸氨水溶液中的所述异丁酸与所述浓氨水的体积比为(4～6):3。
在其中一些实施例中，步骤b中，每克干菌泥中添加所述异丁酸氨水溶液8ml～12ml。
在其中一些实施例中，步骤c中上清液与乙醇的混合物中乙醇的浓度为(75～85)ml/100ml。
在其中一些实施例中，所述氯仿甲醇溶液中的氯仿与甲醇的体积比为(1～2.5):1。
在其中一些实施例中，步骤d中，先使用含MgSO4的缓冲液对步骤c得到的沉淀物进行重悬，然后再使用氯仿甲醇溶液对重悬液进行萃取。
在其中一些实施例中，所述含MgSO4的缓冲液的pH 7.4～7.8，MgSO4浓度为1.5mmol/L～2.5mmol/L；优选的，每克干菌泥中所述含MgSO4的缓冲液的使用量为5ml～10ml。
在其中一些实施例中，步骤d中使用的所述氯仿甲醇溶液与所述含MgSO4的缓冲液的体积比为1:(1～4)。
在其中一些实施例中，步骤e中对所述有机相进行旋转蒸发干燥；优选的，旋转蒸发干燥之后包括对干燥物依次进行加水复溶、透析和真空冷冻干燥的步骤。
在其中一些实施例中，步骤a包括：
a1、离心发酵液收集菌体；
a2、纯化水与菌体混匀，离心收集菌泥；
a3、将a2所得菌泥与乙醇混合，离心收集菌泥；
a4、将a3所得菌泥与甲醇混合，离心收集干菌泥。
在其中一些实施例中，所述菌体选自百日咳杆菌、大肠杆菌、副百日咳杆菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌、假单胞菌、奈瑟氏菌、嗜血杆菌中的任意一种或多种。
一种菌体中寡糖的提取纯化方法，按照所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法得到脂寡糖，然后对所述脂寡糖进行水解。
本发明提供了一种从菌体中提取脂寡糖和寡糖的方法，干菌中加入异丁酸氨水溶液进行提取，再经乙醇沉淀、氯仿甲醇溶液萃取的方法获得精纯LOS。之后将LOS进行水解将脂质去除得到寡糖(OS)。相对于传统的热酚水法提取LOS，本方法提取周期短，可以不添加有毒溶剂苯酚，能避免对操作人员造成伤害且终产品中不会存在有毒物质的风险，以及能避免去除后续产品中残留有毒物质的繁琐工艺步骤，降低了成本。并且，发明人发现提高提取液中氨水浓度，可使得LOS纯度明显提高，降低了后续纯化难度；纯化过程采用乙醇沉淀的方法将LOS沉淀，进一步纯化LOS，沉淀再用氯仿甲醇萃取LOS，进一步去除了核酸蛋白等杂质，最终得到精纯的LOS。LOS经水解得到精纯的OS。
附图说明
图1为百日咳杆菌LOS结构；
图2为本发明一实施例的LOS提取纯化工艺路线图；
图3为本发明一实施例的OS提取纯化工艺路线图；
图4为本发明一实施例和对比例的采用浓氨水及1M氨水提取的LOS电泳图；
图5为本发明一实施例和对比例的采用不同比例异丁酸氨水提取的LOS电泳图；
图6为本发明一实施例和对比例的采用不同比例氯仿甲醇萃取获得的LOS电泳图；
图7A为本发明一实施例的LOS萃取过程样品SDS-PAGE图；
图7B为本发明一实施例的纯化LOS样品SDS-PAGE图；
图8A为本发明一实施例的纯化LOS样品对流免疫电泳图；
图8B为本发明一实施例的纯化OS样品对流免疫电泳图；
图9为OS 600MHz 1H NMR图谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例提供一种菌体中脂寡糖的提取纯化方法，包括以下步骤：
a、收集干菌泥；
b、将所述干菌泥与异丁酸氨水溶液混合，离心，收集上清液，所述异丁酸氨水溶液为异丁酸和浓氨水的混合物；
c、将步骤b得到的上清液与乙醇混合，静置，离心，收集沉淀物；
d、使用氯仿甲醇溶液对步骤c得到的沉淀物进行萃取，收集有机相；
e、对步骤d得到的有机相进行干燥。
本发明提供了一种从菌体中提取脂寡糖和寡糖的方法，干菌中加入异丁酸氨水溶液进行提取，再经乙醇沉淀、氯仿甲醇溶液萃取的方法获得精纯LOS。之后将LOS进行水解将脂质去除得到寡糖(OS)。相对于传统的热酚水法提取LOS，本方法提取周期短，可以不添加有毒溶剂苯酚，能避免对操作人员造成伤害且终产品中不会存在有毒物质的风险，以及能避免去除后续产品中残留有毒物质的繁琐工艺步骤，降低了成本。并且，发明人发现提高提取液中氨水浓度，可使得LOS纯度明显提高，降低了后续纯化难度；纯化过程采用乙醇沉淀的方法将LOS沉淀，进一步纯化LOS，沉淀再用氯仿甲醇萃取LOS，进一步去除了核酸蛋白等杂质，最终得到精纯的LOS。LOS经水解得到精纯的OS。
在一些实施方式中，步骤a包括：
a1、离心发酵液收集菌体；
a2、纯化水与菌体混匀，离心收集菌泥；
a3、将a2所得菌泥与乙醇混合，离心收集菌泥；
a4、将a3所得菌泥与甲醇混合，离心收集干菌泥。
用纯化水、乙醇、甲醇对发酵液中提取的菌体进行洗涤，使细菌脱水的同时也可去除可能与LOS共同被提取的其它细胞组分(例如磷脂、脂肪酸等)，简化后续LOS的纯化工作。
在一些实施方式中，步骤a2中，菌体与纯化水添加比例为1:3～1:8(w/v)，即，每克菌体中添加纯化水3ml～8ml。优选为1:5(w/v)。
在一些实施方式中，步骤a3中，优选使用体积分数为80％～90％的乙醇溶液。菌泥与乙醇溶液的添加比例可以为1:1～1:5(w/v)，即，每克菌泥中添加乙醇溶液1ml～5ml。优选为1:2～1:3(w/v)，更优为1:2.5(w/v)。
在一些实施方式中，步骤a3中，菌泥与乙醇混合是在45℃～55℃进行加热搅拌混合。加热搅拌时间优选为10min。
在一些实施方式中，步骤a4中，菌泥与甲醇添加比例为1:1～1:3(w/v)，即，每克菌体中添加甲醇1ml～3ml。优选为1:2(w:v)。
在一些实施方式中，步骤a中，纯化水、乙醇及甲醇循环对菌体进行处理，循环次数为2次及2次以上。
在一些实施方式中，步骤a中，各溶剂添加比例均按照湿菌泥重量添加。
在一些实施方式中，所述异丁酸氨水溶液中的所述异丁酸与所述浓氨水的体积比为(4～6):3，优选为(4.5～5.5):3。
在一些实施方式中，步骤b异丁酸氨水溶液中的所述浓氨水指的是氨的质量浓度为22％～28％的氨水。具体的，浓氨水的质量浓度可以为22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％。优选为25％～28％，提高氨水的浓度，在该范围内可进一步提高提取得到的LOS的纯度和提取率。
在一些实施方式中，步骤b中，每克干菌泥中添加所述异丁酸氨水溶液8ml～12ml。具体可以为8ml、9ml、10ml、11ml、12ml。
在一些实施方式中，步骤c中采用的乙醇为无水乙醇。
在一些实施方式中，步骤c中，上清液与乙醇的混合物中乙醇的浓度可以为(75～85)ml/100ml。具体可以为75ml/100ml、78ml/100ml、80ml/100ml、82ml/100ml、85ml/100ml等。
在一些实施方式中，所述氯仿甲醇溶液为氯仿与甲醇的混合物。
在一些实施方式中，所述氯仿甲醇溶液中的氯仿与甲醇的体积比可以为(1～2.5):1。具体可以为1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1等。
在一些实施方式中，步骤d中，先使用含MgSO4的缓冲液对步骤c得到的沉淀物进行重悬，然后再使用氯仿甲醇溶液对重悬液进行萃取。
在一些实施方式中，所述含MgSO4的缓冲液的pH 7.4～7.8。含MgSO4的缓冲液中，MgSO4浓度可以为1.5mmol/L～2.5mmol/L，Tris浓度可以为45mmol/L～55mmol/L。优选的，每克干菌泥中含MgSO4的缓冲液的使用量为5ml～10ml。
在一些实施方式中，步骤d中使用的所述氯仿甲醇溶液与所述含MgSO4的缓冲液的体积比为1:(1～4)。
优选的，步骤d还包括：使用氯仿甲醇溶液对步骤c得到的沉淀物进行萃取，收集有机相和水相之间的中间相，使用氯仿甲醇溶液对该中间相进行重复萃取，收集有机相。发明人发现，实际上中间相中还含有部分LOS未被分明的萃取至有机相中，通过重复萃取，可提高最终提取出的LOS的产量。重复萃取次数为1～5次，优选为2～4次，最优为3次。
在一些实施方式中，步骤d所述含MgSO4的缓冲液可以为Tris-MgSO4缓冲液。
步骤d所述含MgSO4的缓冲液可替换为纯化水。
在一些实施方式中，步骤e中对所述有机相进行旋转蒸发干燥。优选的，旋转蒸发干燥之后包括对干燥物依次进行加水复溶、透析和真空冷冻干燥的步骤。所述透析孔径可为1K。
本发明实施例还提供一种菌体中寡糖的提取纯化方法，按照上述任一实施例所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法得到脂寡糖，然后对所述脂寡糖进行水解。
在一些实施方式中，对脂寡糖进行水解的方法可以为酸水解。酸水解所用的酸可以为乙酸。具体步骤可以为：将LOS用水溶解成2mg/ml～30mg/ml，加入冰乙酸至乙酸终浓度为0.8％～1.5％，加热水解，调节pH至6.8～7.2终止反应；离心收集上清，用0.45～0.7μm滤器过滤，将滤液真空冷冻干燥获得OS。乙酸水解时间可以为1小时～4小时，优选为2小时。
在一些实施方式中，还包括将水解得到的OS进行纯化的步骤。
纯化方法可以为柱层析。具体可以为：OS加入注射用水溶解，使用层析柱纯化，缓冲液流速2ml/min，收集洗脱液。洗脱液用苯酚硫酸法测化学分布，收取化学分布的第一个峰，合并后透析，用注射用水4-8℃透析2-4天。冻干，获取精制OS。所述层析柱可以为G25、P-4层析柱中的任一种。缓冲液为注射用水或吡啶醋酸溶液(吡啶：醋酸：水4：8：988，pH 4.7)。透析孔径可以为1K。
本发明的提取纯化方法适用的菌体可选自百日咳杆菌、大肠杆菌、副百日咳杆菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌、假单胞菌、奈瑟氏菌、嗜血杆菌或者及其它含有脂多糖或脂寡糖的中的任意一种或多种。
本发明的脂寡糖尤指的是菌体细胞壁上的脂寡糖。
本发明的提取纯化方法得到的寡糖可应用于制备分子佐剂、百日咳疫苗、治疗性产品、动物疫苗等。
以下为具体实施例。
实施例1
百日咳杆菌LOS提取纯化方法，工艺图如图2所示，具体实施步骤如下：
(1)菌体收集及洗涤
取百日咳发酵液离心收集的菌泥100g，加入500ml纯化水，搅拌均匀后离心收集菌体，重复2次；将菌体重悬于300ml的86％乙醇，在52℃水浴下搅拌10min，离心弃上清，重复2次；将菌体重悬于300ml的甲醇，搅拌混匀后离心弃上清，重复2次，获得干菌体45g。
(2)LOS提取及粗纯
干菌中加入体积比5：3异丁酸氨水溶液450ml，分散均匀后搅拌5分钟，离心取上清。异丁酸氨水溶液由异丁酸和浓氨水组成。浓氨水浓度为24％。
上清中加入乙醇，至乙醇终浓度80％，混匀后于2-8℃放置过夜，离心收集沉淀，获得粗纯LOS。
(3)LOS精纯
粗纯LOS中加入Tris-MgSO4缓冲液(含2mmol/L MgSO4，50mmol/L Tris，pH 7.6)315ml，重悬使LOS分散均匀；
重悬粗纯LOS溶液中，加入体积比2：1氯仿甲醇溶液788ml，大力震荡10分钟后离心使其分层，吸取上相并丢弃、分别收集中间层及下相；中间层溶液继续加入Tris-MgSO4缓冲液至315ml，再加入2：1氯仿甲醇溶液788ml进行第二次萃取，收集下相。
合并两次萃取下相，旋转蒸发干燥获得LOS，加水重悬后装入1K透析袋中，用纯化水2-8℃透析2天，每天换水2次。
取透析后溶液真空冷冻干燥，获得精制LOS 330mg。
萃取过程样品和纯化得到的LOS电泳图分别如图7A和图7B所示。
实施例2
百日咳杆菌LOS提取纯化方法，具体实施步骤如下：
(1)菌体收集及洗涤
取百日咳发酵液离心收集的菌泥240g，加入1200ml纯化水，搅拌均匀后离心收集菌体，重复2次；将菌体重悬于600ml的86％乙醇，在52℃水浴下搅拌15min，离心弃上清，重复2次；将菌体重悬于480ml的甲醇，搅拌混匀后离心弃上清，重复2次，获得干菌体96.8g。
(2)LOS提取及粗纯
干菌中加入体积比5：3异丁酸氨水溶液970ml，分散均匀后搅拌5分钟，离心取上清。异丁酸氨水溶液由异丁酸和浓氨水组成。浓氨水浓度为25％。
上清中加入乙醇，至乙醇终浓度80％，混匀后于2-8℃放置过夜，离心收集沉淀，获得粗纯LOS。
(3)LOS精纯
粗纯LOS中加入Tris-MgSO4缓冲液(含2mmol/L MgSO4，50mmol/L Tris，pH 7.6)680ml，重悬使LOS分散均匀；
重悬粗纯LOS溶液中，加入体积比2：1氯仿甲醇溶液1700ml，大力震荡15分钟后离心使其分层，吸取上相并丢弃、分别收集中间层及下相；中间层溶液继续加入Tris-MgSO4缓冲液至680ml，再加入2：1氯仿甲醇溶液1700ml进行第二次萃取，收集下相。
合并两次萃取下相，旋转蒸发干燥获得LOS，加水重悬后装入1K透析袋中，用纯化水2-8℃透析2天，每天换水3次。
取透析后溶液真空冷冻干燥，获得精制LOS 695.2mg。
实施例3
百日咳杆菌LOS提取纯化方法，具体实施步骤如下：
(1)菌体收集及洗涤
取百日咳发酵液离心收集的菌泥400g，加入2000ml纯化水，搅拌均匀后离心收集菌体，重复2次；将菌体重悬于1000ml的86％乙醇，在52℃水浴下搅拌10min，离心弃上清，重复2次；将菌体重悬于800ml的甲醇，搅拌混匀后离心弃上清，重复2次，获得干菌体170g。
(2)LOS提取及粗纯
干菌中加入体积比5：3异丁酸氨水溶液1700ml，分散均匀后搅拌20分钟，离心取上清。异丁酸氨水溶液由异丁酸和浓氨水组成。浓氨水浓度为25％。
上清中加入乙醇，至乙醇终浓度80％，混匀后于2-8℃放置过夜，离心收集沉淀，获得粗纯LOS。
(3)LOS精纯
粗纯LOS中加入Tris-MgSO4缓冲液(含2mmol/L MgSO4，50mmol/L Tris，pH 7.6)1190ml，重悬使LOS分散均匀；
重悬粗纯LOS溶液中，加入体积比2：1氯仿甲醇溶液2975ml，大力震荡20分钟后离心使其分层，吸取上相并丢弃、分别收集中间层及下相；中间层溶液继续加入Tris-MgSO4缓冲液至1190ml，再加入体积比2：1氯仿甲醇溶液2975ml进行第二次萃取，分别收集下相及中间层；中间层继续重复萃取一次，收集下相。
合并三次萃取下相，旋转蒸发干燥获得LOS，加水重悬后装入1K透析袋中，用纯化水2-8℃透析2天，每天换水3次。
取透析后溶液真空冷冻干燥，获得精制LOS 1582.8mg。
实施例4
OS提取纯化方法，工艺图如图3所示，具体实施步骤如下：
称取200mg实施例1提取纯化方法得到的纯化LOS，加入40ml纯化水溶解LOS，加入400μl冰乙酸至乙酸终浓度1％，100℃水解2h。
离心收集上清，加入0.5M氢氧化钠调节pH至7.0，离心收集上清，冻干获得粗制OS。
用吡啶醋酸溶液(吡啶：醋酸：水4：8：988，pH 4.7)将OS溶解至10mg/ml，使用P-4层析柱，缓冲液为吡啶醋酸溶液，流速1ml/min，收集洗脱液。洗脱液用苯酚硫酸法测化学分布，收取化学分布的第一个峰，合并后透析，用注射用水4-8℃透析3天，每天换水2次。取透析液冻干，获取精制OS 36.5mg，收率为18.2％。
实施例1得到的LOS和实施例4得到的OS的对流免疫电泳结果分别如图8A和图8B所示。结果显示纯化产物LOS及OS均和百日咳免疫血清有沉淀反应。OS核磁图谱和标准物质一致，如图9所示。
实施例5
OS提取纯化方法，具体实施步骤如下：
称取1500mg实施例1提取纯化方法得到的纯化LOS，加入300ml纯化水溶解LOS，加入3ml冰乙酸至乙酸终浓度1％，100℃水解2h。
离心收集上清，加入0.5M氢氧化钠调节pH至7.19，离心收集上清，冻干获得粗制OS。
用注射用水将OS溶解至10mg/ml，使用G25层析柱，缓冲液为注射用水，流速2ml/min，收集洗脱液。洗脱液用苯酚硫酸法测化学分布，收取化学分布的第一个峰，合并后透析，用注射用水4-8℃透析2天，每天换水2次。取透析液冻干，获取精制OS 290mg，收率为19.3％。
实施例1～5的纯化LOS及精制OS杂质含量结果如表1所示。获得了纯度较高的LOS及OS，LOS中杂质蛋白含量小于5.3％，核酸含量小于6.7％，精制OS中杂质蛋白含量小于2.1％，核酸含量小于0.7％，细菌内毒素含量小于3EU/mg。
表1纯化LOS及精制OS杂质含量
| 样品 | 蛋白含量(％) | 核酸含量(％) | 内毒素含量EU/mg |
| 实施例1 LOS-1 | 5.3 | 2.98 | / |
| 实施例2 LOS-2 | 4.3 | 6.7 | / |
| 实施例3 LOS-3 | 4.5 | 6 | / |
| 实施例4 OS-1 | 2.08 | 0.71 | 0.991 |
| 实施例5 OS-2 | 0.8 | 0.3 | 2.999 |
对比例1
对比例1与实施例1基本相同，区别仅在于异丁酸氨水溶液中的氨水为1M稀氨水。
百日咳杆菌LOS提取纯化方法，具体实施步骤如下：
(1)菌体收集及洗涤
取与实施例1同批次的百日咳发酵液离心收集的菌泥100g，加入500ml纯化水，搅拌均匀后离心收集菌体，重复2次；将菌体重悬于300ml的86％乙醇，在52℃水浴下搅拌10min，离心弃上清，重复2次；将菌体重悬于300ml的甲醇，搅拌混匀后离心弃上清，重复2次，获得干菌体45g。
(2)LOS提取及粗纯
干菌中加入体积比5：3异丁酸氨水溶液450ml，分散均匀后搅拌5分钟，离心取上清。异丁酸氨水溶液由异丁酸和1M氨水组成。
上清中加入乙醇，至乙醇终浓度80％，混匀后于2-8℃放置过夜，离心收集沉淀，获得粗纯LOS。
实施例1和对比例1提取的粗纯LOS的电泳对比图如图4所示。
对比例2
对比例2与实施例1基本相同，区别仅在于异丁酸氨水溶液中异丁酸与浓氨水体积比不同。
百日咳杆菌LOS提取纯化方法，具体实施步骤如下：
(1)菌体收集及洗涤
取与实施例1同批次的百日咳发酵液离心收集的菌泥100g，加入500ml纯化水，搅拌均匀后离心收集菌体，重复2次；将菌体重悬于300ml的86％乙醇，在52℃水浴下搅拌10min，离心弃上清，重复2次；将菌体重悬于300ml的甲醇，搅拌混匀后离心弃上清，重复2次，获得干菌体45g。
(2)LOS提取及粗纯
分别取9g干菌体，加入90ml异丁酸氨水，其中异丁酸氨水的体积比分别为3：5、4：4、5：3、6：2、7：1，分散均匀后搅拌5分钟，离心取上清。异丁酸氨水溶液由异丁酸和25％氨水组成。
上清中加入乙醇，至乙醇终浓度80％，混匀后于2-8℃放置过夜，离心收集沉淀，获得粗纯LOS。
实施例1和对比例2提取的粗纯LOS的电泳对比图如图5所示。
对比例3
对比例3与实施例1基本相同，区别仅在于氯仿甲醇溶液中氯仿与甲醇体积比不同。
百日咳杆菌LOS提取纯化方法，具体实施步骤如下：
(1)菌体收集及洗涤
取与实施例1同批次的百日咳发酵液离心收集的菌泥100g，加入500ml纯化水，搅拌均匀后离心收集菌体，重复2次；将菌体重悬于300ml的86％乙醇，在52℃水浴下搅拌10min，离心弃上清，重复2次；将菌体重悬于300ml的甲醇，搅拌混匀后离心弃上清，重复2次，获得干菌体45g。
(2)LOS提取及粗纯
干菌中加入体积比5：3异丁酸氨水溶液450ml，分散均匀后搅拌5分钟，离心取上清。异丁酸氨水溶液由异丁酸和25％氨水组成。
上清中加入乙醇，至乙醇终浓度80％，混匀后于2-8℃放置过夜，离心收集沉淀，获得粗纯LOS。
(3)LOS精纯
粗纯LOS中加入Tris-MgSO4缓冲液(含2mmol/L MgSO4，50mmol/L Tris，pH 7.6)315ml，重悬使LOS分散均匀；
将重悬LOS溶液等分为63ml，分别加入体积比为5：1、3：2：1、1：1、1：2的氯仿甲醇溶液158ml，大力震荡10分钟后离心使其分层，分别吸取上相并丢弃、分别收集中间层及下相；分别对中间层溶液继续加入Tris-MgSO4缓冲液至63ml，再分别加入体积比为5：1、3：2：1、1：1、1：2的氯仿甲醇溶液158ml进行第二次萃取，收集下相。
分别合并不同萃取剂两次萃取下相，旋转蒸发干燥获得LOS。
实施例1和对比例3提取的纯化LOS的电泳对比图如图6所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.一种菌体中脂寡糖的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、收集干菌泥；
b、将所述干菌泥与异丁酸氨水溶液混合，离心，收集上清液，所述异丁酸氨水溶液为异丁酸和浓氨水的混合物，所述浓氨水的质量浓度为22％～28％，所述异丁酸氨水溶液中的所述异丁酸与所述浓氨水的体积比为(4～6):3；
c、将步骤b得到的上清液与乙醇混合，静置，离心，收集沉淀物；
d、使用氯仿甲醇溶液对步骤c得到的沉淀物进行萃取，收集有机相；
e、对步骤d得到的有机相进行干燥；
所述氯仿甲醇溶液中的氯仿与甲醇的体积比为(1～2.5):1；
步骤b中，每克干菌泥中添加所述异丁酸氨水溶液8mL～12mL。
2.根据权利要求1所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤c中上清液与乙醇的混合物中乙醇的浓度为(75～85)mL/100mL。
3.根据权利要求1所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤d中，先使用含MgSO4的缓冲液对步骤c得到的沉淀物进行重悬，然后再使用氯仿甲醇溶液对重悬液进行萃取。
4.根据权利要求3所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法，其特征在于，所述含MgSO4的缓冲液的pH 7.4～7.8，MgSO4浓度为1.5mmol/L～2.5mmol/L。
5.根据权利要求4所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法，其特征在于，每克干菌泥中所述含MgSO4的缓冲液的使用量为5mL～10mL。
6.根据权利要求5所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤d中使用的所述氯仿甲醇溶液与所述含MgSO4的缓冲液的体积比为1:(1～4)。
7.根据权利要求1所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤e中对所述有机相进行旋转蒸发干燥。
8.根据权利要求7所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法，其特征在于，旋转蒸发干燥之后包括对干燥物依次进行加水复溶、透析和真空冷冻干燥的步骤。
9.根据权利要求1所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤a包括：
a1、离心发酵液收集菌体；
a2、纯化水与菌体混匀，离心收集菌泥；
a3、将a2所得菌泥与乙醇混合，离心收集菌泥；
a4、将a3所得菌泥与甲醇混合，离心收集干菌泥。
10.根据权利要求1～9任一项所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法，其特征在于，所述菌体选自百日咳杆菌、大肠杆菌、副百日咳杆菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌、假单胞菌、奈瑟氏菌、嗜血杆菌中的任意一种或多种。
11.一种菌体中寡糖的提取纯化方法，其特征在于，按照权利要求1～10任一项所述的菌体中脂寡糖的提取纯化方法得到脂寡糖，然后对所述脂寡糖进行水解及纯化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110119637.2A CN112898443B (zh) | 2021-01-28 | 2021-01-28 | 菌体中脂寡糖和寡糖的提取纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110119637.2A CN112898443B (zh) | 2021-01-28 | 2021-01-28 | 菌体中脂寡糖和寡糖的提取纯化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112898443A CN112898443A (zh) | 2021-06-04 |
| CN112898443B true CN112898443B (zh) | 2022-11-04 |
Family
ID=76119766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110119637.2A Active CN112898443B (zh) | 2021-01-28 | 2021-01-28 | 菌体中脂寡糖和寡糖的提取纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112898443B (zh) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2848223B1 (fr) * | 2002-12-09 | 2005-02-25 | Centre Nat Rech Scient | Nouveau procede d'isolement des endotoxines. |
-
2021
- 2021-01-28 CN CN202110119637.2A patent/CN112898443B/zh active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Micromethods for Isolation and Structural Characterization of Lipid A, and Polysaccharide Regions of Bacterial Lipopolysaccharides;Alexey Novikov等;《Microbial Toxins》;20170507;第167-186页 * |
| Nico Marr等.Variability in the Lipooligosaccharide Structure and Endotoxicity among Bordetella pertussis Strains.《The Journal of Infectious Diseases》.2010,第202卷(第12期),第1897-1906页. * |
| Variability in the Lipooligosaccharide Structure and Endotoxicity among Bordetella pertussis Strains;Nico Marr等;《The Journal of Infectious Diseases》;20101104;第202卷(第12期);第1897-1906页 * |
| 百日咳鲍特菌脂寡糖的制备及寡糖结合物在小鼠体内免疫原性研究;李鑫等;《微生物学免疫学进展》;20180911;第46卷(第5期);第21-27页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112898443A (zh) | 2021-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113234770B (zh) | 脆弱拟杆菌荚膜多糖a的制备方法 | |
| US4271147A (en) | Process for the isolation of membrane proteins from Neisseria meningitidis and vaccines containing same | |
| Gmeiner | The isolation of two different lipopolysaccharide fractions from various Proteus mirabilis strains | |
| CN100540676C (zh) | 一种大孔树脂用于细菌多糖中内毒素去除的方法 | |
| Shinagawa et al. | Isolation and characterization of a leptospiral type-specific antigen | |
| US3976544A (en) | Water-soluble immunological adjuvants, in particular for vaccines, obtained from mycobacteria and related microorganisms and process for their extraction | |
| CA1103155A (fr) | Vaccins acellulaires perfectionnes contenant des polysaccharides capsulaires | |
| EP0333243A2 (en) | Sulphated K5 antigen and sulphated K5 antigen fragments | |
| CN112898443B (zh) | 菌体中脂寡糖和寡糖的提取纯化方法 | |
| CN115028750A (zh) | 泡叶藻岩藻多糖及其制备方法和应用 | |
| CN112724270B (zh) | 一种低分子量苜蓿多糖及其制备方法与调节肠道菌群的应用 | |
| CN111887341A (zh) | 一种提取分离纯化神秘果素的方法 | |
| CN117304360A (zh) | 一种荔枝多糖及其制备方法和应用及含有其酸奶的制备方法 | |
| CN113604522B (zh) | 产胞外多糖的青霉菌d306菌株及其在制备胆汁酸结合剂中的应用 | |
| CN117180412A (zh) | 一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗及其制备方法 | |
| CN107236054A (zh) | 一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法及应用 | |
| CN116041560B (zh) | 一种规模化制备类志贺邻单胞菌特异性多糖的方法 | |
| CN112552418A (zh) | 从红曲霉发酵液中提取分离粗多糖的方法 | |
| RU2051969C1 (ru) | Способ получения бактериальных липополисахаридов | |
| CN111718428A (zh) | 一种利用铁皮石斛发酵液制备水溶性多糖的方法 | |
| RU2412197C2 (ru) | Полимерный фрагмент пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий, способ его получения и его применение в качестве иммуностимулятора | |
| KR950002869B1 (ko) | 세균으로부터 생체활성다당체를 분리 제조하는 방법 | |
| RU2478644C2 (ru) | Способ производства фармакологически приемлемой смеси веществ, содержащей низкомолекулярные компоненты пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий и обладающей иммуностимулирующей активностью | |
| CN111378054B (zh) | 一种痢疾杆菌特异性多糖纯化方法 | |
| US11219843B2 (en) | Extraction of animal-derived pulmonary surfactants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |