CN112680387B

CN112680387B - 一种发酵产放线菌素d的锈赤蜡黄链霉菌株及其应用

Info

Publication number: CN112680387B
Application number: CN202110150963.XA
Authority: CN
Inventors: 张祝兰; 杨煌建; 严凌斌; 连云阳; 陈洲琴; 程贤
Original assignee: Fujian Institute of Microbiology
Current assignee: Fujian Institute of Microbiology
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN112680387A

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种发酵产放线菌素D的锈赤蜡黄链霉菌诱变菌株，并进一步公开其发酵生产放线菌素D的应用。本发明通过常压室温等离子体诱变技术筛选得到一株高产放线菌素D的锈赤蜡黄链霉菌FIM‑Z19‑12(Streptomyces rubiginosohelvolus)，该菌株能够高效发酵放线菌素D，在发酵实验中，所述锈赤蜡黄链霉菌FIM‑Z19‑12发酵产放线菌素D的效价高达1383mg/L，大幅度提高了放线菌素D的产量，能够应用于工业化发酵生产。

Description

一种发酵产放线菌素D的锈赤蜡黄链霉菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种发酵产放线菌素D的锈赤蜡黄链霉菌株，并进一步公开其发酵生产放线菌素D的应用。

背景技术

放线菌素D(ActinomycinD，AMD，更生霉素)最早就是从放线菌S.melanochromogenesNo.1779或者S.Parvullus中分离得到的，属于放线菌素家族的一员，这类化合物由多种链霉菌属的微生物产生。放线菌素D是一种色素肽内酯抗生素，系经典的抗肿瘤药物之一，具有良好的抗肿瘤功效，且与其他抗肿瘤药物联合用药，配合放射治疗肿瘤可取得良好的效果。放线菌素D的抗癌作用可能与其色基结构有较为密切的关系，而环肽部分可能起一种载体的作用，其独特的环肽化学结构、抑制RNA合成的抗肿瘤机理，以及不易与其他化疗药物产生交叉耐药性的特点是化疗药物难得的优点。因此，近年来对放线菌素D的研究一直非常活跃，不断发现新的靶点和抗肿瘤作用的新机制，对放线菌素D不同来源的产生菌的研究、结构改造及低毒高效抗肿瘤活性的类似物筛选也成为开发者的新关注点。

目前，常用的菌种选育技术(strain improvement)根据其原理可分成随机选育(random screening)和理性选育(rationalized selection)两大类。虽然以分子生物学为基础的基因工程、代谢工程以及由各种组学组成的系统生物学研究为定向构建功能细胞株提供了广阔前景，但要真正实现以这些功能细胞培养来达到改造目标却极其困难。由于微生物体内代谢网络的复杂性和多结点性，基因操作后菌株的代谢流往往并不朝着预期设计的方向转移。尤其是在产生抗生素等次级代谢产物的复杂体系中，要想得到优良的工业生产菌株，主要还是采用随机选育技术。长期以来针对锈赤蜡黄链霉菌(Streptomycesrubiginosohelvolus)菌株改良的随机选育技术中主要采用的是紫外、微波和化学诱变剂等传统的诱变育种手段，且已取得一定的效果，然而长期使用这些诱变剂处理同一菌种，由于突变的不定向性及突变的累积使得在获得高产的同时菌株在生活能力、产孢量等方面会明显减弱，并且多次诱变往往导致较高的负突变率和抗性饱和，从而使得菌株改善的空间不足。

常压室温等离子体育种技术(ARTP)是一种微生物基因组快速突变技术，其产生的等离子体富含各种化学活性粒子，对菌株细胞产生遗传物质的损伤、引起细胞膜通透性和蛋白质结构的改变等多重作用，并诱导细胞启动SOS修复机制，在修复过程中产生种类丰富的错配位点，该方法突变率高，已在多种工业微生物的菌种选育中得到成功运用。因此，如何筛选获得符合工业化生产且能够高产放线菌素D的菌株对于放线菌素D的工业化生产及应用具有积极的意义。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种发酵产放线菌素D的锈赤蜡黄链霉菌诱变菌株，以解决现有技术中放线菌素D的发酵菌株性能不理想的问题；

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供所述锈赤蜡黄链霉菌诱变菌株发酵生产放线菌素D的应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种锈赤蜡黄链霉菌株，其分类命名为Streptomyces rubiginosohelvolus FIM-Z19-12，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5 楼，保藏编号为GDMCCNo.61323，保藏日期为2020年12月2日。

本发明还公开了所述锈赤蜡黄链霉菌株在发酵生产放线菌素D中的应用。

本发明还公开了一种发酵生产放线菌素D的方法，包括将所述锈赤蜡黄链霉菌株接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养。

具体的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2-3％，黄豆粉3-4％，蛋白胨0.1-1％，玉米粉0.5-1.5％，磷酸氢二钾0.01-0.1％，调pH7.0-7.2。

优选的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.5％，黄豆粉3.5％，蛋白胨0.5％，玉米粉1.0％，磷酸氢二钾0.05％，余量为蒸馏水，调pH7.0-7.2。

具体的，所述发酵培养的条件包括：控制转速150-300rpm，于28-32℃进行发酵培养3-5d。

具体的，所述的发酵生产放线菌素D的方法，还包括将所述锈赤蜡黄链霉菌株接种于种子培养基中进行种子液培养；

所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2-3％，葡萄糖 0.1-1％，黄豆粉0.5-1.5％，蛋白胨0.1-1％，酵母膏0.1-0.5％，调pH7.0-7.2。

优选的，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.5％，葡萄糖0.5％，黄豆粉1.0％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.3％，调pH 7.0-7.2。

具体的，所述种子液培养的条件包括：控制转速180-300rpm，于28-32℃进行种子液培养40-60h。

具体的，所述的发酵生产放线菌素D的方法，还包括将所述锈赤蜡黄链霉菌株接种于斜面培养基中进行活化的步骤；

所述斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉0.5-1.5％，葡萄糖0.5-1.5％，硫酸镁0.01-0.1％，硝酸钾0.05-0.15％，磷酸氢二钾0.01-0.1％，琼脂2.0％，调pH7.0-7.2。

优选的，所述斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.0％，葡萄糖1.0％，硫酸镁0.05％，硝酸钾0.1％，磷酸氢二钾0.05％，琼脂2.0％，调pH7.0-7.2。

具体的，所述斜面培养基活化步骤的条件包括：于25-30℃进行恒温培养8-12d。

本发明通过常压室温等离子体诱变技术筛选得到一株高产放线菌素D 的锈赤蜡黄链霉菌FIM-Z19-12(Streptomyces rubiginosohelvolus)，该菌株能够高效发酵放线菌素D，在发酵实验中，所述锈赤蜡黄链霉菌 FIM-Z19-12发酵产放线菌素D的效价高达1383mg/L，大幅度提高了放线菌素D的产量，能够应用于工业化发酵生产；且本发明筛选的菌株 FIM-Z19-12稳定性良好，连续传代五代其产放线菌素D效价基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为诱变实验中ARTP射流时间与致死率的关系曲线；

图2为本发明所述菌株FIM-Z19-12的进化树。

具体实施方式

本发明下述实施例中，涉及的培养基包括：

分离平板培养基、斜面培养基及平板培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.0％，葡萄糖1.0％，硫酸镁0.05％，硝酸钾0.1％，磷酸氢二钾0.05％，琼脂2.0％，余量为蒸馏水，调pH7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌 30min；

种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.5％，葡萄糖0.5％，黄豆粉1.0％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.3％，余量为蒸馏水，调pH7.0-7.2， 121℃高压蒸汽灭菌30min；

发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.5％，黄豆粉3.5％，蛋白胨0.5％，玉米粉1.0％，磷酸氢二钾0.05％，余量为蒸馏水，调pH7.0-7.2， 121℃高压蒸汽灭菌30min。

本发明下述实施例中，所述放线菌素D含量的检测采用HPLC法进行检测，具体检测方法参照中国专利CN105254712B中记载的方法。

实施例1出发菌株FIM-Z19的分离

于山东省济南市泰山脚下菜园采集土壤，具体地，用取样铲将表层10cm 左右的浮土除去，采集10cm处土样10g-25g；称取2g土样并加入10mL无菌生理盐水，振荡后静置30min，取上清液即原液并用无菌生理盐水进行梯度稀释，选用稀释度为10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的悬浮液。

分别取原液及选用的悬浮液0.1mL涂布于添加50mg/L重铬酸钾的水配制的分离琼脂培养基平板上，每个样重复3个平行板，然后将涂布后的平板置于28℃培养，观察菌落外观、大小、颜色、边缘形状、表面干湿状态等形态特征。

在无菌操作条件下，培养8-12d后挑出菌落圆形、菌落中心突起、表面皱褶、白色或微黄等具有代表性的单菌落，并划线接种于分离琼脂培养基斜面，置于28℃条件下培养，分离纯化得到菌株，并将得到的菌株命名为菌株FIM-Z19，然后于-80℃条件下，将分离获得的菌株FIM-Z19以20％甘油保存。

实施例2诱变菌株FIM-Z19-12的获得

取上述筛选的菌株FIM-Z19并转接至斜面培养基上，并于恒温培养箱中培养8-12天，且培养温度为28℃；之后用生理盐水洗下斜面培养基上的孢子，玻璃珠打散，经纱布过滤，制成10⁶个/mL的孢子悬液。

用移液枪吸取10μL上述制得的孢子悬液于直径为1cm的圆形铁片上，置于以氦气作为工作气体、电源功率为110W、工作气流量10L/min的常压室温等离子体诱变系统中，且处理距离为2mm，分别处理5s、10s、15s、 30s、45s、60s、75s、90s，将处理后的孢子悬液进行梯度稀释涂平板，制作致死率曲线(如图1所示)。从图中可以看出，诱变处理剂量与菌株FIM-Z19菌株致死率之间存在明显的剂量效应关系，随着处理时间的延长，致死率逐渐升高。

根据上述致死率曲线，选择10s、30s及60s三个不同致死剂量的照射时间，对菌株FIM-Z19的孢子悬液进行等离子体诱变，并将前述三个不同处理时间的孢子悬液混合于装有生理盐水的试管中，混合均匀，得诱变孢子悬液，备用。

取上述孢子悬液，并分别涂布于含链霉素的平板培养基中，其中，控制平板培养基中链霉素浓度(μg/mL)分别为5mg/L、10mg/L、25mg/L、 50mg/L、100mg/L、200mg/L；于30℃培养8-10d后，观察不同平板上的菌落生长情况，观察结果如下表1所示。可见，未长出菌落的平板培养基中对应链霉素最低作用浓度为抗链霉素最小抑菌浓度(MIC)，则由表1中结果可确定，抗链霉素MIC为50mg/L，以此为致死抗性突变标志；

表1链霉素对FIM-Z19菌株孢子致死浓度测定

链霉素(mg/L)	5	10	25	50	100	200
							菌落生长情况	++	++	+	-	-	-

注:+有菌落生长,-无菌落生长

将上述所得诱变孢子悬液进行梯度稀释，稀释度分别控制为10^-1、 10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，选取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的孢子悬液，分别涂布于含50mg/L链霉素的抗性平板上，于28℃避光培养8-12d。

将制得的各个抗性平板上长出的单菌落转接斜面培养基上培养10天后，以1％的接种量接种于种子培养基中，于30℃、230r/min条件下培养 45-50h后得种子液；以10％的接种量将种子液接种于发酵培养基中，于 30℃、230r/min条件下培养3-6d，得发酵液。

取所得发酵液适量，加入两倍体积的无水乙醇，即发酵液与无水乙醇的体积比为1：2，充分振荡、静置、4000r/min离心10min，上清液过有机滤膜后，利用高效液相色谱法测定放线菌素D的产量，并确定本实施例发酵液中产物的结构正确。

通过此方法即筛选出放线菌素D产量最大的菌株，为了方便描述，将筛选所得的菌株命名为菌株FIM-Z19-12，且菌株FIM-Z19-12于甘油中保存。

实施例3诱变菌株FIM-Z19-12的鉴定

生理生化特性鉴定

将获得的菌株FIM-Z19-12在分离培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片，30℃培养7-20d，用光学显微镜、透射和扫描电子显微镜观察单菌落的形态特征及其菌丝。

得到该菌株FIM-Z19的主要形态及生理生化特性如下：平板菌落圆形，中心突起，表面皱褶，气生菌丝白色或微黄，基内菌丝为浅黄色，产可溶性黄或红褐色素；明胶液化，牛奶凝固后胨化，淀粉水解，纤维素上生长好，硝酸盐还原，可利用葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇，不利用蔗糖、棉子糖、肌醇。此菌株为高耗氧菌，最适生长温度为 28-32℃，最适生长pH为7.0-8.0；在摇床转速为230-280r/min，培养3-5d 时，放线菌素D产量最高，发酵过程中溶氧对放线菌素D的产生具有显著作用。

分子生物学鉴定

对诱变菌株FIM-Z19-12的16SrDNA序列进行测序，并将所测的菌株的16SrDNA序列与GenBank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在LPSN(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株16SrDNA 基因序列，系统进化分析用CLUSTAL-X软件进行比对，生成的比对文件用MEGA软件邻接法进行系统进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果，菌株FIM-Z19-12的进化树如图2所示。通过16SrDNA序列分析表明，菌株FIM-Z19-12与锈赤蜡黄链霉菌(Streptomyces rubiginosohelvolus) 的序列同源性为99.25％。

综合上述形态、生理生化特征与分子生物学鉴定，可确定该菌株 FIM-Z19-12属于锈赤蜡黄链霉菌(Streptomyces rubiginosohelvolus)菌属，其分类命名为Streptomycesrubiginosohelvolus FIM-Z19-12，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼，保藏编号为GDMCC No.61323，保藏日期为2020年12月2日。

实施例4诱变菌株FIM-Z19-12发酵生产放线菌素D

菌株FIM-Z19-12的活化：将采用甘油保存的菌株FIM-Z19-12转接至斜面培养基上，并于恒温培养箱中培养8-12d，且培养温度为28℃。

制备种子液：将上述菌株FIM-Z19-12活化所得的单菌落接种于种子培养基(500mL三角瓶内装60mL种子培养基)中，于30℃、250r/min条件下培养40-60h，得种子液。

发酵培养：将上述制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基 (500mL三角瓶内装60mL发酵培养基)中，于30℃、250r/min条件下发酵培养4d，之后将所得发酵液进行检测。

检测结果显示，三批次菌株FIM-Z19-12摇瓶发酵放线菌素D的产量，分别为1362μg/mL、1308μg/mL及1350mg/L。

实施例5诱变菌株FIM-Z19-12的遗传稳定性验证

将上述筛选的高产放线菌素D的菌株FIM-Z19-12进行500mL摇瓶连续培养3-5代，以检测其遗传稳定性，菌株传代发酵实验结果如下：

对高产抗性菌株FIM-Z19-12连续传代6次：F1、F2、F3、F4、F5、F6，经摇瓶发酵后测定发酵效价，以生长良好的原代菌株(F0)为对照，其相对效价为100％，结果见如下表2。

表2传代对菌株FIM-Z19-12产放线菌素D的影响

菌株代数	F1	F2	F3	F4	F5	F6
							相对效价(％)	100	100.2	101.3	99.8	98.5	94.3

由表2数据可知，本发明筛选的菌株FIM-Z19-12传五代发酵水平无明显影响，其放线菌素D效价基本稳定，可维持在同一较高水平；从而表明菌株FIM-Z19-12具有较好的遗传稳定特性，目标菌种即菌株FIM-Z19-12 产放线菌素D水平最终维持在1308mg/L以上。因此，所述诱变菌株锈赤蜡黄链霉菌FIM-Z19-12(Streptomyces rubiginosohelvolus)能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

实施例6不同诱变菌株发酵性能差异

申请人在先研究中，基于微波诱变结合抗性突变方法对适宜发酵放线菌素D的锈赤蜡黄链霉菌FIM-N31进行诱变筛选，其中，诱变菌株Str186 的相对发酵效价最优。

本实施例基于在先筛选的诱变菌株Str186和本发明筛选的诱变菌株锈赤蜡黄链霉菌FIM-Z19-12，按照前述实施例4中发酵方式进行发酵效果的验证，测试3批次发酵液中放线菌素D的发酵效价(μg/mL)结果见下表3 所示，证明本发明的诱变菌株发酵能力更优，能够发酵高产放线菌素D。

表3不同诱变菌株发酵性能差异(n＝3)

批次	1	2	3	平均(μg/mL)
					Str186效价	547	498	532	525.7±25.1
FIM-Z19-12效价	1358	1325	1343	1342.0±16.5

实施例7诱变菌株FIM-Z19-12罐上发酵生产放线菌素D

摇瓶种子培养：将上述菌株FIM-Z19-12菌苔接种于种子培养基 (1000mL三角瓶内装250mL种子培养基)中，于30℃、200r/min条件下培养48h，得摇瓶种子液。

种子罐种子培养：将摇瓶种子液按0.5％量接种于种子培养基(100L罐内装70L种子培养基)中，于培养温度30℃、罐压0.05MPa、空气流量 1:1vvm、搅拌速度为200r/min条件下培养48h，得种子罐种子液。

发酵罐发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(1吨罐内装700L发酵培养基)中，于培养温度30℃、罐压0.05MPa、空气流量1：0.8-1.8vvm、搅拌速度为150-250r/min，发酵培养72h，将放罐所得发酵液进行检测。

检测结果显示，三批发酵生产放线菌素D的产量分别为1369μg/mL、 1383μg/mL及1352μg/mL，进一步证明了本发明筛选菌株可以高效发酵放线菌素D。

可见，本发明基于常压室温等离子体育种技术筛选所得诱变菌株，其发酵性能更优，能够发酵高产放线菌素D，发酵效价高达1383mg/L，大幅度提高了放线菌素D的产量，能够应用于工业化发酵生产；且该菌株 FIM-Z19-12稳定性良好，连续传代五代其产放线菌素D效价基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种锈赤蜡黄链霉菌株，其分类命名为Streptomyces rubiginosohelvolus FIM-Z19-12，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61323，保藏日期为2020年12月2日。

2.权利要求1所述锈赤蜡黄链霉菌株在发酵生产放线菌素D中的应用。

3.一种发酵生产放线菌素D的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述锈赤蜡黄链霉菌株接种于斜面培养基中进行活化的步骤、接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤、以及接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤；

所述斜面培养基由如下质量含量的组分组成：可溶性淀粉0.5-1.5%，葡萄糖0.5-1.5%，硫酸镁0.01-0.1%，硝酸钾0.05-0.15%，磷酸氢二钾0.01-0.1%，琼脂2.0%，余量为水，调pH7.0-7.2；

所述种子培养基由如下质量含量的组分组成：可溶性淀粉2-3%，葡萄糖0.1-1%，黄豆粉0.5-1.5%，蛋白胨0.1-1%，酵母膏0.1-0.5%，余量为水，调pH7.0-7.2；

所述发酵培养基由如下质量含量的组分组成：可溶性淀粉2-3%，黄豆粉3-4%，蛋白胨0.1-1%，玉米粉0.5-1.5%，磷酸氢二钾0.01-0.1%，余量为水，调pH7.0-7.2。

4.根据权利要求3所述的发酵生产放线菌素D的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件包括：控制转速150-300rpm，于28-32℃进行发酵培养3-5d。

5.根据权利要求4所述的发酵生产放线菌素D的方法，其特征在于，所述种子液培养的条件包括：控制转速180-300rpm，于28-32℃进行种子液培养40-60h。

6.根据权利要求4或5所述的发酵生产放线菌素D的方法，其特征在于，所述斜面培养基活化步骤的条件包括：于25-30℃进行恒温培养8-12d。