CN110893234A - 一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗，属于兽用生物制品领域。本发明的亚单位疫苗是以重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白作为抗原，是通过三种重组杆状病毒分别感染昆虫细胞后，经提纯处理制备而成。所述的重组杆状病毒都携带有提高蛋白表达的元件，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1；重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白都是经昆虫细胞密码子优化后的序列，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4。本发明制备的亚单位疫苗免疫犬后能够快速产生特异性抗体，可用于预防犬的犬瘟热病毒、犬细小病毒以及狂犬病病毒的感染。

Description

一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗

技术领域

本发明公开了一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗，属于兽用生物制品领域。

背景技术

犬瘟热(canine distemper)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，常引起消化道、呼吸道以及神经系统异常等症状，并能引起机体免疫抑制(MAGANGA G D,等.Molecular characterization ofcompletegenome ofa canine distemper virus associated with fatal infection in dogs inGabon,Central Africa[J].Virus Research,2018,247:21-25.)。该病传染性强、发病率和死亡率居高不下，已成为危害养犬业和经济动物养殖业的重要传染病之一。CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属的重要成员，是单股负链不分节段的RNA病毒，其基因组编码6个结构蛋白(依次为N、P、M、F、H、L)和2个非结构蛋白(C和V)。其中，H基因全长为1947nt，仅含有一个开放型阅读框，其编码的H蛋白是CDV囊膜表面的糖蛋白之一，可与靶细胞表面的受体(如SLAM和nectin-4)相互作用，介导病毒入侵宿主；同时，H蛋白存在着许多中和性抗原表位，是诱导机体产生中和抗体的主要抗原(HIRAMA K,等.Cytotoxic T-lymphocyte activityspecific for hemagglutinin(H)protein of canine distemper virus in dogs[J].Journal ofVeterinary Medical Science,2003,65(1):109-112.)。

犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)引起的一种以剧烈呕吐、腹泻、腥臭味粪便为主要表征的烈性传染病，分为出血性肠炎型和非化脓性两种(郑怡婷.犬细小病毒的诊断和防治[J].兽医导刊,2017(16):171.)。该病以发病率高、传染性强、病程快、幼犬死亡率高为特点，是犬科动物最主要的传染性病毒病之一。CPV为细小病毒科细小病毒属的无囊膜单股负链DNA病毒，基因组全长5.2kb，编码NS1、NS2两种非结构蛋白及VP1、VP2、VP3三种结构蛋白。病毒的抗原表位通常位于其衣壳蛋白上，CPV病毒衣壳由60个结构蛋白组成，其中包括53～54个VP2蛋白，占衣壳蛋总量的90％，对CPV病毒的抗原性起决定性作用(邱薇,等.犬细小病毒VP2基因的比较及分型研究[J].动物医学进展,2005,26(5):69-72.)。

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种重要的人畜共患传染病，全球流行，病死率为100％，也是我国重要的公共卫生问题。RABV基因组长约12kb，从3’到5’端依次为编码N、M1、M2、G、L蛋白的5个基因，各个基因间还含非编码的间隔序列。其中，G蛋白在囊膜上构成病毒刺突，与病毒致病性有关，是RABV的主要抗原，刺激机体产生体液和细胞免疫，也是唯一诱生中和抗体的保护性免疫抗原(徐兰,等.狂犬病毒糖蛋白研究进展[J].中国人兽共患病学报,2006,22(9):876-879.)。

现有预防上述犬病的疫苗仍为传统的灭活疫苗和弱毒疫苗，其在抗原性上已与当前流行株之间存在明显差异；再者，制备工艺存在生物安全危害、抗原量不足、成本偏高等问题。因此，研制一种安全、高效、与流行株抗原性相匹配、易于规模化生产的新型疫苗迫在眉睫。基于重组蛋白的基因工程技术开发新型亚单位疫苗已成为当前疫苗学的热点和趋势。这类亚单位疫苗不含有核酸物质，不存在潜在的病毒致病基因，安全性更高；高效的表达系统(如昆虫杆状病毒表达系统)可以保证重组蛋白的抗原性和提高重组蛋白的产量，避免传统制备工艺中存在的生物安全危害问题；另外，接种后能快速产生特异性抗体，所产生的免疫应答也能与野毒感染相区分，有利于疫病的控制、净化和消灭，这对保障养犬业的持续健康发展具有重要现实意义。

糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)被证实是蛋白与细胞膜结合的唯一方式，不同于一般的脂类修饰成分，其结构极其复杂。GPI是一种蛋白与细胞膜结合的方式，改造的GPI锚定蛋白是一类通过其羧基末端的GPI锚结构锚定于真核细胞膜表面的蛋白(MEDOF M E,等.Cell-surface engineering with GPI-anchored proteins[J].Faseb Journal Official Publication ofthe Federation ofAmerican Societies forExperimental Biology,1996,10(5):574-86.)。目前，已发现了100多种GPI锚定蛋白，并逐渐认识到在哺乳动物、昆虫、原虫、酵母中，GPI是一种非常普遍的表面蛋白锚定形式。GPI锚定蛋白是通过其羧基末端(C端)的GPI结构锚定于细胞膜表面但不跨越其磷脂双层结构的一类蛋白，如补体调节蛋白CD55、黏附蛋白CD58，在一定程度上可以取代跨膜蛋白的嵌合形式，例如将跨膜蛋白的胞外域C端与GPI锚N端串联。目前还没有采用GPI策略研制重组蛋白(亚单位)疫苗的报道。

发明内容

技术问题

本发明的目的是针对现有预防上述犬病的疫苗仍为传统的灭活疫苗和弱毒疫苗，其在抗原性上已与当前流行株之间存在明显差异；再者，制备工艺存在生物安全危害、抗原量不足、成本偏高等问题，研制一种安全、高效、与流行株抗原性相匹配、易于规模化生产的犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位新型疫苗，用于预防犬的犬瘟热病毒、犬细小病毒以及狂犬病病毒的感染。

技术方案

为达到以上目的，是通过以下技术方案实现的：

一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗，其特征在于：所述的疫苗包含有抗原和免疫佐剂，其中抗原为重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白，都是经昆虫细胞密码子优化后的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4；免疫佐剂为氢氧化铝胶。

所述的一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗，其特征在于：所述的重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白的蛋白质量比为1:1:1，每份所述的疫苗中重组犬瘟热病毒H蛋白的蛋白含量≥10μg，重组犬细小病毒VP2蛋白的蛋白含量≥10μg，重组狂犬病病毒G蛋白的蛋白含量≥10μg，三者混合抗原与免疫佐剂的体积比为3:2。

所述的一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗，其特征在于：所述的重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白是通过三种重组杆状病毒分别感染昆虫细胞后，经纯化处理制备而成，所述的重组杆状病毒都携带有提高蛋白表达的元件，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

所述一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗可以在预防犬的犬瘟热病毒、犬细小病毒以及狂犬病病毒感染中应用。

有益效果

本发明是针对现有预防上述犬病的疫苗仍为传统的灭活疫苗和弱毒疫苗，其在抗原性上已与当前流行株之间存在明显差异；再者，制备工艺存在生物安全危害、抗原量不足、成本偏高等问题，研制出的一种安全、高效、与流行株抗原性相匹配、易于规模化生产的犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位新型疫苗，用于预防犬的犬瘟热病毒、犬细小病毒以及狂犬病病毒的感染。本发明制备的亚单位疫苗免疫犬后能够快速产生特异性抗体，可用于预防犬的犬瘟热病毒、犬细小病毒以及狂犬病病毒的感染。

本发明的特点和优点如下：

1.本发明用当前犬瘟热病毒、犬细小病毒和狂犬病病毒流行株的保护性抗原序列，通过昆虫-杆状病毒表达系统制备重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白，采用亲和层析技术纯化重组蛋白，节约了生产成本，适用于大规模生产。本发明制备的亚单位疫苗不含有核酸物质,g(现有的商品疫苗是有核酸物质的)，安全性极高，免疫动物能够快速产生特异性抗体，可用于预防犬的犬瘟热病毒、犬细小病毒以及狂犬病病毒的感染。

2.本发明所述的犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗中涉及的抗原均基于当前流行株的主要保护性免疫抗原。其中，犬瘟热病毒抗原采用Asia-1型毒株H蛋白的胞外域，犬细小病毒抗原采用CPV-2c型的VP2全序列，狂犬病病毒抗原采用街毒G蛋白胞外域。然而，现有疫苗的种毒已与当前流行株存在明显的抗原性差异。因此，本专利所述的抗原在抗原匹配性上更具优势。商品疫苗是纯病毒-即活的病毒抗原，但是与现在流行的病毒在抗原性上已经发生改变。

3.本发明所述的重组蛋白是通过重组杆状病毒感染昆虫细胞后，经纯化处理制备而成。所有的重组杆状病毒均携带有提高蛋白表达的元件，该元件包含Kozak序列(增强真核基因的翻译效率)、蜂素信号肽(提高外源蛋白的可溶性表达和蛋白质修饰)、GPI序列(提高重组蛋白表达量)。另外，所述的用于编码犬瘟热病毒H蛋白、犬细小病毒VP2蛋白、狂犬病病毒G蛋白的核苷酸序列均经昆虫密码子优化。因此，本专利所述的重组蛋白在优化表达策略方面具有独创性。商品疫苗是用细胞培养病毒的方式(培养-接毒-收毒-纯化-乳化-制苗)，与本发明的策略(不一样的细胞培养系统)完全不一样。

4.所述的昆虫细胞是具有高效表达外源蛋白的悬浮High-Five昆虫细胞株，用重组杆状病毒分别感染相应细胞株的感染周期为48-72小时、产量为110-160mg/L，而采用常规昆虫Sf9细胞的感染周期为72-96小时、产量为60-90mg/L，因此采用所述的昆虫细胞能明显缩短感染周期，提高产量，减少生产成本，适用于大规模化生产。商品疫苗的制备方式与本发明的策略完全不一样，商品疫苗生产的是病毒，本发明生产的是蛋白，生产的蛋白量肯定高，且安全。

5.对犬瘟热病毒、犬细小病毒、狂犬病病毒的免疫保护结果表明，末次免疫后14天，各组分别取5只犬攻毒，口服途径感染0.1mL(含1×10⁷EID₅₀病毒)。攻毒后15天内观察犬存活情况。结果表明，除空白对照组攻毒后犬全部死亡，本发明的亚单位疫苗组和商品疫苗组犬全部存活。

具体实施方式

本专利项目组通过前期研究发现携带有GPI基序能促进外源蛋白的可溶性表达。然而，采用GPI策略表达外源蛋白虽然在技术上只是增加一个序列，但是要真正使用GPI策略，还需要对外源蛋白序列进行分析(信号肽、跨膜域等)，如需要对分析后的蛋白序列进行去除信号肽、保留胞外域等操作，这才能保证GPI基序的正常功能；如若不进行分析，直接使用蛋白全序列，则会出现蛋白不表达或表达量未提升的可能，降低蛋白的可溶性表达。因此，采用GPI策略一方面需要添加特定序列，更重要的是对蛋白序列进行专业性的预测分析和巧妙截取，才能达到利用目的。因此，借助GPI基序的新功能，通过其表达重组蛋白并制备成亚单位疫苗，需要进行一系列的摸索过程，以期适应于产业化。

(一)重组蛋白的制备

1.携带有高效表达元件的穿梭载体pFastBac-GPI的构建

根据基因表达调控的需要(基因转录、翻译，蛋白质修饰等方面)，将包含Kozak序列(增强真核基因的翻译效率)、蜂素信号肽(提高外源蛋白的可溶性表达和蛋白质修饰)、GPI序列(提高重组蛋白表达量)的高效表达元件，经昆虫细胞密码子优化，其核苷酸序列(300个核苷酸)，通过人工合成SEQ ID NO：1(由通用生物系统(安徽)有限公司合成)，再将其插入至穿梭质粒pFastBac1^TM(赛默飞世尔科技公司产品)，构建携带有高效表达元件的穿梭载体pFastBac-GPI。

2.重组杆状病毒rBV-GPI-CDV-H和rBV-CDV-H的构建

将当前流行Asia型CDV强毒株H蛋白的氨基酸序列(Protein ID：AHY03300.1)，通过在线软件(TMHMM Server,v.2.0http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)选取其胞外域，其编码的氨基酸序列(548个氨基酸)为SEQ ID NO：3，人工合成经昆虫细胞密码子优化的核酸序列为SEQ ID NO：2(由通用生物系统(安徽)有限公司合成)。在其人工合成序列两端分别引入Sal I和Kpn I酶切位点。随后，将人工合成序列分别与穿梭质粒pFastBac-GPI和pFastBac1^TM分别进行Sal I和Kpn I(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用凝胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)分别回收片段，在T4连接酶(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)的连接作用下，4℃孵育16小时，转化至E.coli DH5α感受态(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)中，获得重组穿梭质粒pFastBac-GPI-CDV-H和pFastBac-CDV-H。将该重组穿梭质粒转化至E.coli DH10 Bac感受态细胞(赛默飞世尔科技公司产品)中，使其进行同源重组，经含有三抗(卡那霉素终浓度100μg/ml、庆大霉素终浓度50μg/ml、四环素终浓度70μg/ml)的IPTG条件筛选培养基(IPTG终浓度40mg/ml，X-Gal终浓度40mg/ml，该筛选培养基可通过菌落形成颜色判定是否发生同源重组，白色菌落即代表重组成功，蓝色菌落则未成功)培养筛选48小时，挑取白斑，获得重组杆粒rBacmid-GPI-CDV-H和rBacmid-CDV-H。将该重组杆粒通过脂质体介导转染法(X-tremeGENE HP DNAtransfection Reagent，Roche公司产品)转染至Sf9昆虫细胞(赛默飞世尔科技公司产品)，转染72小时待细胞病变后，收集细胞上清液即为第一代重组杆状病毒，接着继续将第一代重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，同样培养条件下，收集第二代重组杆状病毒，以此类推，收集至第四代重组杆状病毒，并将其命名为rBV-GPI-CDV-H和rBV-CDV-H，保存-20℃备用。

3.重组杆状病毒rBV-GPI-CPV-VP2和rBV-CPV-VP2的构建

将当前流行CPV-2c型毒株VP2蛋白的氨基酸序列(Protein ID:AKP54259.1)，通过在线软件(SignalP-5.0http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)去除其信号肽序列，剩余编码的氨基酸序列(584个氨基酸)为SEQ ID NO：5，人工合成经昆虫细胞密码子优化的核酸序列为SEQ ID NO：4(由通用生物系统(安徽)有限公司合成)。参照上述重组杆状病毒的构建方式(见本发明“具体实施方式，(一)重组蛋白的制备，2.重组杆状病毒rBV-GPI-CDV-H和rBV-CDV-H的构建”章节内容)构建获得重组杆状病毒rBV-GPI-CPV-VP2和rBV-CPV-VP2，保存-20℃备用。

4.重组杆状病毒rBV-GPI-RABV-G和rBV-RABV-G的构建

将当前流行RABV街毒株VP2蛋白的氨基酸序列(Protein ID：ACB38373.1)，通过在线软件(SignalP-5.0http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/和TMHMM Server,v.2.0http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)去除其信号肽序列并选取其胞外域序列，编码的氨基酸序列(457个氨基酸)为SEQ ID NO：7，人工合成经昆虫细胞密码子优化的核酸序列为SEQ ID NO：6(由通用生物系统(安徽)有限公司合成)。参照上述重组杆状病毒的构建方式(见本发明“具体实施方式，(一)重组蛋白的制备，2.重组杆状病毒rBV-GPI-CDV-H和rBV-CDV-H的构建”章节内容)构建获得重组杆状病毒rBV-GPI-RABV-G和rBV-RABV-G，保存-20℃备用。

5.高效表达元件(GPI基序)的功能验证

将上述携带有高效表达元件的重组杆状病毒rBV-GPI-CDV-H、rBV-GPI-CPV-VP2、rBV-GPI-RABV-G和对照重组杆状病毒rBV-CDV-H、rBV-CPV-VP2、rBV-RABV-G分别感染Sf9昆虫细胞(赛默飞世尔科技公司产品)，进行病毒滴度测定(检测试剂盒为BacPAK^TMBaculovirus Rapid Titer Kit，购自宝日医生物技术(北京)有限公司)和蛋白产量测定。其中蛋白产量测定，首先根据收集液体积(以500mL为例)，经亲和层析树脂材料(购自美国GE公司)进行纯化，用PBS稀释保存，BCA蛋白定量检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)测定其浓度，计算公式为产量＝[浓度(mg/mL)×重悬体积(mL)]/培养体积(L)。

结果(见表1)显示，携带有高效表达元件的重组杆状病毒(rBV-GPI-CDV-H、rBV-GPI-CPV-VP2、rBV-GPI-RABV-G)相比于对照(未携带有高效表达元件)重组杆状病毒(rBV-CDV-H、rBV-CPV-VP2、rBV-RABV-G)在蛋白产量上得到明显提升(重组犬瘟热病毒H蛋白由32mg/L提升至60mg/L，重组犬细小病毒VP2蛋白由55mg/L提升至90mg/L，重组狂犬病病毒G蛋白由47mg/L提升至70mg/L)，而重组杆状病毒的病毒滴度和感染周期差异不显著(并未发生明显改变)。这表明GPI基序具有提高蛋白产量的功能，可高效表达本发明所涉及的重组蛋白。

表1重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞的病毒滴度、感染周期与蛋白产量测定

6.昆虫细胞株的筛选

将上述重组杆状病毒rBV-GPI-CDV-H、rBV-GPI-CPV-VP2、rBV-GPI-RABV-G分别用Sf9昆虫细胞和High-Five昆虫细胞(High Five昆虫细胞(BTI-TN-5B1-4)购自赛默飞世尔科技公司，是从亲代Trichopulsiani细胞系分离得到的克隆，通常用于使用杆状病毒表达载体系统的重组蛋白表达，这种细胞能进行无血清悬浮培养，显著节省了与无血清和/或悬浮培养时的培养物驯化相关的时间和经费。)进行病毒滴度测定(检测试剂盒为BacPAK^TMBaculovirus Rapid Titer Kit，购自宝日医生物技术(北京)有限公司)，其中无血清培养基为Express Five^TM SFM(赛默飞世尔科技公司产品)。

结果(见表2)显示，感染Sf9昆虫细胞的重组杆状病毒rBV-GPI-CDV-H、rBV-GPI-CPV-VP2、rBV-GPI-RABV-G的病毒滴度分别为2×10⁶IFU/mL、1×10⁷IFU/mL、5×10⁶IFU/mL。蛋白产量分别为60mg/L、90mg/L、70mg/L。

用High-Five昆虫细胞能使重组杆状病毒rBV-GPI-CDV-H的病毒滴度由2×10⁶IFU/mL提升至3×10⁷IFU/mL，感染周期由96小时缩短至56小时，蛋白产量由60mg/L提升至110mg/L；使重组杆状病毒rBV-GPI-CPV-VP2的病毒滴度由1×10⁷IFU/mL提升至5×10⁸IFU/mL，感染周期由72小时缩短至48小时，蛋白产量由90mg/L提升至160mg/L；使重组杆状病毒rBV-GPI-RABV-G的病毒滴度由5×10⁶IFU/mL提升至2×10⁸IFU/mL，感染周期由84小时缩短至72小时，蛋白产量由70mg/L提升至120mg/L。

综上，采用High-Five昆虫细胞可显著提高三种重组杆状病毒的病毒滴度和蛋白产量，并缩短感染周期。

表2重组杆状病毒感染Sf9和High-Five昆虫细胞的差异统计

7.重组蛋白的制备

将High-Five昆虫细胞分别扩大培养至500mL悬浮培养瓶(赛默飞世尔科技公司产品)中，于28℃、120r/min摇床培养，待细胞密度达到5×10⁶个/mL时，取重组杆状病毒rBV-GPI-CDV-H、rBV-GPI-CPV-VP2、rBV-GPI-RABV-G分别以MOI＝0.5(感染复数)感染细胞，继续培养48-72小时，收集细胞培养上清，经8000r/min离心30分钟，去除大的细胞碎片。加入灭活剂BEI(BEI全名为二乙烯亚胺，其原理是破坏病毒核酸而不破坏蛋白质，并保持病毒抗原性，相比于传统甲醛灭活方式更有优势。购自Sigma公司)，使其终浓度为0.5％，作用24小时后，取液进行灭活检验(将液接种细胞观察96小时后细胞是否出现病变，重复三次，均无出现细胞病变后确定灭活成功)。根据收集液体积(以500mL为例)，经亲和层析树脂材料(购自美国GE公司)进行纯化，用PBS稀释保存，获得的重组蛋白分别命名为重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白，经BCA蛋白定量检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)测定其蛋白浓度，-70℃保存备用。

(二)犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗的制备

1.亚单位疫苗制备

1.1抗原准备

取制备的重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白进行适当稀释，将其蛋白质量比设定为1:1:1，与氢氧化铝胶进行乳化。

1.2疫苗配制

参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》中相关疫苗制备步骤，将混合的抗原和氢氧化铝胶(购自南京天邦生物科技有限公司)按3:2的体积比例进行配苗制备，其中使疫苗中氢氧化铝胶含量以氧化铝表示不超过3.9mg/ml，再加入1％的硫柳汞溶液，使其在疫苗中的终浓度为0.01％，充分搅拌后进行分装。每份所述的疫苗中重组犬瘟热病毒H蛋白的蛋白含量≥10μg，重组犬细小病毒VP2蛋白的蛋白含量≥10μg，重组狂犬病病毒G蛋白的蛋白含量≥10μg，最终获得的犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗进行下一步成品检测。

2.亚单位疫苗成品检测

2.1性状外观

静置后，上层为澄清液体，下层为白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2.2无菌检测

无菌检测按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》进行，结果：无菌生长。

2.3安全检测

取用2月龄断奶比格犬(购自青岛博隆实验动物有限公司)，随机分为3组，5只/组，第一组不接种(作为对照)，第二组接种单剂量(4mL/只)，第三组接种高剂量(8mL/只)，分别接种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗。各组隔离饲养14日，记录其精神、饮食、粪便、体温情况以及接种部位是否出现肿胀、坏死和全身不良反应。14日时剖杀所有犬只进行病理学检测，记录免疫后14天免疫犬只精神、体温、饮食、粪便情况；接种部位是否出现肿胀、坏死等反应；免疫后14日将所有犬只剖杀，观察并记录，是否存在犬瘟热病毒、犬细小病毒、狂犬病病毒引起的相关病理变化。

结果，犬只全部存活，剖检注射部位，无因疫苗注射引起的严重局部反应，各组织脏器也无明显病理变化。

2.4效力检测

取用2月龄断奶比格犬(购自青岛博隆实验动物有限公司)10只，皮下、肌肉注射亚单位疫苗1份(4mL/只)，每3天采集血清进行抗体效价测定(抗体检测试剂盒购自长春西诺生物科技有限公司)。通过抗体检测试剂盒检测结果显示亚单位疫苗组在免疫后第3天即可产生，免疫维持期至少达4个月。

(三)犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗的应用

1.免疫方案

用2月龄断奶比格犬(购自青岛博隆实验动物有限公司)45只，皮下、肌肉注射亚单位疫苗1份(4mL/只)，同时设立同类商品疫苗(由于目前尚未有商品化的犬瘟热、犬细小病毒病和狂犬病三联疫苗，因此本试验采用犬狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒与犬细小病毒病五联活疫苗，购自吉林省五星动物保健药厂)和空白对照各15只；免疫后14天后加强免疫一次。

2.攻毒保护试验

2.1对犬瘟热病毒的免疫保护

末次免疫后14天，各组分别取5只犬进行犬瘟热病毒Asia-1型毒株(购自华威特(江苏)生物制药有限公司)攻毒，口服途径感染0.1mL(含1×10⁷EID₅₀病毒)。攻毒后15天内观察犬存活情况。结果表明，除空白对照组攻毒后犬全部死亡，本发明的亚单位疫苗组和商品疫苗组犬全部存活。

2.2对犬细小病毒的免疫保护

末次免疫后14天，各组分别取5只犬进行犬细小病毒CPV-2c型毒株(购自华威特(江苏)生物制药有限公司)攻毒，口服途径感染0.1mL(含1×10⁶TCID₅₀病毒)。攻毒后15天内观察犬存活情况。结果表明，除空白对照组攻毒后犬全部死亡，本发明的亚单位疫苗组和商品疫苗组犬全部存活。

2.3对狂犬病病毒的免疫保护

末次免疫后14天，各组分别取5只犬进行狂犬病病毒街毒株(购自中国兽医药品监察所)攻毒，口服途径感染0.1mL(含1×10⁶TCID₅₀病毒)。攻毒后15天内观察犬存活情况。结果表明，除空白对照组攻毒后犬全部死亡，本发明的亚单位疫苗组和商品疫苗组犬全部存活。

本发明公开了一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗，属于兽用生物制品领域。本发明的亚单位疫苗是基于当前流行株的主要保护性免疫抗原，以重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白作为抗原，是通过三种重组杆状病毒分别感染昆虫细胞后，经提纯处理制备而成。其中，三种重组杆状病毒都携带有提高蛋白表达的元件以及携带有用于编码犬瘟热病毒H蛋白、犬细小病毒VP2蛋白以及狂犬病病毒G蛋白的核苷酸片段。另外，采用High-Five昆虫细胞可显著提高三种重组杆状病毒的病毒滴度和蛋白产量，并缩短感染周期。本发明制备的亚单位疫苗免疫犬后能够快速产生特异性抗体，可用于预防犬的犬瘟热病毒、犬细小病毒以及狂犬病病毒的感染。

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2

SEQ ID NO：3

SEQ ID NO：4

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗

<141> 2019-12-06

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccaccatga aattcttagt caacgttgcc cttgttttta tggtcgtata catttcttac 60

atctatgcgg atcgatgggg acatcaccat caccatcacg attacgatat cccaacgacc 120

gaaaacctgt attttcaggg caagggctct gtcgacgagt ctagagcctg cagtctcgag 180

ggtaccccaa ataaaggcag cggcaccacc agcggcacca cccgcctcct gagcggcatg 240

acctgcttca ccctgaccgg cctgctgggc accctggtga ccatgggcct gctgacctga 300

<210> 2

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgatttcacc aagtatcaac tagcaatatg gaatttagca gattgctgaa agaggatatg 60

gagaaatcag aggccgtaca tcaccaagtc atagatgtct tgacaccgct cttcaaaatt 120

attggagatg agattggttt acggttgcca caaaaactaa acgagatcaa acaatttatc 180

ctccaaaaga caaacttctt caatccgaac agggagttcg acttccgcga tctccactgg 240

tgtattaacc cgcctagcaa gatcaaggtg aattttacta attactgtga tacagttggg 300

gtcaaaaaat ctattgcatc agcagcaaat cccatcattt tgtcagcact ctccggggcc 360

agaggtgaca tattcccgcc gtacagatgc agtggagcta ctacttcagt aggcagagta 420

ttccccctat ccgtatcatt atccatgtct ttgatatcaa gaacatcaga gataatcaat 480

atgctaaccg ctatctcaga cggagtgtat ggtaaaactt atttgctagt gcctgattat 540

attgaagggg agttcgactc gcaaaagatt cgagtctttg agatagggtt tatcaaacgg 600

tggctgaatg acatgccttt actccagaca accaactata tggtcctccc ggaaacttcc 660

aaagccaagg tatgtactat agcagtgggt gagctgacac tagcttcctt gtgtgtagat 720

gagagcactg tattgttata tcatgacagc aacggttcac aagatggtat cctagtagtg 780

acattgggaa tatttggggc aacacctatg gatcaagttg aagaggtgat acctatcgct 840

cacccatcag tggagagaat acatataaca aatcaccgtg ggttcataaa agactcaata 900

gtaacctgga tggtgcctgt attggtctct gagaaacaag aggagcaaaa aaactgtctg 960

gagtctgctt gtcacagaaa atcctaccct atgtgcaacc aaacgtcatg ggaacccttt 1020

ggaggagggc agttgccttc ttatgggcgg ttgacagtac ctctagatcc aagcattgac 1080

cttcaactta acatatcatt tacatatggt ccggttatac tgaacggaga cggtatggat 1140

tattatgaaa gcccactttt ggactccgga tggcttacca tacctcctaa gaacgggaca 1200

gtccttggat tgataaacaa agcaagtaga ggagaccagt tcactgtgac cccccatgtg 1260

ttgacatttg cgcccaggga atcaagtgga aattgttatt tacctattca aacatcccag 1320

attatggata aagatgtcct gactgagtcc aatttagtgg tgttacctac acagaatttt 1380

agatatgtca tagcaacata tgatatatcc cggggcgatc atgcaattgt ttattatgtt 1440

tatgacccaa tccggacgat ttcttataca tacccattta gactaactac caagggtaga 1500

cctgatttcc taaggattga atgttttgtg tgggatgacg atttgtggtg tcatcaattt 1560

taccgattcg aggctaacat cactaactct acaactagtg ttgagaattt agtacgtata 1620

agattctcat gtaaccgttc aaaacct 1647

<210> 3

<211> 1752

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagtgatg gaggagttca accagacggt ggtcaacctg ctgtcagaaa tgaaagagct 60

acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120

tctacgggta cttttaataa tcagacggaa ttcaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180

atcacagcaa actcaagcag acttgtgcat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 240

agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaacg gaaacatggc tttagatgat 300

actcatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360

tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgagttgca tttagttagt 420

tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480

ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagtaat 540

aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600

aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660

tctcatactg gaactagtgg cacaccaaca aatatatacc atggtacaga tccagatgat 720

gttcaatttt acactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac aggtgatgaa 780

tttgctacag gaacatttta ttttgattgt aaaccatgca gactaacaca tacatggcaa 840

acaaatagag cattgggctt accaccattt ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggaggt 900

actaactttg gttatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga 960

aacacaaaca ttattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca 1020

ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat tgcagcagga 1080

cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcga gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt 1140

ggtagacaac atggtcaaaa aactaccaca acaggagaaa cacctgagag atttacatat 1200

atagcacatc aagatacagg aagatatcca gaaggagatt ggattcaaaa tattaacttt 1260

aaccttcctg taacagaaga taatgtattg ctaccaacag atccaattgg aggtaaaaca 1320

ggaattaact atactaatat atttaatact tatggtcctt taactgcatt aaataatgta 1380

ccaccagttt atccaaatgg tcaaatttgg gataaagaat ttgatactga cttaaaacca 1440

agacttcatg taaatgcacc atttgtttgt caaaataatt gtcctggtca attatttgta 1500

aaagttgcac ctaatttaac aaatgaatat gatcctgatg catctgctaa tatgtcaaga 1560

attgtaactt actcagattt ttggtggaaa ggtaaattag tatttaaagc taaactaaga 1620

gcctctcata cttggaatcc aattcaacaa atgagtatca atgtagataa ccaatttaac 1680

tatgtaccaa gtaatattgg aggtatgaaa attgtatatg aaaaatctca actagcacct 1740

agaaaattat at 1752

<210> 4

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaattcccca tttacacgat accagacaaa cttggtccat ggagtcccat cgatatacat 60

catctcagct gtccgaacaa tctggttgtg gaagatgaag gatgcaccaa tttgtctgga 120

ttttcctaca tggaactcaa agtgggatat agttcagcca taaaagtgaa cggattcacc 180

tgtacaggtg tggtgaccga agcagaaacc tacactaact ttgttggtta tgtcaccacc 240

acgtttaaga gaaagcactt tcgccctatg ccggatgcgt gcagagccgc atacaactgg 300

aagatggctg gtgaccccag gtatgaagag tctctgcaca atccgtaccc cgactaccac 360

tggctccgaa ctgtcaagac caccaaggag tcccttgtca tcatatctcc gagcgttaca 420

gatttggacc cgtacgataa atcccttcac tcgagagttt ttcctggcgg aaaatgctca 480

ggaataaccg tgtcctccac ttgctgctct actaaccacg actacaccat ctggatgcct 540

gaaaatccta gactgggaac ttcatgtgac attttcacca atagtagagg gaagagagca 600

tccaaagggg gcaagacttg tggatttgtg gatgaaagag gcttgtacaa gtctctaaag 660

ggagcatgca agctgaagct atgtggggtt ctaggactta gacttatgga cggaacatgg 720

gtcgcgattc agacatcaga tgagatcaaa tggtgctctc ctgatcagct agtaaatcta 780

cacgactttc actcggatga gattgaacat cttgttgtgg aggagttggt caaaaagagg 840

gaagagtgtc tggacgcact ggagactatt atgaccacaa agtccgtgag tttcagacgt 900

cttagtcatt tgaggaagct agtccctggg tttggaaagg cgtataccat attcaacaaa 960

accttgatgg aggctgatgc tcactacaaa tcaatccgga cttggaatga aatcatcccc 1020

tccaaagggt gtttaagagt tggggggaga tgtcatcctc atgtgaacgg ggtgttcttc 1080

aacggcatta tactgggtcc tgacggacat gttctaatcc cagagatgca gtcgtccctc 1140

ctccaccagc atatggaatt gttggagtcc tcagtcatcc ctttgatgca tcccttagca 1200

gacccgtcaa cagtctttaa agacggcgac gaggcagagg actttgttga ggttcacctt 1260

ccggatgtgc acaagcagat ctcgggggtt gatcttggtc tcccaaactg ggggaagtat 1320

gtgctgataa gtgcaggtgc tttgactgca ttaatgttga cgattttctt a 1371

Claims (5)

1.一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗，其特征在于：所述的疫苗包含有抗原和免疫佐剂，其中抗原为重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白，都是经昆虫细胞密码子优化后的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4；免疫佐剂为氢氧化铝胶。

2.根据权利要求1所述的一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗，其特征在于：所述的重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白的蛋白质量比为1:1:1，每份所述的疫苗中重组犬瘟热病毒H蛋白的蛋白含量≥10μg，重组犬细小病毒VP2蛋白的蛋白含量≥10μg，重组狂犬病病毒G蛋白的蛋白含量≥10μg，三者混合抗原与免疫佐剂的体积比为3:2。

3.根据权利要求1或2所述的一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗，其特征在于：所述的重组犬瘟热病毒H蛋白、重组犬细小病毒VP2蛋白以及重组狂犬病病毒G蛋白是通过三种重组杆状病毒分别感染昆虫细胞后，经纯化处理制备而成，所述的重组杆状病毒都携带有提高蛋白表达的元件，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

4.权利要求1-3之一所述一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，是指所述一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗在预防犬的犬瘟热病毒、犬细小病毒以及狂犬病病毒感染中的应用。