CN112566920A

CN112566920A - 改善的蛋白质回收

Info

Publication number: CN112566920A
Application number: CN201980053131.7A
Authority: CN
Inventors: A·阿伦库玛; N·辛格; A·U·博尔万卡
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2018-08-14
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2021-03-26
Also published as: US12103949B2; JP7483679B2; US20210171573A1; JP2024105393A; WO2020036903A1; JP2021534149A; KR20210044821A; EP3837273A1

Abstract

本公开文本提供了一种使用回收冲洗技术的新颖冲洗方法，所述方法使由于冲洗不足导致的产率损失最小化，并且防止或减少回收冲洗过程中靶蛋白的稀释。

Description

改善的蛋白质回收

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月14日提交的美国临时申请号62/718,864的优先权权益，将其通过引用以其整体并入本文。

背景技术

多种治疗性蛋白的皮下递送是快速发展的领域，尤其是对于特定的蛋白质亚型，如需要施用大量的药物的单克隆抗体。为了正确地配制这些分子，需要大于100g/L的浓度。已知在这些高浓度下制造这些分子以及使用切向流过滤(TFF)或其他过滤方法大规模地进行大规模回收高度浓缩的产物都是困难的。

切向流过滤(TFF)是用于分离和纯化生物分子的快速并且有效的方法。它可以应用于广泛的生物学领域，如免疫学、蛋白质化学、分子生物学、生物化学和微生物学。TFF可以用于浓缩和脱盐体积范围从10mL到数千升的样品溶液，并且可以用于从小生物分子中分馏大生物分子、收获细胞悬浮液以及澄清发酵液和细胞裂解液。膜过滤是在生命科学实验室中广泛使用的分离技术。根据膜孔隙率，可以将其分类为微滤或超滤过程。孔径通常在0.001与0.1μm之间的超滤膜用于浓缩和脱盐溶解的分子(蛋白质、肽、核酸、碳水化合物和其他生物分子)、交换缓冲液以及粗分馏。通常依据截留分子量(MWCO)而不是孔径对超滤膜进行分类。

众所周知，在预期用于原料药阶段的高蛋白质浓度(>150mg/mL)的高粘度超滤过程中，达到目标浓度的负担来自于超滤/渗滤(UF/DF)过程。在制造中遇到的一个问题是蛋白质在制造管材或其他“滞留”区域中的保留，导致收集容器中的回收率差，并且因此导致产率差。因此，典型的实践是采用回收冲洗以将保留的蛋白质推入收集容器中以提高总产率。如果冲洗行为遵循理想的活塞流条件，则冲洗过程中将不存在稀释，并且取而代之的是冲洗缓冲液会将蛋白质简单地推入收集容器中并且将其置于“滞留”区域，并且在不进行稀释的情况下回收被困在“滞留”区域的蛋白质将不是问题。然而，在实际条件下，回收冲洗导致产物的稀释，因为在回收冲洗缓冲液和要推入收集容器中的蛋白质之间会发生稀释。因此，需要在回收冲洗过程中减少或防止靶产物的稀释。

发明内容

本公开文本涉及一种在过滤后的回收冲洗过程中减少或防止靶蛋白稀释的方法。本公开文本的一方面涉及(i)在进行所述过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使缓冲液以小于100升/平方米/小时(LMH)的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白的稀释相比，减少或防止所述靶蛋白的稀释。在另一方面，本公开文本涉及一种在过滤后的回收冲洗过程中改善或增加靶蛋白浓度的方法。本公开文本的一方面涉及(i)在进行所述过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使冲洗缓冲液以小于100升/平方米/小时(LMH)的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白浓度相比，改善所述靶蛋白的浓度。

在一些实施方案中，所述回收冲洗中流动的雷诺数(“Re”)小于2000、小于1500、小于1000、小于900、小于800、小于700、小于600、小于500、小于400、小于300、小于200、小于100、小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20、小于10、小于5、小于4或小于3，其中Re用下式计算：

Re＝Dυρ/μ，并且

其中D是通道直径(m)或在非圆柱形流道几何形状的情况下的当量直径，υ是平均速度(m/s)(Q/A_c)，ρ是密度(kg/m³)，并且μ是粘度(Pa·s)。

在一些实施方案中，所述回收冲洗中流动的雷诺数(Re)在约1与约50之间、在约1与约45之间、在约1与约40之间、在约1与约35之间、在约1与约30之间、在约1与约25之间、在约1与约20之间、在约1与约15之间、在约1与约10之间、在约2与约40之间、在约1与约10之间、在约2与约9之间、在约3与约8之间、在约4与约7之间、在约4与约6之间、在约3与约7之间、在约3与约6之间、在约3与约5之间、在约2与约8之间、在约2与约7之间、在约2与约6之间、在约2与约5之间、在约3与约10之间或在约4与约6之间。

在一些实施方案中，所述回收冲洗中流动的雷诺数(Re)是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。在一些实施方案中，所述回收冲洗中流动的Re是约3.8。

在一些实施方案中，所述冲洗流速在约5LMH与约100LMH之间、在约10LMH与约100LMH之间、在约10LMH与约90LMH之间、在约10LMH与约80LMH之间、在约10LMH与约70LMH之间、在约10LMH与约60LMH之间、在约10LMH与约50LMH之间、在约10LMH与约40LMH之间、在约10LMH与约30LMH之间、在约30LMH与约50LMH之间、在约20LMH与约100LMH之间、在约20LMH与约90LMH之间、在约20LMH与约80LMH之间、在约20LMH与约70LMH之间、在约20LMH与约60LMH之间、在约20LMH与约50LMH之间、在约20LMH与约40LMH之间、在约30LMH与约100LMH之间、在约30LMH与约90LMH之间、在约30LMH与约80LMH之间、在约30LMH与约70LMH之间、在约30LMH与约60LMH之间、在约30LMH与约50LMH之间、在约30LMH与约40LMH之间或在约20LMH与约30LMH之间。

在一些实施方案中，所述冲洗流速是至少约10LMH、至少约20LMH、至少约30LMH、至少约40LMH、至少约50LMH、至少约60LMH、至少约70LMH、至少约80LMH、至少约90LMH或至少约100LMH。在一些实施方案中，所述冲洗流速是约30LMH。

在预期用于原料药阶段的高蛋白质浓度(>150mg/mL)的高粘度超滤过程中，本发明方法可能尤其有效。在一些实施方案中，所述靶蛋白的粘度是至少约1厘泊(cP)、至少约2cP、至少约3cP、至少约4cP、至少约5cP、至少约6cP、至少约7cP、至少约8cP、至少约9cP、至少约10cP、至少约11cP、至少约12cP、至少约13cP、至少约14cP、至少约15cP、至少约16cP、至少约17cP、至少约18cP、至少约19cP、至少约20cP、至少约21cP、至少约22cP、至少约23cP、至少约24cP、至少约25cP、至少约26cP、至少约27cP、至少约28cP、至少约29cP或至少约30cP。

在一些实施方案中，所述靶蛋白的粘度高，并且是至少约20厘泊(cP)、至少约21cP、至少约22cP、至少约23cP、至少约24cP、至少约25cP、至少约26cP、至少约27cP、至少约28cP、至少约29cP、至少约30cP、至少约31cP、至少约32cP、至少约33cP、至少约34cP、至少约35cP、至少约36cP、至少约37cP、至少约38cP、至少约39cP、至少约40cP、至少约41cP、至少约42cP、至少约43cP、至少约44cP、至少约45cP、至少约46cP、至少约47cP、至少约48cP、至少约49cP、至少约50cP、至少约51cP、至少约52cP、至少约53cP、至少约54cP、至少约55cP、至少约56cP、至少约57cP、至少约58cP、至少约59cP、至少约60cP、至少约61cP、至少约62cP、至少约63cP、至少约64cP、至少约65cP、至少约66cP、至少约67cP、至少约68cP、至少约69cP、至少约70cP、至少约71cP、至少约72cP、至少约73cP、至少约74cP、至少约75cP、至少约76cP、至少约77cP、至少约78cP、至少约79cP、至少约80cP、至少约81cP、至少约82cP、至少约83cP、至少约84cP、至少约85cP、至少约86cP、至少约87cP、至少约88cP、至少约89cP、至少约90cP、至少约91cP、至少约92cP、至少约93cP、至少约94cP、至少约95cP、至少约96cP、至少约97cP、至少约98cP、至少约99cP或至少约100cP。

在一些实施方案中，所述靶蛋白的粘度是从约2cP至约10cP、从约3cP至约10cP、从约1cP至约9cP、从约2cP至约8cP、从约2cP至约7cP、从约2cP至约6cP、从约3cP至约6cP、从约4cP至约5cP或从约2cP至约5cP。

在一些实施方案中，在所述过滤之前，在所述回收冲洗之后所述靶蛋白的浓度是至少约100g/L、至少约110g/L、至少约120g/L、至少约130g/L、至少约140g/L、至少约150g/L、至少约160g/L、至少约170g/L、至少约180g/L、至少约190g/L、至少约200g/L、至少约210g/L、至少约220g/L、至少约230g/L、至少约240g/L、至少约250g/L、至少约260g/L、至少约270g/L、至少约280g/L、至少约290g/L或至少约300g/L。

在一些实施方案中，在所述回收冲洗之后所述靶蛋白的浓度是从约100g/L至约300g/L、从约110g/L至约250g/L、从约120g/L至约240g/L、从约150g/L至约250g/L、从约130g/L至约260g/L、从约140g/L至约260g/L、从约160g/L至约220g/L或从约170g/L至约230g/L。

在一些实施方案中，在所述回收冲洗之后所述靶蛋白的浓度是约90g/L、约100g/L、约110g/L、约120g/L、约130g/L、约140g/L、约150g/L、约160g/L、约170g/L、约180g/L、约190g/L、约200g/L、约210g/L、约220g/L、约230g/L、约240g/L、约250g/L、约260g/L、约270g/L、约280g/L、约290g/L或约300g/L。

因此，本发明方法可以通过在回收冲洗过程中防止或减少靶蛋白稀释而导致回收冲洗后蛋白质产率提高。在一些实施方案中，与所述回收冲洗过程前所述靶蛋白的浓度相比，在所述回收冲洗之后所述靶蛋白的产率是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％，所述回收冲洗过程由以下组成：(i)在进行所述过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使缓冲液以小于100升/平方米/小时(LMH)的冲洗流速通过所述过滤组件。

在一些实施方案中，与用300LMH的流速进行回收冲洗后获得的所述靶蛋白的产率相比，在所述回收冲洗之后所述靶蛋白的产率提高至少1％、至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。在一些实施方案中，在(i)中的所述通过的进料流速高于在(ii)中的所述冲洗流速。

在一些实施方案中，所述进料流速是至少200LMH、至少210LMH、至少220LMH、至少230LMH、至少240LMH、至少250LMH、至少260LMH、至少270LMH、至少280LMH、至少290LMH、至少300LMH、至少310LMH、至少320LMH、至少330LMH、至少340LMH、至少350LMH、至少360LMH、至少370LMH、至少380LMH、至少390LMH、至少400LMH、至少410LMH、至少420LMH、至少430LMH、至少440LMH、至少450LMH、至少460LMH、至少470LMH、至少480LMH、至少490LMH或至少500LMH。

在一些实施方案中，所述进料流速在200LMH与500LMH之间、在200LMH与450LMH之间、在250LMH与450LMH之间、450LMH、在300LMH与450LMH之间、在300LMH与400LMH之间或在300LMH与350LMH之间。在一些实施方案中，所述进料流速是约300LMH。

在一些实施方案中，所述过滤组件包含膜。在一些实施方案中，可用于所述过滤组件的滤膜衍生自聚偏氟乙烯(PVDF)、聚砜、聚醚砜、聚芳砜、再生纤维素、聚酰胺、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、醋酸纤维素、聚丙烯腈、乙烯共聚物、聚酰胺(如“尼龙6”或尼龙66”)聚碳酸酯、PFA或其任何组合。在一些实施方案中，所述冲洗缓冲液包含有机或无机酸或其盐。

在一些实施方案中，所述有机或无机酸是柠檬酸盐(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐(例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)乙酸盐(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)、三甲胺盐(例如，Tris)、磷酸盐或组氨酸。在一些实施方案中，所述冲洗缓冲液包含组氨酸。在一些实施方案中，所述冲洗缓冲液包含糖。在一些实施方案中，所述糖是蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖、葡萄糖、糖粉或普鲁兰多糖。在一些实施方案中，所述冲洗缓冲液包含20mM组氨酸和250mM蔗糖。

在一些实施方案中，在(i)过程中使用过滤缓冲液。在一些实施方案中，所述过滤缓冲液与所述冲洗缓冲液是相同的。在其他实施方案中，所述过滤缓冲液与所述冲洗缓冲液是不同的。在一些实施方案中，所述过滤缓冲液包含有机和无机酸或其盐。

在一些实施方案中，所述有机或无机酸是柠檬酸盐(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐(例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)乙酸盐(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)、三甲胺盐(例如，Tris)、磷酸盐或组氨酸。

在一些实施方案中，所述过滤缓冲液包含糖。在一些实施方案中，所述糖是蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖、葡萄糖、糖粉或普鲁兰多糖。在一些实施方案中，所述冲洗缓冲液和/或所述过滤缓冲液的pH是约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9或约9.5。

在一些实施方案中，所述样品选自纯的蛋白质样品、澄清的大块蛋白质样品、细胞培养物样品及其任何组合。在一些实施方案中，所述细胞培养物样品衍生自包含哺乳动物细胞的细胞培养基。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、小鼠骨髓瘤(NS0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾成纤维细胞(COS-7)、马-达二氏(Madin-Darby)牛肾细胞(MDBK)或其任何组合。

在一些实施方案中，所述靶蛋白包含抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，所述靶蛋白包含抗体。在一些实施方案中，所述抗体是选自IgM、IgA、IgE、IgD和IgG的同种型。在一些实施方案中，所述IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，所述抗体是抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗LAG3抗体、抗CSF1R抗体或抗IL8抗体。

在一些实施方案中，所述靶蛋白包含酶、激素、细胞因子、细胞表面受体、蛋白酶、细胞因子受体或其任何组合。在一些实施方案中，所述靶蛋白是融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白与异源部分融合。在一些实施方案中，所述异源部分是半衰期延长部分。在一些实施方案中，所述半衰期延长部分包含Fc。

附图说明

图1(FIG.1)示出了使用16号进料管材(176cm²膜面积)从按比例缩小的过程中产生的数据。在回收冲洗之前，在TFF截留液的浓度高于目标浓度之后，测试了许多不同的回收冲洗流速。从图1中可以看出，较高的回收冲洗流速导致浓缩的TFF截留液的稀释更大。

图2(FIG.2)示出了使用具有多种横截面积的管材的计算的雷诺数的比较。横截面积在表1中显示。

图3(FIG.3)示出了与以固定的速度流过具有多种横截面积的管时流体的粘度相比，计算的雷诺数的比较。

具体实施方式

本公开文本提供了在回收冲洗过程中减少或防止靶蛋白稀释的高效方法。具体而言，所述方法使用较慢的流速来抵抗湍流的稀释效应，湍流是在计算的雷诺数(Re)高时发生的。在一些实施方案中，可用于本发明方法的计算的Re低于2000。

如工作例子中所示，所述方法在回收冲洗过程中减少或防止由回收冲洗流速引起的靶蛋白稀释方面是有效的。在某些实施方案中，本公开文本提供了在回收冲洗过程中减少或防止靶蛋白稀释的方法，所述方法使用30LMH的回收冲洗流速，从而与用100LMH的回收冲洗流速获得的靶蛋白的稀释相比，减少或防止靶蛋白的稀释。使用这样的系统允许在回收冲洗过程中非常少地稀释靶蛋白，这允许在不牺牲产物产率或浓度的情况下达到更高的最终目标浓度，由于不存在回收冲洗或因较快的回收冲洗速率导致的过度稀释。

在某些实施方案中，本公开文本提供了从包含目的蛋白和一种或多种污染物的混合物中纯化目的蛋白的方法。可能的污染物包括宿主细胞蛋白(HCP)、高分子量种类(HMWs)、低分子量种类(LMWs)或DNA。

在某些实施方案中，本公开文本提供了纯化抗体的方法。在某些实施方案中，所述混合物衍生自收获的细胞培养液、细胞培养上清液、细胞裂解物和澄清的物料(bulk)。

I.术语

为了可以更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本申请进行阐述。

在本文中使用的情况下，将术语“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，如在本文中以短语如“A和/或B”使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，如以短语如“A、B和/或C”使用的术语“和/或”旨在包括以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

应理解，无论在哪里在本文中用语言“包括/包含(comprising)”描述方面，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”措辞描述的其他类似方面。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC出版社；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,学术出版社；以及OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,牛津大学出版社为技术人员提供了本公开文本中所用的许多术语的通用词典。

单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)可接受的形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考说明书作为整体而获得。因此，通过从整体上参考说明书，可以更全面地定义下面紧接着定义的术语。

替代方案(例如，“或”)的使用应当理解为意指替代方案之一、两者或其任何组合。如本文所用，不定冠词“一个/种”(“a”或“an”)应当理解为是指任何所列举或枚举的组分中的“一个/种或多个/种”。

术语“约”或“基本上包含……”是指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上包含……”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。可替代地，“约”或“基本上包含……”可以意指高达20％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指高达值的一个数量级或高达值的5倍。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上包含……”的含义在该特定值或组成的可接受误差范围内。

如本文所述，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。

如本文所用，术语“目的蛋白”以其最广义使用，以包括存在于混合物中需要纯化的任何蛋白质(天然的或重组的)。此类目的蛋白包括但不限于酶、激素、生长因子、细胞因子、免疫球蛋白(例如，抗体)和/或任何融合蛋白。

术语“澄清”是指去除微粒的过程。澄清可以降低纯化过程期间后续色谱(例如，AEX或CEX)的负担。在一些例子中，澄清是从细胞培养物中去除胶体、脂质、DNA-RNA、残留细胞和其他颗粒的方法。也可以使用过滤，并且可以包括深度过滤器。“澄清的物料”是指已经经受澄清过程的混合物。

术语“病毒灭活”是指从混合物中去除感染性病毒污染物的过程。当前存在许多用于灭活传染性病原病毒的不同方法，包括例如热灭活、溶剂/洗涤剂(S/D)灭活、pH灭活、化学灭活和/或紫外线辐照灭活。

术语“色谱”是指将目的蛋白(例如，抗体)与混合物中存在的其他分子(例如，污染物)分离的任何种类的技术。通常，由于在流动相的影响下混合物的单个分子迁移通过固定介质的速率差异，或在结合和洗脱过程中，将目的蛋白与其他分子(例如，污染物)分离。术语“基质”或“色谱基质”在本文中可互换使用，并且是指任何种类的吸附剂、树脂或固相，其在分离过程中将目的蛋白(例如，含有Fc区的蛋白质(如免疫球蛋白))与混合物中存在的其他分子分离。非限制性例子包括可置于柱或盒中的微粒状、整体的或纤维状树脂以及膜。用于形成基质的材料的例子包括多糖(如琼脂糖和纤维素)；以及其他机械稳定的基质，如二氧化硅(例如，可控孔度玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷颗粒和以上任何一种的衍生物。适用于本公开文本的方法的典型的基质类型的例子是阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂或混合模式树脂。“配体”是与色谱基质附接并且决定基质的结合特性的官能团。“配体”的例子包括但不限于离子交换基团、疏水相互作用基团、亲水相互作用基团、亲硫相互作用基团、金属亲和基团、亲和基团、生物亲和基团和混合模式基团(上述的组合)。可以在本文中使用的一些优选的配体包括但不限于强阳离子交换基团，如磺丙基、磺酸；强阴离子交换基团，如三甲基氯化铵；弱阳离子交换基团，如羧酸；弱阴离子交换基团，如N5N二乙氨基或DEAE；疏水相互作用基团，如苯基、丁基、丙基、己基；以及亲和基团，如蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L。为了可以更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本申请所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本申请进行阐述。

术语“亲和色谱”是指这样的蛋白质分离技术，其中目的蛋白(例如，含有Fc区的目的蛋白或抗体)与对目的蛋白具有特异性的配体特异性结合。通常将这样的配体称为生物特异性配体。在一些实施方案中，生物特异性配体(例如，蛋白质A或其功能变体)与色谱基质材料共价附接，并且当溶液接触色谱基质时在溶液中可接近目的蛋白。在色谱步骤过程中，目的蛋白通常保持其对生物特异性配体的特异性结合亲和力，而混合物中的其他溶质和/或蛋白质则不会与配体明显或特异性结合。目的蛋白与固定的配体的结合允许污染性蛋白质或蛋白质杂质通过色谱基质，同时目的蛋白保持与固相材料上的固定的配体特异性结合。然后在合适的条件下(例如，低pH、高pH、高盐、竞争性配体等)从固定的配体中以活性形式移除特异性结合的目的蛋白，并且使其与洗脱缓冲液一起通过色谱柱，不含较早允许通过柱的污染性蛋白质或蛋白质杂质。任何组分都可以用作配体，以纯化其各自的特异性结合蛋白，例如抗体。然而，在根据本公开文本的各种方法中，将蛋白质A用作含有Fc区的靶蛋白的配体。用于从靶蛋白(例如，含有Fc区的蛋白质)的生物特异性配体(例如，蛋白质A)洗脱的条件可以由本领域普通技术人员容易地确定。在一些实施方案中，蛋白质G或蛋白质L或其功能变体可以用作生物特异性配体。在一些实施方案中，在5-9的pH范围下使用生物特异性配体(如蛋白质A)，以与含有Fc区的蛋白质结合、洗涤或重新平衡生物特异性配体/靶蛋白缀合物，然后用含有至少一种盐的具有约等于或低于4的pH的缓冲液洗脱。

如在本文中可互换使用的术语“纯化”、“分开”或“分离”是指从包含目的蛋白和一种或多种杂质的组合物或样品中提高目的蛋白的纯度。通常，通过从组合物中去除(完全或部分)至少一种杂质来提高目的蛋白的纯度。

如本文所用，术语“缓冲液”是指这样的物质，通过其在溶液中的存在而增加必须添加以引起pH单位变化的酸或碱的量。缓冲溶液通过其酸碱共轭组分的作用来抵抗pH的变化。用于与生物试剂一起使用的缓冲溶液通常能够维持恒定的氢离子浓度，使得溶液的pH在生理范围内。传统的缓冲液组分包括但不限于有机和无机盐、酸和碱。

如本文所用，与色谱相关的术语“色谱柱”或“柱”是通常呈填充有色谱基质或树脂的圆柱体或空心柱的形式的容器。色谱基质或树脂是提供用于纯化的物理和/或化学特性的材料。

术语“离子交换”和“离子交换色谱”是指这样的色谱过程，其中在适当的pH和电导率条件下，可电离的目的溶质(例如，混合物中的目的蛋白)与和固相离子交换材料连接(例如，通过共价附接)的带相反电荷的配体相互作用，使得目的溶质与带电化合物比混合物中的溶质杂质或污染物更多或更少地非特异性相互作用。混合物中的污染性溶质可以从离子交换材料的柱上洗去，或者与目的溶质相比，更快或更慢地与树脂结合或从树脂中排除。“离子交换色谱”具体包括阳离子交换(CEX)、阴离子交换(AEX)和混合模式色谱。

如本文所用，术语“污染物”以其最广义使用，以覆盖混合物内的任何不需要的组分或化合物。在细胞培养物、细胞裂解物或澄清的物料(例如，澄清的细胞培养上清液)中，污染物包括例如细胞培养基中存在的宿主细胞核酸(例如，DNA)和宿主细胞蛋白质。宿主细胞污染物蛋白质包括但不限于由宿主细胞天然或重组产生的那些蛋白质以及与目的蛋白相关或由其衍生的蛋白质(例如，蛋白水解片段)和其他过程相关的污染物。在某些实施方案中，使用诸如离心、无菌过滤、深度过滤和切向流过滤等手段将污染物沉淀与细胞培养物分离。

术语“雷诺数”(Re)用下式计算：

Re＝Dυρ/μ，并且

其中D是通道直径(m)或在非圆柱形流道几何形状的情况下的当量直径，υ是平均速度(m/s)(Q/Ac)，ρ是密度(kg/m³)，并且μ是粘度(PA s)。雷诺数是无量纲单位，并且描述了流动流体中惯性力与粘性力的比率。它用于许多流体流动相关性中，并且用于描述流体流动状态(层流、过渡和湍流)的边界。当流体在平行层中流动时会发生层流，各层之间不会发生中断。当雷诺数小于约2,000时，管中的流动通常是层流的。当雷诺数大于约4,000时，流动是湍流的。在2,000与4,000之间的雷诺数代表层流与湍流之间的过渡区域。

术语“回收冲洗”是指这样的蛋白质纯化步骤，其中使已经浓缩超过其所需目标浓度的蛋白质样品经受冲洗以置换尚未到达收集容器的其他蛋白质。过度浓缩步骤中的过度浓缩量会影响可用于回收步骤的冲洗体积，因为它决定了在达到最终目标蛋白质浓度之前可能的稀释量。在许多大规模的蛋白质纯化过程中，大量的蛋白质可能被保留在管材、管道或其他“滞留”区域中的收集容器外部，并且有必要进行回收冲洗以回收在收集容器或用于收集纯化的蛋白质产物的其他容器中的较大量的蛋白质产物。在不进行回收冲洗的情况下，否则大规模蛋白质纯化系统的管材、管道或其他“滞留”区域中积聚的蛋白质产物可能会由于无法到达蛋白质收集容器或用于收集纯化的蛋白质产物的其他容器而丢失或无法回收。

术语“冲洗缓冲液”是指在回收冲洗过程中使用的溶液或混合物，其用于提高总蛋白质产率、将蛋白稀释至其最终目标浓度或二者兼有。冲洗缓冲液也用于将蛋白质推出蛋白质积聚的过滤组件的管材或其他区域。

术语“过滤缓冲液”是指在过滤过程中使用的溶液或混合物，其用于使含有目的蛋白的进料通过膜上方或其中。

术语“过滤组件”是指用于进行蛋白质纯化的整个系统。过滤组件的一个例子是切向流过滤(TFF)系统，其中使含有目的蛋白的进料经受垂直于滤膜的进料流。可商购获得的TFF系统包括

Flux切向流过滤系统(GE Life Sciences)。过滤组件的另一个例子是直流过滤(DFF)系统，其中使含有目的蛋白的进料经受平行于滤膜的进料流。

术语“进料流速”(LMH)或有时“错流流速”是指切向流过滤(TFF)蛋白质纯化步骤中的流速，其中使含有目的蛋白的进料经受垂直于滤膜的进料流。进料的切向流防止截留在过滤器表面的颗粒积聚，并且从而干扰过滤。在超滤浓缩步骤过程中，进入超滤膜盒的进料流提供了用于浓缩和缓冲液交换必需的跨膜压(TMP)和错流通量。在直流过滤(DFF)系统的上下文中，术语“进料流速”是指平行于滤膜的流速。

术语“冲洗流速”(LMH)是指用于蛋白质纯化步骤的流速，其中使已经浓缩超过其所需目标浓度的蛋白质样品经受冲洗以置换收集容器中不存在的蛋白质。冲洗流速代表在纯化过程的回收冲洗阶段过程中冲洗缓冲液流经系统的速率。

术语“渗滤”是指从含有蛋白质、肽、核酸和其他生物分子的溶液中去除、置换盐或溶剂或降低其浓度的过程。所述过程使用可渗透膜过滤器，以根据分子尺寸分离溶液或混合物的组分。小于膜孔的分子自由通过膜。

术语“超滤”是指使用过滤器将一种尺寸的颗粒与另一种尺寸的颗粒分离的过程。超滤是压力驱动的膜过程，其广泛用于蛋白质浓缩和缓冲液交换。超滤是基于尺寸的分离，其中大于膜孔的种类被保留，并且较小的种类通过过滤器。超滤是通过在压力下不同组分跨膜的过滤速率差异来进行的。

在一些实施方案中，术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。在一些抗体(例如，天然存在的IgG抗体)中，重链恒定区由铰链和三个结构域CH1、CH2和CH3组成。在一些抗体(例如，天然存在的IgG抗体)中，每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(在本文中缩写为CL)组成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。重链可以具有或不具有C末端赖氨酸。术语“抗体”可以包括双特异性抗体或多特异性抗体。

在一些实施方案中，如本文所用的“IgG抗体”(例如，人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体)具有天然存在的IgG抗体的结构，即，其具有与相同亚类的天然存在的IgG抗体相同数量的重链和轻链和二硫键。例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体可以由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成，其中两条HC和LC分别通过在天然存在的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体中存在的相同数量和位置的二硫桥连接(除非抗体已经突变以修饰二硫桥)。

免疫球蛋白可以来自任何公知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中分为以下亚类：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白(例如，IgG1)以若干种同种异型存在，它们彼此最多有几个氨基酸的差异。举例来说，“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体和非人抗体；以及全合成抗体。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”是指抗体的保留与抗原特异性结合的能力的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。包括在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括(i)Fab片段(来自木瓜蛋白酶切割的片段)或由VL、VH、LC和CH1结构域组成的相似的单价片段；(ii)F(ab')2片段(来自胃蛋白酶切割的片段)或包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的相似的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)可以任选地通过合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，从而使得它们能够成为单条蛋白质链，在其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用筛选所述片段。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。

“Fc区”(片段可结晶区)、“Fc结构域”或“Fc”是指抗体的重链的C末端区，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合或与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。因此，Fc区包含抗体的除了第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)之外的恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含两个相同的蛋白质片段，其衍生自抗体两条重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定结构域；IgM和IgE Fc区在每条多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。IgG同种型在某些物种中分为以下亚类：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3以及CH1和CH2结构域之间的铰链。如本文所定义的，尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界的定义可能会发生变化，但是人IgG重链的Fc区被定义为从IgG1的氨基酸残基D221、IgG2的氨基酸残基V222、IgG3的氨基酸残基L221和IgG4的氨基酸残基P224延伸到重链的羧基末端，其中编号是根据如在Kabat中的EU索引。人IgG Fc区的CH2结构域从氨基酸237延伸至氨基酸340，并且CH3结构域位于Fc区中的CH2结构域的C末端侧，即，其从IgG的氨基酸341延伸至氨基酸447或446(如果不存在C末端赖氨酸残基)或445(如果不存在C末端甘氨酸和赖氨酸残基)。如本文所用，Fc区可以是天然序列Fc，包括任何同种异型变体或变体Fc(例如，非天然存在的Fc)。

“Fc受体”或“FcR”是与免疫球蛋白的Fc区结合的受体。与IgG抗体结合的FcR包含FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγR家族由三种激活性受体(小鼠中的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人中的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制性受体(FcγRIIB)组成。人FcγR的各种特性是本领域已知的。大多数先天性效应细胞类型共表达一种或多种激活性FcγR和抑制性FcγRIIB，而自然杀伤(NK)细胞选择性地表达一种激活性Fc受体(小鼠中的FcγRIII和人中的FcγRIIIA)，但是在小鼠和人中不表达抑制性FcγRIIB。人IgG1与大多数人Fc受体结合，并且就其所结合的激活性Fc受体的类型而言，被认为等同于鼠IgG2a。

如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如(a)从对于人免疫球蛋白基因而言是转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或者由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化用于表达所述抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。

如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。

氨基酸在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸由其普遍接受的单字母代码来提及。

如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不涉及产物的具体长度。如本文所用，术语“蛋白质”旨在包括由一种或多种多肽组成的分子，所述多肽在一些情况下可以通过除酰胺键以外的键缔合。另一方面，蛋白质也可以是单条多肽链。在后一种情况下，单条多肽链在一些情况下可以包含两个或更多个多肽亚基，其融合在一起以形成蛋白质。术语“多肽”和“蛋白质”也指表达后修饰的产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽或蛋白质可以从天然生物来源衍生或通过重组技术产生，但是不一定从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式(包括通过化学合成)产生。

如本文所用的术语“多核苷酸”或“核苷酸”旨在包括包含单个核酸以及多个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)或质粒DNA(pDNA)。在某些方面，多核苷酸包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，如见于肽核酸(PNA)中)。

术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA、cDNA或RNA片段。当应用于核酸或多核苷酸时，术语“分离的”是指已经从其天然环境中移除的核酸分子、DNA或RNA，例如，出于本公开文本的目的，认为包含在载体中的编码抗原结合蛋白的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的其他例子包括在异源宿主细胞中维持或从溶液中的其他多核苷酸纯化(部分或基本)的重组多核苷酸。分离的RNA分子包括本公开文本的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本公开文本的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以包括调节元件，如启动子、增强子、核糖体结合位点或转录终止信号。

范围：如本文所述，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。

术语“HMW种类”是指混合物中存在的任何一种或多种不想要的蛋白质。高分子量种类可以包括二聚体、三聚体、四聚体或其他多聚体。这些种类通常被认为是与产物相关的杂质；并且可能共价或非共价连接；并且也可能例如由错误折叠的单体组成，其中疏水氨基酸残基暴露于极性溶剂；并且可能引起聚集。

术语“LMW种类”是指混合物中存在的任何一种或多种不想要的种类。低分子量种类通常被认为是与产物相关的杂质；并且可能包括截短的种类或旨在成为二聚体的化合物的半分子(如单克隆抗体)。

术语“宿主细胞蛋白”或HCP是指由宿主细胞产生的与所需目的蛋白的产生无关的不需要的蛋白质。不需要的宿主细胞蛋白可能会分泌到上游细胞培养上清液中。不需要的宿主细胞蛋白也可能在细胞裂解过程中释放。用于上游细胞培养的细胞需要用于生长、转录和蛋白质合成的蛋白质，并且这些不相关的蛋白质在最终药物产物中是不需要的。

在以下小节中进一步详细描述了本公开文本的各个方面。

II.回收冲洗的方法

本公开文本涉及在过滤后的回收冲洗过程中减少或防止靶蛋白稀释的方法。本公开文本的一方面涉及(i)在进行过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使缓冲液以小于300升/平方米/小时(LMH)的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白的稀释相比，减少或防止所述靶蛋白的稀释。在另一方面，本公开文本涉及在过滤后的回收冲洗过程中改善或增加靶蛋白浓度的方法。本公开文本的一方面涉及(i)在进行过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使冲洗缓冲液以小于300升/平方米/小时(LMH)的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白浓度相比，改善所述靶蛋白的浓度。在一些实施方案中，所述靶蛋白的所需浓度高于约100mg/mL、约110mg/mL、约120mg/mL、约130mg/mL、约140mg/mL、约150mg/mL、约160mg/mL、约170mg/mL、约180mg/mL、约190mg/mL或约200mg/mL。

为了调节由于回收冲洗发生的稀释，在下游制造过程中纯化目的蛋白的标准方法是将蛋白质溶液浓缩至稍高的浓度(例如，高20％)。此策略在配制前以相对较低的50mg/mL的浓度用于UF/DF操作时效果很好。例如，在过滤阶段可以将所述靶蛋白浓缩至55-60mg/mL，并且在配制前稀释至50mg/mL。在55-60mg/mL的蛋白质浓度下，在室温下一些单克隆抗体的粘度通常在2-6cP的范围内。

在高蛋白质浓度的情况下，最终浓度和稀释导致恶性循环。当蛋白质浓度高时，为了允许回收冲洗将蛋白质稀释至正确的浓度从而避免过度稀释，希望将所述靶蛋白以非常高的水平(即，高于过滤后的所需浓度)浓缩。例如，以高浓度浓缩蛋白质(例如，从150mg/mL至170mg/mL)可能会花费大量时间，导致另外的通道通过膜并且可能影响产物质量。另外，即使在过滤步骤过程中/之后达到高浓度之后，在回收冲洗过程中仍存在高风险的产物过度稀释。这是因为在许多大规模的蛋白质纯化过程中，相当多的蛋白质可能被保留在管材或管道中的截留罐外部。因此，由于管材或管道中保留了大量蛋白质，最初的回收冲洗可能不会在收集容器中积聚全部量的回收产物。这可能导致另外的回收冲洗，从而可能进一步稀释最终产物的浓度。本发明方法旨在通过减慢冲洗缓冲液的冲洗速率来防止或减少回收冲洗过程中靶蛋白的稀释。因此，本发明方法允许在回收冲洗过程期间跳过或避免另外的回收冲洗步骤。

在一些实施方案中，本公开文本涉及在过滤后的回收冲洗过程中减少或防止靶蛋白稀释的方法。本公开文本的一方面涉及(i)在进行过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使缓冲液以小于300升/平方米/小时(LMH)、小于约250LMH、小于约200LMH、小于约150LMH、小于约140LMH、小于约130LMH、小于约120LMH、小于约110LMH或小于约100LMH的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白的稀释相比，减少或防止所述靶蛋白的稀释。在另一方面，本公开文本涉及在过滤后的回收冲洗过程中改善或增加靶蛋白浓度的方法。本公开文本的一方面涉及(i)在进行过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使冲洗缓冲液以小于300升/平方米/小时(LMH)、小于约250LMH、小于约200LMH、小于约150LMH、小于约140LMH、小于约130LMH、小于约120LMH、小于约110LMH或小于约100LMH的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白浓度相比，改善所述靶蛋白的浓度。

为了根据本发明方法防止或减少所述靶蛋白的稀释，所述过滤组件中的流动是层流。当流体在平行层中流动时会发生层流，各层之间不会发生中断。当雷诺数小于约2,000时，管中的流动通常是层流的。当雷诺数大于约4,000时，流动是湍流的。在2,000与4,000之间的雷诺数代表层流与湍流之间的过渡区域。因此，在一些实施方案中，回收冲洗中流动的雷诺数(“Re”)小于2000、小于1900、小于1800、小于1700、小于1600、小于1500、小于1400、小于1300、小于1200、小于1100、小于1000、小于900、小于800、小于700、小于600、小于500、小于400、小于300、小于200、小于100、小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20、小于10、小于5、小于4、小于3、小于2或小于1，其中Re用下式计算：

Re＝Dυρ/μ，并且

在一些实施方案中，回收冲洗中流动的雷诺数(Re)在约1与约50之间、在约1与约45之间、在约1与约40之间、在约1与约35之间、在约1与约30之间、在约1与约25之间、在约1与约20之间、在约1与约15之间、在约1与约10之间、在约1与约5之间、在约1与约4之间、在约1与约3之间、在约2与约40之间、在约2与约9之间、在约3与约8之间、在约4与约7之间、在约4与约6之间、在约3与约7之间、在约3与约6之间、在约3与约5之间、在约2与约8之间、在约2与约7之间、在约2与约6之间、在约2与约5之间、在约3与约10之间、在约4与约6之间、在约3与约4之间或在约2与约3之间。

在一些实施方案中，回收冲洗中流动的雷诺数(Re)是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。在一些实施方案中，回收冲洗中流动的雷诺数(Re)是约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59或约60。在一些实施方案中，回收冲洗中流动的Re是约3.8。

在某些实施方案中，本公开文本涉及在过滤后的回收冲洗过程中减少或防止靶蛋白稀释的方法。本公开文本的一方面涉及(i)在进行过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使缓冲液以小于约100升/平方米/小时(LMH)的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白的稀释相比，减少或防止所述靶蛋白的稀释。在另一方面，本公开文本涉及在过滤后的回收冲洗过程中改善或增加靶蛋白浓度的方法。本公开文本的一方面涉及(i)在进行过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使冲洗缓冲液以小于约100升/平方米/小时(LMH)的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白浓度相比，改善所述靶蛋白的浓度。在一些实施方案中，所述冲洗流速在约5LMH与约100LMH之间、在约10LMH与约100LMH之间、在约10LMH与约90LMH之间、在约10LMH与约80LMH之间、在约10LMH与约70LMH之间、在约10LMH与约60LMH之间、在约10LMH与约50LMH之间、在约10LMH与约40LMH之间、在约10LMH与约30LMH之间、在约30LMH与约50LMH之间、在约20LMH与约100LMH之间、在约20LMH与约90LMH之间、在约20LMH与约80LMH之间、在约20LMH与约70LMH之间、在约20LMH与约60LMH之间、在约20LMH与约50LMH之间、在约20LMH与约40LMH之间、在约30LMH与约100LMH之间、在约30LMH与约90LMH之间、在约30LMH与约80LMH之间、在约30LMH与约70LMH之间、在约30LMH与约60LMH之间、在约30LMH与约50LMH之间、在约30LMH与约40LMH之间或在约20LMH与约30LMH之间。

在某些实施方案中，本公开文本涉及在过滤后的回收冲洗过程中减少或防止靶蛋白稀释的方法。本公开文本的一方面涉及(i)在进行过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使缓冲液以小于约30升/平方米/小时(LMH)的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白的稀释相比，减少或防止所述靶蛋白的稀释。在另一方面，本公开文本涉及在过滤后的回收冲洗过程中改善或增加靶蛋白浓度的方法。本公开文本的一方面涉及(i)在进行过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使冲洗缓冲液以小于约30升/平方米/小时(LMH)的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白浓度相比，改善所述靶蛋白的浓度。

在一些实施方案中，所述靶蛋白的粘度是至少约1厘泊(cP)、至少约2cP、至少约3cP、至少约4cP、至少约5cP、至少约6cP、至少约7cP、至少约8cP、至少约9cP、至少约10cP、至少约11cP、至少约12cP、至少约13cP、至少约14cP、至少约15cP、至少约16cP、至少约17cP、至少约18cP、至少约19cP、至少约20cP、至少约21cP、至少约22cP、至少约23cP、至少约24cP、至少约25cP、至少约26cP、至少约27cP、至少约28cP、至少约29cP或至少约30cP。

在一些实施方案中，本公开文本在过滤具有高粘度的靶蛋白方面可能特别有效。在一些实施方案中，所述靶蛋白的粘度高，并且是至少约20厘泊(cP)、至少约21cP、至少约22cP、至少约23cP、至少约24cP、至少约25cP、至少约26cP、至少约27cP、至少约28cP、至少约29cP、至少约30cP、至少约31cP、至少约32cP、至少约33cP、至少约34cP、至少约35cP、至少约36cP、至少约37cP、至少约38cP、至少约39cP、至少约40cP、至少约41cP、至少约42cP、至少约43cP、至少约44cP、至少约45cP、至少约46cP、至少约47cP、至少约48cP、至少约49cP、至少约50cP、至少约51cP、至少约52cP、至少约53cP、至少约54cP、至少约55cP、至少约56cP、至少约57cP、至少约58cP、至少约59cP、至少约60cP、至少约61cP、至少约62cP、至少约63cP、至少约64cP、至少约65cP、至少约66cP、至少约67cP、至少约68cP、至少约69cP、至少约70cP、至少约71cP、至少约72cP、至少约73cP、至少约74cP、至少约75cP、至少约76cP、至少约77cP、至少约78cP、至少约79cP、至少约80cP、至少约81cP、至少约82cP、至少约83cP、至少约84cP、至少约85cP、至少约86cP、至少约87cP、至少约88cP、至少约89cP、至少约90cP、至少约91cP、至少约92cP、至少约93cP、至少约94cP、至少约95cP、至少约96cP、至少约97cP、至少约98cP、至少约99cP或至少约100cP。在一些实施方案中，所述靶蛋白的粘度在约20cP与约100cP之间、在约20cP与约90cP之间、在25cP与约100cP之间、在约25cP与约90cP之间、在约30cP与约100cP之间、在约30cP与约90cP之间、在约30cP与约80cP之间、在约30cP与约70cP之间、在约40cP与约60cP之间。在其他实施方案中，所述靶蛋白的粘度是约10cP、约20cP、约30cP、约40cP、约50cP、约60cP、约70cP、约80cP、约90cP或约100cP。

在一些实施方案中，所述靶蛋白的粘度低，并且是从约2cP至约10cP、从约3cP至约10cP、从约1cP至约9cP、从约2cP至约8cP、从约2cP至约7cP、从约2cP至约6cP、从约3cP至约6cP、从约4cP至约5cP或从约2cP至约5cP。

因此，本发明方法可以通过在回收冲洗过程中防止或减少靶蛋白稀释来改善回收冲洗后所述靶蛋白的浓度。在一些实施方案中，在过滤之前，在回收冲洗之后所述靶蛋白的浓度是至少约100g/L、至少约110g/L、至少约120g/L、至少约130g/L、至少约140g/L、至少约150g/L、至少约160g/L、至少约170g/L、至少约180g/L、至少约190g/L、至少约200g/L、至少约210g/L、至少约220g/L、至少约230g/L、至少约240g/L、至少约250g/L、至少约260g/L、至少约270g/L、至少约280g/L、至少约290g/L、或至少约300g/L、至少约200g/L、至少约210g/L、至少约220g/L、至少约230g/L、至少约240g/L、至少约250g/L、至少约260g/L、至少约270g/L、至少约280g/L、至少约290g/L或至少约300g/L。

在一些实施方案中，在回收冲洗之后所述靶蛋白的浓度是从约100g/L至约300g/L、从约110g/L至约250g/L、从约120g/L至约240g/L、从约150g/L至约250g/L、从约130g/L至约260g/L、从约140g/L至约260g/L、从约160g/L至约220g/L或从约170g/L至约230g/L。

在一些实施方案中，在回收冲洗之后所述靶蛋白的浓度是从约100g/L至约300g/L、从约110g/L至约300g/L、从约110g/L至约290g/L、从约120g/L至约290g/L、从约120g/L至约280g/L、从约130g/L至约280g/L、从约130g/L至约270g/L、从约140g/L至约270g/L、从约140g/L至约260g/L、从约150g/L至约260g/L、从约150g/L至约250g/L、从约160g/L至约250g/L、从约160g/L至约240g/L、从约170g/L至约240g/L、从约170g/L至约230g/L、从约180g/L至约230g/L、从约180g/L至约220g/L、从约190g/L至约220g/L、从约190g/L至约210g/L或从约200g/L至约210g/L。

在一些实施方案中，在回收冲洗之后所述靶蛋白的浓度是约90g/L、约100g/L、约110g/L、约120g/L、约130g/L、约140g/L、约150g/L、约160g/L、约170g/L、约180g/L、约190g/L、约200g/L、约210g/L、约220g/L、约230g/L、约240g/L、约250g/L、约260g/L、约270g/L、约280g/L、约290g/L或约300g/L。

在一些实施方案中，与回收冲洗过程前所述靶蛋白的浓度相比，在根据本发明方法的回收冲洗之后所述靶蛋白的产率是至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％。

在一些实施方案中，与用300LMH的流速进行回收冲洗后获得的所述靶蛋白的产率相比，在根据本发明方法的回收冲洗之后所述靶蛋白的产率提高至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％、至少约26％、至少约27％、至少约28％、至少约29％、至少约30％、至少约31％、至少约32％、至少约33％、至少约34％、至少约35％、至少约36％、至少约37％、至少约38％、至少约39％或至少约40％。在一些实施方案中，在(i)中的通过的进料流速高于在(ii)中的冲洗流速。

根据本发明方法，在进行过滤的同时使所述靶蛋白通过所述过滤组件。其中含有靶蛋白的进料的切向流过滤(TFF)步骤中的流速在本文中称为进料流速，与冲洗流速相对。进料的切向流防止截留在过滤器表面的颗粒积聚，并且从而干扰过滤。在超滤浓缩步骤过程中，进入超滤膜盒的进料流提供了用于浓缩和缓冲液交换必需的跨膜压(TMP)和错流通量。

在本公开文本中，所述进料流速高于所述冲洗流速。在一些实施方案中，所述进料流速是至少200LMH、至少210LMH、至少220LMH、至少230LMH、至少240LMH、至少250LMH、至少260LMH、至少270LMH、至少280LMH、至少290LMH、至少300LMH、至少310LMH、至少320LMH、至少330LMH、至少340LMH、至少350LMH、至少360LMH、至少370LMH、至少380LMH、至少390LMH、至少400LMH、至少410LMH、至少420LMH、至少430LMH、至少440LMH、至少450LMH、至少460LMH、至少470LMH、至少480LMH、至少490LMH或至少500LMH，其中所述冲洗流速低于所述进料流速，例如低于100LMH。

根据本发明方法，使用过滤组件进行目的蛋白的过滤。过滤组件通常包含诸如过滤器保持器、过滤盒和用于滤液流动的端口等元件。过滤盒是所述组件的通常容纳膜过滤器的元件，所述膜过滤器用于生物分子的分离和纯化。使用滤膜纯化目的靶蛋白。在一些实施方案中，使用滤膜保留细胞、细胞碎片、细胞器和其他组分，同时允许蛋白质和较小的溶质进入滤液。在一些实施方案中，所述过滤组件包含膜。在其他实施方案中，可用于所述过滤组件膜的膜衍生自聚偏氟乙烯(PVDF)、聚砜、聚醚砜、聚芳砜、再生纤维素、聚酰胺、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、醋酸纤维素、聚丙烯腈、乙烯共聚物、聚酰胺(如“尼龙6”或尼龙66”)聚碳酸酯、PFA或其任何组合。

根据本公开文本的方法包括在回收冲洗过程中使用冲洗缓冲液以回收被保留在管材、管道或其他“滞留”区域中的收集容器外部的蛋白质。由于并非所有纯化的蛋白质都在初始纯化运行过程中到达收集容器，所以有必要进行回收冲洗以回收在收集容器或用于收集纯化的蛋白质产物的其他容器中的较大量的蛋白质产物。在一些情况下，蛋白质纯化和浓缩至高水平可能导致不想要的蛋白质聚集。可能有必要修改缓冲液的pH、盐含量或其他组分，以防止在纯化和浓缩过程期间蛋白质聚集或其他不想要的影响。在一些实施方案中，所述冲洗缓冲液包含有机或无机酸或其盐。在一些实施方案中，所述有机或无机酸是柠檬酸盐(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐(例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)乙酸盐(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)、三甲胺盐(例如，Tris)、磷酸盐或组氨酸。在一些实施方案中，所述冲洗缓冲液包含组氨酸。在一些实施方案中，所述冲洗缓冲液包含糖。在一些实施方案中，所述糖是蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖、葡萄糖、糖粉或普鲁兰多糖。在一些实施方案中，所述冲洗缓冲液包含20mM组氨酸和250mM蔗糖。

根据本公开文本的方法，在进行过滤的同时，在使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件的过程期间使用过滤缓冲液。过滤缓冲液在保护下游色谱和过滤设备方面是必需的，并且在蛋白质纯化和浓缩过程中使用。过滤缓冲液与冲洗缓冲液的不同之处在于冲洗缓冲液是在蛋白质纯化和浓缩过程之后的冲洗回收过程中使用的。在一些实施方案中，所述过滤缓冲液中的组分与所述冲洗缓冲液中的组分是相同的。在其他实施方案中，所述过滤缓冲液中的组分与所述冲洗缓冲液中的组分是不同的。

蛋白质纯化和浓缩至高水平可能导致不想要的蛋白质聚集。可能有必要修改缓冲液的pH、盐含量或其他组分，以防止在纯化和浓缩过程期间蛋白质聚集或其他不想要的影响。在一些实施方案中，所述过滤缓冲液包含有机和无机酸或其盐。在一些实施方案中，所述有机或无机酸是柠檬酸盐(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐(例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)乙酸盐(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)、三甲胺盐(例如，Tris)、磷酸盐或组氨酸。

根据本发明的方法，首先使含有目的蛋白的样品通过过滤组件，然后使其经受回收冲洗。在一些实施方案中，所述样品可能已经直接在过滤和回收冲洗步骤的上游经受了先前的纯化活动，如病毒过滤、阴离子交换色谱(AEX)、阳离子交换色谱(CEX)、深度过滤、酸处理或蛋白质A色谱。经受纯化和过滤的样品可以衍生自诸如细胞培养物、细胞裂解物或澄清的物料(例如，澄清的细胞培养上清液)等来源。在一些实施方案中，所述样品选自纯的蛋白质样品、澄清的大块蛋白质样品、细胞培养物样品及其任何组合。在一些实施方案中，所述细胞培养物样品衍生自包含哺乳动物细胞的细胞培养基。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、小鼠骨髓瘤(NS0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾成纤维细胞(COS-7)、马-达二氏牛肾细胞(MDBK)或其任何组合。

可用于本发明方法的靶蛋白是天然存在或重组产生的任何蛋白质、多肽或肽。在一些实施方案中，所述靶蛋白具有高粘度。在一些实施方案中，所述靶蛋白是具有高分子量(例如，100kDa至500kDa)的蛋白质。在其他实施方案中，所述靶蛋白是具有低分子量的蛋白质。在其他实施方案中，所述靶蛋白具有至少约10kDa、至少约20kDa、至少约30kDa、至少约40kDa、至少约50kDa、至少约60kDa、至少约70kDa、至少约80kDa、至少约90kDa、至少约100kDa、至少约110kDa、至少约120kDa、至少约130kDa、至少约140kDa、至少约150kDa、至少约160kDa、至少约170kDa、至少约180kDa、至少约190kDa或至少约200kDa和高达400kDa或500kDa的分子量。

在一些实施方案中，所述靶蛋白包含抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，所述靶蛋白包含抗体。在一些实施方案中，所述抗体是选自IgM、IgA、IgE、IgD和IgG的同种型。在一些实施方案中，所述IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。本发明方法可适用于与抗原特异性结合的任何抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗LAG3抗体、抗CSF1R抗体或抗IL8抗体。

在一些实施方案中，所述靶蛋白包含酶、激素、细胞因子、细胞表面受体、蛋白酶、细胞因子受体或其任何组合。在一些实施方案中，所述靶蛋白是融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白与异源部分融合。在一些实施方案中，所述异源部分是半衰期延长部分。在一些实施方案中，所述异源部分包含白蛋白、免疫球蛋白恒定区或其部分、免疫球蛋白结合多肽、免疫球蛋白G(IgG)、白蛋白结合多肽(ABP)、PAS化部分、HES化部分、XTEN、PEG化部分、Fc区及其任何组合。在一些实施方案中，所述半衰期延长部分包含非多肽部分。在一些实施方案中，所述半衰期延长部分包含多肽。在一些实施方案中，所述半衰期延长部分包含Fc。在某些实施方案中，本公开文本的融合蛋白包含对免疫球蛋白恒定区或其部分的氨基酸取代(例如，Fc变体)，所述氨基酸取代改变Ig恒定区的抗原非依赖性效应子功能，特别是蛋白质的循环半衰期。

实施例

实施例1

按比例缩小的设计的评估

为了评估潜在的回收冲洗过程，设计了按比例缩小的模型来分析管材尺寸的变化。此按比例缩小的模型使用了176cm²的膜面积，并且首先使用16号管材进行了测试。建模中使用的多种管材描述于表1中。使用了250g/L的起始蛋白浓度，并且测试了多种冲洗进料流速。此数据描绘在图1中。较高的冲洗进料流速导致最终蛋白质浓度较低，并且因此较低的冲洗流速将是理想的，如图1所示。

表1.规模依赖性管材

参数	16号	CM150	DCM Allegro
				内径(mm)	3.1	9.6	12.7
内径(m)	3.1x10<sup>-3</sup>	9.6x10<sup>-3</sup>	1.3x10<sup>-2</sup>
				横截面积(m<sup>2</sup>)	7.55x10<sup>-6</sup>	7.24x10<sup>-5</sup>	1.27x10<sup>-4</sup>

使用具有固定粘度和密度的混合物来探索流速参数对雷诺数的影响，并且详细说明于图2中。所述混合物具有17cP的粘度和1.08g/cm³的密度，并且使用了30升/M²/小时的固定流速。由于所使用的多种管材的横截面差异，因此必须针对每种管材调整比流速。0.03L/min的流速用于CM150系统，并且0.04L/min的流速用于DCM。

还使用0.019m/s的固定流速评估了粘度对雷诺数的影响。这些数据总结于图3中。对于每种管材类型，较高的粘度导致计算的雷诺数较高。

实施例2

使用多种单克隆抗体对冲洗策略的评估

使用设计的冲洗过程评估了三种单克隆抗体(A、B和C)。从抗体A冲洗过程中收集的数据详细说明于表2中。这些数据包括冲洗通量(LMH)、雷诺数(Re)、截留液浓度、纯化原料药浓度、产率、预期产率和冲洗体积。在评估了按比例缩小的冲洗过程之后，还在针对单克隆抗体A的CM150切向流过滤(TFF)规模上验证了所述方法。在所有情况下，将流速均设为30升/M²/小时的通量。考虑到在CM150系统中使用的管材的横截面，这对应于CM150系统中265的雷诺数。针对单克隆抗体B和C产生了另外的按比例缩小的数据和CM150TFF数据，并且这些数据分别呈现于表2和表3中。

表2.单克隆抗体A的数据

表3.单克隆抗体B的30升/M²/小时的回收冲洗

表3.单克隆抗体B的30升/M²/小时的回收冲洗

应领会，具体实施方式部分而不是发明内容和摘要部分旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可以阐述如诸位发明人所设想的本发明的一个或多个但不是所有的示例性方面，并且因此，不旨在以任何方式限制本发明和所附权利要求。

上文已经借助于说明指定功能的实现及其关系的功能建立区块描述了本发明。为了描述的方便，在本文中已经任意定义了这些功能建立区块的边界。只要适当执行指定功能及其关系，就可以定义可替代的边界。

具体方面的前述描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识，在无需过度实验并且不偏离本发明总体概念的情况下容易地修改和/或调整此类具体方面用于各种应用。因此，基于本文给出的传授内容和指导，此类调整和修改旨在包含在所公开的方面的等效物的含义和范围内。应理解，本文中的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，因此本说明书的术语或措辞将由本领域技术人员根据传授内容和指导来解释。

本发明的广度和范围不应当由任何上述示例性方面来限制，而应当仅根据以下权利要求及其等效物来定义。

Claims

1.一种在过滤后的回收冲洗过程中减少或防止靶蛋白稀释的方法，其包括(i)在进行所述过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使缓冲液以小于100升/平方米/小时(LMH)的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白的稀释相比，减少或防止所述靶蛋白的稀释。

2.一种在过滤后的回收冲洗过程中改善或增加靶蛋白浓度的方法，其包括(i)在进行所述过滤的同时使含有所述靶蛋白的样品以进料流速通过过滤组件，以及(ii)在回收冲洗过程中使冲洗缓冲液以小于100升/平方米/小时(LMH)的冲洗流速通过所述过滤组件，从而与用300LMH的冲洗流速获得的靶蛋白浓度相比，改善所述靶蛋白的浓度。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述回收冲洗中流动的雷诺数(“Re”)小于2000、小于1500、小于1000、小于900、小于800、小于700、小于600、小于500、小于400、小于300、小于200、小于100、小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20、小于10、小于5、小于4或小于3，其中Re用下式计算：

Re＝Dτρ/μ，并且

其中D是通道直径(m)或在非圆柱形流道几何形状的情况下的当量直径，τ是平均速度(m/s)(Q/A_c)，ρ是密度(kg/m³)，并且μ是粘度(Pa·s)。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述回收冲洗中流动的Re在约1与约50之间、在约1与约45之间、在约1与约40之间、在约1与约35之间、在约1与约30之间、在约1与约25之间、在约1与约20之间、在约1与约15之间、在约1与约10之间、在约2与约40之间、在约1与约10之间、在约2与约9之间、在约3与约8之间、在约4与约7之间、在约4与约6之间、在约3与约7之间、在约3与约6之间、在约3与约5之间、在约2与约8之间、在约2与约7之间、在约2与约6之间、在约2与约5之间、在约3与约10之间或在约4与约6之间。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述回收冲洗中流动的Re是约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述回收冲洗中流动的Re是约3.8。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述冲洗流速在约5LMH与约100LMH之间、在约10LMH与约100LMH之间、在约10LMH与约90LMH之间、在约10LMH与约80LMH之间、在约10LMH与约70LMH之间、在约10LMH与约60LMH之间、在约10LMH与约50LMH之间、在约10LMH与约40LMH之间、在约10LMH与约30LMH之间、在约30LMH与约50LMH之间、在约20LMH与约100LMH之间、在约20LMH与约90LMH之间、在约20LMH与约80LMH之间、在约20LMH与约70LMH之间、在约20LMH与约60LMH之间、在约20LMH与约50LMH之间、在约20LMH与约40LMH之间、在约30LMH与约100LMH之间、在约30LMH与约90LMH之间、在约30LMH与约80LMH之间、在约30LMH与约70LMH之间、在约30LMH与约60LMH之间、在约30LMH与约50LMH之间、在约30LMH与约40LMH之间或在约20LMH与约30LMH之间。

8.根据权利要求1至6所述的方法，其中所述冲洗流速是至少约10LMH、至少约20LMH、至少约30LMH、至少约40LMH、至少约50LMH、至少约60LMH、至少约70LMH、至少约80LMH、至少约90LMH或至少约100LMH。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述冲洗流速是约30LMH。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白的粘度高。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述靶蛋白的粘度是至少约1厘泊(cP)、至少约2cP、至少约3cP、至少约4cP、至少约5cP、至少约6cP、至少约7cP、至少约8cP、至少约9cP、至少约10cP、至少约11cP、至少约12cP、至少约13cP、至少约14cP、至少约15cP、至少约16cP、至少约17cP、至少约18cP、至少约19cP、至少约20cP、至少约21cP、至少约22cP、至少约23cP、至少约24cP、至少约25cP、至少约26cP、至少约27cP、至少约28cP、至少约29cP或至少约30cP。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述靶蛋白的粘度是至少约20厘泊(cP)、至少约21cP、至少约22cP、至少约23cP、至少约24cP、至少约25cP、至少约26cP、至少约27cP、至少约28cP、至少约29cP、至少约30cP、至少约31cP、至少约32cP、至少约33cP、至少约34cP、至少约35cP、至少约36cP、至少约37cP、至少约38cP、至少约39cP、至少约40cP、至少约41cP、至少约42cP、至少约43cP、至少约44cP、至少约45cP、至少约46cP、至少约47cP、至少约48cP、至少约49cP、至少约50cP、至少约51cP、至少约52cP、至少约53cP、至少约54cP、至少约55cP、至少约56cP、至少约57cP、至少约58cP、至少约59cP、至少约60cP、至少约61cP、至少约62cP、至少约63cP、至少约64cP、至少约65cP、至少约66cP、至少约67cP、至少约68cP、至少约69cP、至少约70cP、至少约71cP、至少约72cP、至少约73cP、至少约74cP、至少约75cP、至少约76cP、至少约77cP、至少约78cP、至少约79cP、至少约80cP、至少约81cP、至少约82cP、至少约83cP、至少约84cP、至少约85cP、至少约86cP、至少约87cP、至少约88cP、至少约89cP、至少约90cP、至少约91cP、至少约92cP、至少约93cP、至少约94cP、至少约95cP、至少约96cP、至少约97cP、至少约98cP、至少约99cP或至少约100cP。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述靶蛋白的粘度是从约2cP至约10cP、从约3cP至约10cP、从约1cP至约9cP、从约2cP至约8cP、从约2cP至约7cP、从约2cP至约6cP、从约3cP至约6cP、从约4cP至约5cP或从约2cP至约5cP。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中在所述过滤之前，在所述回收冲洗之后所述靶蛋白的浓度是至少约100g/L、至少约110g/L、至少约120g/L、至少约130g/L、至少约140g/L、至少约150g/L、至少约160g/L、至少约170g/L、至少约180g/L、至少约190g/L、至少约200g/L、至少约210g/L、至少约220g/L、至少约230g/L、至少约240g/L、至少约250g/L、至少约260g/L、至少约270g/L、至少约280g/L、至少约290g/L或至少约300g/L。

15.根据权利要求14所述的方法，其中在所述回收冲洗之后所述靶蛋白的浓度是从约100g/L至约300g/L、从约110g/L至约250g/L、从约120g/L至约240g/L、从约150g/L至约250g/L、从约130g/L至约260g/L、从约140g/L至约260g/L、从约160g/L至约220g/L或从约170g/L至约230g/L。

16.根据权利要求14所述的方法，其中在所述回收冲洗之后所述靶蛋白的浓度是约90g/L、约100g/L、约110g/L、约120g/L、约130g/L、约140g/L、约150g/L、约160g/L、约170g/L、约180g/L、约190g/L、约200g/L、约210g/L、约220g/L、约230g/L、约240g/L、约250g/L、约260g/L、约270g/L、约280g/L、约290g/L或约300g/L。

17.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中与由(i)和(ii)组成的回收冲洗过程前所述靶蛋白的浓度相比，在所述回收冲洗之后所述靶蛋白的产率是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中与用300LMH的流速进行回收冲洗后获得的所述靶蛋白的产率相比，在所述回收冲洗之后所述靶蛋白的产率提高至少1％、至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在(i)中的所述通过的进料流速高于在(ii)中的所述冲洗流速。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述进料流速是至少200LMH、至少210LMH、至少220LMH、至少230LMH、至少240LMH、至少250LMH、至少260LMH、至少270LMH、至少280LMH、至少290LMH、至少300LMH、至少310LMH、至少320LMH、至少330LMH、至少340LMH、至少350LMH、至少360LMH、至少370LMH、至少380LMH、至少390LMH、至少400LMH、至少410LMH、至少420LMH、至少430LMH、至少440LMH、至少450LMH、至少460LMH、至少470LMH、至少480LMH、至少490LMH或至少500LMH。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述进料流速在200LMH与500LMH之间、在200LMH与450LMH之间、在250LMH与450LMH之间、450LMH、在300LMH与450LMH之间、在300LMH与400LMH之间或在300LMH与350LMH之间。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述进料流速是约300LMH。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述过滤组件包含膜，所述膜衍生自聚偏氟乙烯(PVDF)、聚砜、聚醚砜、聚芳砜、再生纤维素、聚酰胺、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、醋酸纤维素、聚丙烯腈、乙烯共聚物、聚酰胺(如“尼龙6”或尼龙66”)聚碳酸酯、PFA或其任何组合。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述冲洗缓冲液包含有机和无机酸或其盐。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述有机或无机酸是柠檬酸盐(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐(例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)乙酸盐(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)、三甲胺盐(例如，Tris)、磷酸盐或组氨酸。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述冲洗缓冲液包含组氨酸。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述冲洗缓冲液包含糖。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述糖是蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖、葡萄糖、糖粉或普鲁兰多糖。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述冲洗缓冲液包含20mM组氨酸和250mM蔗糖。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中在(i)过程中使用过滤缓冲液。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述过滤缓冲液与所述冲洗缓冲液是相同的。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述过滤缓冲液与所述冲洗缓冲液是不同的。

33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述过滤缓冲液包含有机和无机酸或其盐。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述有机或无机酸是柠檬酸盐(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐(例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)乙酸盐(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)、三甲胺盐(例如，Tris)、磷酸盐或组氨酸。

35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述过滤缓冲液包含糖。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述糖是蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖、葡萄糖、糖粉或普鲁兰多糖。

37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述冲洗缓冲液和/或所述过滤缓冲液的pH是约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9或约9.5。

38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述样品选自纯的蛋白质样品、澄清的大块蛋白质样品、细胞培养物样品及其任何组合。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述细胞培养物样品衍生自包含哺乳动物细胞的细胞培养基。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、小鼠骨髓瘤(NS0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾成纤维细胞(COS-7)、马-达二氏牛肾细胞(MDBK)或其任何组合。

41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白包含抗体或融合蛋白。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述靶蛋白包含抗体。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述抗体是选自IgM、IgA、IgE、IgD和IgG的同种型。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述IgG抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

45.根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗LAG3抗体、抗CSF1R抗体或抗IL8抗体。

46.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白包含酶、激素、细胞因子、细胞表面受体、蛋白酶、细胞因子受体或其任何组合。

47.根据权利要求41或46所述的方法，其中所述靶蛋白是融合蛋白。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述融合蛋白与异源部分融合。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述异源部分是半衰期延长部分。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述半衰期延长部分包含Fc。