CN102725304A

CN102725304A - 用于亲和色谱法的冲洗溶液和方法

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Publication number: CN102725304A
Application number: CN2010800574576A
Authority: CN
Inventors: A·弗劳恩舒; K·比尔
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2030-12-17
Also published as: EP3272764B1; RU2564569C2; BR112012014937A2; KR20120109506A; JP2016128495A; SG181771A1; EP2513134A1; ES2651065T3; CA2784278C; JP2013514073A; SG10201408384PA; US20170044211A1; AU2010332778A1; LT3272764T; PL2513134T3; AU2010332778B2; US9505803B2; JP5909450B2; PT2513134T; EP3272764A1

Abstract

本发明提供一种用于亲和色谱法的冲洗方法，其中包含精氨酸或精氨酸衍生物和非缓冲盐的优选在大于8.0的高pH的冲洗溶液可有效去除杂质如高分子量物和宿主细胞蛋白，同时还提高洗脱液中的产物浓度并且保持回收产物的高百分比产率。

Description

用于亲和色谱法的冲洗溶液和方法

发明背景

基于目标蛋白与固相如凝胶基质靶标的优先结合，亲和色谱法可以从分子混合物如细胞采集物纯化所述目标蛋白。该固相组分通常被制成柱子，供施加含有目标蛋白的混合物从中通过。在此初始步骤(称为捕获步骤)中，目标蛋白特异性地与固相靶标结合而混合物中的其它组分流过柱子。然而，混合物中的某些组分，包括高分子量物(HMW)、低分子量物(LMW)和宿主细胞蛋白(HCP)，可能作为杂质与目标蛋白一起保留在柱子内。因此，通常进行一个或多个冲洗步骤，该步骤中将一种或多种冲洗溶液施加在柱子上以去除这些杂质同时保持目标蛋白与固相的结合。最后，在通过冲洗步骤去除杂质之后，通过洗脱步骤从柱子中回收目标蛋白，该步骤中将破坏目标蛋白与固相靶标的结合的洗脱溶液施加在柱子上并且在洗脱液中回收目标蛋白。因此，亲和色谱法在纯化目标蛋白中的有效性在很大程度上取决于确定可以高效去除杂质(例如HMW、LMW、HCP)同时不破坏目标蛋白与固相靶标的结合或另外不具有不希望的影响的冲洗条件。

一种特别有用的亲和色谱法类型是用于纯化含有免疫球蛋白Fc段的蛋白质如抗体和Fc融合蛋白的蛋白A色谱法。已经描述有多种冲洗溶液用于从蛋白A柱去除杂质，包括含有以下之一的冲洗溶液：疏水性电解质(例如pH为5.0-7.0的氯化四甲铵、氯化四乙铵、氯化四丙铵或氯化四丁铵)、溶剂(例如5-20%异丙醇或聚丙烯/己二醇)、脲(例如浓度为1-4M)、洗涤剂(例如0.1-1%吐温20或吐温80)、聚合物(例如5-15%聚乙二醇，如PEG400或PEG8000)或pH在5.0和7.0之间的浓度为0.8-2.0M的高浓度缓冲溶液如Tris、HCl、醋酸盐、硫酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液(参见例如Shukla,A.A.和Hinckley,P.(2005)Biotechnol.Prog.24:1115-1121；Blank的美国专利第6,127,526号和第6,333,398号；和Breece等的美国专利第6,870,034号)。然而，这些化学制剂许多都有一种或多种缺点，包括但不限于毒性、腐蚀性、可燃性、不稳定性、作为危险废物的高处置成本和/或在冲洗步骤期间去除污染物的低效率。

还描述了单独含有盐(如氯化钠)或与洗涤剂(例如吐温20)、溶剂(例如己二醇)或聚合物(例如聚乙二醇)组合的蛋白A色谱法冲洗缓冲液(Breece等的美国专利第6,870,034号)。

Barron等描述了用于蛋白A色谱法的中间冲洗溶液(intermediatewash solution)，其在pH为5.0-7.5的磷酸盐/醋酸盐缓冲液中含有0.5至2.0M精氨酸(最佳为1M精氨酸，pH为5.0的0.1M磷酸盐/醋酸盐缓冲液)。该精氨酸冲洗步骤据报道用于去除HCP污染物。作者还测试了pH为5.0-7.5含有0.5-2.0M氯化钠的中间冲洗溶液，但是报告NaCl冲洗未显示HCP的显著减少(Barron等，“Improving Purity onProtein A Affinity Media Through Use of an Arginine Intermediate WashStep”，http://www.priorartdatabase.com/IPCOM/000127319)。

Sun等也描述了亲和色谱柱(如蛋白A柱)的冲洗，使用含有精氨酸或精氨酸衍生物、浓度为0.1-2.0M并且pH为4.5-8.0的冲洗缓冲液(美国专利公布第20080064860号和第20080064861号；PCT公布第WO 2008/031020号)。

精氨酸还被用于从亲和色谱柱和其它类型的纯化柱洗脱蛋白质。例如，Arakawa等描述了使用含有0.5-2.0M精氨酸、pH为4.1-5.0的洗脱缓冲液从蛋白A柱洗脱抗体的方法(Arakawa等，(2004)ProteinExpression and Purification 36:244-248；Tsumoto，K.等，(2004)Biotechnol.Prog.20:1301-1308；美国专利公布第20050176109号)。此外，Ejima等的美国专利第7,501,495号描述了使用含有盐酸精氨酸的展开液从凝胶过滤柱洗脱蛋白质的方法。Ghose等描述了使用精氨酸梯度作为洗脱剂从未衍生化二氧化硅洗脱目标蛋白的方法(Ghose,S.等，(2004)Biotech.Bioeng.87:413-423)。Coffman等的美国专利公布第20030050450号描述了从含Fc分子和蛋白A的复合物分离含Fc分子的方法，其中将Fc/蛋白A复合物施加在疏水作用柱(HIC)上并且用含有精氨酸的缓冲液冲洗柱子。

发明概述

本发明提供用于亲和色谱法的高效而耐用的冲洗溶液以及使用该溶液的冲洗方法。该冲洗溶液在洗脱步骤之前的冲洗步骤中应用，其使用产生从亲和基质洗脱的高产率和高浓度的目标蛋白，同时有效地从施加到基质的起始物料去除高分子量物(HMW)和宿主细胞蛋白(HCP)。冲洗溶液的特征在于同时存在精氨酸(或精氨酸衍生物)和非缓冲盐，如卤盐。冲洗溶液优选处于8.0以上的高pH。精氨酸(或精氨酸衍生物)和非缓冲盐的所述组合比单独含有精氨酸或盐的冲洗溶液去除明显更多的杂质并且产生与回收的目标蛋白的高浓度相关的陡峭的洗脱峰。

因此，在一个方面，本发明提供使用供目标蛋白结合的亲和色谱(AC)基质制备纯化的目标蛋白的方法，所述方法包括在从AC基质洗脱目标蛋白之前用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和(ii)非缓冲盐的一种或多种冲洗溶液冲洗AC基质。优选地，在用一种或多种冲洗溶液冲洗之前将目标蛋白上样到AC基质上，并且在用一种或多种冲洗溶液冲洗(具体来讲)以从AC基质去除杂质之后从AC基质洗脱目标蛋白。

在一个优选实施方案中，所述AC基质是蛋白A柱。在多种其它实施方案中，AC基质可以例如选自由以下组成的组：蛋白G柱、蛋白A/G柱、蛋白L柱、固定化金属离子亲和色谱(IMAC)柱、钙调素树脂柱、MEP HyperCel^TM柱、结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的柱、结合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的柱和结合Strep-Tag II的柱。虽然与本文中描述的亲和基质结合的其它蛋白质也适用于根据本发明方法的纯化，但是在一个优选实施方案中，所述目标蛋白是与AC基质如蛋白A柱结合的抗体或抗体片段。

在一个优选实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液包含盐酸精氨酸，浓度优选在0.05-2.0M的范围，更优选在0.05-0.85M的范围，最优选在0.1-0.5M的范围。在具体的实施方案中，盐酸精氨酸存在的浓度为0.1M或约0.1M、0.25M或约0.25M，或0.5M或约0.5M。在其它实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液包含精氨酸衍生物，如选自由以下组成的组的衍生物：乙酰基精氨酸、N-α-丁酰基-精氨酸、胍丁胺(agmatine)、arginic acid和N-α-特戊酰基(pyvaloyl)精氨酸。虽然也涵盖D-精氨酸，但是所述精氨酸或精氨酸衍生物优选包含L-精氨酸。

在一个优选实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液中的非缓冲盐是氯化钠(NaCl)，浓度优选在0.1-2.0M的范围。在具体的实施方案中，NaCl存在的浓度为0.75M或约0.75M、1.0M或约1.0M，或1.25M或约1.25M。在其它实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液中的非缓冲盐选自由氯化钾、氯化钙和氯化镁组成的组。

在一个具体实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH大于8.0，优选至少为8.1，更优选至少为8.5并且更优选至少为8.9。在一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH在8.1-9.5的范围。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH在8.5-9.5的范围。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH为约9.0。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH为9.0。

本文中描述的精氨酸和非缓冲盐冲洗组合优选在含有两种组分的单一冲洗溶液中应用(即用同时包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和(ii)非缓冲盐的一种冲洗溶液冲洗所述AC基质)。或者，可以在先后的冲洗中使用两种冲洗溶液，一种含有精氨酸或精氨酸衍生物(优选pH大于8.0)并且另一种含有非缓冲盐。因此，在冲洗方法的另一个实施方案中，用第一冲洗溶液和第二冲洗溶液这两种冲洗溶液冲洗AC基质。在一个实施方案中，所述第一冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物，所述第二冲洗溶液包含非缓冲盐。在另一个实施方案中，第一冲洗溶液包含非缓冲盐，第二冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物。

本发明的冲洗方法可有效去除各种杂质，包括高分子量(HMW)物和宿主细胞蛋白(HCP)。

在另一个方面，本发明提供使用蛋白A柱制备纯化的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括(a)将包含所述抗体或抗体片段的混合物上样到蛋白A柱上；(b)用包含(i)浓度在0.05-2.0M(更优选0.05-0.85M，最优选0.1-0.5M)范围的盐酸精氨酸和(ii)浓度在0.1-2.0M范围的氯化钠的冲洗溶液冲洗所述蛋白A柱，其中所述冲洗溶液从蛋白A柱中去除杂质；和(c)从所述蛋白A柱洗脱所述抗体或抗体片段。在具体的实施方案中，盐酸精氨酸存在的浓度为0.1M或约0.1M、0.25M或约0.25M，或0.5M或约0.5M。在具体的实施方案中，NaCl存在的浓度为0.75M或约0.75M、1.0M或约1.0M，或1.25M或约1.25M。在多种实施方案中，冲洗溶液的pH大于8.0，优选至少为8.1，更优选至少为8.5，更优选为9.0，在8.1-9.5的范围，或在8.5-9.5的范围。

发明详述

本发明提供用于亲和色谱法如蛋白A色谱法的新型冲洗溶液，其在洗脱目标蛋白之前被施加到柱上以去除杂质。所述新型冲洗溶液由精氨酸或精氨酸衍生物和非缓冲盐组成。通常所述冲洗溶液是水溶液。

本文中使用的术语“非缓冲盐”是指存在于所述冲洗溶液中的其类型和浓度使得它在应用条件(如高pH)下添加酸或碱时对保持冲洗溶液的pH大体上没有帮助的盐。通常，所述非缓冲盐是离子盐。非缓冲盐包括卤盐，包括包含Cl或Br(更优选Cl)的卤盐，具体来讲是包含碱金属或碱土金属(包括Na、K、Ca和Mg，更优选Na或K)的卤盐。术语“非缓冲盐”不包括在应用条件下大体上有助于保持冲洗溶液的pH的缓冲盐，如醋酸钠、磷酸钠和Tris。在一个优选实施方案中，所述非缓冲盐是卤盐(例如包含Cl或Br)。在另一个实施方案中，非缓冲盐是包含钠(Na)、钾(K)、钙(Ca)或镁(Mg)(更优选为钠(Na)或钾(K))的卤盐。在又一个实施方案中，非缓冲盐选自由NaCl、KCl、CaCl₂和MgCl₂组成的组。在一个特别优选的实施方案中，非缓冲盐是氯化钠(NaCl)。通常所述非缓冲盐在至少1M的“高”浓度使用。其它合适的浓度和浓度范围在下面进一步描述。

冲洗组分的该新型组合比常用的工序去除更多的杂质而不影响回收率。此外，该冲洗条件产生与洗脱液中的目标蛋白的较高浓度相关的陡峭的洗脱峰，这对提高其它下游纯化过程的效能是有利的。

杂质(包括宿主细胞蛋白(HCP)和产物相关的杂质如高分子量(HMW)物和低分子量(LMW)物)的高效去除在目标蛋白的下游加工期间是关键的因素。亲和色谱法常被用作用于目标蛋白(例如抗体)的多阶段纯化过程的第一阶段，并且亲和色谱法之后的目标蛋白的纯度显著地影响随后的纯化步骤的种类和数目。亲和色谱法的另一个重要作用是浓缩产物，这允许在随后的纯化步骤中使用相应减小的、成本更低的柱子。因此，优化在亲和色谱法步骤期间的杂质去除是特别重要的。

低pH条件(通常介于pH 3–4之间)对于从亲和基质洗脱结合了的目标蛋白是必要的，但具有潜在地诱导聚集的缺点。历史上，更宽松的条件(如pH 5-5.5)已经用于从柱上冲洗非特异性结合的杂质，同时保持目标蛋白和亲和基质之间的相互作用。然而，由于在这些条件下，特别是在高上样密度操作时目标蛋白的部分洗脱，目标蛋白的回收率往往降低。因此，在一个优选实施方案中，本发明提供的冲洗溶液可在大于8.0的高pH有利地使用，这在允许杂质去除的同时保持目标蛋白与亲和基质的结合。

本发明提供的用于亲和色谱法的新型冲洗溶液是基于精氨酸(或精氨酸衍生物)和非缓冲盐的混合物，优选在高pH使用。存在于一般的采集物或细胞萃取液中的杂质的广泛的生物物理多样性导致产生与色谱介质的固相和/或结合了的目标蛋白的相互作用的非常多样的方式。杂质的强度高低不同的束缚可能是两个分子之间的非共价分子间相互作用的结果，如氢键、静电相互作用、疏水性和范德华力或这些相互作用类型的组合。因此，用以去除杂质的若干不同机理的组合很可能比基于去除杂质的单一机理的方法更有效。

基于本文中的分析数据，就非缓冲盐在冲洗溶液中的作用而论，介于目标蛋白和亲和基质的配体之间的高亲和相互作用不被高非缓冲盐浓度下的冲洗破坏，而被非特异性地束缚到固定化配体或结合了的目标蛋白的带电残基上的带电污染物可被高效地去除。因此，虽然不希望受机理限制，仍认为在冲洗溶液中使用的非缓冲盐能够破坏介于被非特异性地束缚到亲和色谱基质的一种或多种组分(例如，基质的化学载体如树脂，固定在基质上的亲和配体和/或与固定在基质上的配体结合的目标靶标)的带电残基上的带电污染物(杂质)之间的离子相互作用，而不破坏结合靶标与固定化配体的特异性结合。

就精氨酸在冲洗溶液中的作用而论，据报道精氨酸能够增溶某些析出的蛋白质(Umetsu,M.等，(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.328:189-197;Tsumoto，K.等，(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.312:1383-1386)，减少聚集体的形成(Arakawa,T.等，(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.304:148-152)，并且减少蛋白质非特异性吸附到表面上(Ejima,D.等，(2005)J.Chromatogr.A.1094:49-55)。虽然不希望受机理限制，仍认为蛋白质聚集的减少可能源自对蛋白质上与精氨酸相互作用的疏水补丁(hydrophobic patch)的掩蔽。该相互作用可在精氨酸上的胍基和蛋白质上的色氨酸基之间发生，或经由精氨酸群集引起的疏水补丁的形成而发生，或可以是这些作用的组合。

就在冲洗溶液中使用大于8.0的pH而论，碱性pH可以使HCP和HMW部分变性，而包括单体抗体的稳定蛋白质不受这些条件影响。虽然不希望受机理限制，仍认为污染物蛋白质的变性可以表现为轻微的结构变化，其可能足以减弱非特异性结合。因此，冲洗溶液的高pH对于通过使杂质与结合了的目标蛋白或亲和基质的固体载体的相互作用失稳来提高杂质的去除可能是有益的。

因此，在一个方面，本发明提供使用供目标蛋白结合的亲和色谱法(AC)基质制备纯化的蛋白质的方法，所述方法包括在从AC基质洗脱目标蛋白之前用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和(ii)非缓冲盐的一种或多种冲洗溶液冲洗AC基质。

本文中使用的术语“亲和色谱基质”或“AC基质”意图指固相介质，通常是凝胶或树脂，其允许生物化学混合物的分离，基于在目标蛋白和AC基质之间的高特异性结合相互作用，如在受体和配体、酶和底物或抗原和抗体之间。因此，所述固相介质包含目标蛋白能够可逆地固着(取决于缓冲条件)的靶标。可以包含AC基质的固定化或固相介质的非限制性实例包括凝胶基质如琼脂糖微球(如可商购的Sepharose基质)和玻璃基质如多孔玻璃微球(如可商购的ProSep基质)。

目标蛋白与AC基质的结合通常通过柱色谱法实现。即，将AC基质制成柱子，使含有目标蛋白的生物化学混合物流过所述柱子，随后通过使一种或多种冲洗溶液流过柱子来冲洗柱子，随后通过使洗脱缓冲液流过柱子来从柱子洗脱目标蛋白。

或者，目标蛋白与AC基质的结合可以通过分批处理实现，其中使所述含有目标蛋白的生物化学混合物与所述AC基质一起在容器中孵育以允许目标蛋白与AC基质结合，从容器中去除固相介质(例如通过离心)，冲洗固相介质以去除杂质并且再回收(例如通过离心)以及从固相介质洗脱目标蛋白。

在又一个实施方案中，可以使用分批处理和柱色谱法的组合。例如，目标蛋白与AC基质的最初的结合可以通过分批处理实现并且随后可以将固相介质装填到柱子中，随后冲洗柱子并且从柱子洗脱目标蛋白。

特定的固相基质的性质(具体来讲是附着于固相的靶标的结合性质)决定了可以使用该固相基质纯化的蛋白质的类型。例如，在本发明的一个优选实施方案中，AC基质是蛋白A柱，其包含作为附着于固相的靶标的细菌细胞壁蛋白(蛋白A)，其特异性地结合在某些免疫球蛋白的Fc段内的CH₂和CH₃结构域。蛋白A的结合性质在本领域中是已确立的。因此，在本发明的一个优选实施方案中，目标蛋白(待纯化)是抗体或包含Fc段的抗体片段。此外，可以使用蛋白A色谱法纯化的其它蛋白质包括Fc融合蛋白。就能够与蛋白A基质特异性结合的任何蛋白质而言，其均可以根据本发明的方法来纯化。

多种蛋白A树脂在本领域是熟知的并且适于在本发明中使用。可商购的蛋白A树脂的非限制性实例包括MabSelect、MabSelectXtra、MabSelect Sure、rProtein A Sepharose FF、rmpProtein A SepharoseFF、Protein A Sepharose CL-4B和nProtein A Sepharose 4 FF(均可商购自GE Healthcare)；ProSep A、ProSep-vA High Capacity、ProSep-vAUltra and ProSep-Va Ultra Plus(均可商购自Millipore)；Poros A和Mabcapture A(均可商购自Poros)；IPA-300、IPA-400和IPA-500(均可商购自RepliGen Corp.)；Affigel protein A和Affiprep protein A(均可商购自Bio-Rad)；MABsorbent A1P和MABsorbent A2P(均可商购自Affinity Chromatography Ltd.)；Protein A Ceramic Hyper D F(可商购自Pall Corporation)；Ultralink Immobilized protein A和Agarose proteinA(均可商购自PIERCE)；以及Protein A Cellthru 300和Protein AUltraflow(均可商购自Sterogen Bioseparations)。

除了蛋白A色谱法之外，本发明的冲洗方法可以应用于其它亲和色谱系统。例如，在另一个实施方案中，AC基质可以是蛋白G柱、蛋白A/G柱或蛋白L柱，其中每个也都是具有本领域中确定的结合性质的免疫球蛋白结合细菌蛋白。因此，AC基质即蛋白G基质、蛋白A/G基质或蛋白L基质可以用于纯化抗体、包含Fc段的抗体片段和Fc融合蛋白。

AC基质和它们可有效纯化的蛋白质类型的其它非限制性实例包括以下：固定化金属离子亲和色谱(IMAC)柱(用于纯化对金属离子具有亲和力的蛋白质，如组氨酸标签蛋白)、钙调素树脂柱(用于纯化带有钙调素结合肽(CBP)标签的蛋白质)、MEP HyperCel^TM柱(选择性地结合免疫球蛋白的纤维素基质)、结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的柱子(如选择性地结合带有MBP标签的蛋白质的Dextrin Sepharose^TM树脂)、结合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的柱子(如选择性地结合带有GST标签的蛋白质的Glutathione Sepharose^TM树脂和结合Strep-Tag II的柱子(如选择性地结合带有Strep-Tag II标签的蛋白质的Strep-Tactin^TMSepharose树脂)。此外，免疫亲和基质(其包含作为固着到固相上的靶标的抗体)可用于纯化与固着到固相上的抗体特异性结合的目标抗原。

虽然本文具体地针对使用蛋白A色谱法的抗体的纯化来描述目标发明，但是就本领域已知的与特定的AC基质选择性结合的任何蛋白质而言，该蛋白质可接受使用本文中描述的冲洗方法来纯化。

本发明的冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物。在本发明中可以使用的精氨酸可以是天然氨基酸精氨酸(例如L-精氨酸)、D-精氨酸或精氨酸衍生物。精氨酸衍生物的非限制性实例包括酰化精氨酸，如乙酰基精氨酸和N-α-丁酰基-精氨酸、胍丁胺、arginic acid和N-α-特戊酰基精氨酸。精氨酸或精氨酸衍生物可以以酸加成盐的形式使用。可以形成酸加成盐的酸的实例包括盐酸等。

在冲洗溶液中的精氨酸或精氨酸衍生物的浓度通常在0.05M和2.0M之间(例如0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M、0.85M、0.9M、0.95M、1.0M、1.1M、1.15M、1.20M、1.25M、1.30M、1.35M、1.40M、1.45M、1.5M、1.55M、1.6M、1.65M、1.7M、1.75M、1.8M、1.85M、1.9M、1.95M或2.0M)，更优选在0.05和0.85M(这是精氨酸在20℃水中的上限溶解度)之间(例如0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M或0.85M)，最优选在0.1和0.5M之间(例如0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M或0.5M)。在多种实施方案中，精氨酸或精氨酸衍生物的浓度可以是例如0.05M、0.1M、0.2M、0.25M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M或0.8M，或在0.1M和0.5M之间。在某些实施方案中，在冲洗溶液中精氨酸或精氨酸衍生物的浓度是0.25M或更大。在具体的实施方案中，精氨酸存在的浓度为0.1M或约0.1M、0.25M或约0.25M，或0.5M或约0.5M。

本发明的冲洗溶液还包含非缓冲盐(如上所述)，其类型和浓度使得足以破坏在杂质和亲和基质的一种或多种组分之间的离子相互作用。在一个优选实施方案中，非缓冲盐是卤盐。在一个特别优选的实施方案中，非缓冲盐是氯化钠(NaCl)。在其它实施方案中，非缓冲盐可以是例如氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl₂)或氯化镁(MgCl₂)。在冲洗溶液中的非缓冲盐浓度通常在0.1M和2.0M之间(例如0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M、0.85M、0.9M、0.95M、1.0M、1.1M、1.15M、1.20M、1.25M、1.30M、1.35M、1.40M、1.45M、1.5M、1.55M、1.6M、1.65M、1.7M、1.75M、1.8M、1.85M、1.9M、1.95M或2.0M)，或在0.5M和1.5M之间(例如0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M、0.85M、0.9M、0.95M、1.0M、1.1M、1.15M、1.2M、1.25M、1.3M、1.35M、1.4M、1.45M或1.5M)，或在1M和2M之间(例如1M、1.1M、1.15M、1.2M、1.25M、1.3M、1.35M、1.4M、1.45M、1.5M、1.55M、1.6M、1.65M、1.7M、1.75M、1.8M、1.85M、1.9M、1.95M或2M)。在某些实施方案中，在冲洗溶液中的非缓冲盐的浓度是1M或更大。在具体的实施方案中，在冲洗溶液中的非缓冲盐存在的浓度为0.75M或约0.75M、1.0M或约1.0M，或1.25M或约1.25M。

虽然更低的pH也适用于本发明的冲洗溶液，但是本发明的冲洗溶液的pH通常大于8.0。在一个具体的实施方案中，pH大于8.0，优选至少为8.1，更优选至少为8.5或8.9。在一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH在8.1-9.5的范围。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH在8.5-9.5的范围。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH为约9.0。在另一个实施方案中，所述一种或多种冲洗溶液的pH为9.0。或者，取决于待纯化的目标蛋白，可以使用更低的pH值，例如在pH 5.0-8.0范围的pH，或7.5或7.0或6.5或5.0的pH。取决于待纯化的蛋白质的性质，本领域的一般技术人员可以选择冲洗溶液的适当的pH值。因此，所述冲洗溶液可以含有用于调节和/或保持pH的一种或多种缓冲液。在冲洗溶液中可以包括的典型缓冲液的非限制性实例包括Tris(三(羟甲基)甲胺)、双-Tris、双-Tris丙烷、组氨酸、三乙醇胺、二乙醇胺、甲酸盐、醋酸盐、MES(2-(N-吗啉基)乙烷磺酸)、磷酸盐、HEPES(4-2-羟乙基-1-哌嗪乙烷磺酸)、柠檬酸盐、MOPS(3-(N-吗啉基)丙烷磺酸)、TAPS(3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙烷磺酸)、Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、TES(2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙烷磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N’-双(2-乙烷磺酸)、二甲胂酸盐(cacodylate)(二甲基胂酸)和SSC(盐水柠檬酸钠)。

本文中描述的精氨酸和非缓冲盐冲洗组合优选在含有两种组分的单一冲洗溶液中应用。或者，可以在先后的冲洗中使用两种冲洗溶液，一种含有精氨酸或精氨酸衍生物(优选在高pH)并且另一种含有非缓冲盐。因此，在冲洗方法的另一个实施方案中，在洗脱目标蛋白之前，用第一冲洗溶液和第二冲洗溶液这两种冲洗溶液冲洗AC基质。在一个实施方案中，第一冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物(优选在大于8.0的pH)，第二冲洗溶液包含非缓冲盐。在另一个实施方案中，第一冲洗溶液包含非缓冲盐，第二冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物(优选在大于8.0的pH)。用于冲洗溶液的合适的精氨酸衍生物和非缓冲盐以及优选浓度、浓度范围和pH条件的实例如上所述。

本发明的冲洗方法可有效去除各种杂质，包括高分子量(HMW)物和宿主细胞蛋白(HCP)。如在实施例中详细描述，本发明的冲洗溶液可有效减少洗脱液中的HMW物和HCP两者，同时实现在洗脱液中目标蛋白的高百分比产率和在洗脱液中目标蛋白的高浓度。例如，在多种实施方案中，使用本文中描述的冲洗方法产生大于95%的目标蛋白的百分比产率，更优选大于96%，更优选大于97%。就洗脱液中HMW物的减少(可以表示为洗脱液中的HMW%)而论，在多种实施方案中使用本文中描述的冲洗方法产生小于10%的在洗脱液中的HMW%，或小于5%，或小于2.0%，或小于1%或小于0.5%。就洗脱液中HCP的减少(可以表示为对数减少值(LRV))而论，在多种实施方案中使用本文中描述的冲洗方法产生至少为1.1的对于洗脱液中HCP的LRV，或至少为1.3，或至少为1.5，或至少为2.0，或至少为2.3，或至少为2.5，或至少为2.7。

虽然本文针对在亲和色谱法期间的冲洗步骤来描述本发明，但是对本领域一般技术人员显而易见的是，在冲洗步骤前后进行其它步骤以实现从亲和色谱基质纯化目标蛋白。例如，在冲洗步骤之前，本发明的方法可以包括平衡步骤，其中将亲和色谱基质用上样缓冲液平衡；和上样或捕获步骤，其中将含有目标蛋白的生物化学混合物(例如细胞采集物)施加到AC基质上。用于平衡和上样缓冲液的合适的条件将取决于AC基质和待纯化的目标蛋白的性质而不同，并且本领域一般技术人员可以使用本领域已确立的方法和信息容易地确定这些条件。用于在蛋白A柱上纯化抗体的平衡和上样缓冲液的非限制性实例在实施例1和2中阐述。此外，在如上所述的冲洗步骤之后，本发明的方法可以包括使用普通冲洗溶液的一个或多个其它冲洗步骤，和/或洗脱步骤，其中将洗脱缓冲液施加到亲和色谱基质上以从基质洗脱目标蛋白。用于洗脱缓冲液的合适的条件将取决于AC基质和待纯化的目标蛋白的性质而不同，并且本领域一般技术人员可以使用本领域已确立的方法和信息容易地确定这些条件。通常，在酸性pH进行目标蛋白从AC基质的洗脱。用于在蛋白A柱上纯化抗体的洗脱缓冲液的非限制性实例在实施例1和2中阐述。

在另一个方面，本发明提供在抗体的蛋白A纯化期间用于从含抗体混合物去除杂质的优选方法。因此，本发明提供使用蛋白A柱制备纯化的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括

a)将包含抗体或抗体片段的混合物上样到所述蛋白A柱上；

b)用包含(i)和(ii)的冲洗溶液冲洗蛋白A柱：(i)浓度在0.05-2.0M的范围(更优选在0.05-0.85M的范围，最优选在0.1-0.5M的范围)的盐酸精氨酸，和(ii)浓度在0.1-2.0M的范围的氯化钠，其中所述冲洗溶液从蛋白A柱中去除杂质；和

c)从蛋白A柱洗脱所述抗体或抗体片段。

优选地，冲洗溶液在大于8.0的pH。盐酸精氨酸的优选浓度和浓度范围如上所述。例如，在一个优选实施方案中，盐酸精氨酸的浓度为约0.25M或0.25M。氯化钠的优选浓度和浓度范围如上所述。例如，在一个优选实施方案中，氯化钠的浓度为约1M或1M。优选的pH和pH范围同样如上所述。例如，在一个实施方案中，冲洗溶液的pH在8.1-9.5的范围。在另一个实施方案中，冲洗溶液的pH是8.5或更大。在另一个实施方案中，冲洗溶液的pH为9.0。

通过以下实施例进一步说明本发明，不应当将以下实施例视为进一步的限制。本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请均明确地以全文引用的方式并入本文。

实施例

实施例1：精氨酸/非缓冲盐冲洗溶液与其它冲洗溶液的比较

在本实施例中，比较了多种冲洗溶液在亲和色谱法期间从含抗体溶液去除杂质的有效性。更具体地讲，比较了三种冲洗溶液：一种不含精氨酸和非缓冲盐pH为5.0，第二种含有非缓冲盐但不含精氨酸pH为7.0，第三种同时含有非缓冲盐和精氨酸pH为9.0。

通过深层过滤采集含有介于1.5和2.5g/L之间抗体的澄清、哺乳动物细胞培养上清液并且使用ALC柱(具体来讲是蛋白A柱(GEHealthcare))纯化，根据以下表1中描述的条件进行：

表1蛋白A柱的操作条件

*Res.Time=保留时间；**:CV，柱体积

向平衡的柱子上样澄清的采集物并且首先用冲洗溶液1(在以下表2中描述)冲洗，随后用冲洗溶液2(20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄，pH7.0)第二次冲洗，随后在低pH洗脱。利用ALC分析洗脱液的抗体浓度，利用尺寸排阻色谱法(SEC)分析其中的HMW/LMW，并利用酶联免疫吸附测定分析其中的HCP含量，在相同细胞系上显色。用于第一次冲洗比较的各种冲洗溶液在以下表2中示出：

表2用于第一次冲洗的不同的冲洗溶液

*用32%NaOH溶液调节pH

四种不同单克隆抗体(mAb)的蛋白A纯化(使用表2中所示的三种不同冲洗溶液)的百分比产率在以下表3中示出。

表3使用各种冲洗溶液的不同抗体的百分比产率

表3显示用W1-A5(不含有非缓冲盐或精氨酸，pH 5.0)或W2-N7(含有非缓冲盐但不含精氨酸，pH 7.0)冲洗产生的抗体回收量取决于待纯化抗体的波动。更具体地讲，用W1-A5冲洗产生在81%和96%之间波动的产率，用W2-N7冲洗产生在92%和101%之间波动的产率。相比之下，对于纯化的所有四种抗体而言，用W3-Arg/N9(含有非缓冲盐和精氨酸两者，pH 9.0)冲洗产生一致的高产率(96%以上)。

四种不同mAb的蛋白A纯化(使用表2中所示的三种不同冲洗溶液)之后的洗脱液浓度(g/L)在以下表4中示出。

表4使用各种冲洗溶液的不同抗体的洗脱液浓度

表4显示洗脱液浓度还受在ALC期间使用的冲洗缓冲液所影响。对于四种mAb中的三种(mAb Qg、By和Va)而言，用W3-Arg/N9冲洗比用W1-A5或W2-N7冲洗产生更高的洗脱液浓度。W1-A5冲洗之后四种抗体的平均洗脱液浓度是最低的(17.1g/L)，随后是W2-N7冲洗(17.3g/L)，用W3-Arg/N9冲洗之后是最高的(21.7g/L)。

四种不同mAb的蛋白A纯化(使用表2中所示的三种不同冲洗溶液)之后在洗脱液中的宿主细胞蛋白(HCP)的减少在以下表5中示出。HCP的减少表示为相对于细胞采集物中数值的对数减少值(LRV)。

表5使用各种冲洗溶液的不同抗体的洗脱液中的HCP减少

就杂质去除而论，基于表5中的数据，在三种冲洗缓冲液之间可以确定明确的顺序。由低pH冲洗W1-A5获得最低的HCP减少，随后是使用盐冲洗W2-N7的冲洗，最高的去除系数由pH为9.0的精氨酸-NaCl组合缓冲液(W3-Arg/N9)获得。以去除的对数级表示，用W1-A5冲洗之后获得平均1.4个对数级(log)，用W2-N7获得1.55个对数级，用W3-Arg/N9获得2.2个对数级的最高去除。

四种不同mAb的蛋白A纯化(使用表2中所述的三种不同冲洗溶液)之后在洗脱液中的高分子量(HMW)物的水平在以下表6中示出。在洗脱液中的HMW物的水平可表示为洗脱液中总蛋白质的百分数(%)。

表6使用各种冲洗溶液的不同抗体的洗脱液中的HMW物水平

表6显示HMW物的水平对于4种不同mAb是非常不同的并且HMW的去除是mAb相关的。总的说来，W1-A5冲洗溶液是有效性最差的冲洗溶液。用W2-N7冲洗溶液获得更好的结果并且在ALC洗脱液中最低的HMW数值与用W3-Arg/N9冲洗溶液得到的一致。W1-A5冲洗对W3-Arg/N9冲洗相比，三种mAb(mAb Qg、By和Va)作出HMW减少到1/2.6至1/5.9倍的反应，而mAb-Bp只显示勉强的减少。

对以上表3-6中概述的实验结果的总结在以下表7中示出。有阴影的行表示采集物的组成。

表7用于四种mAb的三种ALC冲洗溶液的比较

Conc.=洗脱液浓度；HCP=宿主细胞蛋白；HMW=高分子量物；LRV=对数减少数值；NA=不适用。

实施例2：各种精氨酸/盐冲洗溶液的比较

在本实施例中，比较了其它冲洗溶液(含有不同量的非缓冲盐和/或精氨酸，处于不同pH值)在亲和液相色谱法(ALC)期间去除杂质的有效性。在本实施例中使用的色谱条件在以下表8中阐述。

表8蛋白A柱的操作条件

*Res.Time=保留时间；**：CV，柱体积

在本实施例中比较的冲洗溶液在以下表9中阐述：

表9用于第一次冲洗的其它不同的冲洗溶液

*未测量精确浓度(1M Tris碱[(羟甲基)氨基甲烷]用于调节pH)

在表9中所示的四种冲洗溶液允许低非缓冲盐冲洗溶液(W4-0.15M N7，含有150mM NaCl)与高非缓冲盐冲洗溶液(W2-N7，含有1M NaCl)的直接比较，以及pH为8.0的单独含有精氨酸的冲洗溶液(W5-Arg8)与处于碱性pH的含有非缓冲盐与精氨酸的组合的冲洗溶液(W6-Arg/N8)的比较。

使用表9中所示的四种不同冲洗溶液，以及精氨酸单独冲洗(W5-Arg8)与高盐单独冲洗(W2-N7)的组合，来纯化mAb-By获得的百分比产率、洗脱液中的HMW物百分比和HCP的减少(表示为LRV)在以下表10中示出。

表10使用各种冲洗溶液的mAb-By纯化数值

*LW=用12柱体积代替6柱体积进行冲洗。

表10显示对于所有冲洗条件，抗体的百分比产率均保持在97%以上。此外，用于去除杂质(HMW和HCP)的最高效的冲洗溶液是处于碱性pH的同时含有精氨酸和高非缓冲盐的冲洗溶液(W6-Arg/N8)或含有处于碱性pH的精氨酸(W5-Arg8)和高非缓冲盐(W2-N7)的冲洗溶液组合使用的情形。

用相当的生理冲洗溶液(W4-0.15M N7)冲洗，与上样到柱子上的起始物料相比将HCP减少到1/64倍(1.81个对数级)。相比之下，用pH为8的非缓冲盐-精氨酸组合(W6-Arg/N8)冲洗导致减少到1/498倍(2.7个对数级)。

HMW的减少遵循类似的趋势。用含有20mM磷酸钠、150mMNaCl、pH 7.0的冲洗溶液(W4-0.15M N7)冲洗在洗脱液中产生1.6%HMW，而用非缓冲盐-精氨酸组合(W6-Arg/N8)冲洗使该数值降低到1/5倍以下。

实施例3：冲洗溶液中碱性pH与生理pH的比较

在本实施例中，将pH作为冲洗溶液关于去除HCP和HMW的参数进行了分析并且显示出碱性pH条件的优越性。使用实施例2的表8中阐述的条件，对mAb-Va的细胞采集物(具有稍微不同水平的HMW和HCP)进行了亲和液相色谱(ALC)分析。

在本实施例中比较的冲洗溶液在以下表11中阐述：

表11用于第一次冲洗的具有不同pH值的冲洗溶液(对于mAb-Va)

*未使用NaOH进行pH调节

使用表11中所示的三种不同冲洗溶液纯化mAb-Va获得的百分比产率、洗脱液中的HMW物百分比和HCP的减少(表示为LRV)在以下表12中示出。

表12生理pH与碱性pH对于mAb-Va纯化数值的比较

只含高非缓冲盐的冲洗溶液(W2-N7)作为基线对照冲洗来确定处于近似生理pH 7.0(冲洗溶液W6-Arg/N7)和处于碱性pH 8.9(冲洗溶液W3b-Arg/N8.9)的精氨酸/非缓冲盐组合去除HCP/HMW的能力。与较低pH(pH 7.0)相比，在较高pH(pH 8.9)观察到HMW水平从1.6%到1.4%的小而值得注意的减少。更明显的是对HCP去除的作用。这里，较低pH冲洗(pH 7.0)使HCP降低1.48个对数级，而高pH冲洗(pH 8.9)使数值降低1.61个对数级，从而突出了高pH冲洗在杂质去除能力中的优越性。

实施例4：精氨酸/盐冲洗溶液与其它冲洗溶液的比较

在本实施例中，比较了含有吐温80、除了精氨酸以外的氨基酸或高浓度Tris的其它冲洗溶液与精氨酸/非缓冲盐冲洗溶液。在本实施例中，将pH作为冲洗溶液关于去除HCP和HMW的参数进行了分析并且显示出碱性pH条件的优越性。使用实施例1的表1中阐述的条件，对mAb-Va的细胞采集物(具有稍微不同水平的HMW和HCP)进行了亲和液相色谱(ALC)分析。

在本实施例中比较的冲洗溶液在以下表13中阐述：

表13用于第一次冲洗的具有不同组分的冲洗溶液

*LW=用12柱体积代替6柱体积进行冲洗。**用1M储备溶液调节pH，浓度未测量。

使用表13中所示的六种不同冲洗溶液纯化mAb-Va获得的百分比产率、在洗脱液中的HMW物百分比和HCP的减少(表示为LRV)在以下表14中示出。

表14冲洗溶液组分对于mAb-Va纯化数值的比较

*LW=用12柱体积代替6柱体积进行冲洗。

表14显示与只含高非缓冲盐(W2-N7)、吐温80(W7-N7-T80)、其它氨基酸如甘氨酸(W8-N7-0.1M G)或高浓度Tris(W9-0.5M Tris 8.9LW)的其它冲洗溶液相比，在高pH的精氨酸/非缓冲盐冲洗溶液(W3b-Arg/N8.9)在HMW和HCP去除中是最高效的冲洗溶液。

实施例5：高pH的精氨酸/非缓冲盐冲洗溶液与低pH和高只含盐的比较

在本实施例中，比较了处于高pH的精氨酸/非缓冲盐冲洗溶液与处于高pH和低pH的非缓冲盐溶液的有效性。具体来讲，评价和比较了以下条件：(1)低pH(即7.0)的非缓冲盐冲洗溶液，(2)高pH(即9.0)的非缓冲盐冲洗溶液，和(3)高pH(即9.0)的与精氨酸结合的非缓冲盐冲洗溶液。此外，分析了精氨酸对去除HMW、LMW和HCP的作用，并且显示使用处于碱性pH条件的与精氨酸结合的非缓冲盐溶液是特别有效和有利的。在本实施例中比较的冲洗溶液在以下表15中阐述：

表15用于第一次冲洗的具有不同组分的冲洗溶液

*，用32%的NaOH储备溶液调节pH至9.0。

对mAb-By的细胞采集物进行了使用在实施例1的表1中阐述的条件的亲和液相色谱(ALC)分析，使用具有极小差异的不同水平的HMW和HCP，在以下表16中详述。

表16蛋白A柱的操作条件

*，对于用冲洗溶液W3-Arg/N9的操作，6CV用于平衡，4CV用于洗脱和储存。**，Res.Time=保留时间。***，tq=现状条件(按原样)。

使用在表15中所示的三种不同的冲洗溶液，测量了mAb-By纯化的参数：(1)源于SEC的抗体浓度(g/L)，(2)HMW和LMW物百分比，(3)以ng/mg单克隆抗体表示的HCP水平和(4)在ALC洗脱液中的源于ALC的百分比产率。结果在以下表17中示出。

表17冲洗溶液组分对于mAb-By纯化数值的比较

*，第二数值对应于通过0.2μm过滤器过滤之后的第二次测量。

具体来讲，表17显示与只含非缓冲盐的其它冲洗溶液(W2-N7和W10-N9)相比(与其pH无关)，在9.0的高pH的精氨酸/非缓冲盐冲洗溶液(W3-Arg/N9)是去除HMW、LMW和HCP的最高效的冲洗溶液。具体来讲，与单独用pH为7(W2-N7)或pH为9(W10-N9)的非缓冲盐冲洗相比，用pH为9.0的精氨酸/非缓冲盐冲洗溶液冲洗使HCP降低到至少1/3倍并且使LMW降低到至少1/4倍。

实施例6：用于精氨酸/盐冲洗溶液的精氨酸和NaCl浓度和pH的范围的比较

在本实施例中，考察了其它精氨酸和非缓冲盐浓度和pH冲洗条件以确定它们在亲和液相色谱法(ALC)期间对杂质去除的影响。在本实施例中比较的冲洗溶液在以下表18中阐述：

表18用于第一次冲洗的具有不同组分的冲洗溶液

*，用8M NaOH调节pH；**，通过W13-Arg/N9的5倍稀释获得缓冲液并且用8M NaOH调节pH至9.0

对mAb-By的细胞采集物进行ALC(在实施例1的表1中阐述的条件下)，使用具有极小差异的稍微不同水平的HMW和HCP，如在以下表19中详述。

表19蛋白A柱的操作条件(在4min的res.time)⁺

*，对于用冲洗溶液W11-Arg/N8.5的操作；**，对于用冲洗溶液W12-Arg/N9.5的操作；***，用1M Tris调节pH；****，对于用冲洗溶液W13-Arg/N9和W14-Arg/N9的操作；*****，用8M NaOH调节pH。⁺Res.Time=保留时间。

使用在表18中所示的任何两种不同的冲洗溶液，测量了mAb-By纯化之后的参数：(1)源于SEC的抗体浓度(g/L)，(2)HMW和LMW物百分比(%)，(3)以ng/mg单克隆抗体表示的HCP水平和(4)在ALC洗脱液中的源于ALC的百分比产率。这些结果在以下表20中示出。

表20在不同NaCl浓度和pH水平的冲洗缓冲液用于纯化mAb-By的效率(两种不同的起始物料)

表20中所示的数据强调处于高pH的精氨酸/非缓冲盐冲洗溶液用于亲和液相色谱法的效力。用(1)pH为8.5的精氨酸和较低浓度的非缓冲盐(0.75M NaCl)，(2)pH为9.5的精氨酸和较高浓度的非缓冲盐(1.25M NaCl)或(3)低浓度(例如100mM)或高浓度(例如500mM)的精氨酸冲洗引起HCP的显著减少(平均>2个对数级的减少)，没有损失产率。

Claims

1.一种使用供目标蛋白结合的亲和色谱(AC)基质制备纯化的目标蛋白的方法，所述方法包括在从所述AC基质洗脱所述目标蛋白之前，用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和(ii)非缓冲盐的一种或多种冲洗溶液冲洗所述AC基质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物和(ii)非缓冲盐的一种冲洗溶液冲洗所述AC基质。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述冲洗溶液包含盐酸精氨酸。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述非缓冲盐是氯化钠(NaCl)。

5.根据权利要求1所述的方法，其中用第一冲洗溶液和第二冲洗溶液这两种冲洗溶液冲洗所述AC基质，其中：

(a)所述第一冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物，所述第二冲洗溶液包含非缓冲盐；或

(b)所述第一冲洗溶液包含非缓冲盐，所述第二冲洗溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白是与蛋白A柱结合的抗体或抗体片段。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种冲洗溶液从所述AC基质中去除杂质。

8.一种使用蛋白A柱制备纯化的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括

a)将包含所述抗体或抗体片段的混合物上样到所述蛋白A柱上；

b)用包含(i)浓度在0.05-0.85M范围的盐酸精氨酸和(ii)浓度在0.1-2.0M范围的氯化钠的冲洗溶液冲洗所述蛋白A柱，其中所述冲洗溶液从所述蛋白A柱中去除杂质；和

c)从所述蛋白A柱洗脱所述抗体或抗体片段。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述盐酸精氨酸的浓度为0.25M或约0.25M。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述氯化钠的浓度为1M或约1M。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述一种或多种冲洗溶液的pH大于8.0。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述一种或多种冲洗溶液的pH在约8.5-9.5的范围内。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述另一冲洗溶液的pH是9.0。

14.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中所述杂质包含高分子量(HMW)物。

15.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中所述杂质包含宿主细胞蛋白(HCP)。