CN112661818A

CN112661818A - 一种犬猫细小病毒vp2350-420蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112661818A
Application number: CN202011580723.5A
Authority: CN
Inventors: 翟颀; 温肖会; 林瑜婷; 魏文康; 翟少伦; 吕殿红; 田彤彤; 贾春玲; 周秀蓉
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2021-04-16

Abstract

一种犬猫细小病毒VP2_350‑420蛋白及其制备方法与应用。本发明公开了一种蛋白及其制备方法与应用。该蛋白的氨基酸序列如细小病毒中VP2蛋白的第350～420位氨基酸序列所示或具有所述蛋白功能的对细小病毒中VP2蛋白的第350～420位氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰的变体，具有高度保守、抗原性高、亲水性强等优点，可用于制备预防和/或治疗犬/猫细小病毒病的药物。

Description

一种犬猫细小病毒VP2350-420蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种犬猫细小病毒VP2_350-420蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

犬、猫细小病毒分别被认为危害犬和猫最为严重的病毒之一，分别引起较高的死亡率，用药物防治的治愈率很低。其中犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)，可感染各种年龄的犬，以90日龄以下的较多，引发犬的急性出血性肠炎和心肌炎。猫细小病毒(Felineparvovirus，FPV)，可感染猫科动物，以3-5月龄的幼猫发病最多，引发急性肠炎、泛白细胞减少症。两种病的发病年龄，临床症状也较为相似。犬猫细小病毒同属细小病毒科细小病毒属成员，在基因组水平上的相似性达97％以上，含有两个开放阅读框，可以表达产生VP1和VP2两种结构蛋白以及NS1和NS2两种非结构蛋白。VP1、VP2蛋白是能够产生体液免疫和细胞免疫的重要抗原，在病毒免疫中占有重要地位，其中VP2蛋白是主要的结构蛋白，犬细小病毒和猫细小病毒VP2基因的相似性在97.1％-99.9％之间，VP2蛋白不但是能够诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原，也是决定犬猫细小病毒血凝性和宿主范围的蛋白。有研究人员将犬细小病毒VP2基因上编码主要抗原表位克隆于真核表达载体pVAX1中构建了犬细小病毒VP2的DNA疫苗，结果显示其重组质粒能够在COS-7细胞中正确表达并有良好的免疫原性，将该重组质粒免疫小鼠犬，能够诱导小鼠犬只产生较高的抗体水平一定的免疫保护力。但是DNA疫苗在使用安全性方面存在一定的争议，并且市场上目前还没有在犬猫间通用的细小病毒基因工程疫苗。

发明内容

为了现有技术的不足，本发明的第一方面的目的，在于提供一种蛋白。

本发明的第二方面的目的，在于提供一种编码第一方面的蛋白的多核苷酸。

本发明的第三方面的目的，在于提供一种包含第二方面的多核苷酸的质粒。

本发明的第四方面的目的，在于提供一种包含第三方面的质粒的工程菌。

本发明的第五方面的目的，在于提供第一方面的蛋白的制备方法。

本发明的第六方面的目的，在于提供第一方面的蛋白在制备预防和/或治疗犬/猫细小病毒病的药物中的应用。

本发明的第七方面的目的，在于提供一种包含第一方面的蛋白的疫苗。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为：

a)如细小病毒中VP2蛋白的第350～420位氨基酸所示的氨基酸序列；

或b)如细小病毒中VP2蛋白的第350～420位氨基酸所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰后且具有所述蛋白功能的序列。

所述细小病毒优选为猫细小病毒和犬细小病毒中的至少一种。

优选的，所述蛋白的氨基酸序列为：

a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

或b)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰后且具有所述蛋白功能的序列。

本发明的第二个方面，提供一种编码第一方面的蛋白的多核苷酸。

一种多核苷酸，所述多核苷酸为编码第一方面的蛋白的多核苷酸。

优选的，所述多核苷酸为如SEQ ID NO.2所示序列的多核苷酸。

本发明的第三方面，提供一种包含第二方面的多核苷酸的质粒。

一种质粒，包含第二方面的多核苷酸。

本发明的第四方面，提供一种包含第三方面的质粒的工程菌。

一种工程菌，包含第三方面的质粒。

本发明的第五方面，提供第一方面的蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)扩增第二方面的多核苷酸；

(2)构建含有步骤(1)所述的多核苷酸的质粒，转入大肠杆菌；

(3)诱导表达得到目的蛋白。

优选的，步骤(1)中的扩增方法如下：以猫/犬细小病毒为模板，VP2_350-420F(SEQ IDNO.9)、VP2_350-420R(SEQ ID NO.10)为引物进行PCR扩增。

优选的，步骤(1)中所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，步骤(1)得到的多核苷酸序列与载体PET-28a经双酶切后连接，得到重组表达质粒。

本发明的第六方面的目的，提供第一方面的蛋白在制备预防和/或治疗犬/猫细小病毒病的药物中的应用。

本发明的第七方面的目的，提供一种包含第一方面的蛋白的疫苗。

所述疫苗还包含佐剂。

所述佐剂优选为细胞因子、脂质体、CpG-ODN佐剂和单磷酰基脂质A中的至少一种。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种蛋白，该蛋白的氨基酸序列如细小病毒中VP2蛋白的第350～420位氨基酸序列所示或具有所述蛋白功能的对细小病毒中VP2蛋白的第350～420位氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰的变体，该蛋白具有高度保守、抗原性高、亲水性强等优点，可用于制备预防和/或治疗犬/猫细小病毒病的药物。

附图说明

图1是实施例2中犬/猫细小病毒VP2基因的系统进化树图。

图2是实施例2中犬/猫细小病毒VP2蛋白抗原指数预测图。

图3是实施例2中犬/猫细小病毒VP2蛋白亲水性预测图。

图4是实施例3中含重组表达质粒PET-28a-VP2_350-420的菌液PCR鉴定和双酶切电泳图。

图5是实施例3中未经诱导表达的菌液、经诱导表达后的菌液和纯化His-VP2_350-420重组蛋白的电泳图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

本实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本实施例中，疑似CPV感染猫粪便棉拭子(27份)、疑似FPV感染犬粪便棉拭子25份于2016～2017年采集于广州某动物医院；犬猫细小病毒抗原快速检测卡购自韩国百易奥生物公司；猫肾传代细胞(CRFK)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC编号：CL9)；核酸提取试剂盒购自Axygen公司；胎牛血清、1640培养基、胰酶、双抗均购自Gibco公司；DNAMarker、PCR试剂盒、DNA片段凝胶回收试剂盒、pMD19-T载体等均购自TaKaRa公司；2×TaqPCR MasterMix、Top10感受态细胞购自天根生化公司。

实施例1犬猫细小病毒的分离鉴定

将猫犬粪便棉拭子浸出液上清滴于犬猫细小病毒快速检测卡的加样孔中，15min后观察结果，只有一条线(C)表示阴性结果，出现两条带(C和T)，表示阳性结果。选取阳性的样品，用核酸提取试剂盒提取病毒核酸，犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、猫细小病毒(Feline parvovirus，FPV)分别使用CPV特异性引物(CPVF:5-ACGGTGGTCAACCTGCTGTC-3(SEQ ID NO.3)/CPVR:5-AAACCAAACTCCCCAAGCAT-3(SEQ ID NO.4))、和FPV特异性引物(FPVF:5-TGGTTCTGGGGGTGTGGG-3(SEQ ID NO.5)/FPVR:5-GCTGCTGGAGTAAATGGC-3(SEQ IDNO.6))进行鉴定。对于PCR也是阳性的样品，用0.22μm滤器过滤后接入CRFK细胞，置于5％CO₂，37℃培养箱中继续培养3-5d，每日观察细胞生长状态是否出现细胞病变。每代收集接毒后细胞上清和细胞液，用PCR进行鉴定。结果共分离到FPV 6株分别命名为：FPV-A、FPV-B、FPV-C、FPV-D、FPV-E、FPV-F，CPV4株分别命名为：CPV-A、CPV-B、CPV-C、CPV-D。

FPV-A、FPV-B、FPV-C、FPV-D、FPV-E、FPV-F、CPV-A、CPV-B、CPV-C、CPV-D已在硕士学位论文“10株犬猫细小病毒的分离鉴定及NS1和VP2基因遗传变异分析，田彤彤”中公开。

实施例2犬猫细小病毒不同毒株的VP2蛋白序列分析

参考GenBank中的CPV和FPV基因编码序列，利用Primer Premier 5.0软件设计VP2基因的全长扩增引物：(VP2F:5-CAGGACAAGTAAAAAGAGACAA-3(SEQ ID NO.7)/VP2R:5-ATTTTCTAGGTGCTAGTTGAGA-3(SEQ ID NO.8))对分离到的10株病毒进行VP2基因的PCR扩增，将扩增出的片段连接入pMD19-T载体后送擎科基因公司测序，应用DNAStar软件中的Editseq程序分析测序获得的VP2基因序列，推导其编码的氨基酸序列，用MegAlign程序与GenBank中登录的CPV和FPV参考株(具体参见表1)VP2核苷酸、氨基酸序列进行比对并构建系统进化树，用Protean程序对10株FPV/CPV及6株参考株的VP2蛋白抗原指数及亲水性进行分析。

表1 CPV/FPV参考株序列信息

对10株FPV/CPV及6株FPV/CPV参考分离株绘制VP2基因的系统进化树，结果如图1所示：FPV毒株FPV-A、FPV-B、FPV-C、FPV-D、FPV-E、FPV-F和FPV-USA在同一分支上，CPV-A、CPV-B、CPV-D和CPV-HB相似度高，属于同一分支。

对10株FPV/CPV及6株FPV/CPV参考分离株的VP2蛋白氨基酸序列进行分析共发现24个位点差异(如表2、3所示)：主要集中在loop2环(200～250位)，而loop1，loop3，loop4环上的氨基酸序列则比较保守，第80位、93位、103位、323位上的四个氨基酸残基决定犬猫细小病毒的宿主特异性及抗原性，这四位上，FPV决定宿主范围的氨基酸分别是K、K、V、D，CPV决定其宿主范围的氨基酸分别是R、N、A、N，决定犬猫细小病毒血凝性为第375位氨基酸，两种病毒在这个位置的氨基酸都为D。

表2 10株FPV/CPV及6株FPV/CPV参考分离株的VP2蛋白氨基酸序列的差异位点

表3 10株FPV/CPV及6株FPV/CPV参考分离株的VP2蛋白氨基酸序列的差异位点

用DNAstar软件中Protean程序对分离的10株FPV/CPV及6株参考毒株的VP2蛋白进行亲水性和抗原指数预测分析，结果如图2、3所示：发现16株毒株在亲水性和抗原指数方面仅存在细微差异，16株病毒VP2蛋白上存在两段明显的亲水性和抗原指数较高区域，一个位于VP2蛋白内部的350～420位氨基酸，另一个位于VP2蛋白N端的5～45位氨基酸。

因此，选取VP2蛋白内部的350～420位氨基酸作为疫苗中的蛋白。

实施例3犬猫细小病毒VP2_350-420基因原核表达重组质粒的构建及重组蛋白的表达

根据VP2_350-420基因序列设计引物(VP2_350-420F:CAGCCATATGCAAGGGCCATTTAAAACAC(SEQ ID NO.9)/VP2_350-420R:GCACCTCGAGTTAAAAGTTAATATTTTGAATC(SEQ ID NO.10))，上下游引物中已经分别加入酶切位点Nde I和Xho I，以实施例1分离的犬细小病毒CPV-A株核酸为模板，进行PCR扩增。利用限制性内切酶Nde I和Xho I对PCR产物进行双酶切，然后再与用同样限制性内切酶双酶切的原核表达载体PET-28a连接，构建重组表达质粒PET-28a-VP2_350-420。将重组质粒转化大肠杆菌TOP10后，经菌液PCR以及双酶切(Nde I和Xho I)鉴定，获得与预期大小一致的目的条带(如图4所示，M为DNA DL 5000标准分子量；1为菌液PCR结果；2为双酶切鉴定结果)，表明原核表达质粒构建成功。

将构建成功的PET-28a-VP2_350-420重组表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在37℃下经1mmol/L的IPTG诱导表达。取20mL IPTG诱导表达后的菌液，4℃离心获得菌体沉淀后，加入适量PBS缓冲液，悬浮均匀，经超声裂解后，离心，得到上清液。取上清，利用His-tag蛋白纯化磁珠纯化重组蛋白，得到纯化的His-VP2_350-420重组蛋白。分别取未加IPTG诱导的菌液、加IPTG诱导8h后的表达菌液以及纯化的His-VP2_350-420重组蛋白，进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图5所示(图中，M：蛋白质标准分子量(从上至下为150kDa、100kDa、70kDa、50kDa、35kDa、20kDa、15kDa)；1：未加IPTG诱导的0h菌液；2：IPTG诱导的8h菌液。3：纯化的His-VP2350-420重组蛋白)：目的条带有表达，大小为11.4kDa左右，与预测大小一致(VP2_350-420蛋白预测分子量7.8kDa，表达的融合蛋白His标签约3.6kDa)，纯化的重组蛋白纯度较高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种犬猫细小病毒VP2350-420蛋白及其制备方法与应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 71

<212> PRT

<213> Canine Parvovirus/Feline parvovirus

<400> 1

Gln Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln

1 5 10 15

Thr Asp Glu Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly

20 25 30

Arg Gln His Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg

35 40 45

Phe Thr Tyr Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp

50 55 60

Trp Ile Gln Asn Ile Asn Phe

65 70

<210> 2

<211> 213

<212> DNA

<213> Canine Parvovirus/Feline parvovirus

<400> 2

caagggccat ttaaaacacc tattgcagca ggacgggggg gagcgcaaac agatgaaaat 60

caagcagcag atggtgatcc aagatatgca tttggtagac aacatggtca aaaaactacc 120

acaacaggag aaacacctga gagatttaca tatatagcac atcaagatac aggaagatat 180

ccagaaggag attggattca aaatattaac ttt 213

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acggtggtca acctgctgtc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaccaaact ccccaagcat 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tggttctggg ggtgtggg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctgctggag taaatggc 18

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caggacaagt aaaaagagac aa 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

attttctagg tgctagttga ga 22

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cagccatatg caagggccat ttaaaacac 29

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcacctcgag ttaaaagtta atattttgaa tc 32

Claims

1.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为：

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为：

a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1或2所述蛋白的多核苷酸。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为如SEQ ID NO.2所示的多核苷酸。

5.一种质粒，其特征在于：所述质粒包含权利要求3或4所述的多核苷酸。

6.一种工程菌，其特征在于：所述工程菌包含权利要求5所述的质粒。

7.权利要求1或2所述的蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)扩增权利要求3或4所述的多核苷酸；

(2)构建含有步骤(1)所述的多核苷酸的质粒，转入大肠杆菌；

(3)诱导表达得到目的蛋白。

8.权利要求1或2所述的蛋白在制备预防和/或治疗犬/猫细小病毒病的药物中的应用。

9.一种疫苗，其特征在于：所述疫苗包含权利要求1或2所述的蛋白。

10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗还包含佐剂。