CN102276725B

CN102276725B - 隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及应用

Info

Publication number: CN102276725B
Application number: CN2010102001176A
Authority: CN
Inventors: 陈兆国; 李艳; 米荣升; 黄燕; 周鹏
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2010-06-13
Filing date: 2010-06-13
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2030-06-13
Also published as: CN102276725A

Abstract

本发明公开了一种隐孢子虫CTL和Th混合多表位融合蛋白，其包含：SEQ ID NO.1、SEQID NO.3中任意一条或两条氨基酸序列。本发明还公开了隐孢子虫混合多表位基因，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。本发明隐孢子虫混合多表位基因和融合蛋白，能制成疫苗，对小鼠隐孢子虫感染具有很好的免疫保护效果，适于作为抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

Description

隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及其应用。

背景技术

隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)引起的一种世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病，可以感染包括人类在内的哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类等170多种动物。对免疫功能正常的宿主可引起自限性腹泻，对免疫功能受损的宿主则呈慢性腹泻并常常危及生命，给人类健康和生命安全带来了严重威胁，也给畜牧业生产造成了巨大的损失。隐孢子虫最先由Tyzzer于1907年在小鼠胃腺粘膜组织切片中发现。其中，微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是最主要的人兽共患病病原。迄今为止，研究人员已在实验室筛选了上千种化学药物和抗生素，仍未找到理想的抗隐孢子虫药物。因此隐孢子虫病的免疫预防和治疗就显得十分重要，但目前仍缺乏有效的隐孢子虫病预防疫苗。

在以往的隐孢子虫疫苗研究中，人们通常在重组疫苗中编码一个全长的隐孢子虫抗原蛋白。但是，此类单一的疫苗候选分子的免疫保护效果并不理想，其原因可能是隐孢子虫基因组巨大，生活史复杂，抗原种类繁多，单一的抗原无法彻底阻断病原在宿主体内的生活周期，导致单一抗原、单一表位的免疫保护效果不够理想。考虑使用多抗原疫苗时，由于载体容量有限，并且大分子蛋白可能会造成动物免疫病理反应，所以在单一载体中加入多个抗原存在很大的局限性。近年来，国际寄生虫学界开始尝试利用抗原表位预测工具进行抗原表位预测，构建多表位疫苗(multi-epitope vaccine)，多表位疫苗也称鸡尾酒式疫苗，是同时携带多个与目标抗原相关的表位及辅助性表位的疫苗。与传统疫苗相比，多表位疫苗具有独特的优势，能被多种遗传背景的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子所识别、结合，从而得到高效的递呈，尤其在细胞免疫方面具有显著的优势，以应对病原微生物的变异以及免疫反应中诸多的不利因素。在抗疟疾多表位疫苗研制领域，已设计合成了多个基因工程疫苗和合成肽疫苗，取得了较好的免疫保护效果，其中不少已进入Ⅱ期或Ⅲ期临床试验。在隐孢子虫领域目前尚无这方面的报道。

为使机体获得最佳的免疫保护，构建多表位疫苗时需综合考虑机体的免疫应答特征和疾病的特殊性，针对性地选择目的抗原表位。体液免疫主要通过B细胞产生抗体来发挥作用，故可以选择特异性B细胞表位来定向诱导宿主的体液免疫应答。细胞免疫应答包括CD4⁺辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞，分为Th1与Th2两个亚群)应答和CD8⁺细胞毒性T细胞(cytotoxicT lymphocyte，CTL)应答。因此，可根据机体对病原体的免疫应答特点，选择特异性的Th1、Th2或CTL表位来诱导机体免疫应答向Th1、Th2或CTL应答类型定向发展。

细胞免疫在宿主抗隐孢子虫感染过程中起着至关重要的作用。研究显示微小隐孢子虫初次和再次感染均引起强烈的细胞免疫反应，其中CD4⁺辅助性T细胞参与控制感染，CD8⁺细胞毒性T细胞则有很强的清除寄生虫的作用。

发明内容

本发明要解决缺少有效的隐孢子虫多表位疫苗的技术问题，提供一种隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白，该混合多表位基因和融合蛋白可用于制备抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

此外，还需要提供一种隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种隐孢子虫混合多表位融合蛋白，包含：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3中任意一条或两条氨基酸序列。

所述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3都富含CTL和Th表位，SEQ ID NO.1中含有4个CTL表位和2个Th表位，SEQ ID NO.3中含有3个CTL表位和1个Th表位。

优选的，所述隐孢子虫混合多表位融合蛋白还包含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，该序列中含有4个Th表位。增加SEQ ID NO.2序列可适当提高免疫肽分子量，以使免疫小鼠产生更高的血清抗体效价、具有更好免疫原性。

优选的，所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3三段序列之间设有柔性氨基酸组成的接头序列，该接头序列能使各段富含CTL和Th表位的氨基酸序列在空间上互相独立，防止各表位多肽分子由于空间结构发生变化而阻碍其和MHC(主要组织相容性复合体，具有抗原呈递作用)分子的结合；同时接头序列可适当提高免疫肽分子量，以增强多表位融合蛋白的免疫原性。

更优选的，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种隐孢子虫混合多表位基因，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。

优选的，所述隐孢子虫混合多表位基因具有编码SEQ ID NO.7所示氨基酸序列的核苷酸序列。更优选的，所述隐孢子虫混合多表位基因具有SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述隐孢子虫混合多表位基因的重组载体。

所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表达载体、重组真核表达载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗，包含上述隐孢子虫混合多表位基因和表达载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种隐孢子虫混合多表位融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

在本发明中，将融合蛋白与弗氏不完全和完全佐剂、Montanide ISA 206等充分混匀制备亚单位疫苗。

在本发明的另一方面，还提供了一种隐孢子虫混合多表位基因在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

在本发明中，将隐孢子虫混合多表位基因克隆到真核表达载体如pVAX1、pcDNA3.1等，或共同插入细胞因子基因，构建成核酸疫苗。

本发明隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因，克隆到真核表达载体后形成的核酸疫苗，经动物免疫保护试验结果表明，与对照组相比，本发明核酸疫苗组排出卵囊数量明显减少，开始排出卵囊时间延后，卵囊排出持续时间明显缩短，提示该核酸疫苗对小鼠隐孢子虫鼠基因型感染有很好的免疫保护效果。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例2隐孢子虫P1、P2和P3基因片段的PCR扩增产物电泳结果图；

图2是本发明实施例2隐孢子虫混合多表位融合基因P1-2和CpT的PCR扩增产物电泳结果图；

图3是本发明实施例2重组质粒pMD-CpT双酶切产物电泳结果图；

图4是本发明实施例3重组原核表达质粒pGEX-CpT的双酶切鉴定电泳图；

图5是本发明实施例3重组蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳图；

图6是本发明实施例3重组蛋白表达产物经纯化后的SDS-PAGE电泳结果图；

图7是本发明实施例4隐孢子虫混合多表位基因PCR扩增产物电泳鉴定图；

图8是本发明实施例4重组克隆载体pMD18T-CpT(e)的双酶切鉴定电泳结果图；

图9是本发明实施例4重组真核表达质粒pVAX-1-CpT的双酶切鉴定图；

图10是本发明实施例5重组真核表达质粒pVAX-1-CpT作为核酸疫苗免疫后小鼠隐孢子虫卵囊排出曲线图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本发明利用生物信息学技术，对微小隐孢子虫疫苗候选抗原与宿主MHCⅠ类分子H2-Kd、H2-Ld和H2-Dd以及MHCⅡ类分子H2-Ad、H2-Ed结合的表位分别进行预测，筛选出理想的抗原表位；选取多个富含CTL和Th表位的不同抗原片段，构建包含一个或多个抗原片段、且富含CTL和Th表位的多价多表位基因，各抗原片段之间用柔性氨基酸链接。将该多表位基因克隆到原核表达载体中进行原核表达；将该多表位基因克隆到真核表达载体，构建核酸疫苗，观察其对小鼠隐孢子虫感染的免疫保护效果。动物免疫保护试验结果显示，与对照组相比，核酸疫苗组排出卵囊数量明显减少，开始排出卵囊时间延后，卵囊排出持续时间明显缩短，提示该核酸疫苗对小鼠隐孢子虫鼠基因型感染有很好的免疫保护效果。

实施例1隐孢子虫T细胞抗原表位的预测和筛选

从GenBank下载微小隐孢子虫抗原CP15(登录号L34568)、CP15/60(登录号L08612)的氨基酸(Amino Acid，AA)和基因序列，从实验室获得隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidiummousegenotype)P23抗原氨基酸及基因序列。运用SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/home.htm)、ProPred-I(http://www.imtech.res.in/raghava/propred1/)和NetMHC 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)3个表位预测服务器，分别对上述隐孢子虫抗原同鼠源9个氨基酸残基的H2-d(包括H2-Kd、H2-Ld和H2-Dd)型MHC Ⅰ类分子结合的限制性CTL表位进行预测。具体方法为：预测H2-Kd、H2-Ld限制性表位时，将抗原氨基酸序列分别输入服务器，保存SYFPEITH I预测分值大于20的9肽；同时保存ProPred-I返回结果的前15位；寻找二者的重复序列。按照文献[Panagiotopoulos C，Qin H，Tan R，et al.Identification of a β-cell-specific HLA class I restricted epitope in type 1 diabetes[J].Diabetes，2003，52(11)：2647-2651]报道的方法，计算两者所含MHC Ⅰ类分子结合9肽的得分并排序，选取得分明显大于其他肽段的序列。结合NetMHC 3.0预测结果，进行综合分析。预测H2-Dd限制性表位时，保存ProPred-I返回结果的前15位，结合NetMHC 3.0预测结果进行综合分析。

运用RANKPEP(http://bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/)、MHCPred(http://www.jenner.ac.uk/MHCPred)、MHC2Pred(http://www.imtech.res.in/raghava/mhc2pred/)和MHC BindingPrediction(http://epitope.liai.org：8080/tools/matrix/iedb_input？matrixClass＝I，II)4个表位预测服务器预测3个隐孢子虫抗原同鼠源H2-d(包括H2-Ad和H2-Ed)型MHCⅡ类分子结合的Th表位。具体方法是，将隐孢子虫抗原的氨基酸序列分别以FASTA格式输入以上服务器，返回的表位数据存至word文档。若氨基酸序列长度大于1000个AA残基时，保存得分高的前20个表位，否则取前15个表位。保存RANKPEP显示为红色的返回结果。找出4个服务器预测结果重复率大于60％的片段(即有5个以上重复氨基酸残基)取其并集，将序列向两端各延长1-6个序列作为鼠源H2-d型分子结合的候选表位。

结果：经过预测，发现微小隐孢子虫CP15抗原5-59AA区段(SEQ ID NO.1)、隐孢子虫鼠基因型P23抗原的1-113AA区段(SEQ ID NO.2)、微小隐孢子虫CP15/60抗原的11-95AA区段(SEQ ID NO.3)分别含有4、0、3个CTL表位，包括H2-Kd型表位2个，H2-Ld型3个，H2-Dd型2个；分别含有2、4、1个Th表位。与其他区段相比，上述区段所含的T细胞表位较多，是CTL和Th表位富集区域，故选择这3段序列构建CTL和Th混合多表位基因，并将CP15抗原5-59AA区段、P23抗原的1-113AA区段、CP15/60抗原的11-95AA区段编码的核苷酸序列SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，依次命名为P1、P2和P3。

实施例2隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因的扩增和鉴定

(1)引物的合成

根据筛选的隐孢子虫抗原CP15、P23和CP15/60表位富集区域编码的核苷酸序列，按照重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extension，gene SOEing)PCR技术方法要求，设计3对引物，分别扩增基因片段P1、P2和P3。引物序列见表1，在P1上游引物(P1F)的5’端加上适当的保护性碱基、限制性内切酶EcoR I序列；在P2的上游引物(P2F)和P1的下游引物(P1R)的5’端加上互补的一个15氨基酸多肽接头的DNA序列；在P2的下游引物(P2R)和P3上游引物(P3F)的5’端加上柔性氨基酸接头GS的DNA序列；在P3下游引物(P3R)的5’端加上限制性内切酶Sal I序列、终止密码子TAA和保护性碱基。引物交由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

表1PCR引物序列

在表1中，引物序列的加粗字体为酶切位点或Linker序列。

(2)目的基因的扩增与连接

以实验室保存的隐孢子虫重组质粒pMD-18T-CP15、pMD-18T-P23、pMD-18T-CP15/60的DH5α转化菌为模板，用表1的引物通过PCR分别扩增目的片段P1、P2、P3。结果如图1所示，扩增片段大小与预期大小相符。图1中，M：100bp DNA分子量标准；1：P1扩增产物；2：P2扩增产物；3：P3扩增产物。序列测定结果显示，P1大小为225bp，P2大小为393bp，P3大小为276bp，未发生序列变异。

PCR产物用胶回收试剂盒回收，通过gene SOEing PCR技术连接P1、P2片段，命名为P1-2。用胶回收试剂盒回收P1-2，再次通过gene SOEing PCR技术连接P1-2和P3，命名为CpT。电泳结果显示，P1-2和CpT的大小与预期相符(见图2)。图2中，M：100bp DNA分子量标准；1：P1-2扩增产物；2：CpT扩增产物。

用胶回收试剂盒回收CpT，采用TA克隆方法将目的基因与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，用PCR、酶切和测序法验证。经EcoR I和Sal I酶切鉴定正确(见图3)后，进行序列测定，结果显示其大小为837bp(SEQ ID NO.8)，其中16-828位核苷酸为编码区序列，该编码区序列中，16-18位核苷酸ATG为起始密码子，826-828位核苷酸TAA为终止密码子，整个序列未发生序列变异。鉴定正确的重组质粒命名为pMD-CpT。图3中，M1：100bp DNA分子量标准；M2：Marker Ⅳ DNA分子量标准；1：重组质粒pMD-CpT的EcoR I和Sal I双酶切产物。

CpT的具体序列为：

CCGGAATTCCCGACCATGAAATTGGATGAGGTTGTTGAGCTTTTACCAGCACGTAAAAGACGTAAGATAGCCAGAGGTTGTCTTAACAGAAGAACTGCAGCTTTTATCGCAAAGCTCCGCAAATCTAAGGCTGAATGTCCAATGGGAGAGAAACCTGTTGCTGTTCGTACCCATTTACGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGATGGGTTGTTCATCATCAAAGCCAGAAACTAAAGTTGCTGAAAATAAATCTGCAGCAGATGCTAACAAACAAAGAGAATTAGCTGAAAAGAAGGCTCAATTAGCCAAGGCTGTAAAGAATCCAGCTCCAATCAGCAACCAAGCTCAACAAAAGCCAGAAGAACCAAAGAAGTCCGAGCCTGCTCCAAATAACCCTCCAGCTGCTGATGCGCCAGCAGCCCAAGCTCCTGCTGCCCCTGCCCCTGCTGCCCCTGCTTCACAGGATAAGCCAGCTGAGGCTCCAGCTGCTGAAGCTCCAGCTGCTGAACCTGCTGCTCAACAAGACAAGCCAGCTGATGCCGGATCCATGGGTAACTTGAAATCCTGTTGTTCTTTTGCCGATGAACACTCCCTAACCTCTACTCAACTAGTAGTTGGAAATGGTTCAGGAGCTTCAGAAACTGCTTCCAACCACCCCCAAGAAGAAGTTAATGATATTAATACTTTTAATGTAAAGTTAATAATGCAAGATAGAAGTAAGCTTGACTGTGAGGTAGTATTTGATAGCACAAGTATTTCGCTTTCTGGAGATGGAAAATGCAGAAATATTGCTTTGGATGAATAAGTCGACGGG(SEQ ID NO.8)

共编码270个AA，序列为：

MKLDEVVELLPARKRRKIARGCLNRRTAAFIAKLRKSKAECPMGEKPVAVRTHLRGGGGSGGGGSGGGGSMGCSSSKPETKVAENKSAADANKQRELAEKKAQLAKAVKNPAP I SNQAQQKPEEPKKSEPAPNNPPAADAPAAQAPAAPAPAAPASQDKPAEAPAAEAPAAEPAAQQDKPADAGSMGNLKSCCSFADEHSLTSTQLVVGNGSGASETASNHPQEEVNDINTFNVKLIMQDRSKLDCEVVFDSTSISLSGDGKCRNIALDE(SEQ ID NO.7)

实施例3隐孢子虫混合多表位基因的原核表达

(1)原核表达质粒的构建与鉴定

取pGEX-4T-1质粒和pMD-CpT质粒，分别同时用EcoR I和Sal I酶切。酶切产物用胶回收试剂盒回收后用T₄DNA连接酶连接。连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落。碱裂解法提取重组质粒，经PCR、EcoR I和Sal I双酶切鉴定及测序鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组原核表达质粒命名为pGEX-CpT。重组原核表达质粒pGEX-CpT经EcoR I和Sal I双酶切鉴定结果如图4所示，图4中，1：pGEX-CpT的EcoR I和Sal I双酶切产物；M：Marker Ⅳ DNA分子质量标准，图4表明重组原核表达质粒pGEX-CpT经EcoR I和Sal I双酶切鉴定正确。

(2)原核表达质粒的诱导表达

将pGEX-CpT转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性单菌落，培养至D_600nm达0.5左右时，以终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导7h，期间每隔1h取样，进行浓度为12％的SDS-PAGE电泳，观察蛋白表达情况。经IPTG诱导5h后表达量达到最高(见图5)，SDS-PAGE分析蛋白的分子量比预计的57ku略大。在图5中，1-3：重组质粒转化菌IPTG诱导5h产物；4：重组质粒转化菌未诱导表达产物；M：蛋白质标准分子量。

取IPTG诱导5h的表达菌，经液氮冻融3次并进行超声波裂解，收集上清液，沉淀加8mol/L尿素溶解，离心后分别收集上清液和沉淀，经GST柱纯化后用SDS-PAGE分析重组蛋白的存在形式(见图6)。图6中，M：蛋白质标准分子量；1：pGEX-CpT转化菌诱导5h菌液；2：pGEX-CpT转化菌诱导5h菌液超声裂解后的上清；3：pGEX-CpT转化菌诱导5h菌液超声裂解后的沉淀溶于8mol/L尿素中；4：pGEX-CpT转化菌诱导5h菌液超声裂解后的沉淀溶于PBS。BandScan软件分析显示，表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的12.3％，主要以包涵体形式表达。

实施例4隐孢子虫混合多表位基因真核重组表达质粒的构建

(1)引物的设计和合成

为使隐孢子虫多表位基因CpT正确克隆到真核表达质粒中并正常表达，根据pVAX1载体多克隆位点上酶切位点及三联密码子要求重新设计引物扩增CpT(e)，引物引入限制性酶切位点EcoR I和Xba I及Kozak序列，在EcoR I后补充碱基保证三联体密码子不错位。该引物序列的上游引物CpT F(e)为：CCGGAATTCCCGACCATGGCTATGAAATTGGATGAGGTTGTTG(SEQ IDNO.15)；下游引物CpT R(e)为：CCCTCTAGATTATTCATCCAAAGCAATATTTCT(SEQ ID NO.16)。

(2)目的基因的扩增、克隆和鉴定

以pMD-CpT重组质粒转化菌为模板，利用引物CpT F(e)/CpT R(e)，扩增目的片段CpT(e)。经过30个循环的PCR扩增，获得了CpT(e)基因，大小与预计相符(见图7)。图7中，M：100bp DNA分子质量标准；1：CpT(e)PCR扩增产物。

用胶回收试剂盒回收CpT(e)，采用TA克隆方法将目的基因与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，用PCR、EcoR I/Xba I双酶切和测序法进行验证，鉴定正确的重组质粒命名为pMD-CpT(e)。重组质粒pMD-CpT(e)经EcoR I/Xba I双酶切后得到2条带，与预计片段大小相同(见图8)。图8中，M1：100bp DNA分子量标准；M2：MarkerⅣDNA分子量标准；1：重组质粒pMD-CpT(e)的EcoR I和Xba I双酶切产物。经测序鉴定序列未发生碱基突变。

(3)真核重组表达质粒的构建

大量提取重组质粒pMD-CpT(e)和真核表达质粒pVAX-1，用EcoR I和Xba I分别进行酶切，酶切产物经胶回收试剂盒回收后用T₄DNA连接酶连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落，碱裂解法提取重组质粒，经PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆，将鉴定正确的真核重组表达质粒命名为pVAX-1-CpT。pVAX-1-CpT经EcoR I和Xba I双酶切鉴定，得到与预计片段大小相符的片段(见图9)。图9中，M1：MarkerⅣDNA分子量标准；M2：100bp DNA分子量标准；1：真核重组表达质粒pVAX-1-CpT的EcoR I和Xba I双酶切产物。pVAX-1-CpT经测序鉴定未发生碱基突变，插入的序列符合开放阅读框的三联体密码子顺序。

用碱裂解法大量提取pVAX-1-CpT质粒，聚乙二醇(PEG8000)沉淀法纯化质粒DNA，GEHeal thcare NanoVue紫外可见光分光光度计测定质粒浓度。

实施例5动物免疫保护试验

将30只4周龄BALB/c小鼠分成3组，每组10只，包括pVAX-1-CpT试验组和pVAX-1空载体、生理盐水对照组。试验组用重组真核表达质粒pVAX-1-CpT经生理盐水稀释后进行背部皮下多点免疫，每只小鼠注射质粒0.05mg；2个对照组以相同的方法分别注射pVAX-1空载体和生理盐水，pVAX-1免疫剂量亦为0.05mg/只小鼠，生理盐水对照组接种剂量为0.05mL/只小鼠。每2周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫2周后，每只小鼠经口接种1×10⁶个隐孢子虫鼠基因型卵囊。感染后每隔2d采取粪便10g，加40mL水溶解，铜纱网过滤，滤液3000r/min离心10min，收集沉淀。加10mL饱和蔗糖混匀，1500r/min离心10min。用铁丝圈蘸取液面表层至载玻片上，盖上盖玻片，用10×40倍显微镜镜检，对50个视野内的隐孢子虫卵囊进行计数。

结果：

与对照组相比，试验组开始排出卵囊时间延后。至感染后31d，核酸疫苗pVAX-1-CpT仅于感染后第10d检测到卵囊；pVAX-1空载体组于感染后第10d检测到卵囊，第16d达到高峰，至试验结束即接种后第31d，仍有卵囊排出；而生理盐水对照组于感染后第7d开始检测到卵囊，13-19d达到高峰，至感染后第31d仍有卵囊排出(图7)。

与对照组相比，试验组所排出卵囊数量明显减少。各组小鼠粪便中隐孢子虫卵囊排出情况如图10所示，31天各组总共检测到的相对卵囊数依次为：pVAX-1-CpT免疫组2个；pVAX-1空载体对照：16个；生理盐水空白对照：20个，差异非常显著。

与对照组相比，试验组卵囊排出持续时间明显减少。pVAX-1-CpT试验组仅于感染后第10d检测到卵囊；pVAX-1空载体组排卵囊持续时间超过21d；生理盐水对照组排卵囊时间超过24d(见图10)。

图10结果表明本发明重组真核表达质粒pVAX-1-CpT制成的核酸疫苗具有很好的免疫保护效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及其应用

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>55

<212>PRT

<213>Cryptosporidium parvum

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(55)

<223>CP15抗原片段

<400>1

Met Lys Leu Asp Glu Val Val Glu Leu Leu Pro Ala Arg Lys Arg Arg

1 5 10 15

Lys Ile Ala Arg Gly Cys Leu Asn Arg Arg Thr Ala Ala Phe Ile Ala

20 25 30

Lys Leu Arg Lys Ser Lys Ala Glu Cys Pro Met Gly Glu Lys Pro Val

35 40 45

Ala Val Arg Thr His Leu Arg

50 55

<210>2

<211>113

<212>PRT

<213>Cryptosporidium mouse genotype

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(113)

<223>P23抗原

<400>2

Met Gly Cys Ser Ser Ser Lys Pro Glu Thr Lys Val Ala Glu Asn Lys

1 5 10 15

Ser Ala Ala Asp Ala Asn Lys Gln Arg Glu Leu Ala Glu Lys Lys Ala

20 25 30

Gln Leu Ala Lys Ala Val Lys Asn Pro Ala Pro Ile Ser Asn Gln Ala

35 40 45

Gln Gln Lys Pro Glu Glu Pro Lys Lys Ser Glu Pro Ala Pro Asn Asn

50 55 60

Pro Pro Ala Ala Asp Ala Pro Ala Ala Gln Ala Pro Ala Ala Pro Ala

65 70 75 80

Pro Ala Ala Pro Ala Ser Gln Asp Lys Pro Ala Glu Ala Pro Ala Ala

85 90 95

Glu Ala Pro Ala Ala Glu Pro Ala Ala Gln Gln Asp Lys Pro Ala Asp

100 105 110

Ala

<210>3

<211>85

<212>PRT

<213>Cryptosporidium parvum

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(85)

<223>CP15/60抗原片段

<400>3

Met Gly Asn Leu Lys Ser Cys Cys Ser Phe Ala Asp Glu His Ser Leu

1 5 10 15

Thr Ser Thr Gln Leu Val Val Gly Asn Gly Ser Gly Ala Ser Glu Thr

20 25 30

Ala Ser Asn His Pro Gln Glu Glu Val Asn Asp Ile Asn Thr Phe Asn

35 40 45

Val Lys Leu Ile Met Gln Asp Arg Ser Lys Leu Asp Cys Glu Val Val

50 55 60

Phe Asp Ser Thr Ser Ile Ser Leu Ser Gly Asp Gly Lys Cys Arg Asn

65 70 75 80

Ile Ala Leu Asp Glu

85

<210>4

<211>165

<212>DNA

<213>Cryptosporidium parvum

<400>4

atgaaattgg atgaggttgt tgagctttta ccagcacgta aaagacgtaa gatagccaga 60

ggttgtctta acagaagaac tgcagctttt atcgcaaagc tccgcaaatc taaggctgaa 120

tgtccaatgg gagagaaacc tgttgctgtt cgtacccatt tacgt 165

<210>5

<211>339

<212>DNA

<213>Cryptosporidium mouse genotype

<400>5

atgggttgtt catcatcaaa gccagaaact aaagttgctg aaaataaatc tgcagcagat 60

gctaacaaac aaagagaatt agctgaaaag aaggctcaat tagccaaggc tgtaaagaat 120

ccagctccaa tcagcaacca agctcaacaa aagccagaag aaccaaagaa gtccgagcct 180

gctccaaata accctccagc tgctgatgcg ccagcagccc aagctcctgc tgcccctgcc 240

cctgctgccc ctgcttcaca ggataagcca gctgaggctc cagctgctga agctccagct 300

gctgaacctg ctgctcaaca agacaagcca gctgatgcc 339

<210>6

<211>255

<212>DNA

<213>Cryptosporidium parvum

<400>6

atgggtaact tgaaatcctg ttgttctttt gccgatgaac actccctaac ctctactcaa 60

ctagtagttg gaaatggttc aggagcttca gaaactgctt ccaaccaccc ccaagaagaa 120

gttaatgata tcaatacttt taatgtaaag ttaataatgc aagatagaag taagcttgac 180

tgcgaggtag tatttgatag cacaagtatt tcgctttctg gagatggaaa atgcagaaat 240

attgctttgg atgaa 255

<210>7

<211>270

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(55)

<223>CP15抗原片段

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(56)..(70)

<223>接头序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(71)..(183)

<223>P23抗原序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(184)..(185)

<223>接头序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(186)..(270)

<223>CP15/60抗原片段

<400>7

Met Lys Leu Asp Glu Val Val Glu Leu Leu Pro Ala Arg Lys Arg Arg

1 5 10 15

Lys Ile Ala Arg Gly Cys Leu Asn Arg Arg Thr Ala Ala Phe Ile Ala

20 25 30

Lys Leu Arg Lys Ser Lys Ala Glu Cys Pro Met Gly Glu Lys Pro Val

35 40 45

Ala Val Arg Thr His Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Cys Ser Ser Ser Lys Pro Glu Thr

65 70 75 80

Lys Val Ala Glu Asn Lys Ser Ala Ala Asp Ala Asn Lys Gln Arg Glu

85 90 95

Leu Ala Glu Lys Lys Ala Gln Leu Ala Lys Ala Val Lys Asn Pro Ala

100 105 110

Pro Ile Ser Asn Gln Ala Gln Gln Lys Pro Glu Glu Pro Lys Lys Ser

115 120 125

Glu Pro Ala Pro Asn Asn Pro Pro Ala Ala Asp Ala Pro Ala Ala Gln

130 135 140

Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ser Gln Asp Lys Pro

145 150 155 160

Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu Pro Ala Ala Gln

165 170 175

Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Gly Ser Met Gly Asn Leu Lys Ser Cys

180 185 190

Cys Ser Phe Ala Asp Glu His Ser Leu Thr Ser Thr Gln Leu Val Val

195 200 205

Gly Asn Gly Ser Gly Ala Ser Glu Thr Ala Ser Asn His Pro Gln Glu

210 215 220

Glu Val Asn Asp Ile Asn Thr Phe Asn Val Lys Leu Ile Met Gln Asp

225 230 235 240

Arg Ser Lys Leu Asp Cys Glu Val Val Phe Asp Ser Thr Ser Ile Ser

245 250 255

Leu Ser Gly Asp Gly Lys Cys Arg Asn Ile Ala Leu Asp Glu

260 265 270

<210>8

<211>837

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(16)..(828)

<400>8

ccggaattcc cgacc atg aaa ttg gat gag gtt gtt gag ctt tta cca gca 51

Met Lys Leu Asp Glu Val Val Glu Leu Leu Pro Ala

1 5 10

cgt aaa aga cgt aag ata gcc aga ggt tgt ctt aac aga aga act gca 99

Arg Lys Arg Arg Lys Ile Ala Arg Gly Cys Leu Asn Arg Arg Thr Ala

15 20 25

gct ttt atc gca aag ctc cgc aaa tct aag gct gaa tgt cca atg gga 147

Ala Phe Ile Ala Lys Leu Arg Lys Ser Lys Ala Glu Cys Pro Met Gly

30 35 40

gag aaa cct gtt gct gtt cgt acc cat tta cgt ggt gga ggc ggt tca 195

Glu Lys Pro Val Ala Val Arg Thr His Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser

45 50 55 60

ggc gga ggt ggc agc ggc ggt ggc ggg tcg atg ggt tgt tca tca tca 243

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Cys Ser Ser Ser

65 70 75

aag cca gaa act aaa gtt gct gaa aat aaa tct gca gca gat gct aac 291

Lys Pro Glu Thr Lys Val Ala Glu Asn Lys Ser Ala Ala Asp Ala Asn

80 85 90

aaa caa aga gaa tta gct gaa aag aag gct caa tta gcc aag gct gta 339

Lys Gln Arg Glu Leu Ala Glu Lys Lys Ala Gln Leu Ala Lys Ala Val

95 100 105

aag aat cca gct cca atc agc aac caa gct caa caa aag cca gaa gaa 387

Lys Asn Pro Ala Pro Ile Ser Asn Gln Ala Gln Gln Lys Pro Glu Glu

110 115 120

cca aag aag tcc gag cct gct cca aat aac cct cca gct gct gat gcg 435

Pro Lys Lys Ser Glu Pro Ala Pro Asn Asn Pro Pro Ala Ala Asp Ala

125 130 135 140

cca gca gcc caa gct cct gct gcc cct gcc cct gct gcc cct gct tca 483

Pro Ala Ala Gln Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ser

145 150 155

cag gat aag cca gct gag gct cca gct gct gaa gct cca gct gct gaa 531

Gln Asp Lys Pro Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu

160 165 170

cct gct gct caa caa gac aag cca gct gat gcc gga tcc atg ggt aac 579

Pro Ala Ala Gln Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Gly Ser Met Gly Asn

175 180 185

ttg aaa tcc tgt tgt tct ttt gcc gat gaa cac tcc cta acc tct act 627

Leu Lys Ser Cys Cys Ser Phe Ala Asp Glu His Ser Leu Thr Ser Thr

190 195 200

caa cta gta gtt gga aat ggt tca gga gct tca gaa act gct tcc aac 675

Gln Leu Val Val Gly Asn Gly Ser Gly Ala Ser Glu Thr Ala Ser Asn

205 210 215 220

cac ccc caa gaa gaa gtt aat gat att aat act ttt aat gta aag tta 723

His Pro Gln Glu Glu Val Asn Asp Ile Asn Thr Phe Asn Val Lys Leu

225 230 235

ata atg caa gat aga agt aag ctt gac tgt gag gta gta ttt gat agc 771

Ile Met Gln Asp Arg Ser Lys Leu Asp Cys Glu Val Val Phe Asp Ser

240 245 250

aca agt att tcg ctt tct gga gat gga aaa tgc aga aat att gct ttg 819

Thr Ser Ile Ser Leu Ser Gly Asp Gly Lys Cys Arg Asn Ile Ala Leu

255 260 265

gat gaa taa gtcgacggg 837

Asp Glu

270

<210>9

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<22l>misc_feature

<222>(1)..(37)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(9)

<223>EcoR I酶切位点

<400>9

ccggaattcc cgaccatgaa attggatgag gttgttg 37

<210>10

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(65)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(45)

<223>接头序列

<400>10

cgacccgcca ccgccgctgc cacctccgcc tgaaccgcct ccaccacgta aatgggtacg 60

aacag 65

<210>11

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(68)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(45)

<223>接头序列

<400>11

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggcagc ggcggtggcg ggtcgatggg ttgttcatca 60

tcaaagcc 68

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(29)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(9)

<223>BamH I酶切位点

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(9)

<223>接头序列

<400>12

catggatccg gcatcagctg gcttgtctt 29

<210>13

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(35)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(9)

<223>BamH I酶切位点

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(9)

<223>接头序列

<400>13

gccggatcca tgggtaactt gaaatcctgt tgttc 35

<210>14

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(9)

<223>Sal I酶切位点

<400>14

cccgtcgact tattcatcca aagcaatatt tctg 34

<210>15

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(43)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(9)

<223>EcoR I酶切位点

<400>15

ccggaattcc cgaccatggc tatgaaattg gatgaggttg ttg 43

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(33)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(9)

<223>Xba I酶切位点

<400>16

ccctctagat tattcatcca aagcaatatt tct 33

Claims

1.一种隐孢子虫混合多表位融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.7所示的氨基酸序列。

2.一种隐孢子虫混合多表位基因，其特征在于，所述混合多表位基因的核苷酸序列为编码SEQ ID NO.7所示氨基酸序列的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的隐孢子虫混合多表位基因，其特征在于，所述混合多表位基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的隐孢子虫混合多表位基因。

5.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求2所述的隐孢子虫混合多表位基因和表达载体。

6.权利要求1所述的隐孢子虫混合多表位融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

7.权利要求2所述的隐孢子虫混合多表位基因在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。