CN108410775B - 一株高产维生素k2（mk-7）的纳豆芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株高产维生素k2（mk-7）的纳豆芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108410775B CN108410775B CN201810392873.XA CN201810392873A CN108410775B CN 108410775 B CN108410775 B CN 108410775B CN 201810392873 A CN201810392873 A CN 201810392873A CN 108410775 B CN108410775 B CN 108410775B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus subtilis
- subtilis natto
- natto
- vitamin
- production
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- PFRQBZFETXBLTP-UHFFFAOYSA-N Vitamin K2 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 PFRQBZFETXBLTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 59
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims abstract description 49
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 49
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 title claims description 37
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 title claims description 37
- DKHGMERMDICWDU-GHDNBGIDSA-N menaquinone-4 Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 DKHGMERMDICWDU-GHDNBGIDSA-N 0.000 title claims description 35
- 239000011700 menaquinone-7 Substances 0.000 title abstract 4
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 claims abstract description 38
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 33
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 2
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 claims 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 abstract description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- PFRQBZFETXBLTP-RCIYGOBDSA-N 2-[(2e,6e,10e,14e,18e)-3,7,11,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaen-1-yl]-3-methyl-1,4-dihydronaphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 PFRQBZFETXBLTP-RCIYGOBDSA-N 0.000 abstract 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 15
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical group CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- VOJUXHHACRXLTD-UHFFFAOYSA-N 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid Chemical compound C1=CC=CC2=C(O)C(C(=O)O)=CC(O)=C21 VOJUXHHACRXLTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 2-methyl-3-[(2e,6e,10e,14e)-3,7,11,15,19-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaenyl]naphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 2
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- VOJUXHHACRXLTD-UHFFFAOYSA-M 1,4-dihydroxy-2-naphthoate Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC(C([O-])=O)=C(O)C2=C1 VOJUXHHACRXLTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010065780 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteridine pyrophosphokinase Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N Menaquinone 1 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 ABSPRNADVQNDOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013494 PH determination Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N aldehydo-D-xylose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 108010089355 dihydroneopterin aldolase Proteins 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRASJONUBLZVQX-UHFFFAOYSA-N naphthoquinone group Chemical group C1(C=CC(C2=CC=CC=C12)=O)=O FRASJONUBLZVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940086319 nattokinase Drugs 0.000 description 1
- 108010073682 nattokinase Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019175 phylloquinone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011772 phylloquinone Substances 0.000 description 1
- MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N phylloquinone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 MBWXNTAXLNYFJB-NKFFZRIASA-N 0.000 description 1
- 229960001898 phytomenadione Drugs 0.000 description 1
- 108700022290 poly(gamma-glutamic acid) Proteins 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一株高产维生素K2(MK‑7)的纳豆芽孢杆菌及其应用，属于微生物领域。本发明的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND‑1‑A27于2018年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2018131。大幅度提高了维生素K2(MK‑7)的产量，产量约达70mg/L，并且仅需要3天即可达到最大产量，大大缩短了发酵周期，节约时间成本，能够应用于工业化发酵生产且该菌株遗传稳定性良好，连续传代5代其产维生素K2(MK‑7)产量基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一株高产维生素K2(MK-7)的纳豆芽孢杆菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术
维生素K2(menaquinone，MK)是一种脂溶性维生素，具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物，是人体中不可缺少的重要维生素之一。维生素K2为甲萘醌类系列化合物，淡黄色晶体，根据其分子结构上C－3位异戊二烯侧链的长短不同共有14种形式，以MK-n表示指侧链上异戊二烯单位的个数)，其中MK-7(天然维生素K2)生物活性最为显著。
目前维生素K2(MK-7)主要以化学合成为主，但传统化学合成法存在化学前体原料来源限制、化学反应产生大量异构体、副产物多、产率低、带来环境污染等问题，且合成的维生素K2，其异戊二烯侧链多是顺式结构，活性较低。而活性最高的多是发酵法制得。因此，微生物发酵法制备维生素K2越来越受到欢迎，采用微生物发酵法来进行维生素的工业化生产的最大优点是：能够大大简化生产工序并改善劳动条件、减少环境污染、同时也有利于资源开发和综合利用。但是现有菌株发酵生产维生素K2的产量相对较低，发酵水平相对较低，从而导致成本过高。这是是限制发酵生产维生素K2发展的一个主要原因。另外，目前菌株发酵生产维生素K2的发酵周期也都较长，需要6天以上，时间成本较大。因此，选育高产菌株，研究菌株特性及发酵行为，对于提高发酵生产维生素K2的生产性能，具有重要科学价值。
目前一种新型高效的物理诱变方法——氦气常压室温等离子体诱变育种技术广泛应用于菌株的诱变选育。以高纯氦气为工作气体，在常温常压状态下产生高能量的等离子体，其富含的高能化学活性粒子能够对菌株产生高强度遗传物质损失，进而利用细胞启动的SOS高容错率修复机制，产生种类多样的错配位点，最终形成了遗传稳定、种类丰富的突变株。因此将其运用到维生素K2生产菌株的诱变选育之中具有重要价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种生物发酵高产维生素K2(MK-7)的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)的诱变菌株，以及利用该菌株发酵生产维生素K2(MK-7)的方法，可达到高效生产维生素K2(MK-7)的要求。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明的第一个目的是提供一株高产维生素K2(MK-7)的纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilis natto)ND-1-A27，于2018年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2018131。
本发明的第二个目的是提供所述纳豆芽孢杆菌ND-1-A27在发酵生产维生素K2(MK-7) 中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是从所述纳豆芽孢杆菌ND-1-A27发酵3～6天得到的发酵液中提取维生素K2(MK-7)。
本发明的第三个目的是提供所述纳豆芽孢杆菌ND-1-A27发酵生产维生素K2(MK-7)的方法，所述方法是将上述菌株的细胞液体培养物以2～4％(w/w)的接种量接种在发酵培养基中，在35～38℃，静置培养条件下发酵培养3～6天。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基成分为甘油40～60g/L；酵母粉40～60g/L；大豆蛋白胨180～200g/L；磷酸氢二钾0.5～0.8g/L。
本发明的第四个目的是提供包含所述纳豆芽孢杆菌ND-1-A27的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
本发明的第五个目的是提供利用所述纳豆芽孢杆菌ND-1-A27制备得到的食品、药品或保健品。
本发明的第六个目的是提供所述纳豆芽孢杆菌ND-1-A27在食品、药品或保健品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种生物发酵高产维生素K2(MK-7)的纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilis natto)的诱变菌株，以及利用该菌株发酵生产维生素K2(MK-7)的方法，大幅度提高了维生素K2(MK-7)的产量。又由于诱变后菌株生长速度快，大大缩短生长发酵周期，节约时间成本，能够应用于工业化发酵生产且该菌株遗传稳定性良好，连续传代5代其产维生素K2 (MK-7)产量基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。生物材料保藏
纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1-A27，于2018年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2018131。
附图说明
图1为本发明的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1在营养琼脂上的菌落形态；
图2为本发明的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1在显微镜下的拍摄图像；
图3为本发明中的致死率曲线；
图4为本发明中诱变菌株的产量比较；
图5为本发明中诱变菌株发酵周期的研究；
图6为纳豆芽孢杆菌诱变株的遗传稳定性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步描述本发明，本发明不仅限于所述实施例。
实施例1：初始菌株纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1的分离鉴定以及菌株的保存
(1)纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1的分离、筛选
本发明从市场购得纳豆，称取1.0-2.0g土样于250mL三角瓶中，用10-50mL生理盐水悬浮，然后进行梯度稀释，取0.1mL稀释液涂布于营养琼脂平板上进行培养。37℃条件下培养8h后，选取长势较好的单菌落进行发酵验证。挑取单菌落接种到新鲜的液体种子培养基， 37℃、90-120r/min培养8h，再以2％(w/w)的接种量接入装液量为30mL/250mL的发酵培养基，37℃、静置培养条件下发酵3-6天，收集发酵液，经萃取剂萃取和0.22μm的有机膜处理后，采用高效液相色谱检测维生素K2(MK-7)产物浓度。
(2)纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1的鉴定
对该菌株进行形态学观察、生理生化鉴定以及16s rDNA菌种鉴定分析后，鉴定ND-1为纳豆芽孢杆菌。具体鉴定结果如下：
形态学观察：菌落为灰白色，近圆形，表面干燥，不透明，有褶皱，无光泽，边缘不光滑成裂叶状，中央颜色深于边缘部分(如图1)；对培养24h的菌株进行个体形态观察，发现菌株革兰氏染色呈阳性，短杆状，两端钝圆(如图2)。
生理生化鉴定：对分离出的菌株分别进行了数项生理生化试验，包括革兰氏染色、接触酶、V-P测定、V-P培养物、pH测定、明胶液化、淀粉水解、D-葡萄糖发酵、D-木糖发酵、 D-甘露醇发酵、NaCl耐盐生长、硝酸盐还原等试验。鉴定过程中用枯草芽孢杆菌做对照以增加鉴定结果判定的准确性。再结合其具有的产纳豆激酶及合成γ-PGA等特性，进一步确定为纳豆芽孢杆菌。
16s rDNA菌种鉴定：通过基因组试剂盒提取纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilisnatto)ND-1 菌株的全基因组，采用通用引物27F和1492R调取该菌株的16s rDNA片段，测序结果于NCBI 上进行比对。
实施例2：利用ARTP对ND-1诱变以及利用结构类似物对诱变菌株进行初步的筛选
(1)菌悬液的制备
挑取营养琼脂培养基上的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1菌株一环，接种在装有30mL种子培养基的250mL锥形瓶中，在37℃下，置于摇床上以120r/min的转速培养8h至对数期，离心将菌体用生理盐水悬浮。用生理盐水将菌体适当稀释成OD值在0.8-1.2 之间，在超净台将金属载片置于酒精灯外焰灼烧，冷却后放到已灭菌的玻璃平板中，取菌悬液均匀涂于载片，不经风干，进行诱变。
(2)ARTP诱变
诱变系统操作仓先开紫外灭菌，再用无菌镊子将载片放至诱变系统操作仓，调节载台下方旋钮，使载片处于气流端口处。设置仪器功率为100W、气流量参数为10SLM，以诱变时间为可变参数,诱变时间分别为0s、10s、20s、30s、40s、50s。样品处理完毕，将载片放至装有生理盐水的管中，震荡，把纳豆枯草芽抱杆菌洗脱到液体中，形成新的菌悬液。将处理后的菌悬液进行梯度稀释涂平板，制作致死率曲线如下图3所示，从图中可以看出诱变处理时间与菌株致死率之间存在明显的剂量效应关系，随着处理时间的延长，致死率逐渐升高。
(3)结构类似物的抗性筛选
将上述菌悬液梯度稀释后涂布在含有90mg/L的维生素K2前体物质(DHNA)的结构类似物1，4-二羟基-2-萘甲酸(HNA)的固体培养基上，置于37℃培养箱培养过夜，得到31 个单菌落。
实施例3：利用诱变初步筛选后的菌株发酵生产维生素K2(MK-7)
(1)制备诱变菌株的细胞液体培养物
分别挑取含结构类似物抗性培养基上的31株诱变菌株以及初始菌株纳豆芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto)ND-1接种在装有30mL种子培养基的250mL锥形瓶中，在37℃下，置于摇床上以120r/min的转速培养8h至对数期，即制得诱变菌株的细胞液体培养物。
(2)发酵培养基的成分及配比为：
甘油50g/L；酵母粉50g/L；大豆蛋白胨189g/L；磷酸氢二钾0.6g/L；121℃高压蒸汽下灭菌20min。
(3)摇瓶发酵：
将上述菌株的细胞液体培养物以2％(w/w)的接种量接种在装有已灭菌的30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃，静置培养条件下发酵培养6天，得发酵液。
(4)产物检测：
将上述发酵液用萃取剂(正己烷：异丙醇＝2：1)萃取3次，使用氮吹仪将萃取剂吹干，并使用甲醇复溶，再通过0.22μm的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析维生素K2(MK-7)的含量。制作得初始菌株以及31株诱变菌株的产量分析图如图4。其中编号1 为初始菌株，2至32为诱变筛选得到的菌株。则得到编号27号菌株产量突出，达69.76mg/L，约为原始菌株产量的320％。将其命名为纳豆芽孢杆菌ND-1-A27，已于2018年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2018131。
实施例4：菌株ND-1-A27的发酵周期探究
将经实施例3验证过的高产维生素K2(MK-7)的菌株ND-1-A27进行摇瓶连续培养6天，每天取样，研究其发酵过程中菌体量和产量的变化。如下附图5，则由图可得，在发酵两天时，菌体含量已达最高，产量在第三天结束已趋于稳定，因此发酵周期仅需3天。
实施例5：菌株ND-1-A27的遗传稳定性验证
将经实施例3验证过的高产维生素K2(MK-7)的菌株ND-1-A27进行摇瓶连续培养5代，以检测其遗传稳定性。经摇瓶发酵后测定发酵能力，以生长良好的原代菌株为对照。菌株传代发酵实验结果如下图6所示。由图可知，菌株ND-1-A27传代对发酵水平无明显影响，其产维生素K2(MK-7)能力基本稳定，维持在同一较高水平，从而表明菌株ND-1-A27具有较好的遗传稳定特性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一株高产维生素K2的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1-A27，其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1-A27于2018年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2018131。
2.权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1-A27在发酵生产维生素K2中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是从所述纳豆芽孢杆菌发酵3～6天得到的发酵液中提取维生素K2。
4.权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1-A27发酵生产维生素K2的方法，其特征在于，所述方法是将上述菌株的细胞液体培养物以质量分数2～4％的接种量接种在发酵培养基中，在35～38℃，静置培养条件下发酵培养3～6天。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为甘油40～60g/L；酵母粉40～60g/L；大豆蛋白胨180～200g/L；磷酸氢二钾0.5～0.8g/L。
6.一种包含权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1-A27的微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
8.利用权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1-A27制备得到的食品、药品或保健品。
9.权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ND-1-A27在制备食品、药品或保健品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810392873.XA CN108410775B (zh) | 2018-04-27 | 2018-04-27 | 一株高产维生素k2（mk-7）的纳豆芽孢杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810392873.XA CN108410775B (zh) | 2018-04-27 | 2018-04-27 | 一株高产维生素k2（mk-7）的纳豆芽孢杆菌及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108410775A CN108410775A (zh) | 2018-08-17 |
| CN108410775B true CN108410775B (zh) | 2019-10-25 |
Family
ID=63137166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810392873.XA Active CN108410775B (zh) | 2018-04-27 | 2018-04-27 | 一株高产维生素k2（mk-7）的纳豆芽孢杆菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108410775B (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110157654B (zh) * | 2019-05-21 | 2020-07-28 | 江南大学 | 一种纳豆芽孢杆菌重组菌及其构建方法与应用 |
| CN110129234B (zh) * | 2019-05-27 | 2021-03-02 | 沈阳农业大学 | 经诱变的高产天然维生素k2的枯草芽孢杆菌菌株及其应用 |
| CN110499345B (zh) * | 2019-09-02 | 2021-05-28 | 福建康鸿生物科技有限公司 | 一种维生素k2(MK-7型)的发酵方法 |
| CN111349639A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-06-30 | 西宝生物科技（上海）股份有限公司 | 一种提高纳豆芽孢杆菌高效生物合成维生素k2（mk-7）的方法 |
| CN112812986A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-05-18 | 苏州微克生活科技有限公司 | 一种高产纳豆激酶和维生素k2的枯草芽孢杆菌xtk1001及其应用 |
| CN113564071B (zh) * | 2021-07-16 | 2023-02-17 | 湖北美琪健康科技有限公司 | 一种生产甲萘醌-7的纳豆芽孢杆菌及其应用 |
| CN113755404B (zh) * | 2021-10-13 | 2023-02-28 | 华北制药股份有限公司 | 维生素k2(mk-7)高产菌株及其筛选方法和生产维生素k2(mk-7)的方法 |
| CN114231554B (zh) * | 2021-12-27 | 2023-07-28 | 安徽工程大学 | 一种维生素k2系列产物的生物合成方法 |
| CN115261430A (zh) * | 2022-08-08 | 2022-11-01 | 扬州日兴生物科技股份有限公司 | 一种基于酶解制备几丁寡糖的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102808005A (zh) * | 2012-09-14 | 2012-12-05 | 上海红马饲料有限公司 | 一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素k2的方法 |
| CN103865835A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-06-18 | 江南大学 | 一株甲萘醌-7（mk-7）高产菌及其应用 |
| CN104328064A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-02-04 | 丽水双健生物工程有限公司 | 一种纳豆芽孢杆菌及其在发酵生产维生素k2中的应用 |
| CN106701719A (zh) * | 2017-01-16 | 2017-05-24 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素k2和纳豆激酶的方法 |
| CN106916810A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-07-04 | 南京工业大学 | 一种快速高效筛选维生素k2（mk‑7）高产菌的方法 |
| CN107118991A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-09-01 | 山东凤凰生物有限公司 | 一种具有产mk‑7能力的纳豆芽孢杆菌及其应用 |
-
2018
- 2018-04-27 CN CN201810392873.XA patent/CN108410775B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102808005A (zh) * | 2012-09-14 | 2012-12-05 | 上海红马饲料有限公司 | 一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素k2的方法 |
| CN103865835A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-06-18 | 江南大学 | 一株甲萘醌-7（mk-7）高产菌及其应用 |
| CN104328064A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-02-04 | 丽水双健生物工程有限公司 | 一种纳豆芽孢杆菌及其在发酵生产维生素k2中的应用 |
| CN106701719A (zh) * | 2017-01-16 | 2017-05-24 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素k2和纳豆激酶的方法 |
| CN106916810A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-07-04 | 南京工业大学 | 一种快速高效筛选维生素k2（mk‑7）高产菌的方法 |
| CN107118991A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-09-01 | 山东凤凰生物有限公司 | 一种具有产mk‑7能力的纳豆芽孢杆菌及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 纳豆菌微生态制剂的研究进展;尹聪 等;《新进展》;20111031;第38-42页，参见全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108410775A (zh) | 2018-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108410775B (zh) | 一株高产维生素k2（mk-7）的纳豆芽孢杆菌及其应用 | |
| CN108251339B (zh) | 一株乙偶姻高产菌株及其在发酵生产乙偶姻中的应用 | |
| CN107988115B (zh) | 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法 | |
| CN102660461A (zh) | 一种缩短烟叶发酵周期的微生物制剂及其应用 | |
| CN114854630B (zh) | 一种耐硒芽孢杆菌及其选育方法和应用 | |
| CN108004184A (zh) | 一种芽孢杆菌及其用于生产异戊酸的方法 | |
| CN111849807B (zh) | 一种刺糖多孢菌ds190375及其发酵产物、菌剂、发酵与筛选方法及应用 | |
| CN110343638B (zh) | 一株新的产达托霉素的链霉菌及其应用 | |
| CN113583881B (zh) | 一种发酵产布雷费尔德菌素a的正青霉菌株及其应用 | |
| CN113388556B (zh) | 利用金色链霉菌生产金霉素的方法 | |
| CN113215022B (zh) | 一种根际奇顿杆菌及其分离方法和应用 | |
| CN110846245B (zh) | 一种紫外诱变型盐单胞菌突变株及其诱变方法和应用 | |
| CN112661807B (zh) | 抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用 | |
| CN107418922B (zh) | 一种根际芽孢杆菌及其利用烟草工业废弃物生产乙酸己酯的方法 | |
| CN101974452B (zh) | 一种粘杆菌素高产菌株及其筛选方法 | |
| CN110903994B (zh) | 产高温蛋白酶地衣芽孢杆菌及其应用 | |
| CN116286545B (zh) | 一种类球红细菌诱变菌株hcyj-01及应用 | |
| CN110564636A (zh) | 产高温蛋白酶嗜热脂肪地芽孢杆菌及应用 | |
| CN110643519A (zh) | 紫红色素高产的南极真菌突变株、其选育方法及其应用 | |
| CN116426439A (zh) | 一种发酵产金霉素的金色链霉菌株及其应用 | |
| CN113430146B (zh) | 表达石杉碱甲的苏云金芽孢杆菌hw1株及其应用 | |
| CN117070382A (zh) | 一株高产四乙酰基植物鞘氨醇的菌株及其应用 | |
| CN112680387B (zh) | 一种发酵产放线菌素d的锈赤蜡黄链霉菌株及其应用 | |
| CN110195032A (zh) | 生丝微菌lxl-pq-409及其应用 | |
| CN112725238B (zh) | 一种发酵产利普司他汀的毒三素链霉菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |