CN112661807B

CN112661807B - 抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用

Info

Publication number: CN112661807B
Application number: CN202011524888.0A
Authority: CN
Inventors: 孔青; 牟海津; 张芳; 马云晓
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN112661807A

Abstract

本发明提出一种抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的抗菌脂肽Fengycin是抗菌脂肽Fengycin A和抗菌脂肽Fengycin B的混合物，该抗菌脂肽Fengycin来源于海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的发酵提取物，经试验证明，该抗菌脂肽Fengycin对黄曲霉菌丝延长、孢子萌发和黄曲霉毒素生物合成都有明显地抑制作用。此外，本发明还对海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的发酵培养基进行了优化，利用优化后的发酵培养基产生的抗菌脂肽含量为(571.26±9.72)mg/L，为优化前产量的1.82倍，为产抑制黄曲霉的抗菌脂肽大规模生产奠定基础。

Description

抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用。

背景技术

黄曲霉毒素是一类聚酮衍生的呋喃氧杂萘邻酮物，属于曲霉的次生代谢产物，目前已证实能产生黄曲霉毒素的菌株主要是曲霉属的黄曲霉和寄生曲霉。大量的实验数据表明，黄曲霉毒素可使人类和多种动物诱发实验性肝癌，是目前已发现的最强化学致癌物。黄曲霉毒素的去除方法可分为常规方法和生物脱毒法，常规方法包括碱处理法、氧化处理法、吸附剂处理法等，但常规方法容易导致营养损失，并且成本较高；生物脱毒法具有特异性强、不对原料产生污染等优点，是近些年黄曲霉毒素脱毒研究的热点。尤其是花生等农作物上的黄曲霉毒素更是非常棘手的农产品安全问题。

海洋微生物种类繁多、代谢产物丰富多样而有别于陆生生物，从中筛选出既可以抑制黄曲霉生长，又不会对花生等农作物产生二次污染，即安全无毒的抗黄曲霉微生物或功能因子，具有很大的开发潜力和研究价值。目前，国内外对抗菌海洋微生物和抗菌海洋活性物质的研究很多，主要分布在交替单胞菌属(Alteromonassp.)、节杆菌属(Arthobactersp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)、微球菌属(Micrococcussp.)、假单胞菌属 (Pseudomonassp.)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonassp.)、葡萄球菌属 (Staphylococcussp.)等菌属，这些海洋微生物或其代谢产物对一些病原细菌和某些植物病原真菌都有较好地抑制作用，但目前有关海洋微生物作为抗黄曲霉活性来源的研究鲜有报道，也没有有关海洋微生物抑制黄曲霉生长和毒素合成的报道。

发明内容

本发明提供了一种抗菌脂肽Fengycin，其来源于海洋巨大芽孢杆菌 Bacillusmegaterium的发酵提取物，经试验证明，该抗菌脂肽Fengycin对黄曲霉菌丝延长、孢子萌发和黄曲霉毒素生物合成都有明显地抑制作用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用，所述抗菌脂肽Fengycin是抗菌脂肽Fengycin A和抗菌脂肽Fengycin B的混合物。

作为优选，所述抗菌脂肽Fengycin A具有结构式(I)，抗菌脂肽Fengycin B具有结构式(II)：

其中，R1是含有15-18个碳的脂肪酸链，R2是含有15-16个碳的脂肪酸链。

作为优选，所述抗菌脂肽Fengycin中抗菌脂肽Fengycin A和抗菌脂肽 FengycinB的质量比为1：1。

作为优选，所述抗菌脂肽Fengycin是通过海洋巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium发酵培养得到的发酵液先经酸沉淀法得到抗菌脂肽的粗提脂肽、再对粗提脂肽进行分离纯化得到，其中，所述海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium于2013年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.7086。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

作为优选，所述海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium具有如SEQ ID NO.1所示序列。

作为优选，所述发酵培养所采用的发酵培养基为MgSO₄ 0.78g/L、酵母浸膏0.05g/L、KH₂PO₄ 1.50g/L和CuSO₄ 0.39mg/L。

作为优选，对粗提物进行分离纯化得到具体为：

采用超滤膜分离装置先截留粗提脂肽水溶液中分子量超过30kDa的大分子物质，收集截留物，利用Milli-Q水溶解并加入色谱级甲醇使脂肽胶束分散成单体；

将上述处理过的溶液再次使用超滤膜分离装置将分子量小于30kDa的脂肽单体分子分离出去，收集过滤液，浓缩得到纯化的抗菌脂肽Fengycin。

作为优选，抗菌脂肽Fengycin在100μg/mL浓度时对黄曲霉具有良好的抑制作用，该浓度下，黄曲霉的抑菌圈直径高达20.7±0.2mm。

作为优选，抗菌脂肽Fengycin在50±0.1μg/mL浓度时，达到对黄曲霉菌孢子生长的最低抑菌浓度；在200±0.2μg/mL浓度时，达到完全没有黄曲霉菌孢子萌发的最低杀真菌浓度；在140μg/mL浓度时，能够抑制黄曲霉的产孢能力和菌丝延长；在400μg/mL时，不再观察到菌丝生长。

作为优选，抗菌脂肽Fengycin在100μg/mL浓度时，黄曲霉毒素的生物合成得以完全抑制。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明采用滤纸片扩散法从海洋中分离筛选出1株抑制黄曲霉活性高的微生物，利用16S rDNA特异性扩增技术对其菌种进行鉴定，证明其为海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium；

2、本发明对利用海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium产抗菌脂肽的发酵培养基进行优化，利用回归方程得到抗菌脂肽产量最高时各关键因子的最优组合：MgSO₄0.78g/L、酵母浸膏0.05g/L、KH₂PO₄ 1.50g/L和CuSO₄ 0.39 mg/L。利用优化后的发酵培养基产生的抗菌脂肽含量为(571.26±9.72)mg/L，为优化前产量的1.82倍，这为产抑制黄曲霉的抗菌脂肽大规模生产奠定基础；

3、本发明对所得抗菌脂肽进行了分离，首次发现了抗菌脂肽Fengycin，其为抗菌脂肽FengycinA和抗菌脂肽Fengycin B的混合物，经试验证明，该抗菌脂肽Fengycin对黄曲霉菌丝延长、孢子萌发和黄曲霉毒素生物合成都有明显地抑制作用。

附图说明

图1为本发明实施例提供的Fengycin(FengycinA和FengycinB混合物) 的液相色谱图；

图2为本发明实施例提供的对照组(左)和实验组(右)对黄曲霉的抑菌效果示意图；

图3为本发明实施例提供的扫描电镜观察Fengycin对黄曲霉菌菌丝形态的影响，其中，A、B为对照组菌丝体；C、D为处理组菌丝体；

图4为本发明实施例提供的扫描电镜观察Fengycin对黄曲霉菌孢子形态的影响，其中，A、B为对照组孢子形态；C、D为处理组孢子形态；

图5为本发明实施例提供的透射电镜观察Bacillo mycin D对黄曲霉菌菌丝形态的影响，其中，A、B为对照组菌丝体；C、D为处理组菌丝体。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

海洋微生物的分离

将取回的海洋样品分别做如下处理：海草、海藻等海生生物用无菌生理盐水充分洗涤后，再用无菌器具剪碎后稀释；海鱼先用无菌生理盐水充分洗涤，再以无菌器具进行解剖，分别取其肠道和体表2部分，各加入50mL无菌海水，经漩涡振荡器振荡1min后，静置至澄清，分别取上清液3mL于30mL 无菌生理盐水中稀释；泥沙用无菌生理盐水按1:10(V/V)的比例稀释制成悬液；海水直接用无菌生理盐水按1:10(V/V)的比例稀释。将稀释好的鱼肠、鱼体、泥沙、海水、海草5组样品溶液分别用微量移液器吸取100μL涂布于高氏一号、牛肉膏蛋白胨、MRS和PDA培养基平板上，装有高氏一号和PDA的平板置于28℃培养箱培养，装有MRS和牛肉膏蛋白胨培养基的平板置于37℃培养箱培养2d后，取出所有的平板，将每一种培养基(每种培养基含5个平板) 上不同菌落形态的菌株划线接种于相应培养基的试管斜面上保存。将分出的海洋微生物接种于相应的液体培养基中，20r/min摇床培养24h，制成海洋微生物培养液。

抗黄曲霉海洋微生物的筛选

采用滤纸片扩散法筛选抗黄曲霉的海洋微生物。用灭菌枪头吸取0.1mL 黄曲霉孢子悬液(1ⅹ10⁷mL^-1)，均匀涂布于PDA平板上，板上平整放直径6mm 的无菌滤纸片2片，用微量移液器吸10μL海洋微生物培养液滴加在无菌滤纸片上，每种海洋微生物各做3个平行。将所有平板放入37℃培养箱培养。

从海洋中取样分离出68株微生物，其中鱼肠20株，鱼体表4株，泥沙16株，海水15株，海草13株。通过滤纸片扩散法筛选出27株海洋微生物对黄曲霉的抑菌圈直径在1cm以上，其中1株鱼肠18抑制作用最明显，对黄曲霉的抑菌圈直径达3cm，后续对其进行重点研究。

菌株鉴定

形态和生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》(第九版)。16S rDNA序列测定过程如下:

1)基因组DNA的提取：使用UNIQ-10柱式DNA抽提试剂盒提取基因组 DNA；

2)16S rDNA基因序列的PCR反应：

上游引物为5-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3；

下游引物为5-CTTGTTACGACTTCACCC-3；

3)测序：由上海生工生物工程技术服务有限公司纯化、克隆和测序；

4)序列的数据处理:测序结果在美国国立生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information，NCBI)使用Blast比对，从GenBank数据库中获得与菌株16S rDNA同源的公认标准序列数据，使用MEGA4.1软件计算序列相似性并作系统发育分析。

5)结果：鱼肠18菌株的16S rDNA序列的PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)中的电泳结果见图1。16S rDNA大小在1.5kb 左右，是16S rDNA序列的扩增产物，符合测序要求。

将鱼肠18菌株的16S rDNA序列送上海生工序，其序列长为1481bp，与PCR产物的电泳结果基本吻合。把该序列提交NCBI比对，通过在GenBank 上比对，发现20株细菌和菌株鱼肠18同源性最高，且均为芽孢杆菌。用 MEGA4.1软件对鱼肠18菌株和这20株芽孢杆菌进行序列和进化树分析发现，鱼肠18菌株与巨大芽孢杆菌有98％以上的相似性。此外，鱼肠18菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上生长为白色的圆形菌落，菌落边缘整齐，表面湿润光滑，好氧生长，显微镜下细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，芽孢圆形；生理生化测定结果表明，此菌株能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、淀粉、柠檬酸钠等作为碳源，能水解明胶。结合形态特征和生理生化测定结果，初步鉴定鱼肠18菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，具有如 SEQ ID NO.1所示序列。

实施例2

海洋巨大芽孢杆菌的培养

从新鲜的海洋巨大芽孢杆菌斜面上挑去一环接种于种子培养基 (100mL/250mL)，在36℃下，160r/min摇床震荡培养18～22h，再以实验设计的接种量接入基础发酵培养基(100mL/250mL)，同上相同培养条件震荡培养 72h。

其中，关于发酵培养基：采用Plackett-Burman设计法筛选影响目标产物的主要影响因子，结果发现，葡萄糖(P＝0.0004)对抗菌脂肽的产量为正效应，影响程度大，且为发酵培养基的唯一碳源。但由于葡萄糖的添加量过大，易导致发酵物过于黏稠，不利于离心去除菌体及抗菌物质的分离纯化，因此只选取酵母浸膏(P<0.0001)、KH₂PO₄(P<0.0001)、MgSO₄(_P＝0.0005)及 CuSO₄(P＝0.0035)作为影响产量的关键因子。

在此基础上，通过BBD响应曲面法确定了关键因子的最佳水平并建立了产生抗菌脂肽的二次多项数学模型，之后对最佳发酵工艺进行了预测，利用回归方程得到抗菌脂肽产量最高时各关键因子的最优组合：MgSO₄ 0.78g/L、酵母浸膏0.05g/L、KH₂PO₄ 1.50g/L、CuSO₄ 0.39mg/L。利用优化后的发酵培养基产生的抗菌脂肽含量为(571.26±9.72)mg/L，为优化前产量的1.82倍。

抗菌脂肽的提取及其粗提物含量测定

采用酸沉淀法提取抗菌脂肽。培养结束后，在4℃下，8000r/min离心10min 去除菌体细胞，收集上清液。在上清液中加入6mol/L HCl调节pH至2.0，低温磁力搅拌5h，过夜沉淀，4℃、10000r/min离心20min，收集沉淀。将沉淀在55℃烘箱中干燥24h，称重即为抗菌脂肽粗提脂肽干重。

实施例3

脂肽的纯化(两步超滤法)

将脂肽水溶液过0.22μm的醋酸纤维素滤膜(PALL Gelman Laboratory, NewYork,USA)以除去微小杂质，选取截留分子量为30kDa聚醚砜超滤膜分离装置通过两步超滤法初步纯化脂肽抗生素。具体为：

第一步，采用该超滤膜分离装置截留脂肽胶束和大分子杂蛋白等分子量超过30kDa的大分子物质并收集截留物。将截留物用200μL移液枪轻轻取出，用Milli-Q水溶解并加入一定量的色谱级甲醇使脂肽胶束分散成单体，用1.0M NaOH将溶液的pH值调整到7.0并低温(4℃)磁力搅拌2h备用。

第二步将上述处理过的溶液再次使用该超滤膜分离装置将小于30kDa的脂肽单体分子分离出去，收集过滤液，将该过滤液采用真空旋转蒸发和真空冷冻干燥的方式来进一步浓缩得到纯化脂肽粉。

将脂肽粉溶解在Milli-Q水中并用0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤制备成 500μg/mL的脂肽溶液4℃冷藏备用。

脂肽的鉴定

脂肽组分的分离和所有的质谱分析所用的电喷雾质谱(ESI-MS)设备为采用配备了电喷雾离子源(正离子模式)的LCQ Fleet Ion Trap液质联用仪 (Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)。HPLC采用Zorbax SB-C₁₈ MS 柱(Agilent,Santa Clara,USA)(φ2.1x100 mm,3.5μm)进行分析。

不同的脂肽如surfactin，fengycin和iturin具有不同的极性，分别可在 85-100％，50-70％，40-50％的乙腈水溶液体系中洗脱出来。因此洗脱液为乙腈(A)和水(B，含有0.1％的甲酸)，surfactin的梯度洗脱条件为：0-3.5min， 60％A-93％A；3.5-20min，93％A。Iturin和fengycin的梯度洗脱条件为：0-9min， 45％A-55％A；9-20min，55％A。流速为200μL/min；进样量为10μL；柱温为35℃；检测波长为210nm。电喷雾源操作电压为4kV，毛细管电压为35V，操作温度为325℃，操作压力为25bar，检测方式：正离子，分子量质荷比全扫描范围为200-2000。ESI-MS/MS中化合物的典型碎片离子采用CID技术获得，氦气为碰撞池中碰撞气体，根据试验需要进行碰撞能量设定来对脂肽组分的氨基酸序列进行进一步分析。Iturin和surfactin标准品也在此条件下进行分析作为对照。

在ESI-MS中通过碰撞诱导解离质谱技术(CID)得到一系列碎片离子，进而对所得到的碎片离子进行分析归纳，最后分析推导出表征脂肽同系物的一级结构。通过LC–ESI-MS/MS技术手段，共鉴定出包括surfactin、iturin、 fengycin三大族均在内的超过40种脂肽分子一级结构。其中含有七大类环状 surfactin亚型、2种esperin同系物(第五位L-Asp和β-hydroxyfattyacid形成内酯环)、两大类线性surfactin亚型、2种Bacillomycin D，含有一个碳碳双键的线性fengycinA和B首次被鉴定出来，如图1所示，保留时间为9.57min的峰即为fengycinA和B混合物的峰。

实施例4

4.1 黄曲霉孢子悬液的制备

用含0.1％Tween-80的无菌蒸馏水，将PDA斜面培养的黄曲霉孢子洗下并经脱脂棉过滤制成黄曲霉孢子悬浮液。所得孢子用血球计数法计数，用0.1％ Tween-80的无菌蒸馏水稀释至所需浓度。

4.2 Fengycin对黄曲霉抑菌活性的检测

使用无菌水制黄曲霉孢子悬液，稀释其浓度至1.0×10⁵个/mL(血球计数板计数)，吸取0.1mL涂PDA平板，在其上放置高温灭菌后的牛津杯，再将200μL脂肽抑菌物加入牛津杯，对照组加无菌水，28℃下培养48h，记录抑菌圈直径大小，实验重复3次，从而确定抗菌脂肽对黄曲霉的抑制作用。

Fengycin生物活性检测结果表明，在Fengycin浓度为100μg/mL下对黄曲霉的抑菌圈直径高达20.7±0.2mm，如图2所示，抑菌效果明显增加，显示出了对黄曲霉良好的抑菌活性。

4.3 Fengycin对黄曲霉孢子的MIC和MFC的测定

采用连续稀释法，将初始浓度为2mg/mL的Fengycin溶液，配制成含 Fengycin浓度为400、200、100、50、25μg/mL的系列PDB培养液。将经紫外灯照射30min灭菌后的96孔板中每孔分别加入200μL上述培养液，未加 Fengycin的纯PDB培养液设为对照(CK)。再向每孔中加入5μL、浓度为1.0 ×10⁷个/mL(经血球计数法计数)的黄曲霉孢子悬浮液，置于28℃恒温培养，待CK孔中病院菌丝明显生长(约48小时)后观察结果，每组实验重复3次，整个实验重复2次。

根据定义，培养物中化合物完全抑制指示菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度(MIC)(即肉眼无可见黄曲霉菌丝)；在足够的培养天数下，培养物中在显微镜下观察，完全没有真菌孢子萌发的最低浓度为最低杀真菌浓度(MFC)。 Fengycin对黄曲霉孢子的MIC和MFC见表1。

表1 Fengycin对黄曲霉孢子的MIC和MFC

4.4 Fengycin对黄曲霉菌孢子萌发的影响

配制Fengycin终浓度为400、200、140、70、30、15μg/mL的系列MM 培养液和PDA培养基各2mL分别加入12孔板中，纯培养液作为对照(CK)。在液体MM培养基中分别加入20μL浓度为1×10⁷个/mL黄曲霉菌孢子悬浮液，在PDA培养基中分别加入5μL浓度为1×10⁷个/mL黄曲霉菌孢子悬浮液并涂布，之后均置于28℃恒温培养箱中，130rpm培养12h。然后在显微镜下观察各处理组孢子萌发情况，以抽出芽管、长出菌丝为依据，以芽管长度大于等于孢子短径视为萌发。每个处理重复3次，观察10个视野至少200个孢子，分别计数萌发和未萌发的孢子，试验重复两次。

孢子萌发抑制率＝(对照组孢子萌发率-含药组孢子萌发率)/对照组孢子萌发率×100％

由表2结果可知，不管是PDA固体培养基还是MM液体培养基，经12h 培养后，CK组孢子均基本萌发，而加入Fengycin后，孢子的萌发率会下降。随着抑菌物质Fengycin的增加，抑菌效果越明显，且对MM培养基中培养的黄曲霉影响更大，抑制效果更明显：这可能是由于PDA培养基成分更有利于黄曲霉孢子的萌发和生长，而MM培养基成分营养较少，更加限制了其孢子萌发和生长。

在PDA培养基中，当Fengycin的浓度达到140μg/mL时，其对孢子萌发的抑制率达到77.21％，当浓度达到400μg/mL时，没有观察到孢子萌发。在MM培养基中，当Fengycin浓度达到200μg/mL时，就几乎没有观察到孢子的萌发。除此之外，我们还观察到加入Fengycin后培养的孢子芽管长度变短，孢子球直径变小。

表2 Fengycin对黄曲霉菌孢子萌发的影响

注：表中的萌发和抑制率的各数值差异均显著(p＜0.05)。

4.5 Fengycin对黄曲霉菌菌丝生长的影响

配制Fengycin终浓度为400、200、140、70、30、15μg/mL的系列PDA 培养基(50℃左右时操作)，充分混匀后倒入高温灭菌的培养板(φ＝90mm) 中，不含Fengycin以等量水的PDA平板作为对照(CK)。将在PDA培养基上培养24-30h的黄曲霉菌，用打孔器打取菌丝块(φ＝5mm)，菌丝面朝下，用灭菌的镊子轻轻将其置于已凝固的系列含药培养基中央，28℃恒温培养。待 CK组菌丝长至平板边缘，采用十字交叉法测各菌落直径，并计算出不同处理对菌丝生长的抑制率。每个实验重复3次，整个试验重复2次。

菌丝生长抑制率＝(对照组菌落直径-含药组菌落直径)/对照组组菌落直径ⅹ100％

Fengycin对黄曲霉菌菌丝生长的影响结果见表3。Fengycin的加入较CK 组相比，对黄曲霉菌丝生长有明显的抑制作用。在PDA培养基中，随着抑菌物质Fengycin的增加，抑菌效果越明显：当Fengycin的浓度达到140μg/mL 时，其对菌丝生长的抑制率达到69.92％，当浓度达到400μg/mL时，没有观察到菌丝生长。另外，在显微镜下观察，CK组的黄曲霉菌丝粗壮、挺拔，而实验组的黄曲霉菌丝细弱、萎蔫，说明Fengycin对黄曲霉菌丝有较强的抑制作用。

表3 Fengycin对黄曲霉菌丝生长的影响

注：表中的萌发和抑制率的各数值差异均显著(p＜0。05)。

4.6 Fengycin对黄曲霉菌产孢能力的影响

将黄曲霉菌丝块接种到含有不同浓度Fengycin的PDA培养基平板上， 28℃恒温培养8d，分别取10mL含有0.1％的tween 80的无菌水洗下孢子，比较不同处理孢子的浓度(血球计数板计数)。

Fengycin对黄曲霉菌产孢能力的影响结果如表4所示。在PDA培养基中，随着抑菌物质Fengycin的增加，对黄曲霉产孢能力的抑制作用越明显：当Fengycin的浓度达到140μg/mL时，其对黄曲霉的产孢能力抑制率达到92。90％。说明Fengycin的加入，对黄曲霉菌包囊孢子的形成有明显的抑制作用。

表4 Fengycin对黄曲霉产孢能力的影响

注：表中的萌发和抑制率的各数值差异均显著(p＜0。05)。

4.7 Fengycin对黄曲霉菌菌丝及孢子形态结构的影响

通过前面的研究表明，Fengycin对黄曲霉菌孢子萌发、菌丝生长等均具有明显的抑制作用。为了进一步从细胞水平上探索Fengycin对黄曲霉的抑制作用，我们研究了Fengycin对黄曲霉菌丝、孢子显微结构的影响。

在6孔板中加入含Fengycin浓度为100μg/mL MM培养基2mL作为实验组，纯MM培养基作为对照组。接种黄曲霉孢子悬浮液10μL，浓度为1 ×10⁷个/mL。一组经过24h收集实验组和对照组的菌丝体，用2.5％戊二醛固定电镜制片常规方法处理后进行扫描电镜(SEM)观察并采集图像。

另一组是经过48h震荡培养后，挑取生长菌丝用2.5％戊二醛固定电镜制片常规方法处理后进行透射电镜(TEM)观察并采集图像。

在扫描电镜下，我们看到含Fengycin的实验组和CK组相比，黄曲霉菌丝体和孢子结构均有明显的变化。从图3中可以看出，CK组中黄曲霉的菌丝体完整、饱满，呈现直、长、排列整齐、表面光滑等特点；而经过Fengycin 处理过的黄曲霉的菌丝体生长明显异常，菌丝体扭曲、散乱，菌丝折叠，散乱、打结、萎蔫、变形形成褶皱。对照组孢子、孢子梗形态粗壮、饱满，孢子表面粗糙；经过Fengycin处理过的孢子梗和孢子囊扭曲、变形、萎缩，不能正常生长，孢子表面凹陷并且明显畸形，甚至有些孢子囊上不能形成孢子 (图4)这些说明Fengycin能够导致黄曲霉孢子表面形态结构和菌丝表面形态结构的改变，从而使其表面形态产生异常。

在透射电镜下，我们看到含Fengycin的实验组和CK组相比，黄曲霉菌丝体细胞结构均有明显的变化，如图5所示，CK组中黄曲霉的菌丝体细胞壁清晰、完整，边缘平整、无缺陷和断裂，细胞膜完整光滑，细胞器结构紧密，细胞质均匀，线粒体、液泡脂质体等细胞器清晰可见，核膜、核仁清晰可见。而经过Fengycin处理过的黄曲霉的菌丝体细胞结构明显异常：细胞壁溶解、变得稀薄、模糊，细胞内壁凹凸不平，细胞间隙变大，细胞核核仁破坏，核膜消失，细胞质分布不均匀，胞内的原生质和细胞器被降解而不完整，并且固缩形成颗粒状结构，液泡明显变大，呈空泡化状态。这说明Fengycin能导致黄曲霉菌丝细胞壁溶解、细胞膜破坏、细胞间隙变大、细胞质破坏、细胞内容物泄露，从而使细胞代谢不能正常运行。

4.8 Fengycin对黄曲霉生物量和毒素产量的影响

将初始浓度为2mg/mL的Fengycin溶液，配制成含Fengycin浓度为100、 50μg/mL的终浓度的PDB和MM培养基作为实验组，纯PDB和MM培养基作为对照组。分别取15mL置于50mL锥形瓶中，分别接种50μL浓度为1 ×10⁷个/mL的黄曲霉孢子悬液，置于28℃恒温振荡器以200rpm培养。每组实验重复进行3次。培养48小时后离心收集真菌菌丝体，用无菌水洗涤离心 2次，分别测定其干重。

分别取10mL液体培养基中提取黄曲霉毒素，经免疫亲和柱纯化，三氟乙酸衍生后，使用高效液相色谱仪测定，荧光检测器发射波长440nm，激发波长360nm，色谱柱为ZORBAXC₁₈柱(150mm×4.6mm，5μm)。流动相为甲醇:水:乙腈(50:40:10)，流速为0.8mL/min，检测时间为15min。

Fengycin对黄曲霉生长生物量和毒素产量的影响结果如表5所示。无论是PDB培养基还是MM培养基，Fengycin的加入的实验组较对照组相比，对黄曲霉菌丝生长和毒素积累均有明显的抑制作用。在PDB培养基中，当 Fengycin的浓度为100μg/mL时菌丝体干重减少达75.33％，几乎完全抑制了黄曲霉毒素的生物合成，同时单位生物量中毒素含量减少达77.44％。在MM 培养基中培养时，出现了相一致的实验结果。这说明黄曲霉毒素的减少不仅仅是由于通过抑制真菌生长造成的，同时Fengycin可直接使黄曲霉毒素的含量减少。

表5 Fengycin对黄曲霉生长生物量和毒素产量的影响

Claims

1.抗菌脂肽Fengycin在抑制黄曲霉生长和毒素合成中的应用，其特征在于，所述抗菌脂肽Fengycin是抗菌脂肽Fengycin A和抗菌脂肽Fengycin B的混合物；

所述抗菌脂肽Fengycin A具有结构式（I），抗菌脂肽Fengycin B具有结构式（II）：

（I）

（II）

其中，R₁是含有15-18个碳的脂肪酸链，R₂是含有15-16个碳的脂肪酸链。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗菌脂肽Fengycin中抗菌脂肽Fengycin A和抗菌脂肽Fengycin B的质量比为1：1。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗菌脂肽Fengycin是通过海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium发酵培养得到的发酵液先经酸沉淀法得到抗菌脂肽的粗提脂肽、再对粗提脂肽进行分离纯化得到，其中，所述海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium于2013年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.7086。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述海洋巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium具有如SEQ ID NO.1所示序列。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养所采用的发酵培养基为MgSO₄0.78 g/L、酵母浸膏0.05 g/L、KH₂PO₄ 1.50 g/L和CuSO₄ 0.39 mg/L。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，对粗提物进行分离纯化得到具体为：

采用超滤膜分离装置先截留粗提脂肽水溶液中分子量超过30 kDa的大分子物质，收集截留物，利用Milli-Q水溶解并加入色谱级甲醇使脂肽胶束分散成单体；

将上述处理过的溶液再次使用超滤膜分离装置将分子量小于30 kDa的脂肽单体分子分离出去，收集过滤液，浓缩得到纯化的抗菌脂肽Fengycin。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抗菌脂肽Fengycin在100μg/mL浓度时对黄曲霉具有良好的抑制作用，该浓度下，黄曲霉的抑菌圈直径高达20.7±0.2 mm。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抗菌脂肽Fengycin在50±0.1μg/mL浓度时，达到对黄曲霉菌孢子生长的最低抑菌浓度；在200±0.2μg/mL浓度时，达到完全没有黄曲霉菌孢子萌发的最低杀真菌浓度；在140μg/mL浓度时，能够抑制黄曲霉的产孢能力和菌丝延长；在400 μg/mL时，不再观察到菌丝生长。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抗菌脂肽Fengycin在100μg/mL浓度时，黄曲霉毒素的生物合成得以完全抑制。